JP3148895B2 - 精製方法 - Google Patents
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Description
する。より詳細には、本発明は、百日咳菌(Bordetella
pertussis)から抗原因子を高収量で、純粋かつ安定し
た形で分離・精製する方法、精製された因子およびそれ
らの混合物に関する。
る。呼吸器合併症を起こすほかに、百日咳は、特に社会
経済的に下層の子供や母親の抗百日咳抗体をもたない新
生児において、神経障害と高い死亡率をもたらす。百日
咳の原因菌はグラム陰性球杆菌のBordetella pertussis
である。この細菌は気道に侵入して、細菌が死滅したあ
とでさえも残存する中毒症状を誘発すると考えられてい
る。
ために乳幼児の免疫化を勧めているが、種々のワクチン
製剤のネガティブ効果に対して多大の懸念が生じてい
る。通常のB.pertussisワクチン製剤の毒性は、単純な
紅潮から永久的な神経障害および/または死亡にまで及
ぶ副作用を引き起こす。その結果、通常のB.pertussis
ワクチンの使用が減り、百日咳の症例数が増加した。
を含み、これは56℃、30分の処理で不活化される。この
際菌は他の減毒処理にさらされないので、加温に耐えら
れる毒性物質がワクチン中に混入し、これが副作用の発
生の一因となっている。このタイプのワクチンのもう1
つの結果は、投与に対する応答として広範囲の抗体が形
成されることである。この種のワクチンにより誘導され
た血清は、予防または治療物質として使用するための高
い特異性および高い防御能を備えておらず、また診断物
質としての価値も有していない。
つくられる。しかしながら、培養の可変性は微生物の最
終組成を変化させ、また不活化剤のグルタルアルデヒド
やホルムアルデヒドは時々貯蔵の際に活性有毒物質に転
化されやすい凝集物質の形成へ導くことがある。
れる。しかしながら、これらのワクチンは毒性株からつ
くったものよりも防御能がかなり劣ることが証明され
た。Wardlaw et al.,J.Med.Micro.Biol.,9:89−100(1
976)を参照されたい。
研究は無細胞ワクチン中で使用するためのB.pertussis
の毒性成分の研究へ向けられた。1つの重要な成分は、
百日咳の発生において主要な役割を演ずる蛋白外毒素、
すなわち百日咳毒素(pertussis toxin:PT)であり、こ
れは百日咳菌の主な防御抗原であると考えられる[A.A.
Weiss et al.,Ann.Rev.Microbiol.,40:661(1986)]。
状赤血球凝集素抗原(FHA)である。この抗原は、単独
でまたはPTとの組合わせで、いくらかの防御能をもつこ
とが分かっている。例えば、米国特許第4563303号およ
び欧州特許公開第231083号を参照されたい。
する方法はすでに発表されており、これらの方法は様々
な収量と成分純度をもたらす。例えば、米国特許第4563
303号は、セルロース硫酸、デキストラン硫酸と結合し
た多糖ゲル、または架橋多糖ゲルに吸着させ、その後FH
Aを溶離することにより、BordetellaからFHAを精製する
ことを開示している。
および日本公開特許公報59.175439Aは、2つの因子PTと
FHAのそれぞれの異なる発酵法およびFHAの生産培地に関
する。これらの文献に記載された分離・精製法は、労力
と時間のかかる抽出、沈澱、遠心、透析、その後のクロ
マトグラフ精製を必要とする。このようなプロセスは単
一因子の分離に少なくとも1週間を要し、しかも商業規
模での抗原またはワクチンの製造にとって明らかに満足
のゆくものではない。
および欧州特許公開第121249号はB.pertussisから分泌
された全赤血球凝集素画分の主要物質としてのPTとFHA
に関し、これらの物質は発酵培地中に存在する比と同じ
比でワクチン製剤において使用される。赤血球凝集素の
抽出・精製のために、発酵培地は遠心して細胞塊を除
き、次に上澄みから硫酸アンモニウムを用いて沈澱させ
た。沈澱物はショ糖密度遠心により再沈澱させ、次に分
離および透析を起った精製した。この方法で使用する技
術は大容量の操作を含み、複雑で精巧な装置、例えば外
気への長時間露出を避けるための連続遠心分離、および
骨の折れる繁雑な操作を必要とする。これはバッチごと
に変化する生成物の抗原組成をもたらす。最後に、得ら
れた抗原の純度は、残留する菌体内毒素および外気への
長時間露出によりもたらされた発熱性物質のためにまだ
不十分である。
は主にアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製
法を開示している。この方法では、発酵培地が回転楕円
形のヒドロキシアパタイトに約pH8で送られ、これによ
り大部分のFHAが吸着され、一方PTは溶出される。吸着
剤による濾過に先立って遠心を行うと、細胞や破片によ
る吸着剤のブロッキング(少ない流れ挙動、低い回収
率、遅い操作、および後続の工程にとって望ましくない
汚染を引き起こす)が避けられる。その後、PT画分を含
む溶出液は約pH6に調整し、別のヒドロキシアパライト
カラムを通過させ、これによりPTを保持させる。その
後、両因子は完全に別々の系でさらに処理される。この
方法では、両因子は、適当な緩衝液/塩溶液でヒドロキ
シアパタイトキャリヤーから溶離された後、ハプトグロ
ビン−セファロースまたはフェチュイン−セファロース
のようなアフィニティーリガンドで修飾された担体に送
られ、これにPTが選択的に結合され、一方FHAはそのま
ま溶出される。その後、精製は沈澱、および/または別
の簡単なクロマトグラフィー分画化、および/または透
析により完結される。
(1983)はPTのみに限定された類似方法を開示してい
る。この方法では、B.pertussis発酵培地の遠心により
得られた上澄みからの抽出は、pH6の上澄みにアフィゲ
ルブルー(Affi−Gil blue)樹脂を加え、約2日間の接
触時間後液相からそれを取り出し、(そのNAD様構造ゆ
えに)シバクロン色素に特異的に結合したPTを適当な緩
衝液/塩溶液で溶離し、活性画分をプールすることによ
り達成される。最初の精製では、PTを選択的に結合させ
るために、アフィニティー担体としてフェチュイン−ア
ガロースが使用される;溶離後、精製は簡単な分画クロ
マトグラフィーおよび塩析により完結される。
法は非常に労働集約的で時間のかかるゾーン遠心分離を
回避するものであるが、それらはまだ発酵培地からの細
胞および破片の分離を必要とする。Sekura et alに記載
されるような、クロマトグラフカラムに全液体を通すこ
とのない、上澄みからの吸着は実際的な簡素化にあた
る。しかしながら、この方法では、1種類のターゲット
成分が分離されるにすぎない。
al.,Anal.Biochem.,159:402−411(1986)により報告
された。PTはブルーセファロース(他のシバクロン改質
担体と同等物)とpH6.0で約12時間接触させ、吸着剤を
濾過し、それをクロマトグラフィーカラムに充填するこ
とにより培養上澄みから吸着された。溶離およびプール
後、PT画分を直ちにフェニルセファロース担体に加え
た。PTは、その疎水性ゆえに、および媒体の高いイオン
強度ゆえに、フェニルセファロース担体に結合された。
溶離は比較的低い塩濃度でpH10緩衝液/クリセロール混
合物を用いて行われた。プールした画分は希釈され、pH
5.0に酸性化され、ヒドロキシアパタイトHAPに加えら
れ、そして溶離およびプール後に残留するPT断片から分
離された。
87)は、Sekura et alの方法に基づいた色素−リガンド
クロマトグラフィーを使用することによるB.pertussis
培養物からのPTおよびFHAの抽出を開示している。培養
液のpHは6.0に調整され、ブルーセファロースゲルが加
えられた。このゲルはトリス−HCl、pH8.0緩衝液で洗浄
され、結合物質は1.0M NaCl含有緩衝液、pH8.0で溶離さ
れた。
は、分別沈澱、リン酸塩緩衝液での抽出によるB.pertus
sis培養物中のFHA抗原とLPF−HA抗原の塩析;超遠心分
離による分画化;HA画分のプール;ホルマリンによる不
活化;およびアジュバントの添加によってつくられた百
日咳成分ワクチンを開示している。
を選択的に吸着させるための担体を使用している。欧州
特許公開第140386A号は、CNBr活性化セファロース、ア
ガロース、セルロースまたはデキストランに結合しうる
アフィニティーリガンドとして変性ヒトまたは動物セル
ロプラスミンの使用を開示している。
量でしかも一定の保証された品質での利用可能性は、目
下使用しうる精製法の大規模商業使用に対して1つの重
大な欠点を残している。このタイプの担体は無菌である
はずがなく、従って常にヒトの医薬品の製造において許
容し得ない汚染(特に、ウイルスによる汚染)の危険性
を伴う。
並びにB.pertussis感染症の早期発見のための簡便な診
断手段の必要性が依然として残っている。
から高度に精製されたB.pertussis抗原因子を迅速、簡
便、安全に抽出するための改良方法を提供する。望まし
くは、抽出される因子は百日咳毒素(PT)および線状赤
血球凝集素(FHA)である。
両方を含む全発酵培地もしく無細胞培養上澄みを、両抗
原を吸着できるヒドロキシアパタイト含有吸着剤と接触
させることを伴う。この吸着剤は、培地との適当な接触
時間後、培地から分離される。その後、部分的に精製さ
れたPTおよびFHAを含む溶液はpH、イオン強度および温
度の適当な条件下で吸着剤から溶離される。
菌できる濃縮/部分精製された形で、かつ良好な収量で
これらの因子が得られる。本方法が全発酵培地に適用さ
れる場合には、菌体を除去して無細胞培養上澄みを得る
ための遠心分離の必要性が回避できる。
製を可能にする上記方法の改良を提供する。上記方法の
ほかに、本発明の抽出手順後の追加工程は1種またはそ
れ以上の抗原因子の更なる精製を可能にする。これらの
追加工程は上記の溶液を2つの連続カラムクロマトグラ
フィーにかけることを含む。クロマトグラフィーの1つ
は無極性リガンドクロマトグラフィーカラムを使用す
る。好ましくは、無極性リガンドクロマトグラフィーは
2つのクロマトグラフィーのうちの最初のものである。
これらの2つのカラムからのPTおよびFHAの部分精製混
合物の溶離は、菌体内毒素や他の蛋白様物質を本質的に
含まない形の、精製された抗原混合物をもたらす。
得られた混合物中のPTおよびFHA因子は、通常のサイズ
排除クロマトグラフィー工程の適用によって、相互汚染
なしに互いから容易に分離することができる。
好な収量で、しかも免疫原因子または前駆物質としてヒ
トへ投与するのに許容しうる品質レベルで得られる。さ
らに、この方法は工業生産規模に合わせることが容易で
ある。
大量に生産される、高度精製B.pertussis抗原因子、と
りわけPTおよびFHAを提供する。これらの因子は、個々
に使用されようと他の生物、ウイルスまたは病気に対す
るワクチンと一緒に混合物として使用されようと、B.pe
rtussisに対する安全でしかも効力がある安定した成分
ワクチンの開発を可能にする。これらの精製因子は、B.
pertussis感染症の予防、診断または治療処置に有効な
抗B.pertussis血清を生産するための基本物質を提供す
る。
の好適な実施態様においてさらに説明することにする。
1種またはそれ以上の抗原因子を抽出・精製するための
改良法を提供する。特に、本発明によって、因子PTおよ
びFHAの精製方法が提供される。また、精製されたPTお
よびFHA抗原の混合物が本発明によって提供される。
は培養物からのPTおよびFHAの抽出を提供する。本発明
方法で用いるB.pertussisの種々の菌株は知られてお
り、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの
ような商業コレクションから容易に入手できる。これら
の利用可能な菌株は、それらが目的の抗原因子PTおよび
FHAの少なくとも一方、好ましくは両方、も液体培地中
で十分量生産できる限り、本発明方法において使用可能
である。
はないが、B.pertussis phase I、B.pertussis phase I
I、B.pertussis phase I CS、B.pertussis Tohama、B.p
ertussis 185−30株、B.pertussis 18−323株、B.pertu
ssis 134株、B.pertussis 509株、B.pertussis Wellcom
e 28株、およびOffice of Biologics B.pertussis 165
株などである。本発明で使用するのに適した菌株は、大
阪の発酵研究所から寄託番号IFO−14073として入手でき
るB.pertussis phase I、Tohamaである。
当分野で知られたいろいろな方法で増殖させることがで
きる。種培養物の量および起源または保存方法に応じ
て、異なる培養工程および液体または固体培地を用いる
種々の培養法が知られている。しかしながら、大規模生
産のために通常許容しうる大きなの接種物をもたらす既
知方法はどれも本発明において使用するのに適している
だろう。
した者によって選択され、例えばGengou培地[EPA82/30
5465.5];N.Andorn et al.,Appl.Microbio.Biotechno
l.,28:356−360(1988)およびそこに引用された文献に
記載の培地;Verway培地[米国特許第4784589号];合成
培地B2[P,Van Hemert.Prog.Indust.Microbiol.,(Bul
l,M.J.,ed),vol.13,p.151,Elsevier Sci.,Amsterdam
(1977)]または記載されたその修飾培地を含むが、こ
れらに制限されない。
ために、接種物は適当な液体培地に加えられ、その後当
分野で知られた通常の発酵方法および発酵槽設計を用い
て発酵が行われる。当分野で習熟した者は、通常の発酵
槽設計、発酵培地、発酵方法および発酵パラメーターの
特定の組合わせの選択に応じて、異なる結果が得られる
ことを理解するであろう。本発明で使用するのに適した
組合わせは大規模生産で使用するのに適したものであ
る。方法、設計および培地のこのような組合わせの例は
EPA077646;EPA121249;EPA239504;Andorn et al,Sato et
al(1983),Sekura et alおよびSvoboda et al(すべ
て先に引用されており、参照によりここに挿入される)
に例示されている。EPA1211249;先に引用したAndorn et
al;およびEPA239504に記載の方法が最適である。
酵培地は目的のPTおよびFHA因子の変性および/または
分解を避けるために、無菌状態で維持される。2種の抗
原は1〜25℃の温度範囲で抽出される。本発明の好適な
実施態様では、培地を1〜10℃に冷却し、この温度に保
持する。pHは7.0以下に調整する。好ましくは、pHはリ
ン酸または酢酸を用いてpH6.0〜6.4の範囲に調整する。
場合により、防腐剤を培地に加えてもよい。例えば、チ
メロサールナトリウムが0.2g/lまでの最終濃度で培地に
加えられるか、または2−フェノキシ−エタノールが0.
3〜1%の最終濃度で培地に加えられる。所望により、
慣用防腐剤は本発明方法で用いる緩衝溶液に加えること
もできる。
は大きい粒子ペレットを除くためにフィルターを通すこ
とができる;ただし、その際環境からの汚染の危険性の
ある接触を避けるようにする。
が培地中の細胞が小さい細胞粒子よりも一層容易に沈降
するのに適した形で発酵培地に加えられる。好適な実施
態様において、本発明方法は、全培養液からのHO−apa
の分離を促進し、かつ培養液と吸着剤の接触時間を最小
限にするために、物理的手段または追加のプロセス工程
を採用する。例えば、吸着剤は多孔性または半透性担体
もしくはキャリヤーとして培地に導入される。この種の
好適な実施態様では、HO−apaは結晶形であるか、また
はもとの培地中の大部分の粒子の比重と十分に異なる比
重をHO−apa粒子に与える担体材料に結合または吸着さ
れるか、あるいはその中に封じ込められる。好適な形の
HO−apa吸着剤は、慣用手段によるHO−apa/吸着PTおよ
びFHAの液体からの分離を促進するために、1.15に等し
いか又はそれより大きい見掛け密度を有する。
剤は吸着剤の粒度測定、多孔性および機械的性質を促進
する担体に担持される。好適な担体は60μmまたはそれ
以上の粒径、および両抗原の拡散を可能にする孔径(30
0KDaまたはそれ以上の排出限界に対応する)を有する。
このような吸着剤は培地と適合する多孔性硬質構造体中
にHO−apaを封じ込めるか、またはそれに結合もしくは
吸着させることにより得られる。このような担体には、
制限するものではないが、シリカ、アルミナおよび他の
一般的な無機多孔質担体、またはアクリル樹脂、ビニル
樹脂、アガロース、セルロースまたはこれらの混合物の
ような有機樹脂もしくはバイオ−有機ゲル担体が含まれ
る。これらの担体は最後に架橋により構造化または硬化
することができる。多数の望ましい担体が市販されてい
る;例えば、HA−Utorgel[IBF、フランス]またはHA−
TSK−Gel、HA型[TOYO 500 Mfg.Co.、日本]。これらの
担体は、目的の生物学的因子に対する最大の吸着能と共
に、良好な流動性および十分な分離力を可能にする。こ
れらの担体に担持されたHO−apaの使用は、クロマトグ
ラフィーカラムへの担体の充填およびその中で担体の洗
浄、その後の目的因子の溶離を容易にする。また、本発
明で使用する場合、吸着剤は無菌であることが好適であ
る。
ットルあたりHO−apa少なくとも0.5グラムの最少量でB.
pertussis培地に加えられる。HO−apaの適量は培養液1
リットルあたりHO−apa0.5〜2.0グラムの範囲である。
させるに足る時間のあいだ培養液と接触させておく。一
般に、完全吸着に要する時間は5分から30時間までの範
囲でありうる。より好ましくは、吸着時間は6〜24時
間、通常一晩である。吸着時間のあいだ、培地は穏やか
に撹拌することが望ましい。また、撹拌やポンプ運動の
ような機械的手段を吸着時間のあいだ使用してもよく、
これは培養液と吸着剤とのより緊密な接触を可能にす
る。
器の底へ沈降させることにより、培養液から分離され
る。場合により、培養液は発酵槽から改良された吸着剤
分離能を有する別のタンクまたは容器へ移してもよい。
例えば、円錐形の底をもつ容器は吸着剤の沈降後の分離
を容易にする。また、大部分の目的因子がHO−apaに吸
着された後で、吸着剤からの培養液のデカントを可能に
する容器が使用されてもよい。吸着剤の選択的保持は濾
過、流動化または遠心分離のような技術により促進され
る。
強度の緩衝溶液により十分に洗浄される。緩衝液は5〜
8のpHをもつことが望ましい。この洗浄工程は約1〜15
℃の温度で実施され、大部分の残留細胞ともとの発酵培
地の不要の残留成分を除去する。好ましくは、洗浄工程
はpHが約5.5〜7の範囲で、イオン強度が150より小さい
緩衝液を用いる。特に望ましい洗浄温度は約4〜8℃で
ある。
れ、当分野でよく知られた、いずれの緩衝系であっても
よい。この方法に有用な慣用緩衝系に対する制限は、単
に、所定の緩衝液が望ましいpHおよびイオン強度で作用
し、かつ目的の抗原因子、HO−apaまたはその担体材料
とネガティブに相互作用しないということである。本発
明で使用される緩衝液の例には、制限するものではない
が、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス、お
よびアンモニウム緩衝液が含まれる。
た抗原因子が200mMより大大きいイオン強度の緩衝塩溶
液によりほぼ中性pHで担体から溶離される。望ましく
は、溶離は1〜15℃の温度範囲および約6.0〜9.0のpHで
緩衝塩溶液を用いて行われる。約4〜8℃の温度が特に
好適である。塩溶液は当分野で通常使用されて当業者に
よく知られたいずれの塩を含んでいてもよい。塩の例に
は、制限するものではないが、塩化物または硫酸塩の可
溶性形態のNa、Ca、K、Mg、アンモニウム塩が含まれ
る。
よびpHにつきただ2つの希釈率をもつリン酸塩緩衝液が
洗浄および溶離工程で、並びに本発明の精製・分離方法
における追加工程で適用しうる標準セットとして使用さ
れる。この単純な緩衝液を使用することにより調製およ
び操作が簡単になり、抗原因子の不安定化および汚染の
危険性が相当に低減される。さらに、リン酸塩緩衝液は
やはりリン酸基を含むHO−apaと非常によく適合する。
子が吸着されたHO−apa担体は初めに緩衝液A1(リン酸
塩10〜15mM、pH5.5〜7.0)で、次により高いイオン強度
の緩衝液A2(リン酸塩50〜300mM、pH5.5〜7.0)で十分
に洗浄される。その後、抗原因子はNaCl(0〜700mM)
を補給した緩衝液b2(リン酸塩100〜500mM、pH7.2〜8.
0)により一緒に溶離され、活性蛋白因子がプールされ
る。
を避けるために、最初の蛋白ピークだけがプールされ
る。溶離後のB.pertussisの残留菌体による汚染を避け
るためには、プールした画分を通常の滅菌濾過にかけ
る。
原因子の混合物をもたらす。溶液中のこれらの因子は少
なくとも30%の純度である点に特徴がある。一般に、純
度は50%を越える。この溶液中で、これらの因子はイム
ノアッセイ(精製抗原因子で免疫したヤギおよびウサギ
により生産された抗体を使用)で調べたときPTについて
は50mg/l以上そしてFHAについては200mg/l以上の特定濃
度を有する。これらのイムノアッセイに関する技術につ
いては、先に引用した、Y.Sato et al.,Infect.Immun.
を参照されたい。本発明方法により単離された因子を含
む溶液中の残留内毒素のレベルは、通常のリムルス血球
溶解物テストで測定したとき、5×106内毒素単位/mg蛋
白より少ない。これらのテストは当分野で知られてお
り、製品化されている。
知られた他の精製法から得られた抗原混合物をしのい
で、主要な利点を提供する。とりわけ、この混合物は蛋
白加水分解現象により生じたより小さい断片が混入して
いない部分精製PTおよびFHAを含んでいる。
は残留蛋白、脂質および他の汚染物からさらに精製する
ことができる。本発明の追加の精製工程は2つのクロマ
トグラフィー工程を含む。これらの工程は溶液から2種
類の因子を分離することなく行うことができる。
順に行われるが、本発明の好適な実施態様は以下で説明
する。この好適な実施態様は脱塩、透析または濃縮のよ
うな時間のかかる工程を省き、最初のクロマトグラフィ
ーの溶媒系からの残留汚染の危険性をなくすものであ
る。
ましくは、最初のもの)は上記溶液中の部分精製抗原
を、約6.0〜9.0の範囲の中性または弱アルカリ性pHおよ
び高イオン強度(好ましくは、0.2〜1.5M)で、通常の
担体に添加することを含む。
ものではないが、セルロース、アガロース、デキストラ
ン、アクリル樹脂および他のポリ炭水化物、並びにそれ
らの架橋された又は他の方法で改質された誘導体もしく
は多孔性樹脂、または無機担体が含まれ、これらの担体
に無極性リガンドが担体に疎水性を与えるに足る量で結
合される。無極性リガンドは担体との結合に関与するよ
うな極性または反応性基を含まない、芳香族または直鎖
状、分枝鎖状もしくは環状脂肪族化合物でありうる。選
ばれた無極性基の種類、並びに担体の置換体積および置
換度は、目的抗原を吸着するそれぞれの最終担体の能力
を決定するパラメーターであることが、当分野で習熟し
た者には明らかであるだろう。
用いる担体は、置換または無置換フェニル、アルキルフ
ェニル、もしくは炭素原子数2〜26の直鎖状脂肪族基と
して無極性リガンドが結合された通常の高分子マトリッ
クスである。この目的にかなう担体が数種類市販されて
いる;例えば、ブチル−TSKまたはオクチル−TSK(Merc
k社)、フェニルセファロースまたはブチルセファロー
ス(Pharmacia Fine Chemicals社)。
用いる担体はより大きい剛性または架橋結合によって特
徴づけるられもの、例えば良好な流動性により迅速な精
製を可能にするTSK、から選ばれる。最適な実施態様で
は、担体上にブチルまたはオクチルのような脂肪族リガ
ンドの存在するものが最も効率のよい抗原因子の結合お
よび精製を可能にする。
の抗原を同時にそして完全に結合する能力によって特徴
づけられる。高イオン強度(例.0.2M以上)の条件下
で、抗原はより無極性の形態で存在すると思われる。
される緩衝系は、それらが希望のpH範囲とイオン強度を
有しかつ目的抗原因子とも吸着剤ともネガティブに相互
作用しない限り、生物学的因子の処理に常用されるいず
れの緩衝系であってもよい。このような用途に適する緩
衝液の例には、制限するものではないが、リン酸塩、酢
酸塩、炭酸塩、トリスエタノールアミノメタンおよびア
ンモニウム緩衝系が含まれる。低イオン強度の場合に
は、緩衝塩の濃度が低く保たれる;高イオン強度の場合
には、緩衝塩の濃度が高いか、または、好ましくは追加
の非緩衝塩がその系に添加される。これらの塩は当分野
で通常使用されて当業者によく知られたいずれの塩であ
ってもよく、例えば塩化物または硫酸塩の可溶性形態の
Na、Ca、K、Mg、アンモニウム塩が含まれる。本発明の
最適な実施態様では、先に述べたように、また実施例2
に記載するように、ただ2つのpHレベルとpHにつきただ
2つの希釈率をもつリン酸塩緩衝液が標準セットとして
使用される。
内毒素と残留する少量の不純物を除くために、中性ない
し弱アルカリ性(pH7.0〜9.0)の緩衝塩溶液で洗浄され
る。好ましくは、緩衝塩溶液B2を使って担体を洗浄す
る。
し中イオン強度(例.10mM〜300mM)の酸性緩衝液(pH範
囲5.0〜7.0)を使用することにより一緒に溶離される。
好ましくは、界面活性剤を補給した緩衝液A2を使って2
種の抗原を溶離する。界面活性剤は水溶性の非イオン界
面活性剤でありうる。好適な実施態様において、非イオ
ン界面活性剤はエトキシル化脂肪酸アルコール、例えば
ツイーン系(ICI社、英国)、トリトンX系(Rohm and
Haas社、米国)、ベロール(Berol)系(Berol社、デン
マーク)、またはマーリパル(Marlipal)系(Huls社、
ドイツ)であり、緩衝液に約0.5〜25%の量で加えられ
る。最適な界面活性剤はベロール185(Berol社)とマー
リパル24/80(Huls社)であり、これらは0.5〜5.0%程
度に少ない量の界面活性剤による迅速溶離を可能にす
る。この溶離工程後、抗原を含む画分がプールされる。
工程からのプールした抗原溶液、または好ましくは、第
一のクロマトグラフィー工程からのプールした抗原画分
を、弱酸性pH(pH5.0〜7.0)および低イオン強度(10〜
200mM)で両抗原を保持しうる第二のキャリヤーに装填
することを含む。この工程は前工程からの界面活性剤の
除去を可能にする。
はヒドロキシアパタイトキャリヤーである。この用途に
適するキャリヤーの例には、純粋なヒドロキシアパタイ
ト、または他のキャリヤー材料(例えば、生物学・生化
学分野で通常使用されるシバクロン−ブルー改質ゲル担
体)に担持された又は封じ込められたヒドロキシアパタ
イトが含まれる。弱酸性ないし中性のpH(pH5.0〜7.0)
および低イオン強度(10〜200mM)で両方の目的抗原因
子を吸着できる上記のような他のキャリヤーもこの方法
において有用である。好適な担体はpH5.0〜7.0および低
イオン強度で接触させたとき両抗原を保持する、良好な
流動性と機械抵抗をもつ市販の吸着剤である。この種の
キャリヤーの例は、制限するものではないが、HAウルト
ロゲル(IBF社、フランス)、トリスアクリル−フルー
(IBF社、フランス)、ブルーセファロースゲル(Pharm
acia社、スウェーデン)、アフィゲルブルー(BioRad
社、米国)などである。この精製工程には、トリスアク
リル−ブルーが最も適した吸着剤である。
洗浄され、200mMより大きい高イオン強度の中性ないし
弱アルカリ性緩衝溶液(pH6.0〜9.0)で一緒に溶離され
る。好ましくは、洗浄のために緩衝溶液A2が用いられ、
抗原の溶離のために緩衝塩溶液B2が用いられる。別法と
して、2種の抗原はリン酸塩緩衝液中のNaClの線勾配を
使って溶離される。活性画分は特異的イムノアッセイ
[先に引用したSoto et alを参照]により同定され、プ
ールされる。
2種類の高度精製抗原の混合物として得られる。一般に
は、百日咳毒素を構成する5つの蛋白サブユニットと22
0KDaのFHAがSDS−ゲル電気泳動により検出される。FHA
は他の精製法ではしばしば220kd物質の分解産物に相当
するより小さい蛋白種の混合物として得られる。例え
ば、T.L.Cowell et al.,“Bacterial Vaccines",Vol I
V:371−379,Robbins,Hill,Sadoff eds.,Thienne−Strat
ton,New York(1982)を参照されたい。従って、本発明
の更なる利点は他の分解産物からの完全FHA種の精製で
ある。リムルス血球溶解物テストで測定した精製抗原の
内毒素含量は10内毒素単位/mg蛋白より少ない。
デヒド、過酸化水素、テトラニトロメタン、または他の
不活化剤を使う無毒化反応に供される。また、この混合
物はワクチン分野で通常使用される技術を使ってワクチ
ン製造用の精製抗原原液として用いられる。例えば、混
合物は滅菌濾過、無毒化、濃度の調整、およびワクチン
を投与する際に常用されるアジュバント(例.水酸化ア
ルミニウム、リン酸アルミニウムまたはカルシウム)の
添加からなる定法に付される。また、この原液は同一ま
たは異なる病気に対する他の抗原もしくはトキソイドと
組み合わせたワクチンのために使用される。
類のB.pertussis抗原の比と異なる比が望まれる場合、
またはワクチンや診断剤として1種類のみの抗原を使用
することが望まれる場合、2種類の因子はそれらの分子
量に基づいて交差汚染なしに互いから簡単に分離でき
る。混合物中のPTとFHAを分離するために慣用技術に
は、当分野で習熟した者によく知られた、ゲル担体上で
の排除クロマトグラフィーが含まれる。この種の排除ク
ロマトグラフィーゲルは一般に製品化されている(例.
セファクリルゲル;Pharmacia社)。例えば、2つの純粋
因子の分離が望まれる場合は、最終抗原プールを蛋白濃
度の調整後セファクリルS200−HRゲルに加え、続いて溶
媒系B1(300〜700mM NaClを含むリン酸塩緩衝液10〜10
0mM、pH5.5〜8.5)を使ってこのゲルから抗原を溶離す
る。
と対照的に多くの利点により特徴づけられる。例えば、
これらの2種の抗原のいずれか一方を精製する従来方法
と相違して、本発明方法は意外にも、遠心により細胞や
破片を前以て除去することなく、1回の吸着工程でB.pe
rtussis培養物からのPTとFHAの両抗原の選択的抽出を可
能にする。これにより、本発明方法では従来方法におい
てしばしば用いられら入手困難な特異的ヒトまたは動物
アフィニティーリガンド修飾担体の使用が避けられる。
ないので簡便かつ迅速に実施される。さらに、本発明方
法は、所望により完全無菌条件下で、迅速に行われると
いう点で最終抗原因子の品質および純度に貢献する。大
気との接触または外来生物学的物質(例.アフィニティ
ーリガンド)からの外部汚染、および熱変性または分解
からの内部汚染はこの方法によって最大限に回避でき
る。
たSvoboda et alおよびSato et alの観察に反して、こ
の方法が付着細胞による流動障害、乏しい機械抵抗、ま
たは吸着核酸によるUV監視の妨害の諸難点を排除すると
いうことは驚くべきことである。前以て培養液の遠心を
行うことなく全精製工程の第一工程としてヒドロキシア
パタイトを使用することは本方法の主な利点であると考
えられる。
ー担体を用いることである。このような合成担体は、本
方法と得られた精製抗原因子に、滅菌の改良とヒトに対
する使用安全性の利点を与える。意外にも、PTおよびFH
Aの精製に関して、あるいはその両方の吸着に関して先
に記載した数種のクロマトグラフィー担体は、本方法に
よって与えられた特定のpH範囲およびイオン強度で作用
させたとき、2つの目的因子を一緒に吸着および溶離す
る本発明方法において満足のゆくことが見いだされた。
軽減し、これにより汚染の危険性を少なくする。数多く
の利点ゆえに、本発明方法は因子PTまたはFHAを別々
に、あるいは一緒に分離・精製するのに有用である。
本発明の範囲を制限するものではない。
(参照によりここに引用される)に記載の方法および条
件に従って、修飾Stainer−Scholte培地で発酵させた。
酸で約6.2に調整した。防腐剤チメロサールナトリウム
を0.1g/lの最終濃度で培地に加えた。
え、穏やかに撹拌しながら一晩培地と接触させておい
た。担体に吸着された抗原を沈降させた後、それの培地
から分離し、リン酸塩緩衝液(pH6.2、10mM)で繰り返
し洗った。
(G90型)に充填した。その後、リン酸塩緩衝液(100m
M、pH6.2)を用いて2回目の洗浄を行い、NaCl(500m
M)を補給したリン酸塩緩衝液(pH7.6、200mM)を使っ
て、抗原因子を一緒に溶離した。
ールは第1図に示してある(280nmでUV監視)。
混合物を含む1つの溶液をもたらした。この溶液はその
後滅菌濾過に付した。
0mM)を補給したリン酸塩緩衝液(pH7.6、200mM)に溶
解し、その他の処理を行うことなく同一緩衝液で予め平
衡化したブチル−TSKキャリヤーに加えた。
レベルを約50〜1000倍までさらに減少させた。抗原は2.
2%ベロール(Berol)185界面活性剤(Berol社、デンマ
ーク)を加えたリン酸塩緩衝液(200mM、pH6.2)で同時
溶離し、活性画分をプールした。一般的な溶離プロフィ
ールは第2図に示してある(280nmでUV監視)。
ールは発熱物質を含まない水で100mM以下の濃度に希釈
し、リン酸塩緩衝液(50mM、pH6.2)で平衡化したトリ
スアクリルブルー(Trisacryl Blue)に加えた。この吸
着剤は痕跡量の界面活性剤をすべて除くために同一緩衝
液で洗った。その後、リン酸塩緩衝液(100mM、pH7.6)
中のNaClの線勾配(0〜500mM)を用いて目的抗原を一
緒に溶離し、活性画分をプールした。一般的な溶離プロ
フィールは第3図に示してある(280nmでUV監視)。
よびFHAをきわめて純粋な形で含んでいた。
合、セファクリルS200−HRによるサイズ排除クロマトグ
ラフィーがNaCl(500mM)を補給したリン酸塩緩衝液(5
0mM、pH7.6)を使って実施される。セファクリルS200−
HRゲルでの抗原の分離を容易にするために、トリスアク
リルブルーカラムのプール画分中の蛋白濃度は1.5〜3.0
mg/mlにするのが好適である。
以上で溶離した。一般的な溶離プロフィールは第4図に
示してある(280nmでUV監視)。
ためにおよび/または免疫原調製物の更なる開発のため
に、完全に別個に処理することができ、互いとあるいは
他の抗原、トキソイドまたはこのような処理以前の免疫
原因子とあらゆる比で混合することができる。
すなわちホルマリン、グルタルアルデヒド、過酸化水
素、テトラニトロメタン、または他の不活化剤により不
活化処理を受けた。場合により、それ自体で毒性をもた
ず、かつPTにより実質的に汚染されていないFHAは不活
化処理なしで使用することができる。こうして、不活化
PTおよびFHAまたは処理FHAはその後不活化剤を除くため
に処理され、希望する割合で組み合わされ、そしてアジ
ュバント、すなわち水酸化アルミニウム、リン酸アルミ
ニウムまたはリン酸カルシウムと混合される。
と関連技術の簡便性、使用する物質および装置の入手容
易性、迅速な処理(例えば、発酵終了から純粋な最終抗
原まで2日未満)、および工業生産へのスケールアップ
の容易性の諸利点により特徴づけられ、一方で発酵培地
からの不要物質もりもむしろ抗原に対する特異的選択性
により良好な収量、外部汚染に対する防御、および良好
な純度を提供する。
に含まれ、これらは当分野で習熟した者に明白であると
思われる。本発明の組成物および方法に対するこのよう
な修飾・変更は添付の特許請求の範囲に包含されると考
えられる。
られた蛋白ピークの280nmで記録した溶離プロフィール
である。 第2図は、実施例2に記載の本発明方法の2つのクロマ
トグラフィー工程の最初のものから得られた蛋白ピーク
の280nmで記録した溶離プロフィールである。 第3図は、実施例2に記載の本発明方法の2番目のクロ
マトグラフィー工程から得られた蛋白ピークの280nmで
記録した溶離プロフィールである。 第4図は、実施例3に記載のサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより分離された抗原因子PTとFHAの280nmで記録し
た溶離プロフィールである。
Claims (19)
- 【請求項1】百日咳毒素(PT)および線状赤血球凝集素
抗原(FHA)を含む百日咳菌(Bordetella pertussis)
発酵培地または無細胞培養上澄みから百日咳毒素および
線状赤血球凝集素抗原を精製する方法であって: 前記培地または上済みとヒドロキシアパタイト含有吸着
剤とを、前記毒素および抗原を吸着させるのに十分な時
間およびpHで接触させ;そして 前記毒素と前記抗原との両方は溶離されるpHで溶離剤を
用いて前記吸着剤から、前記吸着毒素および抗原を含む
第一混合物を溶離する; ことから成る上記方法。 - 【請求項2】前記吸着剤は少なくとも1.15の比重を有す
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】前記吸着剤は多孔質または半透性キャリヤ
ー上のヒドロキシアパタイトから成る、請求項1または
2記載の方法。 - 【請求項4】前記キャリヤーはシリカ;アルミナ;他の
無機多孔質担体;有機樹脂およびバイオゲル担体、例え
ばアクリル樹脂、ビニル樹脂、アガロース、セルロー
ス;およびこれらの混合物より成る群から選ばれ、場合
により架橋して構造化または硬質化される、請求項3記
載の方法。 - 【請求項5】前記吸着剤は培地1リットル当たりヒドロ
キシアパライト少なくとも0.5グラムの量で前記培地に
加えられる、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項6】前記吸着時間は5分〜30時間である、請求
項1〜5のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項7】前記PTおよびFHAが付着した前記吸着剤
を、イオン強度が20mMより小である緩衝溶液で洗浄する
ことをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項8】前記溶離工程はpHが6.0〜9.0の範囲で、イ
オン強度が200mMより大である緩衝液を用いて行う、請
求項1〜7のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項9】前記第一混合物は溶離すべき第一蛋白ピー
クに相当するプール画分から成る、請求項1〜8のいず
れか1項記載の方法。 - 【請求項10】前記第一混合物は前記毒素および抗原を
少なくとも30%の量で含む、請求項1〜9のいずれか1
項記載の方法。 - 【請求項11】前記第一混合物を2つの連続クロマトグ
ラフィーカラム(前記カラムの1つは無極性リガンドク
ロマトグラフィーカラムである)にかける工程、第二ク
ロマトグラフィーカラムから内毒素および他の蛋白様物
質を実質的に含まないPTおよびFHAを含む第二混合物を
溶離する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1
項記載の方法。 - 【請求項12】前記無極性リガンドクロマトグラフィー
カラムは、無極性リガンドが担体に疎水性を与えるに足
る量で結合された担体から成る、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】前記無極性リガンドは、リガンドと担体
間の結合と反応しうる基を含まない、芳香族または直鎖
状、分枝鎖状もしくは環状脂肪族化合物から成る、請求
項12記載の方法。 - 【請求項14】前記無極性リガンド担体は置換または非
置換フェニル、アルキルフェニル、もしくは炭素原子数
2〜26の直鎖状脂肪族基が結合された高分子マトリック
スから成る、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】前記担体はセルロース、アガロース、デ
キストラン、アクリル樹脂、ポリ炭水化物、それらの架
橋および改質誘導体、多孔質樹脂、および無機担体から
選ばれる、請求項12、13または14記載の方法。 - 【請求項16】無極性リガンドクロマトグラフィー工程
は、(a)6.0より大のpHおよび0.2Mより大のイオン強
度でカラムに装填すること;および/または(b)装填
したカラムを7.0より大のpH条件下で洗浄すること;お
よび/または(c)水溶性非イオン界面活性剤の存在下
にpHが7.0より小でイオン強度が300mMより小の酸性緩衝
液で一緒に前記カラムからPTおよびFHAを溶離すること
を含む、請求項11〜15のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項17】前記無極性リガンドクロマトグラフィー
カラムは2つのカラムのうちの第一カラムである、請求
項11〜16のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項18】前記第二クロマトグラフィー工程は、第
一カラムからの溶離混合物を7.0より小のpHおよび200mM
より小のイオン強度でPTとFHAの両方を結合しうる担体
に装填し、前記担体から6.0より大のpHおよび200mMより
大のイオン強度の条件下で内毒素および他の蛋白様物質
を実質的に含まない前記PTおよびFHAの混合物を溶離す
ることを含む、請求項11〜17のいずれか1項記載の方
法。 - 【請求項19】サイズ排除クロマトグラフィーによりPT
をFHAから分離することをさらに含む、請求項1〜18の
いずれか1項記載の方法。
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