JP3844496B2 - メルカプト複素環式リガンドを用いるクロマトグラフィ吸着剤 - Google Patents
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Description
本発明は、総体的にはアフィニティクロマトグラフィ、および更に詳細にはシュドバイオアフィニティクロマトグラフィに関する。
発明の背景
診断および治療目的でのモノクローン性抗体およびポリクローン性抗体が迅速に開発され、かつその必要性が増加してきているため、研究努力は最近は抗体含有溶液から抗体を効率的に単離する新規な技法の発明に向けられてきた。幾つかの周知の現在用いられている技法としては、イオン交換体、疎水性支持体、ヒドロキシアパタイトおよびゲル濾過媒体のような古典的な液体クロマトグラフィ用吸着剤の使用が挙げられる。不運なことには、これらの技法は実施に時間がかかり長たらしく、また通常は抗体の異種個体群の単離に適用することはできない。従って、これらの技法は、単離しようとする特定の抗体によっては場合毎に調整する必要がある。
固定化リガンドと精製しようとする特定の分子との間の特異的な相互作用に依存するアフィニティクロマトグラフィは、溶液から抗体を生成するのに用いられるもう一つの周知の現存する技法である。細菌Staphylococcus aureusに由来するプロテインAはIgG抗体のFcフラグメントに対して強力かつ特異的な親和性を有し、IgG抗体を精製するアフィニティリガンドとして約10年間用いられてきた。プロテインAは、クロマトグラフィ用ビーズおよび膜などの極めて多種多様な固形支持材料に固定することができ、高精製抗体を高収率で得るのに用いることができる。
不運なことには、プロテインAは、アフィニティリガンドとして多くの制限を受けている。一つのこのような制限は、プロテインAの法外な価格である。この価格が高いため、プロテインAのアフィニティリガンドとしての大規模な利用は経済的に不可能であることがしばしばある。もう一つのこのような制限は、アフィニティクロマトグラフィによって精製しようとする抗体も含まれている同じ生物学的流体(例えば、血清、腹水、乳、ハイブリドーマ細胞培養上清など)に普通に含まれるプロテアーゼに対するプロテインAの感受性である。このようなプロテアーゼに対するプロテインAのこの感受性により、下記の効果の一方または両方が生じる。すなわち、(1)IgGのFcフラグメントに対するプロテインAの認識は、次第に減少し、(2)プロテアーゼ作用によって生成したプロテインAのフラグメントは、別の状況では純粋な抗体製剤を汚染する。
更にもう一つのプロテインAの制限は、プロテインAを、これが結合した固形支持材料から完全な状態で放出させることによって、これと接触する抗体製剤を汚染する可能性があることである。治療用の抗体製剤の微量のプロテインAまたはプロテインAのフラグメントによる汚染は極めて重大であり、プロテインAおよび/またはプロテインAのフラグメントはヒトで抗原性反応を誘発することができるだけでなくプロテインAは強力なミトゲンとしても知られているからである。
プロテインAは、抗体の一つのクラスの精製にアフィニティリガンドとして用いられてきた唯一のタンパク質ではない。プロテインGも同様にアフィニティリガンドとして用いられてきた。Bjorckら、J. Immunol., 133:969(1984)を参照されたい。プロテインGも免疫グロブリンのFcフラグメントと相互作用するのであり、(クラス1のマウスIgG抗体の単離に余り有効ではないプロテインAとは対照的に)これらの抗体の単離に特に有効である。
最近、第三のタンパク質が、抗体を精製するのに有効なアフィニティリガンドとして同定された。このタンパク質はPeptostreptococcus magnus由来のプロテインLである。プロテインLは、プロテインAおよびプロテインGとは対照的に、IgG抗体の軽鎖とその抗原結合部位を損なうことなく特異的に相互作用する。この特異性により、プロテインLはIgGクラスの抗体とだけでなく、IgAおよびIgMクラスの抗体とも複合体を形成することができる。プロテインLは、その広汎な親和性にも拘らず、プロテインAおよびGに関して前記したのと同様な制限を受ける。
プロテインA、GおよびLはいずれも、前記の制限を受けるのに加えて、クロマトグラフィ作業の間にアフィニティクロマトグラフィカラムをクリーニングするのにしばしば用いられる多数の化学的および物理的作用物(例えば、極限pH、洗剤、ケイオトロピックス(chaotropics)、高温)によって影響されやすい。従って、人によっては前記カラムに適用したクリーニングサイクルの数をできるだけ少なくすることによってそれへの分解をできるだけ少なくすることを選択している。しかしながら、この方法に一つの欠点は、カラムを定期的にクリーニングすることができないため最適の抗体の精製を行なうことができないことである。
抗抗体は、ガンマーグロブリンの精製に用いられるもう一つの型のアフィニティリガンドである。しかしながら、抗抗体は、価格が高くかつ安定性が極めて限定されているため、使用は限定されている。
前記のタンパク質を基剤とするアフィニティリガンドの他に、多数の低分子量のシュドバイオアフィニティ(すなわち、特異性の小さい)リガンドがあり、抗体精製に用いられてきた。ヒスチジン、ピリジンおよび関連化合物は、抗体精製に普通に用いられるシュドバイオアフィニティリガンドの一つの型である。例えば、Huら、「タンパク質のヒスチジン−リガンドクロマトグラフィ:結合機構の多重モード(Histidine-ligand chromatography of proteins:Multiple modes of binding mechanism)」、Journal of Chromatography, 646:31-35(1993);El-Kakら、「免疫グロブリンと固定化ヒスチジンとの相互作用:力学的および速度論的側面(Interaction of immunoglobulin G with immobilized histidine:mechanistic and kinetic aspects)」、Journal of Chromatography, 604:29-37(1992);Wuら、「固定化ヒスチジンを用いる高性能シュドバイオアフィニティクロマトグラフィによる免疫グロブリンGの分離(Separation of immunoglobulin by high-performance pseudo-bioaffinity chromatography with immobilized histidine)」、Journal of Chromatography, 584:35-41(1992);El-Kakら、「マトリックス結合ヒスチジンおよびヒスタミンを用いるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィによるマウスモノクローン性抗体の分離の研究(Study of the separation of mouse monoclonal antibodies by pseudobioaffinity chromatography using matrix-linked histidine and histamine)」、Journal of Chromatography, 570:29-41(1991)を参照されたい。これらの総ては参考として本明細書に引用されたものである。総括的には、米国特許第5,185,313号、第5,141,966号、第4,701,500号および第4,381,239号明細書を参照されたい。これらの総ては、参考として本明細書に引用されたものである。しかしながら、タンパク質の非特異的結合および低容量が、前記化合物を用いる吸着剤の主要な制限である。
親硫黄性化合物(Thiophilic compounds)は、もう一つのクラスのシュドバイオアフィニティリガンドである。親硫黄性化合物の一つの型を用いる吸着剤は、Porathら、FEBS Lett., 185:306(1985)に開示されており、この文献は参考として本明細書に引用したものである。この型の吸着剤は、ヒドロキシル−またはチオール−含有支持体を最初にジビニルスルホンと反応させた後、メルカプトエタノールと反応させることによって製造される。前記の吸着剤は、塩促進法(salt-promoted approach)を用いて免疫グロブリンに吸着する。吸着した免疫グロブリンは、塩濃度を減少させることによっておよび/またはpHを調節することによって溶出される。
抗体を吸着させることができるシュドバイオアフィニティ吸着剤のもう一つの型は、そのリガンドとしてメルカプトピリジンを用いている。Oscarssonら、「ピリジン−およびアルキル−チオエーテルを基剤としたアガロース吸着剤を用いるタンパク質クロマトグラフィ(Protein Chromatography with Pyridine-and Alkyl-Thioether-Based Agarose Adsorbents)」、Journal of Chromatography, 499:235-247(1990)を参照されたい。この文献は参考として本明細書に引用されたものである。この型の吸着剤は、例えばメルカプトピリジンと適正に活性化した固形支持体とを反応させることによって生成される。このようにして形成された吸着剤は、高い塩条件下で抗体を吸着させることができる。
親硫黄性化合物を用いる他のシュドバイオアフィニティ吸着剤は、下記の特許明細書および刊行物に記載されており、これらは総て参考として本明細書に引用されたものである。米国特許第4,897,467号明細書、公表されたPCT出願番号PCT/US89/02329号明細書、公表された欧州特許出願第168,363号明細書、Oscarssonら、「RIAおよびELISA処理法のための親硫黄性吸着剤(Thiophilic adsorbents for RIA and ELISA procedures)」、Journal of Immunological Method, 143:143-149(1991)、およびPorathら、「『親硫黄性』電子−供与体−受容体吸着剤の新規な代表例(A New King of 'Thiophilic' Electron-Donor-Acceptor Adsorbent)」、Makromol. Chem., Macromol. Symp., 17:359-371(1988)。
前記の親硫黄性吸着剤は、抗体を精製するための総体的に十分な手段を提供するが、最初の生物学的液体が血清または腹水のようなタンパク質濃度の高い溶液である場合には、所望な抗体以外の多数のタンパク質がこの吸着剤によって非特異的に結合することが問題となることがある。この非特異的結合の問題は、これらの親硫黄性吸着剤の主要な制限である。
抗体を選択的に結合することができる低分子量リガンドのもう一つの群としては、エチレングリコール、グリシンまたはメルカプトエタノールと反応したペンタフルオロピリジンおよびN−ジメチルアミノピリジンが挙げられる。Ngo、J. Chromatogr., 510:281(1990)を参照されたい。この文献は、参考として本明細書に引用されたものである。これらの材料を用いる吸着剤を用いて、高塩または低塩緩衝液中での免疫グロブリンを単離し、または低塩条件下で他の型のタンパク質を単離することができる。吸着したタンパク質は、pHを低下させることによって溶出させることができる。
更に別の低分子量のシュドバイオアフィニティリガンドは、卵黄または他の生物学的液体から抗体を選択的に結合することができるものとして同定されている。これらのリガンドは特殊な染料である。このリガンドからの結合した抗体の溶出は、特殊な代替物によって行なわれる。
低分子量のシュドバイオアフィニティリガンドを用いる前記吸着剤の総ては、それらが低価格でありかつそれらが化学的および物理的に安定である点で極めて魅力的である。しかしながら、それらの非特異的結合および/またはそれらの毒性の水準は(例えば、ヒトに投与することを目的とした治療用抗体製剤を汚染するとしても)高すぎ、またそれらの抗体に対する容量は低すぎて、プロテインA、GまたはLを特異的な抗体リガンドとして用いる吸着剤の魅力を相殺することはできない。
発明の要約
それ故、本発明の目的は、現在用いられているアフィニティおよびシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤に関する前記の制限の少なくとも幾つかを克服する新規なシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤を提供することである。以下に記載されるまたは明らかになる前記および他の目的を促進するため、免疫グロブリンを選択的に吸着するのに使用するのに適したシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤であって、第一の態様では(a)固形支持材料および(b)この固形支持材料の表面に固定されたリガンドを含んでなり、前記リガンドが式
(式中、X1、X2およびX3のそれぞれは、S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、X4はN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、X1、X2、X3およびX4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物である吸着剤を、以下において提供する。
或いは、本発明の第二の態様に従って免疫グロブリンを選択的に吸着するのに用いるのに適したシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤は、(a)固形支持材料および(b)この固形支持材料の表面に固定されたリガンドを含んでなり、前記リガンドが式
(式中、Y1はS、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、Y2、Y3およびY4のそれぞれはN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、Y1、Y2、Y3およびY4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物である。
本発明は、前記の吸着剤の製造法および前記吸着剤を用いてアフィニティ分離を行なう方法にも関する。
本発明の他の目的、特徴および利点は、一部は以下の説明において記載され、また一部はこの説明から明らかになるであろうしまたは本発明の実施によって学ぶことができる。これらの態様を当業者が本発明を実施することができるほど十分詳細に記載し、かつ他の態様を利用することができること、および本発明の範囲から離反することなく変更を行なうことができることを理解すべきである。従って、以下の詳細な説明は限定的な意味に捕らえるべきではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって最も良く定義される。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、広汎な免疫グロブリンの選択的吸着に有用な新規なシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤に関する。本発明の吸着剤は、免疫グロブリン以外のタンパク質を選択的に吸着するのに用いることもできる。
本発明の教示によれば、シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤は、(a)固形支持材料および(b)固形支持材料の表面上に固定されたリガンドであって、以下に記載の型のメルカプト五員複素環であるリガンドを含んでなる。第一の態様では、前記リガンドは、下記に化合物I
(式中、X1、X2およびX3のそれぞれは、S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2の少なくとも一方は水素ではなく、X4はN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは水素ではなく、X1、X2、X3およびX4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)によって表される構造を有する。
前記のように、R、R1およびR2は、実質的に任意の官能基であることができる。例示の目的だけのためのR、R1およびR2の例としては、置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S、シアノまたは米国特許第4,223,036号、第4,835,161号および第4,699,904号明細書に開示されている官能基のいずれかが挙げられ、これらの特許明細書は総て参考として本明細書に引用されたものである。
本明細書および請求の範囲の目的には、化合物IのCR1R2のR1およびR2の詳細は、X1、X2およびX3の2種類以上について同一または異なるものであることができる。例えば、R1およびR2は、X1に対してそれぞれHおよびメチルであることができ、X2に対してそれぞれHおよびOHであることができる。或いは、R1およびR2は、例えばX1およびX2の両方に対してそれぞれエチルおよびOHであることができる。
化合物Iの例としては、メルカプトチアゾリン(例えば、2−メルカプトチアゾリン)および2−メルカプト−5−チアゾリドンが挙げられる。
本発明の第二の態様では、前記リガンドは、下記の化合物II
(式中、Y1はS、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2の少なくとも一方は水素ではなく、Y2、Y3およびY4のそれぞれはN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは水素ではなく、Y1、Y2、Y3およびY4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)によって表される構造を有する。
化合物IIのR、R1およびR2は、実質的に任意の官能基であることができる。例示の目的だけのためのR、R1およびR2の例としては、置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S、シアノまたは米国特許第4,223,036号、第4,835,161号および第4,699,904号明細書に開示されている官能基のいずれかが挙げられ、これらの特許明細書は総て参考として本明細書に引用されたものである。
本明細書および請求の範囲の目的には、化合物IIのCRのRの詳細は、Y2、Y3およびY4の2種類以上について同一または異なるものであることができる。例えば、Rは、Y2の場合にメチルであることができ、またY3の場合にはOHであることができる。或いは、Rは、例えばY2およびY3の両方に対してエチルであることができる。
化合物IIの例としては、メルカプトイミダゾール(例えば、2−メルカプトイミダゾール)、メルカプトイミダゾリン、メルカプトチアゾール(例えば、2−メルカプトチアゾール、メルカプトトリアゾール(例えば、3−メルカプト−1,2,4−トリアゾールおよび5−メルカプト−1,2,3−トリアゾール)、メルカプトテトラゾール(例えば、5−メルカプト−1,2,3,4−テトラゾール)、メルカプトチアジアゾール(例えば、2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾール)、およびメルカプトメチルイミダゾール(例えば、N−メチル−2−メルカプトイミダゾール、ヒトに対して安全であることが知られている薬剤)が挙げられる。
本発明の吸着剤の固形支持材料は、セルロース、澱粉、デキストラン、寒天またはアガロースのような多糖類、または置換または未置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホンなどの親水性の合成ポリマーから構成されていてもよい。固形支持材料として用いられる他の好適な材料としては、シリカ、アルミナ、酸化チタン、酸化ジルコニウムおよび他のセラミック構造などの多孔性の無機材料が挙げられる。或いは、複合材料を固形支持材料として用いることができる。このような複合材料は、前記材料の2種類以上の共重合によってまたは相互浸透網状組織によって形成することができる。好適な複合材料の例としては、米国特許第5,268,097号および第5,075,371号明細書に開示されているような多糖類−合成ポリマーおよび/または多糖類−無機構造体および/または合成ポリマー−無機構造体が挙げられ、前記文献の総ては参考として本明細書に引用されるものである。
本発明の固形支持材料は、直径が約0.1mm〜1000mmの大きさの範囲のビーズまたは不規則な粒子、任意の大きさの繊維(中空またはそうでないもの)、膜、厚みが約0.1mm〜1mmの平坦な表面、直径が数μm〜数mmの孔を有するスポンジ様材料の形態を採ることができる。
好ましくは前記リガンドはリガンドのメルカプト基と固形支持体上に存在する反応性基との間に形成される共有結合によって固形支持材料上に化学的に固定されている。本発明のリガンドのメルカプト基と反応することができる反応性基としては、エポキシ基、トシレート、トレシレート、ハライドおよびビニル基が挙げられる。前記の固形支持材料の多くは前記列挙した反応性基の一つを包含しないので、固形支持材料と反応しかつ必要な反応性基を提供することができる二官能性活性剤を用いることができる。好適な活性剤の例としては、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリシンジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホンなどが挙げられる。
活性剤の濃度を変化させることによって、本発明の固定化リガンドの量を固形マトリックス1ml当たり1マイクロモル〜数百マイクロモルの割合の間で変化させることができる。典型的には、単位容積当たり少量のリガンドでは免疫グロブリンの分離容量が低く、一方単位容積当たり多量のリガンドでは免疫グロブリンの吸着容量が増加する(また、免疫グロブリン以外のタンパク質の非特異的結合を誘発することができる)。
前記の活性剤は、様々な鎖長を有する。従って、特定の活性剤を選択することによって、固形支持材料と固定化リガンドとの距離を調整することができる。立体的強制条件により、リガンドと固形マトリックスとの間のこの距離は特異性および吸着容量に関する最終生成物の吸着特性に影響を及ぼすことができる。一般的に、鎖長が大きくない場合より鎖長が大きい場合には、固形支持材料上に更に多くのリガンドを固定することができる。
本発明の吸着剤は、従来の吸着剤が典型的に調製されてきたのと同様な方法で調製することができる。更に具体的には、これは、濃度、温度、pH、媒質組成および時間の設定された条件下で前記の種類の固形支持材料を前記の種類の活性剤と反応させることによって行なうことができる。活性化したならば、次に過剰の活性剤および/または活性化副生成物を除去するのに用いられる溶媒を用いて既定の方法で十分に洗浄する。次に洗浄した活性化支持体を、濃度、pH、反応温度、反応媒質、時間および攪拌の既定条件下にて前記の種類のリガンドと接触させて、これと接触した生物学的リガンドから免疫グロブリンを選択的に吸着する吸着剤を生成する。
下記の一つの例外を除けば、本発明の吸着剤を、従来の吸着剤を用いたのと同じ方法で用いることができる。これは、吸着剤をクロマトグラフィカラムに導入した後、カラムを所定のpHの塩の適当な水性溶液で洗浄することを含んでなる。次に、単離しようとする免疫グロブリンを含む生物学的溶液を、塩(例えば、Na2SO4)と結合させ、直接カラムに載荷する。溶液中に含まれる免疫グロブリンは吸着剤によって捕捉され、一方、溶液中に含まれる免疫グロブリン以外のタンパク質および溶液の残りの部分は、流出物中に回収される。適当に洗浄して非特異的に吸着した高分子を除去した後、次に免疫グロブリンをpHを変化させることによっておよび/または塩濃度を変化させることによって脱着させる。次いで、単離した免疫グロブリンを中和する。
前記した一つの例外は、本発明のある種の吸着剤が生物学的溶液に加えてその中に含まれる抗体をリガンドに吸着させる塩を必要としないことである。この塩の必要がなくなることは、塩の添加が望ましくない場合には明らかに有利である。塩を加える必要がない(および、実際に、吸着剤を適正に機能させるために加えることができない)本発明の吸着剤は、窒素原子が五員複素環の2個以上のヘテロ原子を構成している化合物IおよびIIのリガンドを用いるものである。このようなリガンドの例としては、2−メルカプトイミダゾール、3−メルカプト−1,2,4−トリアゾール、5−メルカプト−1,2,3−トリアゾール、5−メルカプト−1,2,3,4−テトラゾール、およびN−メチル−2−メルカプト−イミダゾールが挙げられる。
本発明の吸着剤を用いて、天然の抗体、化学的に改質された抗体、生物工学処理を行なった抗体、抗体フラグメント、および酵素ならびに各種の毒素、ハプテンなどを含む抗体抱合体のような様々な種類の多種多様の抗体を単離することができる。また、本発明の吸着材を用いて、ハイブリドーマ細胞培養物上清、血漿および血漿画分、乳および乳画分、腹水、発酵ブロスなどの様々な多種多様の生物学的液体から抗体を単離することができる。
本発明の吸着剤は、プロテインA、プロテインG、プロテインLなどの抗体−特異タンパク質を用いる吸着剤に比較して、当該技術分野においてかなりの進歩を表している。これは、一部には、本発明の吸着剤が生物学的分解、特に加水分解酵素による分解に対して安定であるからである。また、本発明の吸着剤のリガンドの多くは、タンパク質を基剤とするリガンドよりかなり安い現有価格の市販化合物である。更に、本発明の吸着剤は強酸性およびアルカリ性溶液で処理することができるのであり、これはタンパク質リガンドを用いる吸着剤では不適当であるものである。更に、本発明の吸着剤は、吸着剤の分解または不活性化の危険を引き起こすことなく、洗剤、ケイオトロピック塩(chaotropic salts)などの他のクリーニング剤で処理することができる。更に、本発明の吸着剤に、その捕捉効率または特異性を改質することなく、熱処理を適用することができる。
現在使用されているシュドバイオアフィニティ吸着剤と比較すると、本発明の吸着剤は抗体に対して更に特異的でありおよび/または更に高い吸着容量を示す。
下記の実施例は単なる例示のためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例1:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプトイミダゾールの固定化
官能化したヒドロゲルを充填した細孔を有するエポキシ活性化Hyper DTMシリカオキシド/ポリスチレン複合支持体(BioSepra, Inc.、マールボロー、マサチューセッツ州から市販されており、米国特許第5,268,097号明細書に記載されている)20gを、35%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および65%の5mM2−メルカプトイミダゾールを含むエタノールの100mlに懸濁し、16時間振盪した。スラリーを焼結ガラスフィルター上で濾過し、エタノールで洗浄して、乾燥させた。改質したHyper DTM吸着剤を1Mエタノールアミン、pH10.5に再懸濁して、45℃で2.5時間振盪し、濾過した後、水で洗浄した。次に、ビーズを2M酢酸ナトリウムに再懸濁して、無水酢酸2mlを1時間掛けて振盪しながら加えた。次に、混合物を更に1時間振盪し、焼結ガラスフィルター上で濾過し、中性になるまで水で洗浄した。
次いで、前記の吸着剤上で10mM HEPES、pH7.5を用いて、クロマトグラフィ分析を行なった。ヒト血清1.5mlをHEPES緩衝液で三倍に希釈し、1.2mlのゲル容積のカラムを通過させた。溶出は、クエン酸緩衝液を用いてpHを3.5まで変化させることによって行なった。回収した溶出画分の電気泳動分析を行なったところ、免疫グロブリンは吸着したタンパク質の主要部分を構成しており、免疫グロブリンの純度は75%を上回るものと判定された。フロンタル分析(frontal analysis)による改質ゲルの動的容量は、120cm/時の流速でヒト免疫グロブリンについては、c/10(すなわち、10%漏出)では9.2mg/mlであり、c/2(すなわち、50%漏出)では14.4mg/mlであった。
実施例2:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−アミノイミダゾールの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに2−アミノイミダゾールを用いた点であった。吸着剤の動的容量はフロンタル分析を用いて評価し、120cm/時の流速でヒト免疫グロブリンについては、c/10では1.5mg/mlであり、c/2では2.5mg/mlであった。
実施例1および2の結果を比較すると、硫黄基(メルカプトイミダゾール)を窒素基(アミノイミダゾール)に代えると、吸着容量および捕捉効率は劇的に減少する。
実施例3:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプトチアゾールの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに2−メルカプトチアゾールを用いた点であった。クロマトグラフィ分析は、pH7.5で10mM HEPESおよび500mM硫酸ナトリウムを用いて行なった。ヒト血清1.5mlを4.6mlゲル容積のカラムを通過させ、クエン酸緩衝液でpHを3.5まで変化させることによって溶出を行なった。
回収した溶出画分の電気泳動分析を行なったところ、免疫グロブリンは吸着したタンパク質の主要部分を構成しており、免疫グロブリンの純度は85%を上回るものと判定された。フロンタル分析による改質ゲルの動的容量は、120cm/時の流速では、c/10では6.2mg/mlであり、c/2では7.9mg/mlであった。
実施例4:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプトチアゾリンの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに2−メルカプトチアゾリンを用いた点であった。クロマトグラフィ分析は、pH7.5で10mM HEPESおよび500mM硫酸ナトリウムを用いて行なった。ヒト血清1.5mlを4.6mlゲル容積のカラムを通過させ、クエン酸緩衝液でpHを3.5まで変化させることによって溶出を行なった。
回収した溶出画分の電気泳動分析を行なったところ、免疫グロブリンは吸着したタンパク質の主要部分を構成しており、免疫グロブリンの純度は85%を上回るものと判定された。フロンタル分析による改質ゲルの動的容量は、120cm/時の流速では、c/10では6.2mg/mlであり、c/2では7.7mg/mlであった。
実施例5:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での3−メルカプト−1,2,4−トリアゾールの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに3−メルカプト−1,2,4−トリアゾールを用いた点であった。実施例1で上記したのと同じ種類の分析を用いたところ、純粋なヒト抗体に対する改質ゲルの容量は、フロンタル分析によって、146cm/時の流速および10mM HEPES、pH7を含む吸着緩衝液では、c/10では1.5mg/mlであり、c/2では8.1mg/mlであった。
実施例6:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールを用いた点であった。実施例1で上記したのと同じ種類の分析を用いたところ、純粋なヒト抗体に対する改質ゲルの容量は、フロンタル分析によって、10mM HEPESおよび750mM硫酸ナトリウム、pH7を含む吸着緩衝液において140cm/時の流速では、c/10では9.1mg/mlであり、c/2では11.2mg/mlと決定された。
実施例7:エポキシ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプト−5−チアゾリドンの固定化
実施例1で合成したのと同様の吸着剤を調製した。唯一の差異は2−メルカプトイミダゾールの代わりに2−メルカプト−5−チアゾリドンを用いた点であった。実施例1で上記したのと同じ種類の分析を用いたところ、純粋なヒト抗体に対する改質ゲルの容量は、フロンタル分析によって、10mM HEPESおよび750mM硫酸ナトリウム、pH7を含む吸着緩衝液において140cm/時の流速では、c/10では9.1mg/mlであり、c/2では12.2mg/mlであった。
実施例8:ビニル活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプトチアゾリンの固定化
アミノ−HyperDTM(実施例1のエポキシ活性化HyperDTMをエチレンジアミンと反応させることによるアミノ化によって調製した)15gを、35%の100mMカーボネート緩衝液、pH9.5および65%のエタノールを含む混合物80mlに懸濁した。このスラリーにジビニルスルホン7mlを加え、スラリーを45℃で24時間振盪した。スラリーを濾過し、エタノールで洗浄して、乾燥した。ビーズを35%の50mlカーボネート緩衝液、pH8.6および65%の5mM 2−メルカプトチアゾリンを含むエタノールの混合物75mlに再懸濁した後、45℃で24時間振盪した。次に、スラリーを焼結ガラスフィルターで濾過紙、エタノールで洗浄して、乾燥した。次に、改質したHyperDTM支持体を1Mエタノールアミン、pH10.5を含む溶液100mlに再懸濁し、45℃で24時間振盪し、濾過して、水で洗浄した。
10mM HEPESおよび500mM硫酸ナトリウム、pH7.5を用いて、クロマトグラフィ分析を行なった。ヒト血清1.5mlを4.6mlゲル容量のカラムに通し、クエン酸緩衝液でpHを2.5まで変化させることによって、溶出を行なった。回収した溶出画分の電気泳動分析を行なったところ、免疫グロブリンは吸着したタンパク質の主要部分を構成しており、免疫グロブリンの純度は85%を上回るものと判定された。改質ゲルの動的容量をフロンタル分析によって測定したところ、120cm/時の流速では、c/10では11.8mg/mlであり、c/2では14.4mg/mlであった。
実施例9:ブロモ活性化Hyper DTM支持体上での2−メルカプトチアゾールの固定化
ブロモ活性化HyperDTM5gを、35%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および65%の2−メルカプトチアゾール600mgを含むエタノールの混合物25mlに懸濁した。スラリーを室温で20時間激しく回転させた後、焼結ガラスフィルター上で濾過し、洗浄して、乾燥した。次に、スラリーを1Mエタノールアミンの水性溶液、pH10.5に再懸濁して、室温で2時間激しく回転させた。次に、スラリーを濾過して、水で中性になるまで洗浄した後、2M酢酸ナトリウムに再懸濁した。次いで、無水酢酸1mlを、1時間掛けて加えた。次に、スラリーを更に1時間回転させた後、焼結ガラスフィルター上で濾過して、中性になるまで洗浄し、乾燥した。
次に、改質ゲルを、純粋なヒトIgGを用いて評価した。改質ゲルのフロンタル分析では、動的容量は、10mM HEPESおよび500mM Na2SO4、pH7.0を用いて160cm/時の流速では、c/10では2.2mg/mlであり、c/2では7.8mg/mlであった。
実施例10:エポキシ−Sepharose CL-6B支持体上での2−メルカプトチアゾールの固定化
エポキシ−Sepharose CL-6B支持体(エポキシ含量がゲル1ml当たり10〜12μMのエポキシ活性化アガロースビーズ、Pharmacia Biotech、ピスカタウエィ、ニュージャージー州から市販)を、35%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および65%の2−メルカプトチアゾール600mgを含むエタノールの混合物15mlに懸濁した。スラリーを20時間激しく回転させた後、ガラスフィルター上で濾過し、洗浄して、乾燥した。次に、アガロースビーズを、1Mエタノールアミンの水性溶液、pH10.5に再懸濁して、室温で2時間激しく回転させた。次に、スラリーを濾過して、水で中性になるまで洗浄した後、2M酢酸ナトリウムに再懸濁した。次いで、無水酢酸1mlを、1時間掛けて加えた。次に、スラリーを更に1時間回転させた後、焼結ガラスフィルター上で濾過して、中性になるまで洗浄し、乾燥した。
改質ゲルを、純粋なヒトIgGを用いて評価した。改質ゲルのフロンタル分析では、動的容量は、10mM HEPESおよび500mM Na2SO4、pH7.0を用いて75cm/時の流速では、c/10では5.4mg/mlであり、c/2では24.2mg/mlであった。
実施例11:Eupergit▲R▼支持体上での2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールの固定化
Eupergit▲R▼支持体(メタクリルアミド、N,N−メチレンビス(メタクリルアミド)、および活性オキシラン基を含む成分のコポリマー、Rohm Pharma、ダルムシュタット、ドイツから市販)20gを、50%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および50%のエタノールの50mlに懸濁される。この懸濁液に、2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾール5mMを含むエタノール50mlを加え、スラリーを16時間振盪する。次いで、スラリーを濾過して、50mMカーボネート緩衝液、pH8.6/エタノール(1:1)で洗浄し、真空下にて乾燥した。次に、改質支持体を実施例1に記載したエタノールアミンで飽和し、ヒト血漿からの抗体を洗浄した。その吸着容量も純粋なヒトIgGを用いてフロンタル分析によってチェックし、実施例6における吸着剤について開示されているものの±10%以内であることが予想される。
実施例12:エポキシフラクトゲル支持体(エポキシ活性化したポリメタクリレートを、50%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および50%のエタノールの50mlに懸濁した。この懸濁液に、2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールを含むエタノールを50mlこの懸濁液加え、スラリーを16時間振盪する。次に、スラリーを濾過して、50mMカーボネート緩衝液、pH8.6/エタノール(1:1)で洗浄し、真空で乾燥した。改質した支持体を、次に実施例1に記載したようにエタノールアミンで飽和させ、ヒト血漿から抗体を分離するその能力について試験した。その吸着容量も、純粋なヒトIgGを用いてフロンタル分析によってチェックし、実施例6において吸着剤について開示された値の±10%以内であることが予想された。
実施例12:エポキシ−Fractogel支持体上での2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールの固定化
エポキシ−Fractogel支持体(エポキシ活性化ポリメタクリレート支持体、E. Merck、ウェイクフィールド、RIから市販)20gを、50%の50mMカーボネート緩衝液、pH8.6および50%エタノールの50mlに懸濁する。この懸濁液に5mM2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールを含むエタノール50mlを加え、スラリーを16時間振盪する。次いで、スラリーを濾過して、50mMカーボネート緩衝液、pH8.6/エタノール(1:1)で洗浄し、真空下にて間挿しする。次に、改質した支持体を実施例1に記載した方法でエタノールアミンで飽和し、ヒト血漿から抗体を分離するその能力について試験した。その吸着容量も、純粋なヒトIgGを用いてフロンタル分析によってチェックし、実施例6において吸着剤について開示された値の±10%以内であることが予想された。
実施例13:Spherodex▲R▼支持体上の3−メルカプト−1,2,4−トリアゾールの固定化
市販のSpherodex▲R▼(BioSepra, Inc.、マールボロー、マサチューセッツから発売されているデキストラン−シリカ複合支持体)20gを、脱イオン水70mlに懸濁する。攪拌下にてエチレングリコールジグリシジルエーテル10ml、および200mgの水素化ホウ素ナトリウム200mgを含む1M水酸化ナトリウム30mlを加える。混合物を、室温で16時間振盪した後、中性になるまで脱イオン水で速やかに洗浄する。次に、エポキシ活性化Spherodex▲R▼支持体を実施例1に記載した方法で(最後のアセチル化工程なし)3−メルカプト−1,2,4−トリアゾールと反応させ、ヒト血漿から抗体を分離するその能力について試験した。その吸着容量も、純粋なヒトIgGを用いてフロンタル分析によってチェックし、実施例5において吸着剤について開示された値の±10%以内であることが予想された。
実施例14:2−メルカプトイミダゾール上でのウシ初乳からの免疫グロブリンの精製
ウシ初乳を吸着緩衝液(10mM HEPES、pH7.3)で1:1に希釈し、濾過した。吸着は5.9mlカラム上で120cm/時の流速で行なった。溶出は、200mMリン酸二水素ナトリウム、pH4.25によって行なった。電気泳動分析を行なったところ、溶出した免疫グロブリンの純度は80%を上回っていた。
本明細書に列挙した本発明の態様は単なる典型例としてのものであり、当業者であれば、本発明の精神から離反することなく多くの変更および改質を行なうことができるであろう。これらの総ての変更および改質は、添付の請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内にあることを意図するものである。
Claims (31)
- 免疫グロブリンを選択的に吸着するのに用いるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤であって、(a)固形支持材料、および(b)この固形支持材料の表面に固定されたリガンドを含んでなり、前記リガンドが式
(式中、X1、X2およびX3のそれぞれは、S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、X4はN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、X1、X2、X3およびX4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物であることを特徴とするシュドバイオクロマトグラフィ吸着剤。 - 前記リガンドがメルカプトチアゾリンである、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドが2−メルカプトチアゾリンである、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- X1、X2およびX3のいずれもS、SCH3 +またはOではない、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記の固形支持体が、セルロース、澱粉、デキストラン、寒天またはアガロース、置換または未置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレンおよびポリスルホン、シリカ、アルミナ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、多糖類−合成ポリマー、多糖類−無機構造体、および合成ポリマー−無機構造体からなる群から選択される、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記の固形支持材料が、ビーズ、不規則粒子、繊維、膜、平坦な表面、およびスポンジ様材料からなる群から選択される物理的形態を有する、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドが、このリガンドのメルカプト基と反応性の基を有する二官能性活性剤によって前記固形支持材料の表面に固定されている、請求の範囲第1項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記の二官能性活性剤が、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、およびジビニルスルホンからなる群から選択される、請求の範囲第7項に記載のジュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 免疫グロブリンを選択的に吸着するのに用いるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤であって、(a)固形支持材料、および(b)この固形支持材料の表面に固定されたリガンドを含んでなり、前記リガンドが式
(式中、Y1はS、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、Y2、Y3およびY4のそれぞれはN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ及びシアノのいずれかであり、Y1、Y2、Y3およびY4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物であることを特徴とする、シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。 - 前記のリガンドが、メルカプトイミダゾール、メルカプトイミダゾリン、メルカプトチアゾール、メルカプトトリアゾール、メルカプトテトラゾール、メルカプトチアジアゾールおよびメルカプトメチルイミダゾールからなる群から選択される、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドがN−メチル−2−メルカプトイミダゾール、2−メルカプトイミダゾール、2−メルカプトチアゾール、3−メルカプト−1,2,4−トリアゾール、5−メルカプト−1,2,3−トリアゾール、5−メルカプト−1,2,3,4−テトラゾール、2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールからなる群から選択される、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドがN−メチル−2−メルカプトイミダゾールである、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドが2−メルカプトチアゾールである、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドが2−メルカプト−1,3,4−チアジアゾールである、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- Y1がS、SCH3 +またはOではない、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記固形支持体が、セルロース、澱粉、デキストラン、寒天またはアガロース、置換または未置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレートポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレンおよびポリスルホン、シリカ、アルミナ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、多糖類−合成ポリマー、多糖類−無機構造体、および合成ポリマー−無機構造体からなる群から選択される、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記の固形支持材料が、ビーズ、不規則粒子、繊維、膜、平坦な表面、およびスポンジ様材料からなる群から選択される物理的形態を有する、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記リガンドが、このリガンドのメルカプト基と反応性の基を有する二官能性活性剤によって前記固形支持材料の表面に固定されている、請求の範囲第9項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 前記の二官能性活性剤が、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、およびジビニルスルホンからなる群から選択される、請求の範囲第18項に記載のシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤。
- 化合物の混合物から標的タンパク質をアフィニティ分離する際に標的タンパク質を結合するのに用いるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤の製造法であって、(a)固形支持材料を提供し、(b)前記固形支持材料の表面上にリガンドを固定する工程を含んでなり、前記リガンドが、式
(式中、X1、X2およびX3のそれぞれは、S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、X4はN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、X1、X2、X3およびX4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物であることを特徴とする方法。 - 前記の固定化工程が、前記リガンドのメルカプト基と反応する基を有する二官能性活性剤を用いて前記固形支持材料を活性化し、前記リガンドを前記の活性化した固形支持材料と接触させることを含んでなる、請求の範囲第20項に記載の方法。
- 前記の二官能性活性剤が、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、およびジビニルスルホンからなる群から選択される、請求の範囲第21項に記載の方法。
- 化合物の混合物から標的タンパク質をアフィニティ分離する際に標的タンパク質を結合するのに用いるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤の製造法であって、(a)固形支持材料を提供し、(b)前記固形支持材料の表面上にリガンドを固定する工程を含んでなり、前記リガンドが、式
(式中、Y1はS、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、Y2、Y3およびY4のそれぞれはN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、Y1、Y2、Y3およびY4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物であることを特徴とする方法。 - 前記の固定化工程が、前記リガンドのメルカプト基と反応する基を有する二官能性活性剤を用いて前記固形支持材料を活性化し、前記リガンドを前記の活性化した固形支持材料と接触させることを含んでなる、請求の範囲第23項に記載の方法。
- 前記の二官能性活性剤が、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、およびジビニルスルホンからなる群から選択される、請求の範囲第24項に記載の方法。
- 化合物の混合物から分離される標的タンパク質のアフィニティ分離を行なう方法であって、(a)(i)固形支持材料、および(ii)固形支持材料の表面上に固定されたリガンドであって、式
(式中、X1、X2およびX3のそれぞれは、S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、X4はN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、X1、X2、X3およびX4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物である上記リガンドを含んでなるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤を提供し、(b)標的タンパク質を含む化合物の混合物を前記シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤と接触させ、前記化合物の混合物に適量の塩を加えて標的タンパク質を前記リガンドに結合させ、(c)この混合物と前記シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤とを十分な時間接触させたままにして標的タンパク質を固定したリガンドに選択的かつ可逆的に結合させることによって、混合物から標的タンパク質を分離する工程を含んでなる、方法。 - 前記標的タンパク質が免疫グロブリンである、請求の範囲第26項に記載の方法。
- X1、X2およびX3のいずれもS、SCH3 +またはOではなく、前記の適量の塩は0である、請求の範囲第27項に記載の方法。
- 化合物の混合物から分離される標的タンパク質のアフィニティ分離を行なう方法であって、(a)(i)固形支持材料、および(ii)固形支持材料の表面上に固定されたリガンドであって、式
(式中、Y1はS、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2およびCR1R2からなる群から選択され、但しR1およびR2 は、それぞれ置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、Y2、Y3およびY4のそれぞれはN、NCH3 +、CH、およびCRからなる群から選択され、但しRは置換または未置換アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラールキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシまたはアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、O、S及びシアノのいずれかであり、Y1、Y2、Y3およびY4の少なくとも2個はCH2、CH、CRまたはCR1R2ではない)を有する化合物である上記リガンドを含んでなるシュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤を提供し、(b)標的タンパク質を含む化合物の混合物を前記シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤と接触させ、前記化合物の混合物に適量の塩を加えて標的タンパク質を前記リガンドに結合させ、(c)この混合物と前記シュドバイオアフィニティクロマトグラフィ吸着剤とを十分な時間接触させたままにして標的タンパク質を固定したリガンドに選択的かつ可逆的に結合させることによって、混合物から標的タンパク質を分離する工程を含んでなる、方法。 - 前記標的タンパク質が免疫グロブリンである、請求の範囲第31項に記載の方法。
- Y1がS、SCH3 +またはOではなく、前記の適量の塩は0である、請求の範囲第30項に記載の方法。
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