JPS641445B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS641445B2 JPS641445B2 JP59075314A JP7531484A JPS641445B2 JP S641445 B2 JPS641445 B2 JP S641445B2 JP 59075314 A JP59075314 A JP 59075314A JP 7531484 A JP7531484 A JP 7531484A JP S641445 B2 JPS641445 B2 JP S641445B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gel
- dextran sulfate
- culture
- bordetella
- specific conductivity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 37
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 19
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 claims description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 18
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 15
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 14
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 8
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims 5
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims 5
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims 5
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims 5
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- -1 sulfate ester Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ−HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、デキストラン硫
酸が化学的に結合されたポリサツカライドゲル誘
導体（以下デキストラン硫酸−ポリサツカライド
ゲルと略称する）に接触せしめ、Ｆ−HAを吸着
させた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ
−HAを採取する方法に関する。 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ−
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ−
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ−HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日咳
菌感染防御抗原として注目されるようになつた
［Sato，Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine.，380〜385
（1982）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−
HAが免疫学的に同一であることが確認され、
［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）］、各Ｆ−HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ−HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来知られているＦ−HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ−HAを得る方法がある［Sato，Ｙら；
Infect.Immun.，９，801（1974）］。しかしながら
この方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ−
HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精製
法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ−HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）］があるが、この方法によれば、Ｆ−
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法［Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）］、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心を組合わせる方法［渡辺ら；日
本細菌学雑誌、38，423（1983）］があるが、これ
らの方法は工程が非常に長く複雑であるうえに、
Ｆ−HAの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、また上記において用いられ
るアフイニテイクロマトグラフゲルは市販されて
おらず、これらの調製は非常に手間がかかるうえ
に、原材料が非常に高価である。このような種々
の欠点のため、上記方法もＦ−HAの工業的で安
価な採取方法とはなり得ない。 本発明者らは、Ｆ−HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルに接触せしめ、Ｆ−HAを吸着さ
せ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出することに
より、高純度のＦ−HAがきわめて簡単にしかも
非常に高い収率で得られることを発見し、本発明
を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ−HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、デキスト
ラン硫酸−ポリサツカライドゲルに接触せしめ、
Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出すること
を特徴とするＦ−HAの精製方法である。 本発明において、出発原料であるボルデテラ属
菌培養物とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支
敗血症菌の培養物を含む。本発明において好まし
い培養物は、百日咳菌培養物であり、百日咳菌を
通常の培地、たとえばコーエン・ウイラー培地
や、ステナー・シヨルテ培地などの液状培地に
て、常法により静置培養または振盪培養もしくは
通気攪拌培養して得られる培養物である。この培
養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上
清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれ
らの部分精製標品の形で本発明方法に供される。
本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心等の前
段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、培養
上清等をそのままデキストラン硫酸−ポリサツカ
ライドゲル吸着クロマトグラフイーに付すことが
でき、工程がきわめて簡単である。 本発明において用いられるデキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルとは、デキストランの硫酸
エステル化物をポリサツカライドゲル誘導体に化
学的に結合させたものである。このゲルを調製す
るにあたつては、デキストラン硫酸は種々の製品
がすでに市販されており、一般的に生物関連用と
して用いられているものを使用することができ
る。一方ポリサツカライドゲル誘導体とは、アガ
ロース、デキストラン、セルロース等のポリサツ
カライドに、クロマトグラフイー担体として用い
得るように、通常の結晶精製処理、三次元架橋処
理、形状成型処理等を施したゲル誘導体であり、
これらもすでに市販されており、例えばアガロー
スゲルとしてセフアロース（Sepharose，フアル
マシア社製）、デキストランゲルとしてセフアデ
ツクス（Sephadex，フアルマシア社製）、セルロ
ースゲルとしてアビセル（旭化成製）等がある。 デキストラン硫酸とポリサツカライドゲルとを
化学的に結合させるには種々の方法があるが、例
えば臭化シアンを用いるアンデルソンらの方法
（特開昭52−114018号）や、臭化シアンを用い、
スペーサーとしてリジンを介して結合させる方法
［Bryan M.Turnerら；Biochimica et
Biophysica Acta，659，７〜14（1981）］等の通
常よく用いられる方法で行なえばよい。 なお、デキストラン硫酸−アガロースゲルにつ
いてはすでに市販されており、例えばデキストラ
ン硫酸−セルロースCL4B（フアルマシア社製）
がある。 本発明において、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中
のＦ−HAを精製採取するにあたつては、次のよ
うな方法で行なわれる。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルは、
あらかじめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加
0.01Mリン酸緩衝液等の、中性付近のPH値（PH６
〜９）であり、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度の適
当な緩衝液を用いて平衡化を行なつた後に、Ｆ−
HAの吸着操作に供する。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルへの
Ｆ−HAの吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等
一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の
工業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。
バツチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌培養物
中にデキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルを
投入し、PH6.0〜9.0程度の範囲において０〜30℃
程度の温度にて10〜60分程度緩く攪拌してＦ−
HAを吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培養
物の比電導度が５〜25ｍｓ／cm程度となるよう
に、適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベル
（McIlvaine's）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリ
ウム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引し
て洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ｍｓ／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩
化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着し
ているＦ−HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、デキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルは、百日咳菌培養物中のＦ
−HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−HAの精製
度は数十倍にも達し、しかもＦ−HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られる精製Ｆ−
HAの比活性は４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク電
気泳動（PH4.5）分析において単１のバンドを形
成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ−HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用に
おける劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれ
ている。 したがつて、本発明方法は高純度のＦ−HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密
度勾配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマ
トグラフイー法等と組合わせることも可能であ
り、その際は従来方法で得られる結果に比して非
常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ−HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを200mlの
0.5M炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液
に、0.5M炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させた
セフアロースCL−4B（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）20mlを入れゆるやかに攪拌す
る。攪拌下に、100mlの蒸留水に10ｇの臭化シア
ンを溶解した液を加える。反応液に5M水酸化ナ
トリウム水溶液を添加しつつPHを11に15分間保持
する。その後、PHを下降するに任せ、室温にて攪
拌下17時間保持する。 反応終了後、グラスフイルター上でろ過し、ゲ
ルを0.15M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH
7.2）で充分に洗浄して、デキストラン硫酸−ア
ガロースゲル20mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調整したデキストラ
ン硫酸アガロースゲルをカラム（16mmφ×100mm）
に充填し、これに2M塩化ナトリウム添加0.01M
リン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約17.5ｍｓ／cm）
を通液して平衡化する。このカラムに百日咳Ｉ相
菌東浜株静置培養上清800mlを希釈して、比電導
度約17.5ｍｓ／cm、PH8.0に合わせた液を通液す
る。通液後、上記緩衝液を通液してゲルを洗浄
し、さらに0.20M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH8.0、比電導度約17.5ｍｓ／cm）を通液し、
夾雑物質を洗い出す。 ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.8、比電導度約120ｍｓ／cm）で溶出し、
Ｆ−HAを含む画分29mlを得た。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ−HAの回収率は90％で、精製度（精製Ｆ−
HA画分の比活性／培養上清の比活性）は13倍に
達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
ハプトELISA法［佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）］による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ−HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、デキストラン硫
酸が化学的に結合されたポリサツカライドゲル誘
導体（以下デキストラン硫酸−ポリサツカライド
ゲルと略称する）に接触せしめ、Ｆ−HAを吸着
させた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ
−HAを採取する方法に関する。 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ−
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ−
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ−HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日咳
菌感染防御抗原として注目されるようになつた
［Sato，Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine.，380〜385
（1982）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−
HAが免疫学的に同一であることが確認され、
［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）］、各Ｆ−HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ−HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来知られているＦ−HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ−HAを得る方法がある［Sato，Ｙら；
Infect.Immun.，９，801（1974）］。しかしながら
この方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ−
HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精製
法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ−HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法［Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）］があるが、この方法によれば、Ｆ−
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法［Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）］、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心を組合わせる方法［渡辺ら；日
本細菌学雑誌、38，423（1983）］があるが、これ
らの方法は工程が非常に長く複雑であるうえに、
Ｆ−HAの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、また上記において用いられ
るアフイニテイクロマトグラフゲルは市販されて
おらず、これらの調製は非常に手間がかかるうえ
に、原材料が非常に高価である。このような種々
の欠点のため、上記方法もＦ−HAの工業的で安
価な採取方法とはなり得ない。 本発明者らは、Ｆ−HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルに接触せしめ、Ｆ−HAを吸着さ
せ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出することに
より、高純度のＦ−HAがきわめて簡単にしかも
非常に高い収率で得られることを発見し、本発明
を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ−HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、デキスト
ラン硫酸−ポリサツカライドゲルに接触せしめ、
Ｆ−HAを吸着させた後、ゲルから溶出すること
を特徴とするＦ−HAの精製方法である。 本発明において、出発原料であるボルデテラ属
菌培養物とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支
敗血症菌の培養物を含む。本発明において好まし
い培養物は、百日咳菌培養物であり、百日咳菌を
通常の培地、たとえばコーエン・ウイラー培地
や、ステナー・シヨルテ培地などの液状培地に
て、常法により静置培養または振盪培養もしくは
通気攪拌培養して得られる培養物である。この培
養物は、遠心分離により菌体を除去した培養上
清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれ
らの部分精製標品の形で本発明方法に供される。
本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心等の前
段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、培養
上清等をそのままデキストラン硫酸−ポリサツカ
ライドゲル吸着クロマトグラフイーに付すことが
でき、工程がきわめて簡単である。 本発明において用いられるデキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルとは、デキストランの硫酸
エステル化物をポリサツカライドゲル誘導体に化
学的に結合させたものである。このゲルを調製す
るにあたつては、デキストラン硫酸は種々の製品
がすでに市販されており、一般的に生物関連用と
して用いられているものを使用することができ
る。一方ポリサツカライドゲル誘導体とは、アガ
ロース、デキストラン、セルロース等のポリサツ
カライドに、クロマトグラフイー担体として用い
得るように、通常の結晶精製処理、三次元架橋処
理、形状成型処理等を施したゲル誘導体であり、
これらもすでに市販されており、例えばアガロー
スゲルとしてセフアロース（Sepharose，フアル
マシア社製）、デキストランゲルとしてセフアデ
ツクス（Sephadex，フアルマシア社製）、セルロ
ースゲルとしてアビセル（旭化成製）等がある。 デキストラン硫酸とポリサツカライドゲルとを
化学的に結合させるには種々の方法があるが、例
えば臭化シアンを用いるアンデルソンらの方法
（特開昭52−114018号）や、臭化シアンを用い、
スペーサーとしてリジンを介して結合させる方法
［Bryan M.Turnerら；Biochimica et
Biophysica Acta，659，７〜14（1981）］等の通
常よく用いられる方法で行なえばよい。 なお、デキストラン硫酸−アガロースゲルにつ
いてはすでに市販されており、例えばデキストラ
ン硫酸−セルロースCL4B（フアルマシア社製）
がある。 本発明において、デキストラン硫酸−ポリサツ
カライドゲルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中
のＦ−HAを精製採取するにあたつては、次のよ
うな方法で行なわれる。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルは、
あらかじめ例えば0.2M塩化ナトリウム添加
0.01Mリン酸緩衝液等の、中性付近のPH値（PH６
〜９）であり、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度の適
当な緩衝液を用いて平衡化を行なつた後に、Ｆ−
HAの吸着操作に供する。 デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルへの
Ｆ−HAの吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等
一連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の
工業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。
バツチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌培養物
中にデキストラン硫酸−ポリサツカライドゲルを
投入し、PH6.0〜9.0程度の範囲において０〜30℃
程度の温度にて10〜60分程度緩く攪拌してＦ−
HAを吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培養
物の比電導度が５〜25ｍｓ／cm程度となるよう
に、適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ｍｓ／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベル
（McIlvaine's）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリ
ウム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引し
て洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ｍｓ／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩
化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着し
ているＦ−HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、デキストラン硫酸−
ポリサツカライドゲルは、百日咳菌培養物中のＦ
−HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−HAの精製
度は数十倍にも達し、しかもＦ−HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られる精製Ｆ−
HAの比活性は４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク電
気泳動（PH4.5）分析において単１のバンドを形
成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去される。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ−HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用に
おける劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれ
ている。 したがつて、本発明方法は高純度のＦ−HAの
工業的精製法としてきわめてすぐれた方法であ
る。また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密
度勾配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマ
トグラフイー法等と組合わせることも可能であ
り、その際は従来方法で得られる結果に比して非
常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ−HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを200mlの
0.5M炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液
に、0.5M炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させた
セフアロースCL−4B（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）20mlを入れゆるやかに攪拌す
る。攪拌下に、100mlの蒸留水に10ｇの臭化シア
ンを溶解した液を加える。反応液に5M水酸化ナ
トリウム水溶液を添加しつつPHを11に15分間保持
する。その後、PHを下降するに任せ、室温にて攪
拌下17時間保持する。 反応終了後、グラスフイルター上でろ過し、ゲ
ルを0.15M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH
7.2）で充分に洗浄して、デキストラン硫酸−ア
ガロースゲル20mlを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調整したデキストラ
ン硫酸アガロースゲルをカラム（16mmφ×100mm）
に充填し、これに2M塩化ナトリウム添加0.01M
リン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約17.5ｍｓ／cm）
を通液して平衡化する。このカラムに百日咳Ｉ相
菌東浜株静置培養上清800mlを希釈して、比電導
度約17.5ｍｓ／cm、PH8.0に合わせた液を通液す
る。通液後、上記緩衝液を通液してゲルを洗浄
し、さらに0.20M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH8.0、比電導度約17.5ｍｓ／cm）を通液し、
夾雑物質を洗い出す。 ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.8、比電導度約120ｍｓ／cm）で溶出し、
Ｆ−HAを含む画分29mlを得た。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ−HAの回収率は90％で、精製度（精製Ｆ−
HA画分の比活性／培養上清の比活性）は13倍に
達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
ハプトELISA法［佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）］による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
【表】
実施例 ２
調製例１と同様にして得られた硫酸デキストラ
ン−アガロースゲル200mlを0.2M塩化ナトリウム
添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）に浸漬し、デ
カンテーシヨンをくり返して平衡化する。このゲ
ルを、実施例１で用いたものと同一の百日咳菌培
養上清８を希釈し、比電導度約17.5ｍｓ／cm、
PH8.0に合わせた液に投入し、４℃で約２時間攪
拌する。 ついで、この混合液をグラスフイルター（70mm
φ×150）にかけゲルを過分離する。グラスフ
イルター上のゲルに0.20M塩化ナトリウム添加リ
ン酸緩衝液（PH8.0）を注ぎ、緩やかに吸引して
ゲルを洗浄する。つぎに、1.5M塩化ナトリウム
添加リン酸緩衝液（PH7.8）300mlを注ぎ、約15分
間緩く攪拌後、吸引して精製Ｆ−HA画分300ml
を得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ−HAの回収率は75％で、精製度は18倍に達
した。
ン−アガロースゲル200mlを0.2M塩化ナトリウム
添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）に浸漬し、デ
カンテーシヨンをくり返して平衡化する。このゲ
ルを、実施例１で用いたものと同一の百日咳菌培
養上清８を希釈し、比電導度約17.5ｍｓ／cm、
PH8.0に合わせた液に投入し、４℃で約２時間攪
拌する。 ついで、この混合液をグラスフイルター（70mm
φ×150）にかけゲルを過分離する。グラスフ
イルター上のゲルに0.20M塩化ナトリウム添加リ
ン酸緩衝液（PH8.0）を注ぎ、緩やかに吸引して
ゲルを洗浄する。つぎに、1.5M塩化ナトリウム
添加リン酸緩衝液（PH7.8）300mlを注ぎ、約15分
間緩く攪拌後、吸引して精製Ｆ−HA画分300ml
を得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ−HAの回収率は75％で、精製度は18倍に達
した。
【表】
実施例 ３
デキストラン硫酸−セフアロースCL4B（フア
ルマシア社製）をカラム（50mmφ×100mm）に充
填し、これに0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化する。この
カラムに百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清８を希釈して比電導度約17.5ｍｓ／cm、お
よびPHを8.0に調製した液を通液する。通液終了
後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。 ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液
（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む画分580mlを得
た。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ−HAの回収率は90％で、精製度は約50倍に
達した。またLPF−HA活性は10ELISAユニツ
ト／ml以下であつた。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同等であり、副作用は認められなかつ
た。
ルマシア社製）をカラム（50mmφ×100mm）に充
填し、これに0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化する。この
カラムに百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清８を希釈して比電導度約17.5ｍｓ／cm、お
よびPHを8.0に調製した液を通液する。通液終了
後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。 ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液
（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む画分580mlを得
た。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ−HAの回収率は90％で、精製度は約50倍に
達した。またLPF−HA活性は10ELISAユニツ
ト／ml以下であつた。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同等であり、副作用は認められなかつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ボルデテラ属菌培養物から線維状赤血球凝集
素を精製取得するに際し、ボルデテラ属菌培養物
を、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
サツカライドゲル誘導体に接触せしめ、線維状赤
血球凝集素を吸着させた後、ゲルから溶出するこ
とを特徴とする線維状赤血球凝集素の精製方法。 ２ 該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポ
リサツカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸
−アガロースゲル、デキストラン硫酸−デキスト
ランゲルおよびデキストラン硫酸−セルロースゲ
ルから選ばれる前記第１項の方法。 ３ 該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポ
リサツカライドゲル誘導体を、PH6.9〜9.0、比電
導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液であらかじめ処
理して平衡化したのち吸着処理に付す、前記第１
または２項の方法。 ４ 該吸着処理を、PH6.0〜8.0、温度０〜30℃、
比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの条件下に行なう前
記第１〜３項いずれか１つの方法。 ５ 線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を、PH
5.0〜10.0、比電導度25.0〜130ｍｓ／cmの緩衝液
を用いて行なう前記第１〜４項いずれか１つの方
法。 ６ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、PH5.0
〜10.0、比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液で洗
浄する前記第５項の方法。 ７ 該ボルデテラ属菌培養物が百日咳菌培養物で
ある前記第１〜６項いずれか１つである方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59075314A JPS60218326A (ja) | 1984-04-14 | 1984-04-14 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
| US06/722,381 US4563303A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| AU41223/85A AU571078B2 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Purification of filamentous hemagglutinin |
| CA000479022A CA1237998A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| KR1019850002492A KR890001927B1 (ko) | 1984-04-14 | 1985-04-13 | 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 |
| EP85104545A EP0159003B1 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| DE8585104545T DE3576173D1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
| AT85104545T ATE50600T1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59075314A JPS60218326A (ja) | 1984-04-14 | 1984-04-14 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60218326A JPS60218326A (ja) | 1985-11-01 |
| JPS641445B2 true JPS641445B2 (ja) | 1989-01-11 |
Family
ID=13572667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59075314A Granted JPS60218326A (ja) | 1984-04-14 | 1984-04-14 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60218326A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
-
1984
- 1984-04-14 JP JP59075314A patent/JPS60218326A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60218326A (ja) | 1985-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4563303A (en) | Method for purification of filamentous hemagglutinin | |
| US4704274A (en) | Method for the purification of LPF-HA | |
| JP2562192B2 (ja) | 血清アルブミンの純化方法 | |
| US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
| JPH0231689A (ja) | 百日咳トキシンの精製法 | |
| JP2549225B2 (ja) | 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法 | |
| JP2538224B2 (ja) | 百日咳抗原の精製 | |
| JP3768485B2 (ja) | 血清アルブミンの精製方法 | |
| KR920009730B1 (ko) | 백일해 성분 백신 및 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합백신의 제조방법 | |
| CA1114293A (en) | Purification of pertussis haemagglutinins | |
| US5045203A (en) | Separation of protein antigens of Bordetella bacteria by affinity chromatography | |
| JPS641445B2 (ja) | ||
| JPH0423751B2 (ja) | ||
| KR890001003B1 (ko) | Lpf-ha의 정제방법 | |
| JPS641447B2 (ja) | ||
| JPS641446B2 (ja) | ||
| JPS6241692B2 (ja) | ||
| JPS6241691B2 (ja) | ||
| JPS641448B2 (ja) | ||
| EP0868507A1 (en) | Process for the purification of urease from helicobacter pylori | |
| JPH05170799A (ja) | ヒトインターロイキン８の精製方法 | |
| JP4706093B2 (ja) | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 | |
| CN116410295A (zh) | 一种大肠杆菌表达物的纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |