JPS6262153B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、LPF―HAの採取精製法、さらに詳
しくは、百日ぜき菌の培養物からLPF―HA
（Leucocytosis―promoting factor
hemagglutinin）を採取するに際し、変性セルロ
プラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマ
トグラフイーを用いて、LPF―HAを高収率かつ
高純度で得る方法に関する。 産業上の利用分野 LPF―HAは、百日ぜき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力
（virulence）を欠く相菌やパラ百日ぜき菌・気
管支敗血症菌は産生しない。このLPF―HAは百
日ぜき菌毒素とも称され、多様な生理活性を有す
る蛋白質であることが知られている。その主な生
理活性としては、白血球増多活性、インシユリン
分必増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集
活性等が知られており、なかでも、そのインシユ
リン分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤
としての応用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
ぜき菌の感染および発病の防御にLPF―HAがき
わめて重要なる役割を演じていることが明らかに
され、百日ぜき菌感染防御抗原としても注目され
るようになつた〔Pittman，Ｍ；Review of
Infectious Diseases，１，401〜409（1979），お
よびSato，Ｙ；Seminars in Infectious
Diseases ，Bacterial Vaccine，380〜385
（1982）〕。 したがつて、LPF―HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日ぜ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF―
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF―HAの採取精製法で
は、百日ぜき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル濾過〔Arai，
Ｈ；Biochimica et Biophysica Acta，444，765
（1976）〕、あるいはシヨ糖濃度勾配遠心〔Sato，
Ｙ；Infect.Immun.，６，897〜704，（1972）〕な
どによつて精製する方法が採用されている。しか
しながら、このような方法では、電気泳動法によ
る純度分析で１本のバンドのLPF―HAを得るこ
とは難しく、またその収量も少ない。 高純度のLPF―HAを比較的大量に得る方法と
して、百日ぜき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF―HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ―セフアロース
（ConA―Sepharose，フアルマシア社製）による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されている〔Yajima，Ｍ；Ｊ，
Biochem，83，295〜303（1978）〕。しかしなが
ら、このコンカナバリンＡをリガンドとするアフ
イニテイクロマトグラフイーは、LPF―HAのみ
と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百日ぜき
菌の他の成分、たとえばＦ―HA（Filamentous
―Hemagglatinin）や菌体膜成分なども吸着し、
所望のLPF―HAを高純度で単離するこことが難
しく、優れたアフイニテイクロマトグラフイーと
はいえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF―HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガンドとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF―HAを精製する
方法が試みられている（Irons，Ｌ；
Biochimicaet Biophisica Acta，580，175〜185
（1979）およびCowell，ｊ；Seminars in
Infectious Diseases ，Bacterial Vaccine，
371〜379（1982）〕。このヒトハプトグロビンをリ
ガンドとして用いる場合には、新たに肝炎ウイル
ス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウイ
ルス混入の恐れがある。さらに他の未知の感染性
因子混入の懸念もなおざりにできないことであ
り、これは動物血清を用いる場合も同様である。
現在のところ肝炎ウイルス等の混入をチエツクす
る絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウイル
ス等を不活化するための手段として、60℃、10〜
15時間加熱する方法が知られている。本発明者ら
はそのような加熱処理を行うと、ハプトグロビン
のLPF―HAに対する親和性はほとんど喪失さ
れ、目的とする効果がなくなつてしまうという重
大な欠陥があることを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、そのハイドロキシアパタイトの
カラム操作に長時間を要するため、LPF―HAの
活性低下の恐れがあるほかハイドロキシアパタイ
トが高価であるために、LPF―HAを工業的にか
つ安価に採取するには問題がある。 さらに、最近になつて、百日ぜき菌菌体を機械
的に破砕して菌体成分からLPF―HAを抽出し、
硫安分画したものを出発材料として用い、これを
ハプトグロビンまたはセルロプラスミンなどのプ
ラズマシアロプロテインあるいは唾液ムチンなど
のシアロプロテイン類をリガンドとするアフイニ
テイクロマトグラフイーにてLPF―HAを採取す
る方法が提案されている（英国公開特許第
2015531号）。しかしながらこの英国特許に具体的
に記載されているリガンドはヒトハプトグロビン
だけであり、前記と同様の肝炎ウイルス対策の問
題が残る。また、セルロプラスミンについては具
体的に開示がなく、効果があるか否か不明であ
る。本発明者らの研究によれば、セルロプラスミ
ンをそのまま用いた場合には、充分な、LPF―
HAの精製効果が達せられない。 発明の目的 上記のような技術的背景をもとに、本発明者ら
は、工業的なLPF―HAの単離精製法を見出すべ
く、種々研究を重ねた結果、アフイニテイクロマ
トグラフイーにおけるリガンドとして、変性セル
ロプラスミンを用いることにより所期の目的を達
成することができ、しかも肝炎ウイルス等の対策
としての60℃、10〜15時間の熱処理によつても
LPF―HAの吸着活性を低下しないばかりか、逆
に吸着量を増大する特徴を有することを知り、本
発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、百日ぜき菌の培養物から
LPF―HAを採取するに際し、変性セルロプラス
ミンをリガンドとするアフイニテイクロマトグラ
フイーを用いることにより、百日ぜき菌LPF―
HAを１工程にて高収率かつ高純度で採取する方
法を提供するものである。本発明の他の目的は、
リガンドに起因する肝炎ウイルスその他の感染性
因子の汚染の問題のない高純度のLPF―HAを提
供することである。 発明の構成および効果 本発明の精製法は、百日ぜき菌を常法にしたが
つて培養して得られる培養物を出発材料として用
い、これを変性セルロプラスミンをリガンドとす
るアフイニテイクロマトグラフイーに付すことに
より行われ、LPF―HAの精製とともに、百日ぜ
き菌の内毒素が分別され、高純度のLPF―HAが
高収率で採取される。 出発材料として用いられる百日ぜき菌培養物と
しては、百日ぜき菌相菌（および相菌）を通
常の培地、たとえばコーエン・ウイラー倍地やス
テナー・シヨルテ培地等の液状培地にて常法によ
り静置培養またはタンク培養して得られる培養液
があり、好ましくは該培養液から遠心または濾過
によつて菌体を除去したものである。本発明方法
によれば、塩析、抽出、透析、超遠心、濃縮、平
衡化等、公知方法にみられる種々の前段精製処理
を必要とせず、この培養液をそのまま、アフイニ
テイクロマトグラフイーに供することができる。
このため工程がきわめて簡単である。 本発明で用いられる変性セルロプラスミンと
は、ヒトまたは動物由来のセルロプラスミンを
種々の方法で変性させたものであり、例えばセル
ロプラスミンを60〜85℃にて１〜24時間程度加熱
処理したもの、または、セルロプラスミンを硫化
ナトリウム、硫化アンモニウム等の硫化物、ｌ―
アスコルビン酸、Ｄ―グルコース、Ｄ―ガラクト
ース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトース、マル
トース、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒ
ド、ギ酸、シユウ酸、メルカプトエタノール、ジ
エチルジチオカルバメート等の還元剤、シアン化
ナトリウム、チオチアン酸ナトリウム等のシアン
化合物、EDTA、ニトロトリ酢酸（NTA）、トリ
エチレンテトラミンヘキサ酢酸（TTHA）等の
キレート剤等で処理して、セルロプラスミンに含
まれている銅イオン（Cu++）を還元するかまたは
銅イオンの１部または全部を遊離、除去すること
によつて得られるもの等が含まれる。 上記の変性処理は単独でもまた２種以上の組み
合わせでもよく、また変性セルロプラスミンをマ
トリツクスに固定化した後に行つてもよい。この
ような変性処理は、通常、セルロプラスミンを
0.1〜0.5w／ｖ％濃度に生理食塩液で調製したも
の１容に対し、以下の緩衝液10〜200容に透析す
るという極めて簡単な操作によつて達成できる。
すなわち、硫化ナトリウム、硫化アンモニウム、
シアン化ナトリウム等を使う場合では、それらを
0.01〜1.0M程度含むPH6.0〜8.0の0.01〜0.1Mリン
酸緩衝液を使用し、０〜60℃で１〜10時間程度透
析するとよい。 ｌ―アスコルビン酸、還元糖等を用いる場合
は、それらを0.01〜1.0M程度含む0.01〜0.1M酢
酸緩衝液（PH4.0〜6.0）に０〜15℃で24〜36時間
透析する。アセトアルデヒド、ギ酸、シユウ酸、
メルカプトエタノール、ジエチルジチオカルバメ
ート等を用いる場合は、それらを0.01〜0.1Mリ
ン酸緩衝液に０〜30℃で0.5〜３時間透析する。
チオシアン酸塩を使う場合は、それを0.1〜3.1M
含む0.01〜0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に０
〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。EDTA，NTA，
TTHAを用いる場合は、それを0.01〜1.0M程度
含む0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に
０〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。 原料のセルロプラスミンは市販のものがそのま
ま用いられる。また、人血漿をアルコール分画し
たコーンのフラクシヨンのほか、ヒトもしくは
動物の血液から分離精製して得ることができる。 上記変性セルロプラスミンを用いて百日ぜき菌
培養物をアフイニテイクロマトグラフイーに付す
には、下記のようにして行われる。 変性セルロプラスミンを臭化シアンで活性化し
たセフアロース、アガロース、セルロース、デキ
ストラン等のマトリツクスに固定化させるAxe′n
らの方法〔Axe′n；Nature.，214，1302〜1304
（1967）〕によりアフイニテイゲルを調製し、これ
をカラム法、バツチ法等のクロマトグラフイーに
したがい、百日ぜき菌培養物と接触させてその中
に含まれるLPF―HAを吸着させ、ついで適当な
緩衝液で洗浄して他の物質を除去したのち、溶出
液でLPF―HAを溶出単離する。 カラム法では、カラムにアフイニテイゲルを充
填し、出発材料の百日ぜき菌培養物を流速10ml／
cm2／hr〜500ml／cm2／hrで通液させて吸着させ
る。 バツチ法では、容器中に百日ぜき菌培養物を入
れ、これにアフイニテイゲルを直接添加し、30分
〜３時間程度、好ましくは１時間程度撹拌して吸
着させる。 アフイニテイゲルの用量はとくに制限されない
が、通常、アフイニテイゲル１mlに対し1000〜
2000μｇの蛋白質のLPF―HAを吸着することが
できる。 該LPF―HA吸着アフイニテイゲルの洗浄に
は、PH4.0〜9.0の緩衝液、比電導度10ms／cm〜
150ms／cmの緩衝液等が用いられる。例えば、
0.1〜1.0M塩化ナトリウムを含む0.01〜0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.0〜8.0）を用い、カラム法では、
カラム体積の数10倍程度の液量を流して行う。ま
たバツチ法ではゲル体積の数倍の液量で洗浄処理
が行われる。この洗浄操作により、出発材料中に
多量に含まれる百日ぜき菌内毒素が効果的に分離
除去され、この点においても、本発明方法は従来
公知の方法に比べてきわめてすぐれた特徴を有す
る。 上記洗浄処理後、リガンドに吸着したLPF―
HAを溶出するには、カオトロピツク塩類（例え
ば、−，ClO− ４，CF3COO-，SCN-，
CCl3COO-等のカオトロピツクイオンを放出する
塩類）、エチレングリコール、ジオキサン、尿
素、塩酸グアニジン、EDTA等のアフイニテイク
ロマトグラフイーにおいて一般的に用いられる溶
出液を用いて常法にしたがつて行われる。 本発明のアフイニテイクロマトグラフイーによ
れば、出発材料のPHが4.0〜10.0の範囲では安定
して90％以上の収率に達する。 本発明の方法によつて得られるLPF―HAの純
度は、表１に例示したように、電気泳動法による
分析において90％以上、条件により95％以上もの
高純度に達する。また比活性値は135〜160
（ELISA unit／mg・蛋白質）となり、従来公知
の方法では望み得ない高品質が達成される。 これに対し、ハプトグロビンをリガンドとする
ゲルや、未変性セルロプラスミンをリガンドとす
るゲルを用いて精製した場合、純度は、85％以下
であり、比活性値も120〜130（ELISA unit／
mg・蛋白質）程度までしか達せず、LPF―HAに
対する特異的吸着能は、本発明方法にもとづくゲ
ルがはるかにすぐれていることが明らかである。
このことは、製品LPF―HAのリムルステストお
よびウサギ発熱試験等の生物活性試験にも明確な
差となつてあらわれている。すなわち、ハプトグ
ロビンをリガンドとするゲルを用いて精製した
LPF―HAの場合、百日ぜき菌内毒素の除去が不
充分で約１℃の発熱が認められるが、本発明方法
の場合内毒素の除去はほぼ完全である。 さらに肝炎ウイルス、その他の感染性因子対策
のため60℃、10時間加熱処理を加えた加熱処理ハ
プトグロビンをリガンドとするゲルを用いた場
合、LPF―HAが全く吸着されず、このものは精
製手段として用いることができない。 これに対し、本発明方法においては、加熱処理
変性セルロプラスミンの場合、当該処理により
LPF―HAに対する特異的吸着能、吸着容量を大
幅に向上させると同時に、肝炎ウイルス等の対策
も併せて実施することができる。またｌ―アスコ
ルビン酸やシアン化ナトリウム等により変性処理
を行つた変性セルロプラスミンに、60℃、10〜15
時間加熱処理を加えたものをリガンドとして用い
た場合でも、加熱処理を加えない場合と同様の精
製能力がある。またあらかじめ60℃、10時間の加
熱処理を加えたセルロプラスミンに上記ｌ―アス
コルビン酸変性処理あるいはシアン化ナトリウム
変性処理等を加えたものを用いた場合も、未加熱
処理の場合と同様またはそれ以上の好成績が得ら
れる。したがつて本発明の方法は、肝炎ウイルス
等の汚染の懸念がなく、また百日ぜき菌内毒素の
除去が充分である点でも、公知のハプトグロビン
をリガンドとするゲルを用いる方法より格段にす
ぐれている。 上述のとおり、本発明により提供される変性セ
ルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーによれば、出発材料の百日ぜき
菌培養物から所望のLPF―HAを高収率、高純度
に採取することができ、その操作もきわめて簡単
で、またそのアフイニテイゲルは数10回繰り返し
て使用でき、コスト的にもすぐれており、しかも
百日ぜき菌内毒素もほとんど分離除去できる利点
を有する。したがつて、本発明方法は高純度LPF
―HAの工業的製法としてきわめてすぐれた方法
である。 本発明の方法で得られるLPF―HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほとんど完全に除去されているため、その生理
活性を利用した各種試薬、糖尿病治療薬の医薬品
の調製、さらに百日ぜきワクチンの調製に有用で
ある。 つぎに、調製例、実施例および実験例を挙げて
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこ
れらに限定されるもではない。 調製例 １ ヒトセルロプラスミンの精製 ヒト血漿をアルコール分画して得られるコーン
のフラクシヨン―１を原料とし、Morellらの方
法〔J.Biol.Chem.，244，3494（1967）〕にしたが
つてヒトセルロプラスミンを分離精製する。 すなわち、該コーンのフラクシヨン―１を
DEAE―セフアロースCL6Bによるイオン交換ク
ロマトグラフイーに付し、ついで混入している可
能性のあるハプトグロビンをヘモグロビンセフア
ロースゲルによるアフイニテイクロマトグラフイ
ーで除去したのち、硫安塩析し、0.025M酢酸緩
衝液（PH5.25）に透析して結晶ヒトセルロプラス
ミンを得る。 調製例 ２ 変性セルロプラスミンの調製 調製例１で得られた結晶セルロプラスミンを
Morellらの方法〔Science，127，588（1963）〕に
準じて処理し、各種変性セルロプラスミンを調製
する。 (1) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50ml
を、リン酸緩衝液（PH7.4、イオン強度0.2）に
0.05Mシアン化ナトリウムを含ませた緩衝液5.0
に４℃で12時間透析して、オキシダーゼ活性を
90％喪失したシアン化ナトリウム変性セルロプラ
スミンを得る。 (2) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミンの
加熱処理 (1)と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セル
ロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50mlを調製した
後、この液を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）5.0に
透析する。透析終了後、変性セルロプラスミン含
有液を60℃に加熱・昇温し、10時間同温度に保持
して加熱処理を行う。 (3) ｌ―アスコルビン酸変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50ml
を、酢酸緩衝液（PH5.2、イオン強度1.2）にｌ―
アスコルビン酸５mg／mlを加えた緩衝液5.0に
４℃で36時間透析して、オキシダーゼ活性が65.5
％となつたｌ―アスコルビン酸変性セルロプラス
ミンを得る。 (4) 加熱処理変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンを5w／ｖ％含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）100mlを、水溶液中で60℃、
15時間加熱処理する。 調製例 ３ 加熱処理セルロプラスミンのｌ―アスコルビン
酸変性処理 人血漿をアルコール分画して得られるコーンの
フラクシヨン―１を温浴上で60℃、10時間加熱
を加える。以後調製例１と同様の処理を行い、加
熱処理済みの結晶セルロプラスミンを得る。 この加熱処理済み結晶セルロプラスミンを用
い、調製例２―(3)と同様の処理を加えて、加熱処
理セルロプラスミンのｌ―アスコルビン酸変性処
理を実施する。 調製例 ４ アフイニテイゲルの調製 前記結晶セルロプラスミンおよび各種変性セル
ロプラスミンをリガンドとし、以下のようにして
CNBr―活性化セフアロース4B（フアルマシア社
製）にカツプリングさせてアフイニテイゲルを調
製する。 CNBr―活性化セフアロース4B1.5ｇを1.0mM
塩酸3.0に15分間浸漬して膨潤させたのち、ガ
ラスフイルター（G3）上で1.0mM塩酸を吸引除
去して膨潤セフアロースゲル（5.25ml）を得る。 別に、リガンド（蛋白質量150mg）を0.5M塩化
ナトリウムを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.3）75mlに溶解させ、これに上記膨潤セフア
ロースゲル52.5mlを加え、室温で穏やかに撹拌し
ながら２時間カツプリングさせる。カツプリング
終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液150ml
で４回洗浄したのち、1.0Mエタノールアミン水
溶液（PH8.0）150mlを加え、再び穏やかに撹拌し
ながら２時間反応させる。反応終了後、同様に炭
酸ナトリウム緩衝液150mlにて４回洗浄してエタ
ノールアミンを除去する。得られたゲルを、
1.0M塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
8.0）、1.50mlにて３回洗浄し、さらに1.0塩化ナト
リウムを含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.0）、150ml
にて３回洗浄する。この酢酸緩衝液およびホウ酸
緩衝液による洗浄を交互に３回繰り返して、セル
ロプラスミン―セフアロースおよび変性セルロプ
ラスミン―セフアロースアフイニテイゲルを調製
する。 実施例 １ カラム法によるLPF―HAの精製 前記調製例３で得られたアフイニテイゲル20ml
を充填したカラム（28mmφ×150mm）に、LPF―
HAを1400ELISAunit／ml含有する百日ぜき菌培
養上澄液5.0を室温にて150ml／cm2／hrの流速で
流す。つぎに、1.0M塩化ナトリウムを含むリン
酸緩衝液（PH7.0）、1500mlを同流速で通液してカ
ラムを洗浄する。 上記洗浄処理後、カラムに1.0M塩化ナトリウ
ムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に3.0Mチオ
シアン酸ナトリウムを加えた溶出液100mlを35.0
ml／cm2／hrの流速で流してLPF―HAを溶出す
る。 これらの変性セルロプラスミン、ならびに対照
として未変性セルロプラスミン、ハプトグロビン
をリガンドとするアフイニテイゲルを用いて得ら
れた各LPF―HA画分の分析結果、および各実験
成績を表―１に示す。 本発明による各変性セルロプラスミンをリガン
ドとする場合には、LPF―HAの純度も高く、比
活性値も高い。これに対し、未変性セルロプラス
ミンでは純度、比活性値ともに低く、また収率も
低い。一方公知のハプトグロビンの場合はさらに
品質が悪く、収率も悪い。さらに60℃、10時間加
熱処理ハプトグロビンをリガンドとする場合は、
全くLPF―HAが吸着されず、目的を達成するこ
とができなかつた。 なお、対照として用いたハプトグロビンをリガ
ンドとするゲルは、市販のハプトグロビンを用い
て、前記調製例４と同様としてCNBr―活性化セ
フアロース4Bとカツプリングさせて調製した。
しくは、百日ぜき菌の培養物からLPF―HA
（Leucocytosis―promoting factor
hemagglutinin）を採取するに際し、変性セルロ
プラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマ
トグラフイーを用いて、LPF―HAを高収率かつ
高純度で得る方法に関する。 産業上の利用分野 LPF―HAは、百日ぜき菌相菌および相菌
が産生する活性物質であつて、毒力
（virulence）を欠く相菌やパラ百日ぜき菌・気
管支敗血症菌は産生しない。このLPF―HAは百
日ぜき菌毒素とも称され、多様な生理活性を有す
る蛋白質であることが知られている。その主な生
理活性としては、白血球増多活性、インシユリン
分必増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球凝集
活性等が知られており、なかでも、そのインシユ
リン分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤
としての応用が注目されている。 これらの生理活性とは別に、最近になつて百日
ぜき菌の感染および発病の防御にLPF―HAがき
わめて重要なる役割を演じていることが明らかに
され、百日ぜき菌感染防御抗原としても注目され
るようになつた〔Pittman，Ｍ；Review of
Infectious Diseases，１，401〜409（1979），お
よびSato，Ｙ；Seminars in Infectious
Diseases ，Bacterial Vaccine，380〜385
（1982）〕。 したがつて、LPF―HAの生理活性を研究する
うえに、またその生理活性を利用した医薬品の製
造のために、さらには副作用のより少ない百日ぜ
きワクチンを工業的に製造するために、LPF―
HAを簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発
が望まれている。 従来技術 従来知られているLPF―HAの採取精製法で
は、百日ぜき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽
出、透析したものを出発材料とし、これをイオン
交換クロマトグラフイー、ゲル濾過〔Arai，
Ｈ；Biochimica et Biophysica Acta，444，765
（1976）〕、あるいはシヨ糖濃度勾配遠心〔Sato，
Ｙ；Infect.Immun.，６，897〜704，（1972）〕な
どによつて精製する方法が採用されている。しか
しながら、このような方法では、電気泳動法によ
る純度分析で１本のバンドのLPF―HAを得るこ
とは難しく、またその収量も少ない。 高純度のLPF―HAを比較的大量に得る方法と
して、百日ぜき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF―HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ―セフアロース
（ConA―Sepharose，フアルマシア社製）による
アフイニテイクロマトグラフイーで精製する方法
が提案されている〔Yajima，Ｍ；Ｊ，
Biochem，83，295〜303（1978）〕。しかしなが
ら、このコンカナバリンＡをリガンドとするアフ
イニテイクロマトグラフイーは、LPF―HAのみ
と親和性を有するのではなく、糖類や糖脂質、さ
らに他の糖蛋白質なども吸着するため、百日ぜき
菌の他の成分、たとえばＦ―HA（Filamentous
―Hemagglatinin）や菌体膜成分なども吸着し、
所望のLPF―HAを高純度で単離するこことが難
しく、優れたアフイニテイクロマトグラフイーと
はいえない。 最近、ヒトハプトグロビンがLPF―HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガンドとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF―HAを精製する
方法が試みられている（Irons，Ｌ；
Biochimicaet Biophisica Acta，580，175〜185
（1979）およびCowell，ｊ；Seminars in
Infectious Diseases ，Bacterial Vaccine，
371〜379（1982）〕。このヒトハプトグロビンをリ
ガンドとして用いる場合には、新たに肝炎ウイル
ス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウイ
ルス混入の恐れがある。さらに他の未知の感染性
因子混入の懸念もなおざりにできないことであ
り、これは動物血清を用いる場合も同様である。
現在のところ肝炎ウイルス等の混入をチエツクす
る絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウイル
ス等を不活化するための手段として、60℃、10〜
15時間加熱する方法が知られている。本発明者ら
はそのような加熱処理を行うと、ハプトグロビン
のLPF―HAに対する親和性はほとんど喪失さ
れ、目的とする効果がなくなつてしまうという重
大な欠陥があることを見出した。 また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用
いる精製法でも、そのハイドロキシアパタイトの
カラム操作に長時間を要するため、LPF―HAの
活性低下の恐れがあるほかハイドロキシアパタイ
トが高価であるために、LPF―HAを工業的にか
つ安価に採取するには問題がある。 さらに、最近になつて、百日ぜき菌菌体を機械
的に破砕して菌体成分からLPF―HAを抽出し、
硫安分画したものを出発材料として用い、これを
ハプトグロビンまたはセルロプラスミンなどのプ
ラズマシアロプロテインあるいは唾液ムチンなど
のシアロプロテイン類をリガンドとするアフイニ
テイクロマトグラフイーにてLPF―HAを採取す
る方法が提案されている（英国公開特許第
2015531号）。しかしながらこの英国特許に具体的
に記載されているリガンドはヒトハプトグロビン
だけであり、前記と同様の肝炎ウイルス対策の問
題が残る。また、セルロプラスミンについては具
体的に開示がなく、効果があるか否か不明であ
る。本発明者らの研究によれば、セルロプラスミ
ンをそのまま用いた場合には、充分な、LPF―
HAの精製効果が達せられない。 発明の目的 上記のような技術的背景をもとに、本発明者ら
は、工業的なLPF―HAの単離精製法を見出すべ
く、種々研究を重ねた結果、アフイニテイクロマ
トグラフイーにおけるリガンドとして、変性セル
ロプラスミンを用いることにより所期の目的を達
成することができ、しかも肝炎ウイルス等の対策
としての60℃、10〜15時間の熱処理によつても
LPF―HAの吸着活性を低下しないばかりか、逆
に吸着量を増大する特徴を有することを知り、本
発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、百日ぜき菌の培養物から
LPF―HAを採取するに際し、変性セルロプラス
ミンをリガンドとするアフイニテイクロマトグラ
フイーを用いることにより、百日ぜき菌LPF―
HAを１工程にて高収率かつ高純度で採取する方
法を提供するものである。本発明の他の目的は、
リガンドに起因する肝炎ウイルスその他の感染性
因子の汚染の問題のない高純度のLPF―HAを提
供することである。 発明の構成および効果 本発明の精製法は、百日ぜき菌を常法にしたが
つて培養して得られる培養物を出発材料として用
い、これを変性セルロプラスミンをリガンドとす
るアフイニテイクロマトグラフイーに付すことに
より行われ、LPF―HAの精製とともに、百日ぜ
き菌の内毒素が分別され、高純度のLPF―HAが
高収率で採取される。 出発材料として用いられる百日ぜき菌培養物と
しては、百日ぜき菌相菌（および相菌）を通
常の培地、たとえばコーエン・ウイラー倍地やス
テナー・シヨルテ培地等の液状培地にて常法によ
り静置培養またはタンク培養して得られる培養液
があり、好ましくは該培養液から遠心または濾過
によつて菌体を除去したものである。本発明方法
によれば、塩析、抽出、透析、超遠心、濃縮、平
衡化等、公知方法にみられる種々の前段精製処理
を必要とせず、この培養液をそのまま、アフイニ
テイクロマトグラフイーに供することができる。
このため工程がきわめて簡単である。 本発明で用いられる変性セルロプラスミンと
は、ヒトまたは動物由来のセルロプラスミンを
種々の方法で変性させたものであり、例えばセル
ロプラスミンを60〜85℃にて１〜24時間程度加熱
処理したもの、または、セルロプラスミンを硫化
ナトリウム、硫化アンモニウム等の硫化物、ｌ―
アスコルビン酸、Ｄ―グルコース、Ｄ―ガラクト
ース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトース、マル
トース、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒ
ド、ギ酸、シユウ酸、メルカプトエタノール、ジ
エチルジチオカルバメート等の還元剤、シアン化
ナトリウム、チオチアン酸ナトリウム等のシアン
化合物、EDTA、ニトロトリ酢酸（NTA）、トリ
エチレンテトラミンヘキサ酢酸（TTHA）等の
キレート剤等で処理して、セルロプラスミンに含
まれている銅イオン（Cu++）を還元するかまたは
銅イオンの１部または全部を遊離、除去すること
によつて得られるもの等が含まれる。 上記の変性処理は単独でもまた２種以上の組み
合わせでもよく、また変性セルロプラスミンをマ
トリツクスに固定化した後に行つてもよい。この
ような変性処理は、通常、セルロプラスミンを
0.1〜0.5w／ｖ％濃度に生理食塩液で調製したも
の１容に対し、以下の緩衝液10〜200容に透析す
るという極めて簡単な操作によつて達成できる。
すなわち、硫化ナトリウム、硫化アンモニウム、
シアン化ナトリウム等を使う場合では、それらを
0.01〜1.0M程度含むPH6.0〜8.0の0.01〜0.1Mリン
酸緩衝液を使用し、０〜60℃で１〜10時間程度透
析するとよい。 ｌ―アスコルビン酸、還元糖等を用いる場合
は、それらを0.01〜1.0M程度含む0.01〜0.1M酢
酸緩衝液（PH4.0〜6.0）に０〜15℃で24〜36時間
透析する。アセトアルデヒド、ギ酸、シユウ酸、
メルカプトエタノール、ジエチルジチオカルバメ
ート等を用いる場合は、それらを0.01〜0.1Mリ
ン酸緩衝液に０〜30℃で0.5〜３時間透析する。
チオシアン酸塩を使う場合は、それを0.1〜3.1M
含む0.01〜0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に０
〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。EDTA，NTA，
TTHAを用いる場合は、それを0.01〜1.0M程度
含む0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に
０〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。 原料のセルロプラスミンは市販のものがそのま
ま用いられる。また、人血漿をアルコール分画し
たコーンのフラクシヨンのほか、ヒトもしくは
動物の血液から分離精製して得ることができる。 上記変性セルロプラスミンを用いて百日ぜき菌
培養物をアフイニテイクロマトグラフイーに付す
には、下記のようにして行われる。 変性セルロプラスミンを臭化シアンで活性化し
たセフアロース、アガロース、セルロース、デキ
ストラン等のマトリツクスに固定化させるAxe′n
らの方法〔Axe′n；Nature.，214，1302〜1304
（1967）〕によりアフイニテイゲルを調製し、これ
をカラム法、バツチ法等のクロマトグラフイーに
したがい、百日ぜき菌培養物と接触させてその中
に含まれるLPF―HAを吸着させ、ついで適当な
緩衝液で洗浄して他の物質を除去したのち、溶出
液でLPF―HAを溶出単離する。 カラム法では、カラムにアフイニテイゲルを充
填し、出発材料の百日ぜき菌培養物を流速10ml／
cm2／hr〜500ml／cm2／hrで通液させて吸着させ
る。 バツチ法では、容器中に百日ぜき菌培養物を入
れ、これにアフイニテイゲルを直接添加し、30分
〜３時間程度、好ましくは１時間程度撹拌して吸
着させる。 アフイニテイゲルの用量はとくに制限されない
が、通常、アフイニテイゲル１mlに対し1000〜
2000μｇの蛋白質のLPF―HAを吸着することが
できる。 該LPF―HA吸着アフイニテイゲルの洗浄に
は、PH4.0〜9.0の緩衝液、比電導度10ms／cm〜
150ms／cmの緩衝液等が用いられる。例えば、
0.1〜1.0M塩化ナトリウムを含む0.01〜0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.0〜8.0）を用い、カラム法では、
カラム体積の数10倍程度の液量を流して行う。ま
たバツチ法ではゲル体積の数倍の液量で洗浄処理
が行われる。この洗浄操作により、出発材料中に
多量に含まれる百日ぜき菌内毒素が効果的に分離
除去され、この点においても、本発明方法は従来
公知の方法に比べてきわめてすぐれた特徴を有す
る。 上記洗浄処理後、リガンドに吸着したLPF―
HAを溶出するには、カオトロピツク塩類（例え
ば、−，ClO− ４，CF3COO-，SCN-，
CCl3COO-等のカオトロピツクイオンを放出する
塩類）、エチレングリコール、ジオキサン、尿
素、塩酸グアニジン、EDTA等のアフイニテイク
ロマトグラフイーにおいて一般的に用いられる溶
出液を用いて常法にしたがつて行われる。 本発明のアフイニテイクロマトグラフイーによ
れば、出発材料のPHが4.0〜10.0の範囲では安定
して90％以上の収率に達する。 本発明の方法によつて得られるLPF―HAの純
度は、表１に例示したように、電気泳動法による
分析において90％以上、条件により95％以上もの
高純度に達する。また比活性値は135〜160
（ELISA unit／mg・蛋白質）となり、従来公知
の方法では望み得ない高品質が達成される。 これに対し、ハプトグロビンをリガンドとする
ゲルや、未変性セルロプラスミンをリガンドとす
るゲルを用いて精製した場合、純度は、85％以下
であり、比活性値も120〜130（ELISA unit／
mg・蛋白質）程度までしか達せず、LPF―HAに
対する特異的吸着能は、本発明方法にもとづくゲ
ルがはるかにすぐれていることが明らかである。
このことは、製品LPF―HAのリムルステストお
よびウサギ発熱試験等の生物活性試験にも明確な
差となつてあらわれている。すなわち、ハプトグ
ロビンをリガンドとするゲルを用いて精製した
LPF―HAの場合、百日ぜき菌内毒素の除去が不
充分で約１℃の発熱が認められるが、本発明方法
の場合内毒素の除去はほぼ完全である。 さらに肝炎ウイルス、その他の感染性因子対策
のため60℃、10時間加熱処理を加えた加熱処理ハ
プトグロビンをリガンドとするゲルを用いた場
合、LPF―HAが全く吸着されず、このものは精
製手段として用いることができない。 これに対し、本発明方法においては、加熱処理
変性セルロプラスミンの場合、当該処理により
LPF―HAに対する特異的吸着能、吸着容量を大
幅に向上させると同時に、肝炎ウイルス等の対策
も併せて実施することができる。またｌ―アスコ
ルビン酸やシアン化ナトリウム等により変性処理
を行つた変性セルロプラスミンに、60℃、10〜15
時間加熱処理を加えたものをリガンドとして用い
た場合でも、加熱処理を加えない場合と同様の精
製能力がある。またあらかじめ60℃、10時間の加
熱処理を加えたセルロプラスミンに上記ｌ―アス
コルビン酸変性処理あるいはシアン化ナトリウム
変性処理等を加えたものを用いた場合も、未加熱
処理の場合と同様またはそれ以上の好成績が得ら
れる。したがつて本発明の方法は、肝炎ウイルス
等の汚染の懸念がなく、また百日ぜき菌内毒素の
除去が充分である点でも、公知のハプトグロビン
をリガンドとするゲルを用いる方法より格段にす
ぐれている。 上述のとおり、本発明により提供される変性セ
ルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーによれば、出発材料の百日ぜき
菌培養物から所望のLPF―HAを高収率、高純度
に採取することができ、その操作もきわめて簡単
で、またそのアフイニテイゲルは数10回繰り返し
て使用でき、コスト的にもすぐれており、しかも
百日ぜき菌内毒素もほとんど分離除去できる利点
を有する。したがつて、本発明方法は高純度LPF
―HAの工業的製法としてきわめてすぐれた方法
である。 本発明の方法で得られるLPF―HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほとんど完全に除去されているため、その生理
活性を利用した各種試薬、糖尿病治療薬の医薬品
の調製、さらに百日ぜきワクチンの調製に有用で
ある。 つぎに、調製例、実施例および実験例を挙げて
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこ
れらに限定されるもではない。 調製例 １ ヒトセルロプラスミンの精製 ヒト血漿をアルコール分画して得られるコーン
のフラクシヨン―１を原料とし、Morellらの方
法〔J.Biol.Chem.，244，3494（1967）〕にしたが
つてヒトセルロプラスミンを分離精製する。 すなわち、該コーンのフラクシヨン―１を
DEAE―セフアロースCL6Bによるイオン交換ク
ロマトグラフイーに付し、ついで混入している可
能性のあるハプトグロビンをヘモグロビンセフア
ロースゲルによるアフイニテイクロマトグラフイ
ーで除去したのち、硫安塩析し、0.025M酢酸緩
衝液（PH5.25）に透析して結晶ヒトセルロプラス
ミンを得る。 調製例 ２ 変性セルロプラスミンの調製 調製例１で得られた結晶セルロプラスミンを
Morellらの方法〔Science，127，588（1963）〕に
準じて処理し、各種変性セルロプラスミンを調製
する。 (1) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50ml
を、リン酸緩衝液（PH7.4、イオン強度0.2）に
0.05Mシアン化ナトリウムを含ませた緩衝液5.0
に４℃で12時間透析して、オキシダーゼ活性を
90％喪失したシアン化ナトリウム変性セルロプラ
スミンを得る。 (2) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミンの
加熱処理 (1)と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セル
ロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50mlを調製した
後、この液を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）5.0に
透析する。透析終了後、変性セルロプラスミン含
有液を60℃に加熱・昇温し、10時間同温度に保持
して加熱処理を行う。 (3) ｌ―アスコルビン酸変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50ml
を、酢酸緩衝液（PH5.2、イオン強度1.2）にｌ―
アスコルビン酸５mg／mlを加えた緩衝液5.0に
４℃で36時間透析して、オキシダーゼ活性が65.5
％となつたｌ―アスコルビン酸変性セルロプラス
ミンを得る。 (4) 加熱処理変性セルロプラスミン 結晶セルロプラスミンを5w／ｖ％含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）100mlを、水溶液中で60℃、
15時間加熱処理する。 調製例 ３ 加熱処理セルロプラスミンのｌ―アスコルビン
酸変性処理 人血漿をアルコール分画して得られるコーンの
フラクシヨン―１を温浴上で60℃、10時間加熱
を加える。以後調製例１と同様の処理を行い、加
熱処理済みの結晶セルロプラスミンを得る。 この加熱処理済み結晶セルロプラスミンを用
い、調製例２―(3)と同様の処理を加えて、加熱処
理セルロプラスミンのｌ―アスコルビン酸変性処
理を実施する。 調製例 ４ アフイニテイゲルの調製 前記結晶セルロプラスミンおよび各種変性セル
ロプラスミンをリガンドとし、以下のようにして
CNBr―活性化セフアロース4B（フアルマシア社
製）にカツプリングさせてアフイニテイゲルを調
製する。 CNBr―活性化セフアロース4B1.5ｇを1.0mM
塩酸3.0に15分間浸漬して膨潤させたのち、ガ
ラスフイルター（G3）上で1.0mM塩酸を吸引除
去して膨潤セフアロースゲル（5.25ml）を得る。 別に、リガンド（蛋白質量150mg）を0.5M塩化
ナトリウムを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.3）75mlに溶解させ、これに上記膨潤セフア
ロースゲル52.5mlを加え、室温で穏やかに撹拌し
ながら２時間カツプリングさせる。カツプリング
終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液150ml
で４回洗浄したのち、1.0Mエタノールアミン水
溶液（PH8.0）150mlを加え、再び穏やかに撹拌し
ながら２時間反応させる。反応終了後、同様に炭
酸ナトリウム緩衝液150mlにて４回洗浄してエタ
ノールアミンを除去する。得られたゲルを、
1.0M塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
8.0）、1.50mlにて３回洗浄し、さらに1.0塩化ナト
リウムを含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.0）、150ml
にて３回洗浄する。この酢酸緩衝液およびホウ酸
緩衝液による洗浄を交互に３回繰り返して、セル
ロプラスミン―セフアロースおよび変性セルロプ
ラスミン―セフアロースアフイニテイゲルを調製
する。 実施例 １ カラム法によるLPF―HAの精製 前記調製例３で得られたアフイニテイゲル20ml
を充填したカラム（28mmφ×150mm）に、LPF―
HAを1400ELISAunit／ml含有する百日ぜき菌培
養上澄液5.0を室温にて150ml／cm2／hrの流速で
流す。つぎに、1.0M塩化ナトリウムを含むリン
酸緩衝液（PH7.0）、1500mlを同流速で通液してカ
ラムを洗浄する。 上記洗浄処理後、カラムに1.0M塩化ナトリウ
ムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に3.0Mチオ
シアン酸ナトリウムを加えた溶出液100mlを35.0
ml／cm2／hrの流速で流してLPF―HAを溶出す
る。 これらの変性セルロプラスミン、ならびに対照
として未変性セルロプラスミン、ハプトグロビン
をリガンドとするアフイニテイゲルを用いて得ら
れた各LPF―HA画分の分析結果、および各実験
成績を表―１に示す。 本発明による各変性セルロプラスミンをリガン
ドとする場合には、LPF―HAの純度も高く、比
活性値も高い。これに対し、未変性セルロプラス
ミンでは純度、比活性値ともに低く、また収率も
低い。一方公知のハプトグロビンの場合はさらに
品質が悪く、収率も悪い。さらに60℃、10時間加
熱処理ハプトグロビンをリガンドとする場合は、
全くLPF―HAが吸着されず、目的を達成するこ
とができなかつた。 なお、対照として用いたハプトグロビンをリガ
ンドとするゲルは、市販のハプトグロビンを用い
て、前記調製例４と同様としてCNBr―活性化セ
フアロース4Bとカツプリングさせて調製した。
【表】
【表】
実施例 ２
バツチ法によるLPF―HAの精製
５広口フラスコに、LPF―HA
（1400ELISAunit／ml）を含有する百日ぜき菌培
養上清液4.0を加え、これにアフイニテイゲル
20mlを直接添加する。室温にて１時間、穏やかに
撹拌を続けてLPF―HAをアフイニテイゲルに吸
着させたのち、ガラスフイルター（G2）を用い
て培養上清液を吸引除去する。このガラスフイル
ター上のゲルを、1.0M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）、300mlで洗浄し、つ
いで1.0M塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液
（PH8.0）、300mlで洗浄する。この洗浄操作を交互
に３回繰り返す。 洗浄後、ゲルよりLPF―HAを下記のようにし
て溶出する。すなわち、該ガラスフイルターのゲ
ルに、1.0M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）に3.0Mチオシアン酸ナトリウムを添
加した溶出緩衝液50mlを注ぎ、５分間保持した後
吸引し、溶出液を回収する。溶出したLPF―HA
を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.5）に透析して、チ
オシアン酸ナトリウムを除去する。 得られたLPF―HAについて、実施例１と同様
に各分析を実施した。つぎに該LPF―HAを80
℃、30分間加熱処理したのち、リムルステストを
行つて百日ぜき菌内毒素を測定し、さらにマウス
白血球増多活性その他の生物活性をあわせて測定
した。これらの結果を表２および表３に示す。 本発明の変性セルロプラスミンをリガンドとす
るゲルを用いた場合、高純度のLPF―HAが高収
率で得られ、リムルステストの結果から百日ぜき
菌内毒素が著しく除去されていることが明らかで
ある。これに対し、対照としてのハプトグロビン
をリガンドとするゲルでは、内毒素の除去が不充
分であつた。これらのLPF―HAについてウサギ
発熱試験に供したところ、本発明の変性セルロプ
ラスミンをリガンドとするゲルによる精製LPF―
HAはいずれも陰性で、内毒素が充分に除去され
ていることを示した。
（1400ELISAunit／ml）を含有する百日ぜき菌培
養上清液4.0を加え、これにアフイニテイゲル
20mlを直接添加する。室温にて１時間、穏やかに
撹拌を続けてLPF―HAをアフイニテイゲルに吸
着させたのち、ガラスフイルター（G2）を用い
て培養上清液を吸引除去する。このガラスフイル
ター上のゲルを、1.0M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）、300mlで洗浄し、つ
いで1.0M塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液
（PH8.0）、300mlで洗浄する。この洗浄操作を交互
に３回繰り返す。 洗浄後、ゲルよりLPF―HAを下記のようにし
て溶出する。すなわち、該ガラスフイルターのゲ
ルに、1.0M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.5）に3.0Mチオシアン酸ナトリウムを添
加した溶出緩衝液50mlを注ぎ、５分間保持した後
吸引し、溶出液を回収する。溶出したLPF―HA
を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.5）に透析して、チ
オシアン酸ナトリウムを除去する。 得られたLPF―HAについて、実施例１と同様
に各分析を実施した。つぎに該LPF―HAを80
℃、30分間加熱処理したのち、リムルステストを
行つて百日ぜき菌内毒素を測定し、さらにマウス
白血球増多活性その他の生物活性をあわせて測定
した。これらの結果を表２および表３に示す。 本発明の変性セルロプラスミンをリガンドとす
るゲルを用いた場合、高純度のLPF―HAが高収
率で得られ、リムルステストの結果から百日ぜき
菌内毒素が著しく除去されていることが明らかで
ある。これに対し、対照としてのハプトグロビン
をリガンドとするゲルでは、内毒素の除去が不充
分であつた。これらのLPF―HAについてウサギ
発熱試験に供したところ、本発明の変性セルロプ
ラスミンをリガンドとするゲルによる精製LPF―
HAはいずれも陰性で、内毒素が充分に除去され
ていることを示した。
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 百日ぜき菌培養物からLPF―HA
（Leucocytosis―promoting factor
hemagglutinin）を取得するに際し、変性セルロ
プラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマ
トグラフイーを用いることを特徴とするLPF―
HAの採取精製法。 ２ 百日ぜき菌培養物が百日ぜき菌を液状培地に
培養して得られるものである前記第１項記載の方
法。 ３ 百日ぜき菌培養物をPH4.0〜10.0の範囲に調
整してアフイニテイクロマトグラフイーに付す前
記第１項記載の方法。 ４ 該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由
来のものである前記第１項記載の方法。 ５ 該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由
来のセルロプラスミンを加熱処理して得られるも
のである前記第１項記載の方法。 ６ 該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由
来のセルロプラスミンを還元剤処理、シアン化合
物処理もしくはキレート剤処理に付し、セルロプ
ラスミンに結合する銅イオンを還元もしくはその
銅イオンの一部または全部を遊離させたものであ
る前記第１項記載の方法。 ７ リガンドに吸着したLPF―HAをカオトロピ
ツク塩、エチレングリコール、ジオキサン、尿
素、塩酸グアニジンおよびEDTAから選ばれる１
種もしくは２種以上を用いて溶出する前記第１項
記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58206598A JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| US06/666,172 US4704274A (en) | 1983-11-01 | 1984-10-26 | Method for the purification of LPF-HA |
| CA000466753A CA1210720A (en) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Method for the purification of leucocytosis-promoting factor hemagglutinin (lpf-ha) |
| EP84113134A EP0140386B1 (en) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Method for the purification of lpf-ha |
| DE8484113134T DE3483344D1 (de) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Verfahren zur reinigung von lpf-ha. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58206598A JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6098988A JPS6098988A (ja) | 1985-06-01 |
| JPS6262153B2 true JPS6262153B2 (ja) | 1987-12-24 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58206598A Granted JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0140386B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6098988A (ja) |
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-
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-
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