SE500574C2 - Nitrilofor adsorbent för separation och immobilisering av proteiner, sätt att framställa adsorbentet, samt dess användning för fraktionering och immobilisering av biopolymerer - Google Patents

Description

CN R kan därvid vara C = C// \ / CN Polymernätverket kan bestá av en polyhydroxipolymer såsom en I polygalaktan, exempelvis agar eller agaros, men kan också vara oorganiskt såsom hydroxipropylerad silikagel. Det kan vara i partikelform, och då företrädesvis som partiklar > l mm.

Sättet för framställningen kännetecknas av att polymernätverket först aktiveras med divinylsulfon och att nitrilgrupperna sedan införes.

Bland de geler som vi framställt är exempelvis ®-o-cnz -cnz -soz-cnzcnz-NH-cr-xz -cfficn-CN . och Nc-c c-cnz-cu -cH -cH -NH-ÉÉ 'rä 2 2 2 \\\ /// N H (è-o-cnz -cnz-so vari.(>är polymernätverket.

Den enklaste av de ligander vi hittills har studerat har strukturen -NH-(CH2)-CN.

Vid koppling av denna ligand till agaros med divinylsulfon- metoden erhålles ett adsorbent som i väsentliga avseenden påminner om våra tidigare tiofila geler. dvs. den adsorberar immunglobuliner selektivt ur humant helserum. Detta är oväntat och överraskande. Preliminära studier antyder att -S02- -gruppen är nödvändig för de karakteristiska egenskaperna liksom vid T-gelen.

Med ökande antal cyangrupper i liganden ökar också antalet proteiner som adsorberas. Detta framkommer klarast när cyan- grupperna är bundna till en kolatom som genom dubbelbindning är förbunden med en annan kolatom. Genom att ämnen med sådan struktur har halvledaregenskaper. tetracyanetylen och tetra- 3 cyandimetanbensokinon exempelvis är sedan länge kända orga- niska halvledare. Detta är därför synnerligen intressant. De elektrotekniska egenskaperna beror på förmågan att acceptera elektroner från ett lämpligt donatorsystem.

Ett antal geler med omättade nítrilofora ligander har fram- ställts och undersökts, och den mest intressanta har lígand- strukturen íícn \cH2cN cN Denna gel har helt andra egenskaper än tioaromatiska geler och selekterar helt andra proteiner ur ett serum som passerat en T-gelbädd.

De omättade, nitrilofora liganderna utgör elektronacceptorer och adsorptionen beror på en koppling mellan dessa acceptorer och elektrondonatorer på proteinernas molekylyta, EDA-adsorp- tion (glektron-donator-gcceptor).

Synteser av nitrilofora adsorbenter skall beskrivas mera de- taljerat i samband med ett antal utföringsexempel.

Exempel 1 A. Framställning av divinylsulfonaktiverade polymernätverk. 100 g agaros i partikelform. svälld i 100 ml 0.1 M natrium- karbonat. pH 12, försattes med 100 ml av samma karbonatbuffert och l0 ml divinylsulfon. Suspensionen fick stå i 15 timmar under långsam omrörning. Gelpartiklarna avskildes och tvätta- des först med destillerat vatten och sedan med 0.1 M natríum- karbonatbuffert. pH 10. och användes omedelbart för adsorbent- framställningen.

B. Den divinylsulfonaktiverade gelen enligt A uppslammades i 100 ml 0,1 M natriumkarbonatbuffert. pH 10, och suspensionen försattes med 10 g aminoacetonítril och fick stå under omrör- ning 20 timmar. Gelen avskildes på sugfilter. tvättades med __f,_ll,._l .__- | - ~ ,.

'~' - 'W .'_'. w _: _; 'J sJ I r vatten och med den buffert som senare användes vid adsorptio- nen. Gelen innehöll ca 500 umol ligand per gram torr gel- substans.

Exempel 2 Detta exempel utfördes på samma sätt som exempel 1. men i stället för agaros användes hydroxipropylerad kiselgel, och i stället för natriumkarbonatbuffert en NaHC03-buffert med pH 9.5. Vid A fick suspensionen stå i S timmar. och vid B i 10 timmar i stället för 15 resp. 20 timmar i exempel 1. Gelen innehöll 50 umol ligand per gram torr gel.

Exempel 3 Detta utfördes på samma sätt som exempel 1 men med 3-amino- krotonnitril i stället för aminoacetonitril. Gelen innehöll ca 300 umol ligand per gram torr gel.

Exempel 4 Liksom i exempel 1. men med 2-amino-1.1.3-tricyanopropen i stället för aminoacetonitril. Gelen innehöll ca 500 umol ligand per gram torr gel.

Exempel 5 Liksom i exempel 1. men med 5-amino-4-cyano-3-cyanometyl- pyrazol i stället för aminoacetonitril. Gelen innehöll ca 200 umol ligand per gram torr gel.

Exempel Q Ca 10 g porös cellulosaprodukt bestående av sammanflätade fibrer (“wettex"-dukar eller papper) aktiverades med divinyl- sulfon genom att indränkas med en lösning av 5 2 divinylsulfon i 0,1 M natriumkarbonatlösning. Efter 10 timmar upptogs cello- losadukarna och tvättades med vatten och därefter med 0,1 M NaHC03 justerat till pH 10 med NaOH. Dukarna lades ned i ett bad med 0.1 g 2-amino-1,1.3-tricyanopropen i 30 ml 0,1 M nat- ríumkarbonatlösning. pH 10. Efter 20 timmar upptogs dukarna och tvättades med vatten och därefter med den buffert som se- nare användes för adsorptionsprövningen. 5 Användning av adsorbentet tillgick så att en duk lades runt väggarna på en glasbägare. Provlösning (tarmluddsextrakt i 00.5 M KZSO4. trisbuffert. pH 7.6) hälldes i bägaren så att duken täcktes. Lösningen omrördes med en magnetisk omrö- rare under 1 timme, varvid fosfatasaktiviteten adsorberades på duken. Enzymet urtvättades med destillerat vatten. Vid ett jämförelseförsök med cellulosaduk, till vilken etanolamin kopplats i stället för 2-amino-1.1.3-tricyanopropen. adsor- berades ingen fosfatas från tarmluddsextrakt.

Fraktionering av serumprotein Utsaltningskromatografi har tillämpats på nitrilgruppsinne- hållande adsorbent. En tandemkolonn sammankopplades med fyra 10 ml bäddar i serie innehållande divinylsulfon-tvärbunden agaros (6 %) substituerad med 1) aminoacetonitril (AN). 2) 3-aminokrotonnitril (CN). 3) 2-amino-1.1,3-cyanopropen (TCP) och S-amino-4-cyano-3-cyanometylpyrazol (CPY). Tandembädden jämviktades genom tvättning med 0.05 M trisbuffert (tris- hydroximetylaminometan) innehållande 0.5 M KZSO4. 10 ml serum dialyserat mot jämviktsbufferten satsades i bädden 7tföljt av S0 ml jämviktsbuffert. Det passerande materialet upptogs i två fraktioner (El och Ez). Tandembädden togs isär och varje bädd eluerades för sig genom tvättning med trisbuffert utan KZSO4.

Fig. la och lb visar agarosgelelektrofores resp. polyakrylgel- gradient-elektroforesdiagram av fraktioner eluerade från de skilda bäddarna jämte de tvâ elutionsfraktionerna El och E2 från den sammansatta kolonnen.

Diagrammen visar att en god gruppindelning av serumproteinerna erhölls. Mest protein adsorberades till AN-gelen (15 - 20 %) och därnäst till TCP-gelen (5 - 10 2). medan 45 - 50 % passe- rade tandemkolonnen varvid huvuddelen utgjordes av serumalbu- min.

Immunprecipitation enligt Ouchterlony visade följande protein- innehåll i de olika fraktionerna: AN: IgG. IgA. a CN: IgG. IgA.

: I c | 1 c IgG IgA .C3 C4 ZM CPy: haptoglobin, ceruloplasmin. transferrin, hemopexin, ZM' ceruloplasmin. a El: albumin. ul-antitrypsin, orosomukoid. prealbumín. och E2: transferrin.

Detta visar att de nitrilofora gelerna kompletterar andra ut- saltningsadsorbenter och därför bör ingå i de geler. på vilka en proteinfraktionering byggs upp. Redan preliminära försök visar att detta är fallet, och att om immunglobulinerna av- lägsnas ur utgångsmaterialet erhålles ännu skarpare gruppfrak- tionering.

Fraktionering av tarmluddsextrakt I en tandemkolonn av samma slag som i serumproteinexemplet satsades 25 ml tarmluddsextrakt innehållande 150 mg fast material löst i 0.5 M K2S04. 0.05 M tris-HC1. pH 7,6.

Efter tvättning. isärtagning och elution från de skilda bäd- darna erhölls följande fördelning av protein (mätt genom adsorbansen vid 280 nm) och fosfatasaktívitet: adsorbans aktivitet 280 nm AN I 0.8 0.002 II 1.0 0,011 CN I 0.2 - II 0.6 0.002 TCP I 2.0 0,385 II 1.2 0,028 CPY I 1.3 1,32 II 0.4 ~ Passerat 102 0.008 Anrikningen alkaliskt fosfatas blir alltså i ett steg 30 - 40 gånger. Detta fosfatas har mycket stor användning i ELISA-test och är synnerligen kostsamt.

Jämförelse mellan nitrilofora geler, T-gel och tioaromatiska adsorbenter De nitrilofora och tíoaromatiska adsorbenterna har båda gemen- samt med T-gelen att immunglobuliner adsorberas. Den enklaste nitrilofora gelen och T-gelen är anmärkningsvärt lika vad be- träffar adsorptionsegenskaperna. Medan de tioaromatiska geler- na till sin karaktär är hydrofoba är detta icke fallet vare sig med T- eller nitrilofora geler. Geler med flera nitril- grupper samt vicínal dubbelbindning är särskilt intressanta och uppvisar en oväntad specificitet. Genom de nitrilofora gelerna inför man därför en ny separationsdimension i protein- kromatografin.

Genom att de nitrilofora gelernas ligander är elektronaccep- terande adsorberas även nukleotider. nukleinsyror och andra nukleofila ämnen. Gelerna adsorberar också aromatiska ämnen även i organiska eller hydroorganiska lösningsmedel. Nitrílo- fora geler kan därför utvecklas till universaladsorbenter för aromatiska och heteroaromatiska substanser.

Claims (8)

PATENTKRAV

1. Adsorbent bestående av en fast fas för separation och immobi- lisering av proteiner genom adsorption från en vätskefas, känne- tecknat av att det består av ett hydrofilt polymernätverk med kovalent bundna ligander med formeln -Y-x-R där R är en alifatisk substituent innehållande minst en nitril- grupp eller en substituent som utgöres av Nc - c - - cH2 - cm X är >NQ, >S eller >0, varvid Q är H(CH2)n, där n = 0, 1, 2 eller 3, och Y är -CH2 ~CH2 -S02 -CH2 -CH2 -, som förbinder R-X med polymer- nätverket.

2. Adsorbent enligt krav 1, kännetecknat av att R innehåller gruppen CN / C = C \ CN.

3. Adsorbent enligt något av föregående krav, kännetecknat av att det består av partiklar < 1 mm.

4. Adsorbent enligt något av föregående krav, kännetecknat av att polymernätverket utgöres av en polyhydroxipolymer.

5. Adsorbent enligt något av föregående krav, kännetecknat av att polyhydroxipolymeren är en polygalaktan, såsom agar eller agaros.

6. Adsorbent enligt något av föregående krav, kännetecknat av att polymernätverket utgöres av hydroxipropylerad silikagel. h (ff (Jl 9

7. Sätt att framställa ett adsorbent bestående av ett hydrofilt polymernätverk med kovalent bundna ligander med formeln -Y-x-R där R är en alifatisk substituent innehållande minst en nitril- grupp eller en substituent som utgöres av Nc - T - c - cnz - cN -LH \\¥// H X är >NQ, >S eller >0, varvid Q är H(CH2)n, där n = 0, 1, 2 eller 3, och Y är -CH2 -CH2 -S02 -CH2 -CH2 -, som förbinder R-X med polymer- nätverket, känneteeknat av att polymernätverket först aktiveras med divi- nylsulfon och att nitrilgrupperna sedan införes.

8. Användning av adsorbent bestående av ett hydrofilt polymer- nätverk med kovalent bundna ligander med formeln -Y-x-R där R är en alifatisk substituent innehållande minst en nitril- grupp eller en substituent som utgöres av Nc - c - c - CH2 - cN -i .ll \,í,/ H X är >NQ, >S eller >o, varvid Q är H(CH2)n, där n = 0, 1, 2 eller 3, och Y är -CH2 -CH2 -S02 -CH2 -CH2 -, som förbinder R-X med polymer- nätverket för fraktionering och immobilisering av biopolymerer.