JP2001055340A

JP2001055340A - アルブミン製剤の製造方法

Info

Publication number: JP2001055340A
Application number: JP2000221563A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Matsuoka; 靖史松岡; Shinichiro Hase; 紳一郎長谷; Kazuo Takechi; 和男武智; Shinji Tomioka; 新二富岡; Kazumasa Yokoyama; 和正横山
Original assignee: Welfide Corp
Current assignee: Welfide Corp
Priority date: 1988-10-31
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2001-02-27

Abstract

(57)【要約】【課題】凝集体含量及び夾雑蛋白質含量が低減された
血清アルブミン製剤の製造方法を提供する。【解決手段】本発明の血清アルブミン製剤の製造方法
は、アルブミン製剤の製造方法において、血清アルブミ
ン含有水溶液を、該水溶液中に含まれる凝集体形成因子
を除去する工程に付した後、加熱処理することからな
る。特に凝集体形成因子の除去を、陰イオン交換体を用
いる方法又はアフィニティクロマトグラフィー法で行う
のが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルブミン製剤の
製造方法に関する。より詳細には、凝集体含量及び夾雑
蛋白質含量が低減された血清アルブミン製剤の製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血清ア
ルブミンは血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血
液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してそ
の運搬などの機能を果たしている。上記血清アルブミン
を含有する製剤は、アルブミンの喪失及びアルブミン合
成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの
治療に用いられている。アルブミン製剤は、そこに混入
してくる懸念のあるウイルスを不活化するために、通
常、アルブミン含有水溶液の状態での加熱処理が汎用さ
れている。このような方法により製造される市販のアル
ブミン製剤は、製剤中に凝集体（通常ポリマーと称され
るので、以下、ポリマーという）が存在することが知ら
れている。この凝集体は上記の加熱処理前には殆ど存在
しないことから、加熱処理により熱に不安定な夾雑蛋白
質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられる。
市販のアルブミン製剤は安全に広く使用されていること
から、この凝集体が特に人に害を及ぼすとは考えられて
いないが、加熱変性物であることより、製剤中にできる
だけ含まれていないことが好ましい。また、アルブミン
製剤中には、夾雑蛋白質としてα₁−酸性糖蛋白質が含
まれており、該蛋白質は免疫抑制作用を有する。α₁−
酸性糖蛋白質はアルブミンと物理化学的性質の比較的よ
く似た蛋白質であり、分画法等の慣用の手段では効率的
に分離することが困難である。従って、通常のアルブミ
ン製剤中には免疫抑制作用を有するα₁−酸性糖蛋白質
が残存するおそれがあり、製剤中からできるだけ除去し
ておくことが望ましい。

【０００３】本発明は上記の課題を解決すべく創案され
たもので、本発明者らが種々検討を重ねた結果、ポリマ
ーの形成はアルブミン中に混入するポリマー形成因子
（凝集体形成因子）に起因し、該形成因子は熱に不安定
な夾雑蛋白質（主としてハプトグロビン）である知見を
得、アルブミン中のポリマー形成因子を除去することに
より、加熱処理されてもポリマー含量の少ないアルブミ
ン製剤が得られ、またα ₁−酸性糖蛋白質含量も低減で
きることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、ポリマー含量及びα₁−酸性糖蛋白質含量が低減さ
れたアルブミン製剤及びその製造方法を提供することを
目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべく
なされた本発明のアルブミン製剤の製造方法は、血清ア
ルブミン含有水溶液を該水溶液中に含まれるポリマー形
成因子を除去する工程に付した後、加熱処理することを
特徴とするものである。なお、ポリマー形成因子の除去
は、陰イオン交換体を用いる方法又はアフィニティクロ
マトグラフィー法で行なうのが好ましい。

【０００５】かくして得られた本発明のアルブミン製剤
は、アルブミン濃度を２５％として測定したときに、血
清アルブミン含量に対するポリマー含量が３重量％以下
であり、且つＭａｎｃｉｎｉ法により測定したα₁−酸
性糖蛋白質含量が検出限界以下であることを特徴とす
る。

【０００６】本発明にかかる製剤の主成分であり且つ本
発明の製造方法の出発原料であるアルブミンの由来には
特に制限がなく、具体的には哺乳動物、例えば、ヒト、
ウシ、ウサギ等に由来するものが挙げられ、特にヒト由
来のものが使用される。アルブミンを調製するための出
発原料としては、例えば、コーン氏の冷アルコール分画
によって得られた第Ｖ画分等が例示される。

【０００７】本発明のアルブミン製剤は、上記のアルブ
ミンを含有する水溶液を、該溶液中に含まれるポリマー
形成因子を除去する工程に付した後、加熱処理すること
により得られる。上記のアルブミン含有水溶液中のアル
ブミン含量としては、通常、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ、
特に明示のない限り以下同様）、好ましくは約１〜１０
％に調整される。

【０００８】上記アルブミン含有水溶液中のポリマー形
成因子の除去方法としては、ポリマー形成因子がハプト
グロビン、α₁−酸性糖蛋白質等のアルブミンより等電
点の低い蛋白質であるので、これらを除去するために用
いられる方法であればいずれも使用することができ、例
えば、陰イオン交換体を用いる方法、アフィニティクロ
マトグラフィーを用いる方法等が挙げられる。特にポリ
マー形成因子の主成分であるハプトグロビンはアルブミ
ンと物理化学的性質が比較的よく似ており分画法で効率
的に分離するのは困難なので、陰イオン交換体を用いる
方法又はアフィニティクロマトグラフィーを用いる方法
が好ましい。

【０００９】上記の方法において、陰イオン交換体を用
いる方法を採用する場合、使用される陰イオン交換体と
しては陰イオン交換基（例えば、ジエチルアミノエチル
基等）を有する不溶性担体であればいずれも使用するこ
とができ、より具体的には、この分野で慣用の陰イオン
交換体、例えば、ＤＥＡＥ−セファロース^TM、Ｑ−セフ
ァロース^TM（いずれもファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−
トヨパール^TM、ＱＡＥ−トヨパール^TM（いずれも東ソー
社製）、Ａ２００セルロファイン^TM（生化学工業社
製）、陰イオン交換樹脂等が例示され、ポリマー形成因
子の除去率の点からしてＱ−セファロース、ＱＡＥ−ト
ヨパール等の強陰イオン交換体を用いるのが好ましい。

【００１０】陰イオン交換体を用いる方法は、ハプトグ
ロビン等のポリマー形成因子を含むアルブミン含有水溶
液を陰イオン交換体と接触させることにより行われ、陰
イオン交換体の使用量はアルブミン含有水溶液中のポリ
マー形成因子含量、陰イオン交換体の交換能等により適
宜調整されるが、アルブミン１ｇ当り、陰イオン交換体
２〜５ml、通常３ml程度使用される。本方法はカラム
法、バッチ法のいずれの方法にて行なってもよいが、ポ
リマー形成因子の除去効率の面からカラム法にて行なう
のが好ましい。

【００１１】カラム法にて行なう場合、前記のアルブミ
ン含有水溶液をｐＨ４．８〜９．０程度、好ましくはｐ
Ｈ４．９〜５．５、より好ましくはｐＨ５．１、塩濃度
として0.001 〜0.2 Ｍの塩化ナトリウム程度、好ましく
は0.001 〜0.05Ｍに調整し、溶出液［例えば、0.02Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．１）］で平衡化した陰イオン交
換体カラムを通過させ、次いで溶出液で展開して非吸着
分を回収することにより行われる。上記の操作はアルブ
ミンの変性を抑制するため、低温（通常、１０℃以下）
にて行なうのが好ましい。

【００１２】また、バッチ法にて行なう場合、上記条件
に調整したアルブミン含有水溶液に、陰イオン交換体を
添加して接触させ、１０℃以下にて、３０分〜２時間程
度混和した後、遠心分離等の手段により陰イオン交換体
と分離し、上清を回収することにより行われる。

【００１３】ポリマー形成因子の除去方法としてアフィ
ニティクロマトグラフィー法を採用する場合、該方法に
使用される担体としては、ハプトグロビン等のポリマー
形成因子と特異的親和性を有する物質を固定化した不溶
性担体（以下、アフィニティ担体という）が用いられ
る。不溶性担体としてはセルロース、デキストラン等が
例示され、またハプトグロビン等のポリマー形成因子と
特異的親和性を有する物質としては、夾雑蛋白質の種類
に応じて種々の物質が用い得るが、例えば、ハプトグロ
ビンに対しては抗ハプトグロビン抗体、ヘモグロビン
等、α_１−酸性糖蛋白質に対しては抗α_１−酸性糖蛋白
質抗体等が例示される。これらの抗ハプトグロビン抗
体、抗α_１−酸性糖蛋白質抗体等の抗体はこの分野で慣
用の抗体産生法により調製することができる。上記の特
異的親和性を有する物質と不溶性担体との結合は常法に
準じて行なうことができ、例えば、ブロムシアン化され
たセファロースを膨潤させた後、塩基性緩衝液中で特異
的親和性を有する物質を不溶性担体にカップリングさ
せ、緩衝液で十分に洗浄することにより調製される。

【００１４】アフィニティクロマトグラィーを用いる方
法は、ハプトグロビン等のポリマー形成因子を含むアル
ブミン含有水溶液を、アフィニティ担体と接触させるこ
とにより行われ、例えば、それぞれの夾雑蛋白質と特異
的親和性を有する複数の物質を固定化したアフィニティ
担体と接触させたり、またハプトグロビンに対して特異
的親和性を有する物質を固定化したアフィニティ担体と
接触させ、次いでα_１−酸性糖蛋白質に対して特異的親
和性を有する物質を固定化したアフィニティ担体と接触
させ、さらに必要に応じて他の夾雑蛋白質に対して特異
的親和性を有するアフィニティ担体と接触させることに
より行われる。

【００１５】アフィニティ担体の使用量はアルブミン含
有水溶液中のハプトグロビン等のポリマー形成因子含
量、該アフィニティ担体の吸着能等により適宜調整され
るが、アルブミン１ｇ当り、アフィニティ担体２〜５m
l、通常４ml程度使用される。本方法はポリマー形成因
子の除去効率の面からカラム法にて行なうのが好まし
く、例えば、前記のアルブミン含有水溶液をｐＨ４．０
〜９．０程度、好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好
ましくはｐＨ６．８に調整し、アルブミンの溶解用液で
平衡化した上記アフィニティ担体カラムを通過させ、必
要に応じてカラムを溶解用液で洗浄し、非吸着分を回収
することにより行われる。上記の操作はアルブミンの変
性を抑制するため、低温（通常１０℃以下）にて行なう
のが好ましい。上記工程により夾雑蛋白質が除去され、
得られたアルブミン含有水溶液はポリマー形成因子含量
が低減された溶液である。

【００１６】かかる精製工程によりポリマー形成因子が
低減されたアルブミン含有水溶液は適当な濃度に調整
し、例えば、バイアルに充填するなど所望の製剤形態に
製剤化された後、加熱処理されて本発明のアルブミン製
剤が得られる。上記の加熱処理はアルブミン製剤中に混
入するおそれのあるウイルスを不活化するもので、アル
ブミン濃度５〜３０％程度、通常５又は２０〜２５％程
度に調整した水溶液として行われ、加熱温度としては、
夾雑ウイルスを不活化するに十分な温度及び時間行なえ
ばよく、例えば、５０〜７０℃、好ましくは約６０℃
で、５〜２０時間、好ましくは約１０時間行われる。な
お、上記の加熱処理に際しては、必要に応じて、アルブ
ミンの安定化剤、例えば、Ｎ−アセチルトリプトファン
ナトリウム、カプリル酸ナトリウム等を単独で又は混合
して添加してもよい。これらアルブミンの安定化剤は、
製剤中に含有されるアルブミン１ｇ当り２０〜６０mg、
好ましくは４０mg程度使用される。

【００１７】かくして得られたアルブミン製剤は、アル
ブミン濃度を２５％として測定したときに、アルブミン
含量に対するポリマー含量が３重量％以下であり、且つ
Ｍａｎｃｉｎｉ法により測定したα₁−酸性糖蛋白質含
量が検出限界以下である。本発明のアルブミン製剤は、
従来のアルブミン製剤と同様な用量、用法にて使用され
る。

【００１８】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、混入が危惧
されるウイルスが加熱処理により不活化され、また加熱
処理により生成するポリマーの形成因子であるハプトグ
ロビン等の熱に不安定な夾雑蛋白質が予め除去されてい
るので、ポリマー含量及び夾雑蛋白質含量の少ないアル
ブミン製剤を得ることができる。従って、本発明により
得られたアルブミン製剤は、加熱処理によりウイルスが
不活化されていると共にポリマー含量及びα₁−酸性糖
蛋白質含量が極めて少なく、安全性、安定性等に優れた
製剤である。

【００１９】

【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するため、実
施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によってなん
ら限定されるものではない。実施例１コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分
をアセトンで脱アルコールし、アセトンパウダーを得
た。次いで、アルブミン濃度が１０％となるように水に
溶解し、ｐＨを５．１に調整した。この溶液をＤＥＡＥ
−セファデックスカラムで処理した。溶出液に安定化剤
としてＮ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプ
リル酸ナトリウムをそれぞれ２０ｍＭ添加し、６０℃で
１０時間加熱処理し、アルブミン製剤を得た。該製剤中
のポリマー含量をゲル濾過分析法にて測定した。その結
果、ポリマー含量は、４回の繰り返し実験で３．０％以
下（アルブミン含量に対する相対重量％、ポリマー含量
に関して以下同様）であった。また、比較例として、Ｄ
ＥＡＥ−セファデックス処理をしていない溶液に安定化
剤を添加し、同様に加熱した溶液中のポリマー含量を測
定した。その結果、ポリマー含量は６．３％（４回の繰
り返し実験の平均値）であった。次いで、上記のＤＥＡ
Ｅ−セファデックスに吸着した画分を溶出させ、ゲル濾
過法とセルロースアセテート膜電気泳動法で分析した結
果、吸着画分はハプトグロビンを主体とする蛋白質であ
った。

【００２０】実施例２ブロムシアン化セファロース４Ｂ（５．８ｇ）を１ｍＭ
塩酸で１５分間膨潤させ、水洗した後、塩基性緩衝液
［０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム含有（ｐＨ８．３）］で洗浄した。ヒトヘモグロビ
ン（１００mg）を上記塩基性緩衝液（４０ml）に溶解
し、ここに上記膨潤したゲル（２０ml）を添加し２時間
攪拌した。次いで、１Ｍグリシン（ｐＨ８．０）を１５
mlを添加し、４℃にて一夜攪拌した。ゲルを濾別し、塩
基性緩衝液で十分に洗浄した後、リン酸緩衝食塩水で平
衡化した。斯くして、ヒトヘモグロビン固定化セファロ
ースを調製した。

【００２１】一方、実施例１で使用した第Ｖ画分アセト
ンパウダーを水に溶解し、１０％アルブミン溶液（炭酸
ナトリウム及び水酸化ナトリウムにてｐＨ６．８に調
整）を調製した。この溶液を、上記セファロースゲル
（２０ml）を充填したカラムにとおし、溶出液を２０ml
ずつ分画した。フラクション番号２〜８について、一元
免疫拡散法(Mancini法）でハプトグロビンを定量した。
また各サンプル（５ml）をセントリカット−５０にて２
mlに濃縮し、安定化剤溶液（１ml中、Ｎ−アセチルトリ
プトファンナトリウム３６mg及びカプリル酸ナトリウム
２４mg含有）を２８０μlを添加し、６０℃にて１０時
間加熱し、アルブミン製剤を得た。該製剤中のポリマー
含量をゲル濾過分析法により測定した。溶出液のハプト
グロビン（Ｈｐ）濃度とポリマー含量との関係を表１に
示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】上記表に示されるように、溶出液中のハプ
トグロビン濃度が低いほどポリマー含量が低い結果とな
った。実施例１及び２の結果を勘案すると、アルブミン
より等電点の低い夾雑蛋白質（主としてハプトグロビ
ン）を除去することによりポリマー含量を低減化できる
ことが判明した。

【００２４】実施例３コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分
ペースト（３００ｇ、アルブミン含量１１０．２ｇ）を
冷無菌蒸溜水１．２リッターに溶解し、約１時間攪拌し
た。次いで、１０(V/V) ％酢酸を用いてｐＨを４．６に
調整した後、約−２℃にて濾過（フィルター：０．４５
μｍ）し、さらに冷無菌蒸溜水１．２リッターを加え、
０．８Ｍ炭酸水素ナトリウムでｐＨ５．１に調整し、ア
ルブミン水溶液を得た。

【００２５】一方、ＱＡＥ−トヨパール（３５０ml）を
カラムに充填し、０．５Ｍ塩化ナトリウム（５００ml）
で十分に洗浄した後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．１）で平衡化し、陰イオン交換体カラムを調製し
た。このカラムに上記のアルブミン水溶液をとおし、さ
らに０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（１．２リッター）で洗
浄した。通過液と洗浄液とを合わせ、１Ｎ水酸化ナトリ
ウムにてｐＨを６．２に調整した後、透析・濃縮し、全
量３３０ml（アルブミン濃度：約２８％）とした（以
下、アルブミン調整液という）。

【００２６】このアルブミン調整液に安定化剤溶液（１
００ml中、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム５．
５５ｇ及びカプリル酸ナトリウム３．８９ｇ含有）を３
９．６ml添加し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨを
６．８５に調整した後、除菌濾過した。アルブミン濃度
が２５％となるように調整した後、所定量をバイアルに
分注し、６０℃にて１０時間加熱処理してアルブミン製
剤を得た。

【００２７】得られた製剤中のポリマー含量をゲル濾過
分析法により測定したところ、１．９９％であった。な
お、比較として、ＱＡＥ−トヨパールカラムを使用しな
い点以外は、上記製法と実質的に同様にして調製したア
ルブミン製剤の加熱後のポリマー含量は６．４９％であ
り、本発明の製造方法により得られたアルブミン製剤の
ポリマー含量は著しく低いものである。

【００２８】また、アルブミン製剤及び前記のアルブミ
ン調整液中の夾雑蛋白質含量の測定を一元免疫拡散法(M
ancini法：Mancini G.ら、Immunochemistry,第２巻、第
３号、第235-254 頁、1965年）により行い、その結果を
表２に示す。なお、この際、用いた抗α₁−酸性糖蛋白
質血清、抗ハプトグロビン血清及び抗プレアルブミン血
清は、ウサギを免疫動物として常法により調製したもの
である。これらの抗血清より作製した一元免疫拡散用ゲ
ルを用い、それぞれに対応する夾雑蛋白質に対する沈降
輪面積の標準曲線を図１〜図３に示す。

【００２９】表２に示されるように、本発明のアルブミ
ン製剤及びアルブミン調整液は夾雑蛋白質含量の極めて
少ないものであることが判明した。なお、図１〜図３か
ら明らかなように、ハプトグロビンの検出限界は６．５
mg／dlであり、α_１−酸性糖蛋白質の検出限界は４mg／
dlであり、プレアルブミンの検出限界は４mg／dlであ
る。

【００３０】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】α_１−酸性糖蛋白質に対する一元免疫拡散法に
よる標準曲線を示すグラフである。

【図２】ハプトグロビンに対する一元免疫拡散法による
標準曲線を示すグラフである。

【図３】プレアルブミンに対する一元免疫拡散法による
標準曲線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者武智和男枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者富岡新二高槻市大塚町４丁目12番１号株式会社ミドリ十字淀川工場内 (72)発明者横山和正枚方市招提大谷２丁目1180番地の１株式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルブミン製剤の製造方法におい
て、血清アルブミン含有水溶液を、該水溶液中に含まれ
る凝集体形成因子を除去する工程に付した後、加熱処理
することを特徴とするアルブミン製剤の製造方法。
【請求項２】凝集体形成因子の除去を、陰イオン
交換体を用いる方法又はアフィニティクロマトグラフィ
ー法で行なう請求項１記載のアルブミン製剤の製造方
法。