JPWO2016163480A1 - 多孔質シリカおよびクロマトグラフィ担体 - Google Patents
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Abstract
Description
多孔質シリカの用途に応じて、多孔質シリカがアルカリ環境下で用いられる場合には、多孔質シリカに耐アルカリ性を付与したものを用いることが望まれる。
アフィニティクロマトグラフィでは、担体をアルカリ洗浄することがあるため、担体の耐アルカリ性が重要になる。
特許文献2には、シリカゲルにジルコニウム成分を担持させる耐アルカリ性に優れたシリカゲルの製造方法が提案されている。
特許文献3には、ジルコニアがコートされたコントロールドポアガラスにプロテインAが固定された分離剤が開示されている。
一方、多孔質シリカをクロマトグラフィ担体として用いる場合、ジルコニアの処理前後で多孔質シリカの細孔形状を維持して、処理後の多孔質シリカの理論段数を高めることが望まれる。
[1]リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が1μmol/m2〜25μmol/m2であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が1μmol/m2〜15μmol/m2である、多孔質シリカ。
[2]前記[1]に記載の多孔質シリカからなる、クロマトグラフィ担体用の多孔質シリカ。
[3]多孔質シリカを充填したカラムを用いた分子量453の標準ポリスチレンの測定により検出されたピークから以下の計算式で求められる理論段数が2000段以上である、[2]に記載の多孔質シリカ。
N=5.54×[t/W0.5]2
ここで、Nは理論段数、tは成分の保持時間、W0.5はピーク高さの50%位置におけるピーク幅である。
[5]アフィニティクロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体であって、前記リガンドがプロテインAを含む、[4]に記載のクロマトグラフィ担体。
[6]前記プロテインAの固定化量が9.5mg/mL−bed以上である[5]に記載のクロマトグラフィ担体。
[7]動的結合容量が35mg/mL−bed以上である、[4]または[5]に記載のクロマトグラフィ担体。
[8]前記リガンドがスルホン酸又またはカルボキシル基を含む、陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアミンを含む、陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアルキル基を含む、逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、または、前記リガンドがジオール基を含む、サイズ排除クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体である、[4]に記載のクロマトグラフィ担体。
[10]得られる多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が1μmol/m2〜25μmol/m2であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が1μmol/m2〜15μmol/m2である、[9]に記載の多孔質シリカの製造方法。
[11]前記リン酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させ、次いで前記ジルコニウム酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させる、[9]または[10]に記載の多孔質シリカの製造方法。
[12]前記リン酸化物前駆体が、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸もしくはその塩、オルトリン酸もしくはその塩、または五酸化二リンである、[9]〜[11]のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
[13]前記ジルコニウム酸化物前駆体が、塩化ジルコニウム(IV)、塩化ジルコニウム(III)、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、またはジアルコキシジルコニウムジクロリドである、[9]〜[12]のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
[14]前記リン酸化物前駆体および前記ジルコニウム酸化物前駆体を乾式法で多孔質シリカに付着させる、[9]〜[13]のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
[15]前記焼成の温度が300℃〜500℃である、[10]〜[14]のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
[16]前記[4]に記載のクロマトグラフィ担体を用いてクロマトグラフィを行う方法。
[17]前記[4]に記載のクロマトグラフィ担体を用いてタンパク質を精製するタンパク質の製造方法。
[18]前記タンパク質がIgGである[17]記載のタンパク質の製造方法。
[19]プロテインAを固定化したアフィニティクロマトグラフィ担体であって、動的結合容量が35mg/mL−bed以上であり、かつ、室温で500mMの水酸化ナトリウム水溶液に20時間浸漬し、浸漬前の動的結合容量に対する浸漬後の動的結合容量の割合が60%以上であるアフィニティクロマトグラフィ担体。
本発明の多孔質シリカは、リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が1μmol/m2〜25μmol/m2であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が1μmol/m2〜15μmol/m2であることを特徴とする。以下、この本発明の多孔質シリカを「多孔質シリカ(A)」とも記す。
本発明によれば、耐アルカリ性の高い多孔質シリカを提供することができる。また、この多孔質シリカ(A)を用いて、耐アルカリ性の高いクロマトグラフィ担体を提供することができる。
さらに、この多孔質シリカ(A)を用いることで、クロマトグラフィ担体の理論段数を高くすることができる。
耐アルカリ性が高いとともに、理論段数が高いクロマトグラフィ担体を用いることで、アルカリ性においても高分離能を有するクロマトグラフィ担体を提供することができる。また、クロマトグラフィ担体をアルカリ洗浄する場合に、繰り返し使用によって、理論段数が低下することを防止することができる。
同様に、多孔質シリカに含まれるリン酸化物の少なくとも一部は、Si−O−Pで表される結合でシリカと結合していると考えられる。加えて、さらにリン酸化物の少なくとも一部は、Zr−O−Pで表される結合でジルコニアと結合していると考えられる。以下、多孔質シリカ(A)に含まれるリン酸化物成分を「P成分」とも記す。また、本発明において、リン酸化物前駆体は、焼成等により酸化物となるリン化合物が好ましい。以下、「リン化合物前駆体」を「前駆体P」とも記す。
本発明によれば、前駆体Zrとともに、前駆体Pで多孔質シリカを処理することで、細孔形状を処理前後で維持することができる。細孔形状が維持されることから、Zr成分が多孔質シリカ表面に均一に形成されることがわかる。
これは、多孔質シリカの表面上でP成分とZr成分とが相互作用することで、多孔質シリカの表面にZr成分がより均一に分布するためと考えられる。
したがって、本発明によれば、Zr成分が多孔質シリカ上に均一に分布するため、耐アルカリ性を高めることができる。
Zr原子を有するZr成分は、多孔質シリカの表面に存在していることが好ましい。ここで、「表面に存在する」とは、Zr成分がシリカの表面から内部方向に濃度傾斜を有して存在していることも意味する。
前駆体Zrを多孔質シリカに付着させ焼成することで、多孔質シリカの表面にZr成分を存在させることができる。
前駆体Zrとしては、塩化ジルコニウム(IV)、塩化ジルコニウム(III)、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、ジアルコキシジルコニウムジクロリド等を挙げることができる。
テトラアルコキシジルコニウムの例としては、ジルコニウムテトラ−n−プロポキシド、ジルコニウムテトラ−iso−プロポキシド、ジルコニウムテトラエトキシド、ジルコニウムテトラ−n−ブトキシド等を挙げることができる。
これらは単独で、または2種以上を組み合わせて用いることができる。
この前駆体Zrを焼成することで、Zr成分を多孔質シリカの表面に形成することができる。
一方、Zr原子の含有量が、多孔質シリカの単位比表面積当たり15μmol/m2以下であることで、多孔質シリカの細孔形状を維持することができる。一方、Zr原子が過剰に配合されると、理論段数が低下することがある。Zr原子含有量の値は、好ましくは13.5μmol/m2以下であり、より好ましくは10μmol/m2以下である。
ここで、Zr原子の単位比表面積当たりのモル数は、ICP分析法によって多孔質シリカ全体に対するZr原子含有量(質量%)を求め、このZr原子含有量(質量%)と多孔質シリカの比表面積とから求めることができる。多孔質シリカの比表面積の測定方法は後述するとおりである。
P原子を有するP成分は、多孔質シリカの表面に存在していることが好ましい。
前駆体Pを多孔質シリカに付着させ焼成することで、多孔質シリカの表面にP成分を存在させることができる。
前駆体Pとしては、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸およびその塩、オルトリン酸およびその塩、五酸化二リン等を挙げることができる。これらは単独で、または2種以上を組み合わせて用いることができる。
この前駆体Pを多孔質シリカに付着させ焼成することで、P成分を多孔質シリカの表面に形成することができる。
P原子含有量の値は、好ましくは3.0μmol/m2以上であり、より好ましくは10.0μmol/m2以上である。
一方、P原子の含有量は、多孔質シリカの単位比表面積当たり25μmol/m2以下であることが好ましい。これによって、多孔質シリカの細孔形状を維持しながら均一な分布のZr成分が形成できると考えられる。このため理論段数の低下を抑制できる。
P原子含有量の値は、好ましくは20μmol/m2以下であり、より好ましくは17.5μmol/m2以下である。
ここで、P原子の単位比表面積当たりのモル数の測定方法としては、上記したZr原子と同様に測定することができる。
多孔質シリカ(A)の形状としては、球状粒子であることが好ましく、真球体および楕円体を含めた球状とすることができる。クロマトグラフィ担体の用途では、カラムへの充填性、使用時の圧力損失の抑制の観点から、真球体に近い形状であることが好ましい。
一方、多孔質シリカ(A)の平均粒子径としては、500μm以下であることが好ましく、より好ましくは200μm以下であり、さらに好ましくは100μm以下である。
ここで、多孔質シリカ(A)の平均粒子径はコールターカウンター法による測定方法によって測定される。
また、陽イオン交換クロマトグラフィ担体、陰イオン交換クロマトグラフィ担体、逆相クロマトグラフィ担体、サイズ排除クロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ(A)は、特に限定するものではないが、通常、平均粒子径0.5〜10,000μm、好ましくは1〜500μm、平均細孔径0.5〜600nm、比表面積50〜10,000m2/g、好ましくは100〜1,000m2/g程度のものが望ましい。
アフィニティクロマトグラフィ担体では、リガンドとして、プロテインA、プロテインG、コンカナバリンA、抗原、抗体等を用いることができる。
陽イオン交換クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、スルホン酸、カルボキシル基等を用いることができる。
陰イオン交換クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、1級アミン、2級アミン、3級アミン、4級アミン等のアミンを用いることができる。
逆相クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、アルキル基、フェニル基、フッ化アルキル基等を用いることができる。アルキル基としては、炭素数1〜30のアルキル基を用いることが好ましく、例えば、メチル基、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基等を挙げることができる。
サイズ排除クロマトグラフィ担体では、リガンドとしてジオール基等を用いることができる。
また、動的結合容量は35mg/mL−bed以上であり、かつ、室温で500mMの水酸化ナトリウム水溶液に20時間浸漬し、浸漬前の動的結合容量に対する浸漬後の動的結合容量の割合は60%以上であることが好ましい。
ここで、プロテインAの固定化量の測定方法としては、プロテインAを固定化した担体を乾燥して、この担体を元素分析して求めることができる。
本発明の多孔質シリカの製造方法は、前駆体Pおよび前駆体Zrを任意の順でまたは同時に多孔質シリカに付着させ、次いで焼成することを特徴とする。
以下、前駆体Zrおよび前駆体Pを多孔質シリカに付着させる処理をそれぞれ、「Zr処理」および「P処理」とも記す。P処理とZr処理を行った後に焼成を行うことにより、多孔質シリカが製造される。
本発明の多孔質シリカの製造方法において、前駆体Pおよび前駆体Zrの使用量を、得られる多孔質シリカのP原子含有量およびZr原子含有量が前記多孔質シリカ(A)における含有量となる量使用することにより、多孔質シリカ(A)が得られる。得られる多孔質シリカのP原子含有量およびZr原子含有量の少なくとも一方が前記多孔質シリカ(A)における含有量となる量以外の量使用することにより、多孔質シリカ(A)以外の、リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカが得られる。
本発明の製造方法により得られる、多孔質シリカ(A)以外の多孔質シリカとしては、たとえば、多孔質シリカの単位比表面積当たりの原子の量として、P原子含有量が1μmol/m2〜25μmol/m2であって、かつZr原子含有量が1μmol/m2未満または15μmol/m2を超える多孔質シリカ、Zr原子含有量の量が1μmol/m2〜15μmol/m2であって、かつP原子含有量が1μmol/m2未満または25μmol/m2を超える多孔質シリカ、等が挙げられる。多孔質シリカ(A)以外の多孔質シリカのP原子含有量の下限は0.01μmol/m2が好ましく、上限は50μmol/m2が好ましい。Zr原子含有量の下限は0.01μmol/m2が好ましく、上限は30μmol/m2が好ましい。
例えば、原料のシリカの平均粒子径、D90/D10、比表面積、平均細孔径、細孔容積は、上記した多孔質シリカ(A)と同様の範囲内であることが好ましい。
Zr処理、P処理および焼成の前後において、これらの物性に変化は少ないためである。
乳化方法としては、シリカ前駆体を含む分散相を連続相に微小孔部または多孔質膜を介して供給しエマルションを作製する方法が好ましい。これによって、均一な液滴径のエマルションを作製して、結果として均一な粒子径の多孔質シリカを得ることができる。このような乳化方法としては、マイクロミキサー法や膜乳化法を用いることができる。
本発明の製造方法では、マイクロミキサー法によって作製された多孔質シリカを好ましく用いることができる。マイクロミキサー法については、例えば、国際公開第2013/062105号に開示されている。
本製造方法の好ましい態様としては、多孔質シリカにまず前駆体Pを付着させ、次に前駆体Zrを付着させ、その後に焼成する方法である。別の態様としては、多孔質シリカに前駆体Pと前駆体Zrを同時に付着させ、その後に焼成する方法、および、多孔質シリカに前駆体Zrを付着させた後に前駆体Pを付着させ、その後に焼成する方法がある。
たとえば、多孔質シリカと前駆体P溶液とを混合して多孔質シリカに前駆体Pを接触させた後、圧力常圧〜−0.1MPa、温度10〜100℃で濃縮して乾固し、温度10〜180℃、時間5分〜48時間で乾燥する。次いで、この乾燥体と前駆体Zr溶液とを混合して、この乾燥体の多孔質シリカに前駆体Zrを接触させる。
前駆体Pは水や極性有機溶媒と親和性が高いため、前駆体P溶液に用いる溶媒としては、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、1−プロパノール、アセトニトリル等の有機溶媒等を好ましく用いることができる。
また、P処理後にZr処理をする場合は、Zr処理で用いる溶媒によって前駆体Pが再溶出しないように、前駆体Zr溶液に用いる溶媒としては、有機溶媒を用いることが好ましく、1−プロパノール、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を好ましく用いることができる。
また、Zr処理後にP処理をする場合は、多孔質シリカと前駆体Zr溶液とを混合して多孔質シリカに前駆体Zrを接触させた後、前記と同様の条件で濃縮して乾固し、乾燥し、次いで、得られた乾燥体と前駆体P溶液とを混合して、この乾燥体の多孔質シリカに前駆体Pを接触させる。この場合は、前駆体Zr溶液に用いる溶媒としては、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、1−プロパノール、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒等を用いることが好ましい。
さらに、P処理とZr処理を同時に行う場合は、多孔質シリカと前駆体P溶液と前駆体Zr溶液とを混合して、多孔質シリカに前駆体Pと前駆体Zrを接触させる。この場合は、前駆体Pに合わせて、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、1−プロパノール、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒等を用いることが好ましい。
最終段階の乾燥としては、温度10〜180℃、時間5分〜48時間の範囲内で、1段階または2段階以上で行うことが好ましい。
上記乾燥を行った後、焼成を行う。焼成温度としては、好ましくは300〜500℃、より好ましくは350〜450℃である。これによって、多孔質シリカの変質を防ぐとともに、前駆体Zrおよび前駆体PからZr成分およびP成分を生成することができる。また、焼成時間は、30分〜24時間であることが好ましい。
前駆体P溶液と前駆体Zr溶液との接触、用いる溶媒の選択、乾燥、焼成等は、上記したスラリー濃縮乾固法と同様に行うことができる。
好ましいスラリー濾過法は、原料の多孔質シリカに、水溶性の前駆体Pの水性溶媒溶液を接触させ、濾過および乾燥後、この乾燥体に、前駆体Zrの有機溶媒溶液を接触させ、濾過、乾燥および焼成する方法である。
前駆体P溶液と前駆体Zr溶液との接触、溶媒の選択、乾燥、焼成等は、上記したスラリー濃縮乾固法と同様に行うことができる。
上記した多孔質シリカ(A)にプロテインAを固定させる方法としては、リンカーと称される構造を多孔質シリカ(A)とリガンドの間に介在させ、リンカーの一端を多孔質シリカ(A)に結合させ、かつリンカーの他端をリガンドに結合させることにより、リガンドを多孔質シリカに固定させる方法が挙げられる。
ジオール化の方法としては、例えば、希塩酸等の酸によりエポキシ基を開環させることにより、ジオール修飾多孔質シリカを得る方法を用いることができる。
グリセロールポリグリシジルエーテルの処理方法としては、例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル(商品名「デナコールEX−314」、ナガセケムテック社製)と、メタノール等の有機溶媒とを混合し、乾燥させる。この乾燥体に、デカン等の有機溶媒と三フッ化水素ジエチルエーテルとを加えて混合し、洗浄および乾燥して、グリセロールポリグリシジルエーテル修飾多孔質シリカ(A)を得ることができる。
得られたグリセロールポリグリシジルエーテル修飾多孔質シリカ(A)をホルミル化することで、この多孔質シリカ(A)にプロテインAを還元的アミノ化反応によって担持させることができる。ホルミル化は、例えば、多孔質シリカを過ヨウ素酸ナトリウムを用いて処理することで行うことができる。
また、次いでトリメチルアミンボランやシアノ水素化ホウ素ナトリウム等によって処理することが好ましい。これによって、生成したイミン結合がより安定なアミン結合に還元される。
洗浄としては、リン酸緩衝整理食塩水(PBS、PH7.4)、クエン酸緩衝液(pH2.2)、水酸化ナトリウム水溶液、蒸留水等を用いて複数回行うことができる。
N=5.54×[t/W0.5]2
ここで、Nは理論段数、tは成分の保持時間、W0.5はピーク高さの50%位置におけるピーク幅である。この理論段数は2000段以上が好ましく、3000段以上がより好ましい。また、この理論段数は500,000段以下が好ましく、100,000段以下がより好ましい。
また耐アルカリ性は、アルカリに浸漬する前後でのDBCの保持率で求めることができる。すなわち室温で500mMの水酸化ナトリウム水溶液に20時間浸漬する前後でのDBCを比較し、浸漬前のDBCに対する浸漬後のDBCの割合を算出する。当該割合は、60%以上が好ましく、70%以上がより好ましい。理想的な上限値は100%である。
本発明はまた、上記各クロマトグラフィ担体を用いてクロマトグラフィを行う方法である。本発明はさらに上記クロマトグラフィ担体を用いてタンパク質を精製するタンパク質の製造方法である。特に前記タンパク質がIgGであることが好ましい。
<多孔質シリカ(A)の作製>
表1に、例1〜例28の多孔質シリカの処方を示す。
例1〜例28では、原料の多孔質シリカとしてAGCエスアイテック社製「M.S.GEL SIL EP−DF−5−300A」を用いた。以下、この原料の多孔質シリカをシリカゲルと記す。
このシリカゲルの物性は、以下の通りである。
平均粒子径:4.44μm、均等係数(D90/D10):1.44、平均細孔径:26.2nm、細孔容積:1.30mL/g、比表面積:191m2/g。
ここで、平均粒子径はMultisizerIII(ベックマン・コールター社製)を用いてコールターカウンター法によって測定した。均等係数は同法によってD10粒子径およびD90粒子径を測定し、その比(D90/D10)から求めた。平均細孔径、細孔容積および比表面積は、オートポアIV9510(島津製作所社)を用いて、水銀圧入法によって測定した。以下同じ。
例3の製造方法について説明する。
5gのシリカゲルと、69mLの蒸留水と、0.221gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)との混合液を室温で30分撹拌した。この混合液を72℃、−0.09MPaで減圧濃縮し、乾固した後、180℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に69mLの1−プロパノールと、3.77mLの70質量%ジルコニウムテトラ−n−プロポキシドの1−プロパノール溶液(東京化成社製、以下70%Zr(OPr)4と略すことがある。)とを加え、室温で4時間撹拌した。
その後、60℃、−0.09MPaで減圧濃縮し、乾固した後、室温で一昼夜風乾し、70℃で3時間、120℃で5時間乾燥させた。次いで、400℃で7時間焼成して、多孔質シリカ(A)を得た。
例4〜8、10〜16、22では、表1の処方にしたがって、上記例3と同様にして多孔質シリカを得た。
例9では、表1の処方にしたがって、Zr処理をしない以外は、上記例3と同様にして多孔質シリカを得た。
例17の製造方法について説明する。
7gのシリカゲルと、97mLの蒸留水と、1.456gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)との混合液を室温で30分撹拌した。これを濾過した後、180℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、97mLの1−プロパノールと、5.52mLの75質量%のジルコニウムテトラ−n−プロポキシドの1−プロパノール溶液(マツモトファインケミカル社製、オルガチックスZA−45、以下75%Zr(OPr)4と略すことがある。)を加え、室温で4時間撹拌した。
これを濾過した後、室温で一昼夜風乾し、70℃で3時間、120℃で5時間乾燥させた。次いで、400℃で7時間焼成して多孔質シリカ(A)を得た。
例18の製造方法について説明する。
5gのシリカゲルに、5.86mLの蒸留水と、1.040gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)との混合液を加え、室温で30分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。これを180℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、2.11mLの1−プロパノールと、3.94mLの75質量%ジルコニウムテトラ−n−プロポキシドの1−プロパノール溶液(マツモトファインケミカル社製、オルガチックスZA−45(75%Zr(OPr)4))との混合液を加え、室温で30分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。
これを室温で一昼夜風乾燥し、70℃で3時間、120℃で5時間乾燥させた。次いで、400℃で7時間焼成して多孔質シリカ(A)を得た。
例19〜21、23〜28では、表1の処方にしたがって、上記例18と同様にして多孔質シリカ(A)を得た。
得られた例1〜28の多孔質シリカを用いて、以下の評価を行った。結果を表2に示す。
(P量の測定)
得られた多孔質シリカについて、ICP分析により多孔質シリカ全体に対するP原子含有量であるP量(質量%)を測定した。そして、このP量と後述する多孔質シリカの比表面積とから、P量(μmol/m2)を算出した。
得られた多孔質シリカについて、ICP分析により多孔質シリカ全体に対するZr原子量であるZr含有量(質量%)を測定した。そして、このZr量と後述する多孔質シリカの比表面積とからZr量(μmol/m2)を算出した。
例1〜28によって作製した多孔質シリカ0.5gに、50mM水酸化ナトリウム水溶液13mLを加え、23℃、3時間ロータリーミキサーにて撹拌した。遠心分離後、上澄み液を0.45μmのメンブレンフィルターで濾過し、この濾液中のシリカ濃度を公知の方法であるモリブデン黄吸光光度法を用いて求めた。
また、100mMおよび500mMの水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を用いて、同様の操作を行った。
50mM、100mM、500mMのNaOHについて、例1のSi溶出量を100%として、例2〜22の相対Si溶出量を、以下の計算によって求めた。結果を表2に示す。
各例の50mMのNaOHの相対Si溶出量=(各例の50mMのNaOHのSi溶出量)/(例1の50mMのNaOHのSi溶出量)×100(%)。
各例の100mMのNaOHの相対Si溶出量=(各例の100mMのNaOHのSi溶出量)/(例1の100mMのNaOHのSi溶出量)×100(%)。
各例の500mMのNaOHの相対Si溶出量=(各例の500mMのNaOHのSi溶出量)/(例1の500mMのNaOHのSi溶出量)×100(%)。
例1〜28によって作製した多孔質シリカを、それぞれ、内径4.6mm×長さ250mmのステンレスカラムに充填し、このカラムをクロマトグラフィ装置「ELITE Lachrom(HITACHI社製)」に装填して、次の条件で測定した。
溶離液:テトラヒドロフラン。
流速:0.3mL/min。
温度:23℃。
検出器:UV at 230nm。
サンプル:TSK GEL 標準ポリスチレン(東ソー社製)。
標準ポリスチレンは、次の重量平均分子量のサンプルを用いた。
A300;分子量453、A1000;分子量1050、A2500;分子量2500、A5000;分子量5870、F1;分子量9490、F2;分子量17100、F4;分子量37200、F10;分子量98900、F20;分子量189000、F40;分子量397000、F80;分子量707000、F128;分子量1110000。
N=5.54×[t/W0.5]2
ここで、Nは理論段数、tは成分の保持時間、W0.5はピーク高さの50%位置におけるピーク幅である。
A300(分子量453)の理論段数を表2に示す。
得られた多孔質シリカについて、比表面積(m2/g)、細孔容積(mL/g)、細孔径(nm)を測定した。これらの水銀圧入法による細孔物性は、島津製作所社製「水銀ポロシメーター オートポアIV9510」を用いて測定した。結果を表2に示す。
例3〜8、10〜12、14、16〜28は、本発明の要件を満たす。
詳しくは、例2〜16、22では、スラリー濃縮乾固法(処理方法:A)を用いた例であり、以下のことがわかった。
例2では、P処理をせず、Zr処理をしたものであり、相対Si溶出量が少なくなるものの、理論段数が低下した。
例3〜8、22では、P処理およびZr処理をしたものであり、相対Si溶出量が少なく、理論段数の低下を防いだ。
例9では、Zr処理をせず、P処理をしたものであり、理論段数が低下しなかったものの、相対Si溶出量が多かった。
例10〜12、14、16では、P処理およびZr処理をしたものであり、相対Si溶出量が少なかった。
例10、11、14では、さらに、理論段数の低下を防いだ。
例13および例15ではZr処理量が多く、相対Si溶出量が少なくなるものの、理論段数が低下した。
例18〜21、22〜28では、乾式法(処理方法:C)によって、P処理およびZr処理をしたものであり、相対Si溶出量が少なく、理論段数の低下を防いだ。
図1に、例1、2、8についてポリスチレン分子量に対する理論段数のグラフを示す。
例1は未処理のシリカゲルである。
例2は、P処理を行わずZr処理のみの例であり、理論段数が特に低分子量側で低下した。
例8は、P処理およびZr処理をした例であり、未処理の例1に対して理論段数の低下を防ぐことができた。
図示しないが、本発明の要件を満たすその他の例についても同様の傾向であった。
例1は未処理のシリカゲルである。
例2は、P処理を行わずZr処理のみの例であり、相対Si溶出量が低く、耐アルカリ性を確認することができた。
例8は、P処理およびZr処理をした例であり、Zr処理のみの例2に比べて、相対Si溶出量がより低く、耐アルカリ性をより高めることができた。
図1および図2を通して、Zr処理とともにP処理をすることで、処理前後で多孔質シリカの細孔形状が維持され、さらに耐アルカリ性も向上することがわかる。
例2は、P処理を行わずZr処理のみの例である。
KH2PO4量が多くなるほど、100mMのNaOHの相対Si溶出量が低くなり、理論段数が高くなることがわかる。P成分の量は、細孔形状に影響しにくいと考えられる。
図3から、P原子含有量は、1μmol/m2以上であることが好ましく、より好ましくは3.0μmol/m2以上であり、さらに好ましくは10.0μmol/m2以上であることがわかる。
例9は、Zr処理を行わずP処理のみの例である。
Zr(OPr)4量が多くなるほど、100mMのNaOHの相対Si溶出量が低くなるが、理論段数が低下することがわかる。Zr成分の量が多くなると、多孔質シリカ表面のZr成分量が多くなって、細孔形状が変化し、理論段数が低下すると考えられる。
図4から、Zr原子含有量は、1〜15μmol/m2であることが好ましく、より好ましく2〜13.5μmol/m2であり、さらに好ましくは2.5〜10μmol/m2であることがわかる。
<大粒径の多孔質シリカ(A)の作製>
表3に、例31、32の多孔質シリカの処方を示す。
例31、32では、シリカゲルとしてAGCエスアイテック社製「M.S.GEL SIL EP−DM−35−1000AW」を用いた。(合成方法はWO2013/062105に従う。)
このシリカゲルの物性は、以下の通りである。
平均粒子径:31.7μm、均等係数(D90/D10):1.29、平均細孔径:107.0nm、細孔容積:1.68mL/g、比表面積:61m2/g。
例31は未処理のシリカゲルであり、例32は製造例4にしたがって乾式法により作製した例である。
例32の製造方法について説明する。
シリカゲル50gと、83mLの蒸留水と、3.321gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)との混合液を加えて、室温で30分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させ、180℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、70mLの1−プロパノールと、12.50mLの75質量%ジルコニウムテトラ−n−プロポキシドの1−プロパノール溶液(マツモトファインケミカル社製、オルガチックスZA−45)とを加え、室温で30分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。
これを室温で一昼夜風乾し、70℃で3時間、120℃で5時間乾燥させた。次いで、400℃で7時間焼成して多孔質シリカ(A)を得た。
上記した例1〜28と同様にして、P量、Zr量、相対Si溶出量、理論段数および細孔物性を求めた。結果を表4に示す。
なお、相対Si溶出量は、50mM、100mM、500mMのNaOHについて、それぞれ例31のSi溶出量を100%として、例32の相対Si溶出量を求めた。
(製造例5:リンカーおよびリガンドの導入)
例32で得られた多孔質シリカ(A)5gに、22mLのトルエン、0.85mLのN,N−ジイソプロピルエチルアミン、1.08mLの3−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、4.5時間還流させた。
放冷後、濾過し、100mLのトルエン、50mLのテトラヒドロフラン、65mLのメタノールを用いて、この順序で洗浄した。
その後、20mLの0.5%塩酸水溶液を加え、室温で一昼夜浸漬させ、濾過し、150mLの蒸留水、150mLのメタノールで洗浄し、70℃で一昼夜乾燥させた。
得られたジオール修飾多孔質シリカ3gに、0.64gのデナコールEX−314(ナガセケムテック社製)と1.38mLのメタノールとの混合液を加えて、室温で30分混合した。その後、70℃で一昼夜乾燥させた。
これに18.2mLのデカン、1.1μLの三フッ化ホウ素ジエチルエーテルを加えて、110℃で4時間撹拌した。放冷後、濾過し、130mLのヘキサン、130mLのテトラヒドロフラン、130mLの0.5%塩酸水溶液、650mLの0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液、650mLの蒸留水、130mLのメタノールで洗浄し、70℃で一昼夜乾燥させた。
得られたデナコール−多孔質シリカ(A)0.5gに、2.5mLの2.5重量%過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を加えて、23℃で1.5時間ロータリーミキサーにて撹拌し、遠心分離後、上澄み液を除去し、残渣を同様の操作で30mLの蒸留水、30mLの0.2mol/Lリン酸緩衝液を用いて洗浄した。
これに1.1mLの0.2mol/Lリン酸緩衝液と0.91mLのリコンビナントプロテインAを加えて、23℃で3時間撹拌した。さらに、0.142mLのエタノールアミンを加えて35℃で1.5時間、6.3mgのトリメチルアミンボランを加えて、23℃で3時間撹拌した。
これを濾過し、15mLのリン酸緩衝生理的食塩水(PBS、PH7.4)、15mLのクエン酸緩衝液(pH2.2)、再度15mLのPBS、7.7mLの50mmol/L水酸化ナトリウム水溶液、15mLの蒸留水で洗浄し、1%ベンジルアルコールを含む0.1%酢酸緩衝液(pH5.2)を3.2mL加え、プロテインAを導入した最終品(例41)を得た。プロテインAの固定量は11.5mg/mL−bedであった。また元素分析値はC率:5.57%、N率:0.56%であった。
耐アルカリ性は、室温で500mMの水酸化ナトリウム水溶液に所定時間浸漬する前後でのDBCを比較し、浸漬前のDBCに対する浸漬後のDBCの割合を算出した。DBCの値を表5に、相対DBCの値を表6に示す。本願実施例の例41では、高流速においても高DBCが達成でき、かつ、アルカリ耐性も高いことが明らかとなった。
比較例(例42)として、GEヘルスケア社製、MabSelect SuRe LX(アガロース担体)を用いた。また比較例(例43)として、東ソー社製、TOYOPEARL AF−rProteinA HC−650F(ポリメタクリレート担体)を用いた。ただし例42および例43における流速は0.5mL/分(滞留時間は1.96分)とした。
製造例5と同様にして得られたジオール修飾多孔質シリカ1gに、15mLのN,N−ジメチルホルムアミド、76mgのt−ブトキシカリウム(和光純薬社製)、82mgの1−ブロモブタン(和光純薬社製)を加えて、室温で4時間撹拌した。その後濾過し、20mLのメタノール、20mLの50%メタノール水溶液、20mLのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、70℃で一昼夜乾燥した。これにより、ブチル基修飾多孔質シリカ(逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体)が得られた。
例32で得られた多孔質シリカ(A)5gに、22mLのトルエン、0.85mLのN,N−ジイソプロピルエチルアミン、1.08mLの3−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、4.5時間還流させた。放冷後濾過し、100mLのトルエン、50mLのテトラヒドロフラン、65mLのメタノールを用いて、この順序で洗浄した。その後、70℃で一昼夜乾燥させてエポキシ修飾多孔質シリカを得た。
得られたエポキシ修飾多孔質シリカ0.3gに、0.44gの亜硫酸水素ナトリウムに100mMの水酸化ナトリウム水溶液でpH7に調整した水溶液10mLを加えて、室温で4時間撹拌した。その後濾過し、20mLの蒸留水で洗浄し、10mLの10%硫酸水溶液を加えて室温1時間で浸漬し、20mLの蒸留水、20mLのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、70℃で一昼夜乾燥した。これにより、スルホン酸修飾多孔質シリカ(陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体)が得られた。
例45と同様にして得られたエポキシ修飾多孔質シリカ0.3gに、6mLのテトラヒドロフラン、32mgの無水エチレンジアミン(東京化成社製)を加えて、室温で4時間撹拌した。その後濾過し、20mLの蒸留水、20mLのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、70℃で一昼夜乾燥した。これにより、アミノ基修飾多孔質シリカ(陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体)が得られた。
例46で得られたアミノ基修飾多孔質シリカに1,4−ジオキサン中で無水コハク酸を作用させ、カルボキシル基修飾多孔質シリカ(陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体)を得る。
なお、2015年4月10日に出願された日本特許出願2015−080705号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (15)
- リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、
多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が1μmol/m2〜25μmol/m2であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が1μmol/m2〜15μmol/m2である、多孔質シリカ。 - 請求項1に記載の多孔質シリカからなる、クロマトグラフィ担体用の多孔質シリカ。
- 多孔質シリカを充填したカラムを用いた分子量453の標準ポリスチレンの測定により検出されたピークから以下の計算式で求められる理論段数が2000段以上である、請求項2に記載の多孔質シリカ。
N=5.54×[t/W0.5]2
ここで、Nは理論段数、tは成分の保持時間、W0.5はピーク高さの50%位置におけるピーク幅である。 - 請求項1に記載の多孔質シリカ、および前記多孔質シリカに固定されたリガンドを含む、クロマトグラフィ担体。
- アフィニティクロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体であって、前記リガンドがプロテインAを含む、請求項4に記載のクロマトグラフィ担体。
- 前記プロテインAの固定化量が9.5mg/mL−bed以上である、請求項5に記載のクロマトグラフィ担体。
- 動的結合容量が35mg/mL−bed以上である、請求項5または6に記載のクロマトグラフィ担体。
- 前記リガンドがスルホン酸又またはカルボキシル基を含む、陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアミンを含む、陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアルキル基を含む、逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、または、前記リガンドがジオール基を含む、サイズ排除クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体である、請求項4に記載のクロマトグラフィ担体。
- リン酸化物前駆体およびジルコニウム酸化物前駆体を任意の順でまたは同時に多孔質シリカに付着させ、次いで焼成する、多孔質シリカの製造方法。
- 得られる多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が1μmol/m2〜25μmol/m2であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が1μmol/m2〜15μmol/m2である、請求項9に記載の多孔質シリカの製造方法。
- 前記リン酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させ、次いで前記ジルコニウム酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させる、請求項9または10に記載の多孔質シリカの製造方法。
- 前記リン酸化物前駆体が、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸もしくはその塩、オルトリン酸もしくはその塩、または五酸化二リンである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の多孔質シリカの製造方法。
- 前記ジルコニウム酸化物前駆体が、塩化ジルコニウム(IV)、塩化ジルコニウム(III)、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、またはジアルコキシジルコニウムジクロリドである、請求項9〜12いずれか1項に記載の多孔質シリカの製造方法。
- 前記リン酸化物前駆体および前記ジルコニウム酸化物前駆体を乾式法で多孔質シリカに付着させる、請求項9〜13のいずれか1項に記載の多孔質シリカの製造方法。
- 前記焼成の温度が300℃〜500℃である、請求項9〜14のいずれか1項に記載の多孔質シリカの製造方法。
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