KR920009730B1

KR920009730B1 - 백일해 성분 백신 및 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합백신의 제조방법

Info

Publication number: KR920009730B1
Application number: KR1019850003773A
Authority: KR
Inventors: 아끼히로 긴나가; 미쓰오 사꼬; 히사시 기따가와; 신 사꾸마; 히로시 고바; 쓰까사 니시하라; 사다히로 히라시마
Original assignee: 자이단 호오진 까가꾸 오요비 겟세이 료오호 겐뀨쇼; 노나까 사네오
Priority date: 1984-05-30
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1992-10-22
Also published as: CA1239345A; EP0175841A2; EP0175841A3; ATE61230T1; AU4245985A; JPH0574576B2; EP0175841B1; JPS6176422A; DE3581993D1; AU568743B2; KR860002570A

Abstract

내용 없음.

Description

백일해 성분 백신 및 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합백신의 제조방법

제1도는 각 백신의 감응 주사후 1일, 3일, 7일,10일 및 14일째에 측정된 부어 오른 정도를 플로팅한 그래프를 나타낸다.

본 발명은 백일해 성분 백신 및 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합 백신의 제조방법에 관한 것이다. 더 특별하게는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 배양액으로부터 이후에 설명하는 특정방법에 의해 수득된 고정체 F-HA(섬유질 헤마글루티딘) 또는 그의 톡소이드, 및 비 페루투시스의 배양액으로부터 공지의 방법 또는 이후에 설명하는 특정 방법에 의해 수득된 LPF-HA(백혈구증다증 촉진 인자 헤마글루티닌)의 고정제 톡소이드를 혼합함을 특징으로 하는 백일해 성분 백신의 개량된 제조방법 및 상기의 개량된 백일해 성분 백신을 백일해 항원 성분으로 사용하는 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡송이드의 혼합 백신의 제조방법에 관한 것이다.

백일해는 감염성 질병의 하나이며, 흔히 유아 및 아동에게 발병되므로 공중 건강의 관점에서 매우 중요한 질병이다. 특히, 이 병을 앓는 유아는 매우 심한 증세를 나타내며, 때때로 사망하기도 한다. 이 질병이 백신 예방에 의해 예방될 수 있으며, 이 목적을 위해 비.페르투시스 상 Ⅰ의 전체 세포로부터 제조된 불활성 백신이 널리 사용된다는 것은 공지이다. 그러나, 전체 세포를 함유한 불활성 백신은 중요한 부작용을 가지므로 백신의 접종은 과거에 일시적으로 금지되었었다. 비.페르투시스에 의한 유아 및 아동의 질병은 가장 중요한 사회적 문제의 하나로 남아 있으며, EK라서 부작용이 없는 백일해 백신의 개발이 요청되고 있다.

사또 등은 예방 항원에 대한 기본적 연구에 의해 획기적인 성분 백신인 침전된 정제 백일해 백신의 생산에 성공하였다(일본국 특허 공고 제5203/1982호). 이 백신은 주로 예방 항원으로서 F-HA 및 LPF-HA를 함유한 HA 분획을 함유하며, 열과 같은 부작용이 거의 없이 우수한 예방 효과를 나타내므로 이미 실제적으로 사용되고 있다.

이 침전된 백일해 백신은 비.페르투시스 상 Ⅰ을 적당한 배지에 접종시키고, 약 35℃에서 5일간 정치 배양한 후, 배양 브로스를 원심 분리하여 상층액을 분리하고, 상층액에 황산암모늄을 가하여 약 50% 포화시키거나 알콜을 가하고, 생성된 침전물을 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 분리한 후, 침전물을 염화나트륨이 보충된 완충액으로 추출하고, 추출물을 통상의 방법으로 슈크로오즈 밀도 경사 원심분리하여 백일해 HA 분획을 수거한 다음, 내독소 분획을 제거하고, 생성된 HA 분획을 포르말린으로 처리하여 해독시킴으로써 제조된다. 이 백신은 성분 백신으로 명명된다[Sato,Y.et al. ; Lancet(1), 122~126(1984)]. 그러나, 이 문헌에 나타난 바와 같이 주 백일해 백신 성분으로 F-HA 및 LPF-HA 뿐만 아니라 다른 성분도 함유한다. 더우기 이 성분의 양은 자유로 조절할 수 없으므로 ″어셀룰라 백신″으로 명명된다.

사또 등에 의해 제조된 백신을 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드와 더 혼합하고, 알루미늄 보조제로 임의로 처리한 후 젤라틴, 글루코오즈 등과 같은 안정제와 혼합하여 침전된 정제 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드를 수득한다. 그러나 최근 조홍, 부어 오름, 경변 등과 같은 국소적 반응에 대한 각종 임상적 보고가 보고되어, 이 백신은 완전하지 못하다.

더우기 감염 예방 항원으로 비.페르투시스 상 I 균주에 의해 제조된 F-HA 및 LPF-HA의 기능이 알려졌으며, 중요한 기능은 각종 문헌에 보고되었다[Sato,Y.et al. ; Infect.Immun,. 31, 1223∼1231(1981) : Sato,Y.et al. ; Seminars in Infectious Diseases Ⅳ, Bacterial Vaccine, 380∼385(1982)]. 국소반응과 같은 불필요한 부반응없이 백일해 백신의 성분으로 F-HA 및 LPF-HA를 사용하기 위해, 이를 고도로 정제하는 것이 중요하며, 또한 백신으로 이용될 정도로 충분량의 항원을 생성하기 위해 단순히 및 대량으로 제조할 수 있는 것이 중요하다.

비.페르투시스 배양 상층액을 황산암모늄으로 분획화하고, 생성물을 슈크로오즈 밀도 경사 원심분리한 후, 두번 겔여과함으로써 F-HA를 분리 및 정제할 수 있다는 것은 공지이다[Sato,Y.et al. ; Infect. Immun,. 2, 801(1984)]. 그러나, 이 방법은 많은 단계가 필요하며 매우 복잡하며, 목적하는 F-HA이 저수율로 생성되므로, 이 방법은 공업적 규모로 사용될 수 없다.

또한, 비.페르투시스 F-HA를 이온 교환 크로마토그래피 및 겔여과에 의해 정제하는 것은 공지이다[Arai, H.et al. ; Infect.Immun,. 25, 460(1979)]. 그러나 이 방법에 따르면 목적하는 F-HARK 단지 저수율로 수득되며, 불필요한 비.페르투시스 내독소를 제거하는 것이 매우 곤란하므로 이 방법 또한 실제로 사용될 수 없다.

기타 공지의 방법으로는 히드록시-인회석 흡착 크로마토그래피, 합토글로빈 친화 크로마토그래피, 황산암모늄 분획화 및 겔여과를 배합한 방법이 있다[Cowell, J.L.et al. ; Seminars in Infectious Diseases Ⅳ, Bacterial Vaccine, 37, 1(1982)]. 그러나 이 방법도 많은 단계로 인해 복잡하며, F-HA가 단지 저수율로 수득된다. 그외에도 사용된 히드록시 인회석이 매우 비싸다. 이러한 많은 결점들로 인해, 상기의 방법은 공업적 규모로 F-HA를 제조하는데 부적당하다.

또한 LPF-HA를 분리 및 정제하는 몇가지 방법, 예를들면 비.페르투시스의 배양 배지를 황산암모늄으로 염석시키고, 추출 및 투석한 후 수득된 물질을 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과하는 방법[Arai, H.et al. : Biochimica et Biophysica Acta, 444, 765(1986)], 또는 슈크로오즈 농도 경사 원심분리에 의한 방법 [Sato,Y.et al. ; Infect.Immun., 6,897∼704(1972)]이 있다.그러나, 이런 방법에 따르면 전기영동에 의해 정제 분석에서 단일 밴드를 나타내는 목적 LPF-HARK 수득되는 것은 매우 어려우며, 그 수율이 매우 낮다.

목적하는 고순도의 LPF-HA를 비교적 대량으로 수득하기 위해, 비.페르투시스의 배양 배지의 상층액을 히드록시 인회석이 패킹된 컬럼에 통과시켜 LPF-HA를 흡착시키고, 세척 및 용출시킨 후 콘카나발린 A-세파로즈(콘 A-세파로즈, 파마시아제)로 친화 크로마토그래피하는 방법이 있다[Yajima, M.et al. :J.Biochem., 83, 295∼303(1978)]. 그러나, 리간드로 콘카나발린 A를 사용한 친화 크로마토그래피는 LPF-HA 뿐만 아니라 당류, 당지질 및 당단백질을 흡착시킬 수 있으므로, 세포막 성분과 같은 기타 페르투시스 세포성분을 흡착시켜 목적하는 고정제 LPF-HA의 분리를 곤란하게 한다. 더우기 히드록시 인회석 컬럼으로 처리하는 것은 긴시간을 요하며, LPF-HA 활성을 저하시키고, 히드록시 인회석의 경비때문에 공업적 규모로 저가로 목적하는 LPF-HA를 수득할 수가 없다. 그러므로 LPF-HA를 친화 크로마토그래피하는 것은 부적당하다.

최근 인체 합토글로빈이 LPF-HA에 특이하게 결합한다는 것이 발견되었기 때문에, 리간드로 상기의 콘카나발린 대신에 인체 합토글로빈을 사용하는 친화 크로마토그래피에 의해 LPF-HA를 정제하려는 시도가 있었다[Irons, L.et al. : Biochimica et Biophisica Acta, 580, 175∼185(1979) 및 Cowell, J.et al. ; Seminars in Infectious Diseases Ⅳ, Bacterial Vaccine, 371∼379(1982)]. 또한 비.페르투시스 세포를 기계적으로 파쇄하여 세포 성분으로부터 LPF-HA를 추출하고, 이를 황산암모늄 분획화한 후 수득된 물질을 리간드로 합토글로빈 또는 세룰로플라스민과 같은 혈장 시알로프로테인 또는 타액뮤신과 같은 시알로프로테인을 사용하여 친화 크로마토그래피함을 특징으로 하는 LPF-HA의 수거 방법이 제안되었다.(영국 특허 공개 제2,015,531) 리간드로 합토글로빈 등을 사용하는 친화 크로마토그래피에 의한 이들 방법은 정제된 LPF-HA의 공업적 제조방법으로 기대되고 있다.

그러므로, 공업적 규모로 만족스런 순도를 갖는 F-HA의 어떤 제조방법도 공지되어 있지 않으며, LPF-HA에 있어 리간드로 합토글로빈을 사용한 친화 크로마토그래피에 의한 상기의 방법은 공업적으로 수용할 수 있는 유일한 방법이다.

본 발명의 목적은 고정제된 F-HA 및 LPF-HA를 사용함으로써 불필요한 부작용을 나타내지 않는 백일해 성분 백신의 개량된 공업적 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 백일해 성분 백신을 사용함으로써 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합 백신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 및 기타외 목적 및 이점은 하기의 설명에 의해 이 분야에서 능숙한 사람에게 명백할 것이다.

본 발명의 백일해 성분 백신 및 혼합 백신은 비.페르투시스의 배양액을 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔, 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔로 처리하여 F-HA를 겔에 흡착시키고, F-HA를 겔로부터 용출시킴으로써 수득된 고정제 F-HA 및 영국 특허 공개 제2,015,531호에 기재된 바와 같이 합토글로빈을 리간드로 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 수득된 고정제 LPF-HA를 사용함으로써 제조되며, 본 발명자들은 이후 이 방법을 더 개량하였다.

목적하는 고정제 F-HA는 일본국 특허 출원 제75314/1984,84778/1984 및 91631/1984호에 기재된 하기의 방법에 의해 제조된다.

즉, 비.페르투시스를 코헨-휠러 배지 또는 스테이너-숄테 배지와 같은 통상의 배지에서 정치 배양, 진탕 배양 또는 교반 배양(진탕 배양, 통기 배양 및 통기 교반 배양과 등의)과 같은 통상의 방법으로 배양한다. 수득된 배양 브로스를 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액을 분리한다. 그렇지 않으면, 세포를 파쇄한 후 혼합물을 원심분리하고 상층액을 분리한다. 상층액을 그대로 또는 통상의 방법으로 부분 정지한 후 겔 흡착 크로마토그래피에 의해 특수 정제한다. 염석, 추출, 초원심분리 등과 같은 예비 정제가 필요없으며, 상층액을 직접 셀룰로오즈 셀페이트 겔, 텍스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔, 또는 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔로 크로마토그래피하므로, 정제공정이 단순한 단계로 수행된다.

본 발명에서 셀룰로오즈 설페이트 겔로 사용된 셀룰로오즈의 황산에스테르는 셀룰로오즈, 바람직하게는 결정성 셀룰로오즈 또는 결정성 부분 및 비결정성 부분을 갖는 셀룰로오즈를 설페이트화함으로써 수득된다. 이렇게 수득된 셀룰로오즈의 황산에스테르는 출발물질의 고유형태(바람직하게는 구형)를 잘 유지하며, 수성 매질에 불용성이고 우수한 물리적 안정성을 가지므로 크로마토그래피용 겔로 적당하다. 이들 출발 셀룰로오즈는 예를들면 아비셀(일본 아사히가세이제), 셀룰로핀 GC-15, 호-25, GC-100 또는 CG-200(일본 치소사제)으로 시판되고 있다. 셀룰로오즈의 설페이트화는 통상의 방법, 예를들면 셀룰로오즈의 겔을 유기용매(예.피리딘)중에서 클로로술폰산, 무수황산 또는 기타 설페이트화제로 처리함으로써 수행될 수 있다.

덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔은 덱스트란 셀페이트를 폴리사카라이드 겔 유도체에 화학적으로 결합시킴으로써 제조된다. 덱스트란설페이트의 각종 제품이 시판되고 있으며, 그중에서도 생물적 목적에 통상적으로 사용도는 제품이 바람직하게 사용된다. 폴리사카라이드 겔 유도체는 폴리사카라이드(예.아가로즈,텍스트란,셀룰로오즈 등)를 결정화 정제 처리, 3차원 교차 결합, 성형등과 같은 크로마토그래피용 담체로 사용하기에 적당한 특성을 주는 통상적 방법으로 처리함으로써 제조된 겔 유도체이다. 이들 생성물 또한 시판되고 있으며, 예를들면 세파로즈(스웨덴 파마시아제)와 같은 아가로즈겔, 세파덱스(파마시아제)와 같은 덱스트란 겔, 아비셀(일본 아사히가세이제)과 같은 셀룰로오즈 겔이 있다. 덱스트란 설페이트와 폴리사카라이드의 화학적 결합은 각종 방법, 예를들면 시아노브로마이드를 사용한 앤더슨 등의 방법(일본국 특허 공개 제114018/1977호) 또는 시아노브로마이드 및 리신(스페이서로 사용)을 사용한 방법[Bryan M.Turner et al. ; Biochimica et Biophysica Acta, 659, 7∼14(1981)]에 의해 수행될 수 있다. 덱스트란 설페이트-아가로즈 겔의 한 제품이 이미 시판되고 있으며, 예를들면 덱스트란 설페이트-세파로즈 CL 4B(파마시아제)이다.

교차 결합된 폴리사카라이드의 황산에스테르는 에피클로로히드린, 디클로히드린, 디브로모히드린, 에틸렌글리콜비스에폭시프로필에테르와 같은 교차결합제로 교차결합된 덱스트란, 셀룰로오즈, 아가로즈와 같은 폴리사카라이드의 황산에스테르이다. 교차 결합된 폴리사카라이드는 시판되고 있으며, 예를들면 세파덱스G-10,G-50 및 G-100(스웨덴 파마시아제)와 같은 교차 결합된 덱스트란, 세파로즈 CL-2B,CL-4B 및 CL-6B(파마시아제)와 같은 교차 결합된 아가로즈 및 셀룰로핀 GCL-25 및 GCL-90(일본 치소사제)과 같은 교차 결합된 셀룰로오즈가 있다. 교차 결합된 폴리사카라이드의 설페이트화는 통상의 방법, 예를들면 용기 용매(예.피리딘)중에서 교차 결합된 폴리사카라이드의 겔을 클로로술폰산, 무수황산 또는 기타 설페이트화제로 처리함으로써 수행될 수 있다.

이들 겔과 함께 있는 비.페르투시스의 배양액으로부터 F-HA의 분리 및 정제는 하기의 방법으로 수행된다.

셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이드-폴리사카라이드 겔 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔을 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 인산 완충액과 같은 중성 pH(예.pH 6∼9) 및 약 5∼25ms/cm의 비전도도를 갖는 적당한 완충액으로 미리 평형시키고, F-HA의 흡착에 사용한다.

셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔에 F-HA를 흡착, F-HA가 흡착된 겔을 세척 및 F-HA를 용출시키는 것과 같은 정제처리는 배치방법 또는 컬럼방법과 같이 공업용으로 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 배치방법의 경우, 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔을 비.페르투시스의 배양액에 가하고, 혼합물을 pH 6.0∼9.0 및 온도 0℃∼30℃에서 10∼60 분간 천천히 교반함으로서 F-HA를 겔에 흡착시킨다. 상기 방법에 사용된 비.페르투시스의 배양액은 보통 그를 농축 또는 희석함으로써 5.0∼25.0ms/cm의 비전도도로 조절한다. 배양 용액의 상층액은 또한 상술한 비전도도의 범위일때 그 자체로 사용될 수 있다.

흡착 완결후 배양액-겔 혼합물을 필터에 가하고, 겔을 흡인에 의해 여과액으로부터 분리한다. 분리된 겔을 비전도도 약 5∼25ms/cm 및 pH 약 5.0∼10.0의 적당한 완충액(예.0.2M 염화나트륨 첨가 0.02M 맥일바인의 완충액,0.2M 염화나트륨 첨가,0.01M 인산 완충액 또는 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 트리스-HCl 완충액 등)으로 흡인 세척한다. 그리고 흡착된 F-HA를 pH 약 5.0∼10.0 및 비전도도 약 25∼130ms/cm(상기의 세척은 완충액보다 더 큰 비전도도)의 적당한 완충액(예.1.5M 염화나트륨 첨가 맥일바인의 완충액,1.5M 염화나트륨 첨가 인산 완충액 등)으로 용출시킨다.

컬럼방법의 경우 처리된 출발 용액, 세척용 완충액 및 용출용 완충액은 상술한 배치방법에 사용된 것과 동일하다. 용액의 통과 속도는 약 10ml/cm²시∼500ml/cm²시의 범위로 조절한다.

상기의 정제방법에 따라 비.페르투시스 배양액 중의 F-HA가 특이하게 흡착하므로 F-HA의 정제도는 수십배가 되며, F-HA의 회수율은 75% 이상, 어떤 조건에서는 90% 이상, 거의 100%이다. 그외에도 정제된 F-HA는 약 3.7∼11×10⁴HA 단위//mg 단백질, 보통 4∼8×10⁴HA 단위/mg 단백질[닭혈구 응집시험에 의해 측정, Sato, Y.et al, ; Infect.Immun., 7, 929∼999(1973)]의 높은 비활성을 나타내며, ELISA 활성을 나타낼때 0.9~1.3×10⁵F-HA-Ab-ELISA 단위/㎎ 단백질[F-HA.Elisa 방법에 의해 측정, Sato, Y.et al.; Infect.Immun., 41, 313~320(1983)]이고, 또한 폴리아크릴아미드 디스크 전기 영동 분석(pH 4.5)에서 단일 밴드를 형성하며, 비.페르투시스 내독소가 거의 완전히 제거된다.

상기의 정제방법에 따라, 목적하는 F-HA가 비.페르투시스의 출발 배양액으로부터 단순한 공정에 의해 고수율 및 고순도로 분리될 수 있다. 그외에도, 크로마토그래피 흡착제를 저가로 제조할 수 있으며, 폐기하지 않고 반복해서 사용될 수 있다. 따라서 이 방법은 경제적 관점에서 매우 우수하다. 그러므로 상기의 정제방법은 고정제 F-HA의 공업적 제조방법으로서 매우 우수하다. 필요하다면, 이 정제방법을 슈크로오즈 밀도 경사 초원심분리, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같은 종래의 정제방법과 배합하여 사용한다.

이렇게 수득된 정제된 F-HA는 매우 순수하므로, 그대로 최종 백신을 제조하기 위해 출발물질로 사용될 수 있으나, 포르말린을 사용한 통상의 방법에 의해 톡소이드로 전환시킨 후 임의로 사용될 수 있다.

기타의 출발 정제 LPF-HA는 영국 특허 공개 제2,015,531호에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있으나, 바람직하게는 하기의 정제방법에 의해 제조된다.

그 한가지 방법은 다음과 같다(일본국 특허 출원 제206598/1983호, USSN 666,172).

비.페르투시스를 통상의 방법으로 배양함으로써 수득된 출발 배양 배지를 리간드로 변성 세룰로플라스민을 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 LPF-HA의 정제동안 비.페르투시스의 내독소를 제거하여 고정제된 LPF-HA를 고수율로 수득한다.

정제에 사용된 변성 세룰로플라스민은 동물 유래의 세룰로플라스민을 각종 방법, 예를들면 세룰로플라스민을 60∼85℃에서 1∼24시간동안 가열함으로써 또는 세룰로플라스민을 설파이드(예.황화나트륨,황화암모늄등), L-아스코르브산, 환원당(예.D-글루코오즈,D-갈락토즈,D-만노즈,D-프럭토즈,말토즈,락토즈등), 환원제(예.아세트알데히드,포름산,옥살산,메르캅토에탄올,디에틸디티오카르바메이트 등), 시아노화합물(예.시안화나트륨,티오시안화나트륨,티오시안화칼륨 등), 킬레이트화제(예.EDTA,니트로트라아세트산(NTA),트리에틸렌테트라민-헥사아세트산(TTHA)등)와 같은 변성제로 처리함으로써 세룰로플라스민에 포함된 구리이온(Cu⁺⁺)을 환원시키거나, 구리이온의 부분 또는 전체를 분리 제거함으로써 수득된다.

상기의 변성방법은 단독으로 또는 둘이상을 배합하여 사용할 수 있으며, 세룰로플라스민(즉, 리간드)을 매트릭스(즉, 지지담체)에 고정시킨 후 변성시킬 수 있다. 변성은 생리 식염수에 녹인 0.1∼0.5w/v% 세룰로플라스민용액 1부피를 10∼200부피의 하기 완충액에 투석시킴으로써 쉽게 수행될 수 있다. 즉, 변성제로 황화나트륨, 황화암모늄 또는 시안화나트륨을 사용하는 경우, 0.01∼1.0M의 변성제를 함유한 0.01∼0.1M 인산 완충액(pH 6.0∼8.0)을 사용하여, 투석은 0∼60℃에서 1∼10시간동안 수행한다. 변성제로 L-아스코르브산 또는 환원당을 사용하는 경우, 0.01∼1.0M 변성제를 함유한 0.01M∼0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.0∼6.0)을 사용하며, 투석은 0∼15℃에서 24∼36시간동안 수행한다. 변성제로 아세트알데히드, 포름산, 옥살산, 메르캅토에탄올, 디에틸디티오카르바메이트 등을 사용하는 경우, 0.01∼0.1M 변성제를 함유한 0.01∼0.1M 인산 완충액(pH 6.0∼8.0)을 사용하며, 투석은 0∼30℃에서 0.5∼3시간동안 수행한다. 변성제로 티오시아네이트를 사용하는 경우, 0.1∼0.3M의 변성제를 함유한 0.01∼0.1M 인산 완충액(pH 6.0∼8.0)을 사용하며, 투석은 0∼30℃에서 0.5∼5.0시간동안 수행한다. 변성제로 EDTA,NTA,TTHA를 사용하는 경우, 0.01∼1.0M의 변성제를 함유한 0.01∼0.1M 인산 완충액(pH 6.0∼8.0)을 사용하며, 투석은 0∼30℃에서 0.5∼5.0시간동안 수행한다.

출발 세룰로플라스민은 시판되고 있으며, 혈장을 분획 Ⅳ로 콘의 방법에 의해 알콜 분획화함으로써 수득되거나, 인간 또는 기타 동물 세포로부터 분리하여 정제함으로써 수득될 수 있다.

비.페르투시스의 배양 배지를 상기의 변성 세룰로플라스민으로 친화 크로마토그래피하는 것은 보통 하기의 방법으로 수행된다.

친화성 겔은 액센 등의 방법[Axe'n et al. ;Nature, 214, 1302∼1304(1967)], 즉 변성된 세룰로플라스민을 시아노브로마이드로 활성화된 세파로즈, 아가로즈, 셀룰로오즈 또는 덱스트란 등의 매트릭스에 고정시킴으로써 제조된다. 친화성 겔을 컬럼방법 또 배치방법으로 비.페르투시스의 배양 배지와 접촉하여 배지에 함유된 LPF-HA를 겔에 흡착시키고, 겔을 적당한 완충액으로 세척하여 오염물을 제거한 후 용리액으로 LPF-HA를 용출시킨다.

출발 비.페르투시스의 배양 배지는 상술한 바와 같이 F-HA의 정제에 사용된 것과 같으며, 예를들면 비.페르투시스 상 Ⅰ균주를 코헨-휠러 배지 또는 스테이너-숄테 배지와 같은 공지의 액체 배지에서 정치 배양, 진탕 배양 또는 교반 배양과 같은 통상의 방법으로 배양함으로써 수득된 배양 배지이다. 바람직하게는 배양 배지를 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거한다. 그외에서 상술한 F-HA의 정제방법을 통과한 용액을 출발물질로 사용할 수 있다. 이 LPF-HA의 정제방법에 따라 배양액을 그 자체로, 즉 염석, 추출, 투석, 초원심분리, 농축, 평행 등과 같은 각종 전처리없이 친화 크로마토그래피할 수 있으므로 공정이 매우 단순하다.

컬럼방법에 따라, 친화 겔을 컬럼에 패킹하고, 비.페르투시스의 배양 배지를 10ml/cm²/시∼500ml/cm²/시의 유속으로 컬럼에 통과시킨다.

배치방법에 따라 비.페르투시스의 배양 배지를 용기에 넣고 여기에 친화 겔을 직접 넣은 후 혼합물을 약 30분∼3시간, 바람직하게는 약 1시간동안 교반한다.

친화 겔의 양은 절대적인 것은 아니며, 보통 10,000∼20,000㎍의 LPF-HA(단백질량)을 흡착시키는데 0.1ml의 친화 겔을 사용한다.

LPF-HA가 흡착된 친화 겔의 세척은 보통 pH 4.0∼9.0 및 비전도도 10ms/cm∼150ms/cm의 완충액으로 수행한다. 예를들어, 0.1∼1.0M 염화나트륨을 함유한 0.01∼0.1M 인산 완충액(pH 6.0∼8.0)을 사용하여 컬럼방법의 경우 컬럼의 부피보다 수십∼100배 많은 부피의 완충액을 흘려 보냄으로써 또는 배치방법의 경우 겔의 부피보다 수∼수백배 많은 부피의 완충액으로 처리함으로써 세척을 수행한다. 세척에 의해 출발물질에 포함된 비.페르투시스의 내독소가 효과적으로 제거된다. 이것은 공지의 정제방법보다 우수한 본 발명의 정제방법의 특징중 하나이다.

상기의 세척 단계후 리간드에 흡착된 LPF-HA를 카오트로픽 염(예.I^-,ClO₄ ^-,CF₃COO^-,SCN^-,CCl₃COO^-등과 같은 카오트로픽 이온을 방출할 수 있는 염), 에틸렌글리콜, 디옥산, 우레아, 구아니딘 히드로클로라이드, EDTA 등과 같은 통상의 용리액을 사용하여 용출시킨다.

이 방법의 친화 크로마토 그래피에 따라, 출발물질의 pH가 4.0∼10.0인 경우, 목적생성물이 90% 이상의 고수율로 수득될 수 있다.

상기 방법에 의해 수득된 LPF-HA는 90% 이상, 때때로 95% 이상(전기 영동 분석pH 4.5)의 고순도를 갖는다. 그외에도, 생성물은 공지의 정제방법에 의해 성취될 수 없는 0.9∼1.6×10⁵LPF-HA-Hp-ELISA 단위/mg 단백질, 보통 1.1∼1.2×10⁵LPF-HA-Hp-ELSIA 단위/mg 단백질의 비활성을 갖는다[ELISA 분석에 의해 측정, Sato et al. ; Symposium on Toxins, Proceeding of the 28th Symposium on Toxins, 141~144(1981)]. 본 생성물의 우수성은 리튼머스시험 및 쥐의 피로겐 시험과 같은 LPF-HA 생성물의 생물적 활성 시험 결과로부터 더욱 명백하다. 즉, 이 정제방법의 경우 불필요한 내독소가 거의 완전히 제거된다. 그외에도 상기의 방법은 인체 혈장 성분의 경우 관찰되는 간염 비루스 및 기타 감염인자와 같은 문제점을 피할 수 있다.

예를들어, 열처리에 의해 변성된 세룰로플라스민을 사용하는 경우, LPF-HA의 비흡착성 및 흡착 용량이 강화되며, 간염 비루스등이 효과적으로 제거된다. 더우기, 1-아스코르브산, 시안화나트륨 등에 의해 변성된 세룰로플라스민을 리간드로 사용하는 경우, 변성된 세룰로플라스민을 60℃에서 10~15시간동안 열처리한다 할지라도 겔은 열처리하지 않은 생성물과 마찬가지로 충분한 정제 용량을 나타낼 수 있다. 그외에도, 60℃에서 10시간동안 열처리된 세룰로플라스민을 변성제(예.1-아스코르브산 또는 시안화나트륨)으로 더 처리할때 조차도, 변성된 생성물은 열처리하지 않고 변성제로 변성된 생성물 이상의 특성을 나타낼 수 있다. 그러므로 상기의 방법은 간염 비루스 등의 오염의 위험이 없고, 비.페르투시스의 내독소가 충분히 제거된다는 점에서 매우 우수하다.

상기에서 수득된 변성 세룰로플라스민을 리간드로 사용하는 친화 크로마토그래피는 단순한 방법에 의해 출발 비.페르투시스의 배양 배지로부터 고수율 및 고순도로 목적하는 LPF-HAF를 얻을 수 있게 한다. 그 외에도 친화 겔은 수십~수백배 이상 반복해서 사용될 수 있으므로, 경비가 적게든다는 점에서 유리하다. 본 발명의 방법은 또한 비.페르투시스의 내독소가 거의 제거될 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서 상기의 제1정제방법은 고순도의 LPF-HA를 수득하는 공업적 방법으로써 매우 유용하다. 그외에도, 수득된 LPF-HA는 매우 순수하고 다른 단백질, 지방 및 당류뿐만 아니라 내독소도 함유하지 않으므로, 목적하는 백일해 백신의 제조방법으로 유용하다.

고순도의 LPF-HA를 제조하는 제2방법은 상술한 F-HA의 정제에 사용된 것과 같은 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔 또는 교차 결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔과 같은 겔(일본국 특허출원 제150,945/1984,175,710/1984 및 190,744/1984호 참조)을 사용함으로써 수행된다. 이 방법은 비.페르투시스의 배양액을 겔로 처리하여 LPF-HA를 겔에 흡착시키고, LPF-HA를 용출시키는 단계를 포함한다.

제2방법에 사용된 출발 비.페르투시스의 배양액은 F-HA의 정제방법에 사용된 것 또는 상술한 LPF-HA의 제1정제방법에 사용된 것과 같은 것이다.

셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔을 사용한 LPF-HA의 정제방법은 하기와 같이 수행된다.

출발 LPF-HA 함유 용액은 비.페르투시스의 배양액을 원심분리하여 상층액의 비전도도가 0.1~5.0ms/cm가 되도록 증류수 또는 완충액으로 희석하고, 흡착처리함으로써 제조될 수 있다. 그러나 상층액은 보통 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔에 대한 친화성을 갖는 F-HA를 함유하기 때문에, 상층액을 LPF-HA는 흡착되지 않으나 F-HA는 흡착되는 조건하(비전도도 5.0~25.0ms/cm 및 pH 5~9로 조절된 출발용액을 비전도도 5.0~25.0ms/cm 및 pH 5~9의 완충액으로 평형된 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔이 패킹된 컬럼에 통과시킨다)셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔로 크로마토그래피하고, 컬럼을 통과한 F-HA는 함유하지 않으나 대량의 LPF-HA를 함유한 분획을 흡착처리한다.

LPF-HA를 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔에 흡착, LPF-HA가 흡착된 겔을 세척 및 LPF-HA를 용출하는 단계를 포함한 정제처리는 배치방법 또는 컬럼방법과 같이 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 컬럼방법의 경우, 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔을 컬럼에 패킹하고, 비전도도 0.1~5.0ms/cm 및 pH 5.0~9.0의 적당한 완충액, 예를들면 0.02M 맥일바인의 완충액(pH 5.2)을 통과시켜 미리 평형시킨 후, LPF-HA의 흡착에 사용한다.

흡착시 LPF-HA 함유 용액을 보통 pH 5.0~9.0 및 비전도도 0.5~5.0ms/cm로 조절하고, 셀룰로오즈 설페이트 겔 또는 기타 겔로 패킹된 컬럼에 통과시켜 LPF-HA를 흡착시킨다. 그리고나서 컬럼을 상기 평형에 사용된 것과 같은 완충액으로 세척하여 오염물질을 씻어낸다.

LPF-HA의 용출은 보통 pH 5.0~9.0 및 비전도도 5.0ms/cm 이상의 적당한 완충액을 통과시킴으로써, 바람직하게는 단계적 용출 또는 염 농도 경사 용출에 의해 수명된다. 즉, 비.페르투시스의 배양액을 원심분리함으로써 수득된 희석 상층액을 출발물질로 사용할때 F-HA는 상기 흡착 단계에서 LPF-HA와 함께 흡착되므로 LPF-HA는 용출되나 F-HA는 용출될 수 없는 조건하에 LPF-HA는 용출시켜야만 한다. 그 방법은 하기와 같다. 먼저 pH 5~9 및 비전도도 5~100ms/cm, 바람직하게는 50~60ms/cm의 적당한 완충액(예를들면 0.7M 염화나트륨 첨가 0.02M 맥일바인의 완충액)을 컬럼에 통과시켜 LPF-HA를 함유한 분획을 회수한다. 상기의 용출용 완충액 보다 더 큰 비전도도 (예.비전도도 100~300ms/cm)를 갖는 완충액을 통과시켜 F-HA 및 기타 불순물을 용출시켜 제거한 다음, 셀룰로오즈 셀페이트 겔 또는 기타 겔을 평형시켜 겔을 재사용한다.

가장 바람직한 용출은 염 농도 경사 용출 방법에 의해 수행된다. LPF-HA 함유 용액을 사용하는 경우, F-HA를 미리 제거하고, 빈전도도 0.25??300ms/cm의 염 농도 경사를 갖는 완충액(예.0??4.0M의 염화나트륨 농도 경사를 갖는 0.02M 맥일바인의 완충액(pH 5.2))을 사용하여 용출시켜 LPF-HA 함유 분획을 수득함으로써 고정제 LPF-HA를 수득할 수 있다.

상기의 정제방법에 따라 LPF-HA의 정제도는 수십배가 되며, LPF-HA의 회수율은 80%이상, 거의 100%가 된다. 그외에도 정제된 LPF-HA는 0.8∼0.9×10⁵LPF-Hp-ELISA 단위/mg 단백질의 높은 비활성을 가지며, 폴리아크릴아미드 디스크 전기영동분석(pH 4.5)에서 단일 밴드를 형성한다. 이것은 비.페르투시스 내독소가 거의 완전히 제거된다는 것을 의미한다.

그러므로 상기의 정제방법에 따라 비.페르투시스의 배양액으로부터 단순한 조작에 의해 목적하는 LPF-HA를 고수율 및 고순도로 분리될 수 있으며, 크로마토그래피 흡착제를 저가로 제조할 수 있고 폐기하지 않고 반복해서 사용할 수 있으므로 이 방법은 경제적인 측면에서 매우 우수하다. 따라서 이 제2정제방법은 고정제 LPF-HA를 제조하는 공업적 방법으로 매우 우수하다. 필요하다면 슈클고오즈 밀도 경사 초원심분리, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같은 공지의 정제방법과 아울러 정제시킬 수 있다.

이렇게 수득된 정제된 LPF-HA는 매우 순수하고, 다른 단백질, 지방, 당류등을 함유하지 않으며, 내독소도 거의 완전히 제거되었으므로 최종 백신을 제조하는 출발물질로 사용될 수 있다. 백신을 제조하기 위해 정제된 LPF-HA를 아미노산 존재 또는 부재하에 포르말린을 사용하여 통상의 방법에 의해 톡소이드로 전환시킨 후 사용한다.

본 발명의 백일해 성분 백신은 고순도 F-HA 또는 그의 톡소이드 및 고순도 LPF-HA의 톡소이드를 두 성분의 양이 인체에 필요한 최소량의 항원을 줄 수 있는 비율이 되도록 단순히 혼합함으로써 제조될 수 있다. LPF-HA를 그외 톡소이드로 전환시키는 것은 그를 F-HA와 혼합하기전 또는 후에 수행될 수 있다. 예를들어, 포르말린은 LPF-HA 또는 LPF-HA와 F-HA의 혼합물에 0.1~1.0%양으로 가하고, 혼합물을 22~40℃에서 7~35일간 방치한 후 포르말린을 0.2%량으로 가하고, 혼합물을 임의로 가끔 진탕하면서 실온에서 1~3일간 방치함으로써 LPF-HA이 독설을 저하시킨다. 독성의 저하를 확인한 후 혼합물을 적당한 단백질 함량, 보통 최종 단백질 질소 함량 10~25㎍/ml로 조절한다. 혼합물을 수산화알루미늄 또는 인산 알류미늄과 같은 공지의 보조제와 임의로 혼합하고, 젤라틴 또는 글쿠코오즈와 같은 안정제 및 티메로살과 같은 보존제를 가한후 pH를 5.4~7.4 범위로 조절하여 목적하는 백일해 성분 백신을 수득한다. LPF-HA만을 미리 톡소이드로 전환시킬때 고순도 F-HA 또는 그의 톡소이드와 혼합한다.

혼합된 백신은 백일해 성분 백신을 디프테리아 톡소이드(최종 농도 : 30Lf/ml) 및 파상풍 톡소이드(최종 농도 : 5Lf/ml)와 혼합함으로써 제조될 수 있다.

이렇게 수득된 백신을 동결건조시켜 생성물을 수득할 수 있다.

본 발명은 하기의 제법 및 실시예에 의해 설명되며, 이들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[제법 1]

피리딘(600ml)에 0℃ 이하에서 클로로술폰산(117g)을 적가한다. 적가후 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈 겔(셀룰로핀 GC-15, 치소사제)(80g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 3시간동안 교반한다. 반응 후 반응혼합물을 냉각시키고, 1% 수성 수산화나트륨으로 중화시킨다. 이렇게 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충액-수성 염화나트륨 혼합물로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트 겔을 수득한다.

상술한 방법으로 수득된 셀룰로핀 GC-15 설페이트 겔을 컬럼(400mmφ×130mmφ)내에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 인산완충액(pH 7.6, 전전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형시킨다. 비.페르투시스상 Ⅰ도 하마균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH 7.6; 300ℓ)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨 첨가 인산 완충용액(pH 7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ℓ)을 수득한다. 배양상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 1에 나타낸다.

F-HA의 회수율은 95%이고, 정제도(정제된 F-HA 분획의 비활성/배양상층액의 비활성)은 23배이다. 그 외에도 정제된 F-HA 분획의 LPF-HA 활성은 5.0LPF-Hp-ELISA 단위/ml 보다 적다.

[표 1]

[제법 2]

피리딘(600ml)에 0℃ 이하에서 클로로술폰산(117g)을 적가한다. 적가후 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈(크로마토그래피용 아비셀, 아시히가세이제)(80g)를 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간동안 교반한다. 반응후 반응혼합물을 냉각시키고, 10% 수성 수산화나트륨으로 중화시킨다. 이렇게 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산 완충액-수성 염화나트륨 혼합물로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트 겔을 수득한다.

상기와 같은 방법으로 수득된 아비셀 설페이트 겔을 컬럼 (400mmφ×130mmφ)에 패킹하고, 0.14M 염화나트륨 첨가 0.01M인산 완충액(pH 7.6)으로 평형시킨다. 비.페르투시스상 Ⅰ도 하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 15ms/cm, pH 7.6 ; 300ml)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨 첨가 인산 완충액(pH 7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ℓ)을 수득한다.

배양상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA을 함유한 분획을 분석 데이타는 표 2에 나타낸다.

F-HA의 회수율은 75%이며, 정제도는 14배이다.

[표 2]

[제법 3]

피리딘(500ml)에 클로로술폰산(82g)을 0~5℃에서 적가한다. 적가후 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 결정성 셀룰로오즈 겔(셀롤로핀 GH-25, 치소사제)(80g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간동안 교반한다. 반응후 반응혼합물을 냉각시키고, 10% 수성 수산화나트륨을 점차로 가하여 중화시킨다. 이렇게 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산완충액-수성 염화나트륨 혼합물(pH 7.2)로 잘 세척하여 셀룰로오즈 설페이트 겔을 수득한다.

상술한 방법으로 수득된 셀롤로오즈 설페이트 겔 컬럼400mmφ×130mmφ)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 인산완충액(pH 7.6)으로 평형시킨다. 제법 1에서 사용된 것과 같은 비.페르투시스상 Ⅰ도 하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm,pH 7.6;300ℓ)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 상술한 완충액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨 첨가인산 완충액(pH 7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ℓ)을 수득한다.

배양상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 3에 나타낸다.

F-HA의 회수율은 93.8%이고, 정제도는 25배이다.

미니엄 리콰이어먼트 어브 바이오로지칼 프로덕트, ＂백일해 백신＂(Notification of the Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan, #287, 1981)에 기재된 방법에 따라 정제된 생성물을 생쥐 체중증가 독성 시험, 생쥐 백혈구 증가 독성 시험, 열불안정 독성 유리시험 및 생쥐 히스타민 민감성 독성 시험을 수행한다.

그 결과 모두 시험에서 정제된 생성물은 대조군(생리식염수 사용)과 동일하였으며, 이는 부작용이 관찰되지 않는다는 것을 의미한다.

[표 3]

[제법 4]

소듐 덱스트란 설페이트(5g)를 0.5M 수성탄산나트륨(20ml)에 용해시키고, 0.5M 수성 탄산나트륨으로 평형된 세파로즈 CL-4B(아가로즈 겔, 스웨덴 파마시아 파인 케미칼제)(20ml)를 가한 후, 혼합물을 부드럽게 교반한다. 혼합물에 증류수(100ml)에 용해시킨 시아노 브로마이드(10g) 용액을 교반하면서 가한다. 혼합물에 5M 수성 수산화나트륨을 가하여 pH 11로 유지하면서 혼합물을 15분간 유지시킨다. 그리고 pH값을 낮추면서 혼합물을 실온에서 17시간동안 교반한다. 반응후, 반응혼합물을 유리필터로 여과하고, 수득된 겔을 0.15M 염화나트륨 첨가 인산완충액(pH 7.2)으로 잘 세척하여, 덱스트란 설페이트 아가로즈 겔(20ml)을 수득한다.

상술한 방법으로 수득된 덱스트란 설페이트 아가로즈 겔을 컬럼(16mmφ×100mmφ)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 인산완충액(pH 7.6, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형시킨다. 비.페르투시스상 Ⅰ도 하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH 7.6;800ml)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 상기와 같은 완충액 및 0.20M 염화나트륨 첨가 인산완충액(pH 7.6, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨첨가 인산완충액(pH 7.8, 비전도도 : 약 120ms/cm)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(29ml)을 수득한다.

배양상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA를 함유한 분획의 분석 데이타는 표 4에 나타낸다.

F-HA의 회수율은 90%이며, 정제도는 17배이다.

[표 4]

[제법 5]

피리딘(200ml)℃ 이하에서 클로로술폰산(11ml)을 적가한다. 적가후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 혼합물에 에피클로로히드린-교차결합 덱스트란(세파덱스 G-50, 파마시아제)(7.5g)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간동안 교반한다. 반응후, 반응혼합물을 냉각시키고, 수성 수산화나트륨으로 중화시킨다. 이렇게 수득된 겔을 여과하여 분리하고, 0.01M 인산완충액 용액으로 잘 세척하여 교차결합된 덱스트란 설페이트를 수득한다.

상술한 방법으로 수득된 세파덱스 G-50 설페이트 겔을 컬럼16mmφ×100mmφ)에 패킹하고, 0.2M 염화나트륨 첨가 0.01M 인산완충액(pH 7.6, 비전도도 : 약 17.5ms/cm)으로 평형시킨다. 비.페르투시스상 Ⅰ도 하마 균주의 발효기 배양액의 상층액(비전도도 : 약 17.5ms/cm, pH 7.6;800ml)을 컬럼에 통과시킨다.

컬럼을 상기와 같은 완충액으로 잘 세척하여 오염물을 제거한 후, 흡착된 물질을 1.5M 염화나트륨 첨가 인산완층 용액(pH 7.6)으로 용출시켜 F-HA를 함유한 분획(30ml)을 수득한다.

배양상층액, 통과된 분획 및 정제된 F-HA를 함유한 분획 분석 데이타는 표 5에 나타낸다.

F-HA의 회수율은 93.8%이고, 정제도는 약 20배이다.

[표 5]

[제법 6]

상기 제법 1에서 셀룰로오즈 설페이트 겔에 F-HA함유 용액을 흡착시킴으로써 수득된 통과된 분획(64HA 단위/ml, 1700 LPF-Hp-ELISA 단위/mL, 0.46mg 단백질/ml, pH 7.6)을 출발물질로 사용한다.

출발물질을 문헌(L.I. Irons et al., Biochim. Biophys. Acta, 580, 175~185, 1979)에 기재된 방법에 따라 0.01M 인산완충액(pH 6.0)으로 평형된 히드록시-인회석 컬럼에 통과시켜 LPF-HA를 흡착시킨다. 흡착된 물질을 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 인산완충액 (pH 7.0)으로 용출시켜 단백질 분획(부분정제 LPF-HA)를 수득한다. 수득된 단백질 분획을 리간드로 합토글로빈-세파로즈를 사용하여 친화크로마토그래피하고, 흡착된 물질을 0.5M 염화나트륨 및 3M 티오시안화 칼륨을 함유한 0.05M 인산완충액(pH 7.6)으로 용출시킴으로써 표 6에 나타낸 바와 같은 분석 데이타를 나타내는 정제된 LPF-HA를 회수한다(회수율 : 53%).

[표 6]

[제법 7]

인체 셀롤로플라스민의 제법 :

인체 혈장의 알콜 분획에 의해 수득된 콘의 분획 Ⅳ-1을 출발물질로 사용한다. 출발물질을 모렐등의 정제방법[J. Biol. Chem., 244 3494(1967)]에 의해 정제하여 인체 셀룰로플라스민을 분리한다.

즉, 콘의 분획 Ⅳ-1을 DEAE-세파로즈 CL-6B으로 이온교환 크로마토그래피하고, 헤모글로빈-세파로즈 겔로 친화크로마토그래피하여 합토글로빈의 가능한 오염물을 제거한다. 용액을 황산암모늄으로 염석시키고, 0.025M 아세테이트 완충액(pH 5.25)에 투석시켜 결정성 인체 세룰로플라스민을 수득한다.

변성된 세룰로플라스민의 제법 :

상기에서 수득된 결정성 세룰로플라스민을 모렐들등의 사이언스, 127, 588(1963)에 기재된 방법과 유사한 방법으로 변성시켜 하기의 각종 변성 세룰로플라스민을 제조한다.

(1) 시안화나트륨으로 변성된 세룰로스플라스민 :

결정성 세룰로플라스민의 1w/v% 수용액(50ml)을 0.05M 시안화나트륨(5.0ℓ)를 함유한 인산완충액(pH 7.4, 이온강도 : 0.2)에 4℃에서 12시간동안 투석시켜 옥시다제 활성이 90% 소실된 시안화나트륨 변송 세룰로플라스민을 수득한다.

(2) 시안화나트륨 변성 세룰로플라스민의 열처리 :

시안화나트륨 변성 세룰로플라스민의 열처리 :

시안화나트륨 변성 세룰로플라스민의 1w/v% 수용액을 상기 (1)과 같은 방법으로 제조한다. 용액(50ml)을 0.1M 인산완충액(pH 7.4)(5.0ℓ)에 투석한다. 투석후, 변성된 세룰로플라스민 함유 용액을 60℃에서 10시간동안 가열한다.

(3) L-아스코르브산으로 변성된 세룰로플라스민 :

결정성 세룰로플라스민의 1w/v% 수용액을 L-아스코르브산(5mg/ml)을 함유한 아세테이트 완충액(pH 5.2, 이온강도 : 1.2)(5.0ℓ)에 4℃에서 36시간동안 투석시켜 65.5% 옥시다제 활성을 나타내는 L-아스코르브산 변성 세룰로플라스민을 수득한다.

(4) 열처리에 의해 변성된 세룰로플라스민 :

5w/v%의 결정성 세룰로플라스민을 함유한 0.1M 인산완충액(pH 7.5)(100ml)을 60℃에서 15시간 동안 열처리한다.

(5) L-아스코르브산으로 변성된 열처리된 세룰로플라스민 :

인체 혈장의 알콜 분획화에 의해 수득된 콘의 분획Ⅳ-1을 60℃의 중탕에서 10시간동안 가열한다. 용액을 모렐등의 방법{Science, 127, 588(1963)]으로 처리하여 열처리된 결정성 세룰로플라스민을 수득한다.

이렇게 수득된 열처리된 결정성 세룰로플라스민을 상기 (3)과 같은 방법으로 처리하여 L-아스코르브산을 변성된 열처리된 세룰로플라스민을 수득한다.

친화 겔의 제법 :

상기의 각종 변성된 세룰로플라스민(리간드로 사용)을 CNBr-활성화 세파로즈 4B(파마시아제)와 함께 하기의 방법으로 결합반응 시켜 친화 겔을 제조한다.

CNBr-활성화 세파로즈 4B(1.5g)을 1.0mM 염산(3.0ℓ)에 15분간 침지시켜 팽창시키고, 유리필터에 흡인시킴으로서 1.0mM 염산을 제거하여 생성된 세파로즈 겔(5.25ml)을 수득한다.

한편, 리간드(단백질량 : 150mg)을 0.5M 염화나트륨을 함유한 0.1M 탄산나트륨 완충액(pH 8.2, 73ml)에 용해시키고, 상기에서 제조된 팽창된 세파로즈 겔(5.2ml)을 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간동안 천천히 교반하여 결합반응을 완결한다. 결합반응 후, 반응혼합물을 상기와 같은 탄산나트륨 완충액(150ml)로 4번 세척하고, 여기에 1.0M 에탄올 아민(pH 8.0, 150ml)을 가한 후, 혼합물을 2시간 동안 천천히 교반하면서 다시 반응시킨다. 반응완결 후, 반응혼합물을 상기와 같은 탄산나트륨 완충액(150ml)으로 4번 세척하여 에탄올 아민을 제거한다. 생성된 겔을 1.0M 염화나트륨 함유한 0.1M 아세테이트 용액(pH 8.0)(150ml)로 3번 세척하고, 1.0M 염화나트륨을 함유한 0.1M 보레이트 완충액(pH 8.0)으로 3번 더 세척한다. 아세테이트 완충액 및 보레이트 완충액의 세척을 각각 3번 더 반복하여 각종의 변성된 세룰로플라스민-세파로즈 친화 겔을 수득한다.

컬럼방법에 의한 LPF-HA의 정제 :

상기에서 제조된 친화 겔(20ml)을 컬럼(28mm×φ2mmφ)에 패킹하고, 상기 제법 6에서 사용된 것과 같은 출발물질(5.0ℓ)을 실온에서 150ml/cm²/시의 유속으로 컬럼에 통과시킨다. 1.0M 염화나트륨을 함유한 0.14M 인산완충액(pH 7.0, 1500ml)을 상기와 같은 유속으로 컬럼에 통과시켜 컬럼을 세척한다.

세척후, 1.0M 염화나트륨 및 3.0M 티오시안화나트륨을 함유한 0.1M 인산완충액(pH 7.5)으로 구성된 용리액(100ml)을 35.0ml/cm²/시의 유속으로 컬럼에 통과시켜 LPF-HA를 용출시킨다.

각종의 변성된 세룰로플라스민을 리간드로 사용하여 친화 겔을 사용하는 경우의 실험 데이타 및 LPF-HA 분획의 분석 데이타는 표 7에 기재된다.

결과에서 명백한 바와 같이, 각종의 변성된 세룰로플라스민을 리간드로 사용하는 경우, 수득된 LPF-HA는 높은 순도 및 높은 비활성을 갖는다.

[표 7]

[제법 8]

상기 제법 1과 같은 방법을 수득한 셀룰로핀 GC-15설페이트 겔을 컬럼(40mmφ×200mm)에 패킹하고, 증류수(1.0ℓ)를 통과시킨다. 비.페르투시스, 상Ⅰ 도하마균주의 발효기 배양액의 상층액(5,000ml)을 증류수로 10배 희석하고, 희석된 용액(비전도도 : 약 1.5ms/cm)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 0.02M 맥일바인의 완충액(pH 5.2, 약 50,000ml)으로 잘 세척한후, 흡착된 물질을 염화나트륨 0→4.0M 농도 경사의 0.02M 염화나트륨 첨가 맥일바인의 완충액(비전도도 : 약 2.0ms/cm, pH 5.2)으로 용출시켜, 분획(각각 약 20ml)을 수거하고, LPF-HA를 함유한 분획(액 130ml)을 모은다.

출발물질 및 정제된 LPF-HA의 실험 데이타 및 분석 데이타는 표 8에 나타낸다.

[표 8]

[제법 9]

상기 제법 4과 같은 방법으로 수득된 덱스트란 설페이트-아가로즈 겔을 컬럼(40mmφ×200mm)에 패킹하고, 증류수(1,000ml)을 통과시킨다. 상기 제법 8에서 사용된 것과 같은 상층액(5000ml)를 증류수로 7배 희석하고, 희석된 용액(비전도도 : 약 2.0ms/cm)을 컬럼을 통과시킨다. 컬럼을 0.02M 맥일바인의 완충액(pH 5.2, dir 20,000ml)으로 잘 세척한 후, 흡착된 물질을 0→4.0M 염화나트륨 농도 경사의 0.02M 염화나트륨 첨가 맥일바인의 완충액(비전도도 : 약 2.0ms/cm, pH 5.2)으로 용출시켜 분획(각각 약 20ml)을 수거하고, LPF-HA 분획의 실험 데이타 및 분석 데이타는 표 9에 나타낸다.

[표 9]

[제법 10]

피리딘(200ml)에 0℃ 이하에서 클로로술폰산(11ml)을 적가한다. 적가한후, 혼합물을 65~70℃로 가열한다. 피리딘-클로로술폰산의 혼합물에 피리딘으로 포화된 교차결합된 아가로즈겔(세파로즈 CL-6B, 파마시아제)(30ml)을 가하고, 혼합물을 65~70℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 수성 수산화나트륨으로 중화시킨다. 수득된 겔을 여과하고 분리하고, 0.01M 인산완충염 용액으로 잘 세척하여 교차결합된 아가로즈 설페이트(23ML0을 수득한다.

상기에서 수득한 교차결합된 아가로즈 설페이트 겔을 컬럼(40mmφ×200mm)에 패킹하고, 증류수(1,000ml)를 통과시킨다. 상기 제법 8에서 사용된 것과 같은 상층액(5000ml)를 증류수로 9배 희석하고, 희석된 용액(비전도도 : 약 2.0ms/cm)을 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 0.02M 맥일바인의 완충액(pH 5.2, 약 20,000ml)으로 잘 세척한 후, 흡착된 물질을 0→4.0M 염화나트륨 농도 경사의 0.02M 염화나트륨 첨가 맥일바인의 완충액(비전도도 : 약 2.0ms/cm)을 수거하고, LPF-HA를 함유한 분획(약 200ml)을 모은다. 출발물질 및 정제된 LPF-HA 분획의 실험 데이타 및 분석 데이타는 표 10에 나타낸다.

[표 10]

[실시예 1~7]

편리를 위해, 제법 1,2,3,4 및 5에서 수득한 F-HAs는 각각 시료 a,b,c,d 및 e로 하고, 제법 6,7,8,9 및 10에서 수득된 정제는 LPF-HAs는 각각 시료 V,W,X,Y 및 Z로 한다.

이들 시료를 사용함으로써, 각종 백일해 성분 백신을 하기의 방법으로 제조한다. 상기의 시료를 최종 정제 단계에서 막 필터(0.45ml)로 여과시킴으로써 살균한다.

각 시료 V,W,X,Y 및 Z를 젤라틴(최종 농도 : 0.02v/v%)및 트윈 80(최종 농도 : 0.05v/v%)를 가하고, 포르말린(최종 농도 :0.6v/v%)를 더 가한 후, 혼합물을 40℃에서 2일간 투석시킴으로써 포르말린을 제거한다.

한편, 시료 a,c 및 e를 각각 포르말린(최종 농도 : 0.02v/v%)으로 40℃에서 밤새 프로말린화하여 약간 남아 있는 LPF 활성을 제거함으로써, F-HA 톡소이드를 수득한다. 상술한 것과 같은 방법으로 포르말린을 제거한다. 시료 b 및 d는 그 자체로(즉, 톡소이드를 형성하지 않고) 백신의 제조에 사용한다.

이들 F-HA 시료 b 및 d 및 F-HA 시료 a,c 및 e의 톡소이드를 표 11에 나타낸 각종 배합 방법으로 LPF-HA 시료 V,W,X,Y 및 Z의 톡소이드와 혼합하고, 각 혼합물에 Al(OH)₃(알루미늄으로한 최종 농도 : 약 0.2mg/nl) 및 티메로산(최종 농도 : 0.01v/v%)를 가한후, 혼합물의 최종 pH를 6.7~6.8로 조절하여 7종의 침전된 백일해 성분 백신을 수득한다.

[표 11]

실시예 1~7의 모든 백신을 문헌(Minimum Requirement of Biological Products, Minstry of Health and Welfare, Japan, #287, 1981.)에 기재된 방법으로 일반적 특성시험, 쥐에 독성시험 및 쥐에 활성시험을 수행한다. 그 결과, 그의 모든 특성은 표 12에 나타낸 바와 같이 만족스럽다.

[표 12]

[실시예 8]

실시예 1 및 7에서 제조된 LPF-HA 톡소이드 W 및 F-HA 톡소이드(각각 최종 농도 : 50㎍ 단백질/ml)를 티프테리아 톡소이드 및 파상풍톡소이드(최종 농도 : 각각 33Lf/ml 및 5Lf/ml)와 혼합하고, Al(OH)₃, 젤라틴 및 티메로산(최종 농도 : 각각 0.2mg Al/ml, 0.02w/v%, 및 0.01%)로 혼합한 후, 혼합물을 최종 pH 6.7로 조절하여, 침전된 정제 백일해-디프테리아-파상풍 백신을 수득한다.

이 백신의 특성을 실시예 7과 같은 방법으로 시험한다. 그 결과 모든 특성은 표 13에 나타낸 바와 같이 만족스럽다. 그외에도, 상기 백신의 동결 건조된 생성물은 동결건조 되기전의 생성물과 유사한 결과를 나타낸다.

[표 13]

그외에도 본 발명의 백신을 생쥐의 단독 반응시험에 의해 국소반응(부작용으로)의 측면에서 시판되는 백신과 비교한다.

시험은 무노즈, 제이.제이 등의 방법{J.Reticuloendotherial Society, 27, 259~268(1980)]을 변형시켜 수행한다. 즉, dd/F, SPF 생쥐(4주, 1군:10생쥐)에 각 백신(0.5ml)을 복강내 주사하여 면역시키고, 2주후, 같은 백신(0.025ml)을 생쥐의 발바닥에 피하접종시킨다.(감응주사). 접종후, 생쥐의 발바닥에 두께증가가 다이알두께 거즈로 일정한 간격으로 측정하고, 각군 10마리의 평균치를 부어오는 정도로 나타낸다. 결과는 첨부하는 도면 제1도로 나타낸다.

결과로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 백신(E~G)은 종래의 생성물(A) 및 에셀룰라 백신인 시판되는 생성물(B~D)와 비교해볼때 생쥐 발바닥의 매우적게 부오 오른다(부작용이 적다). 시험된 백신은 다음과 같다 :

A…세포백신(백일해 및 디프테리아 톡소이드의 혼합백신)(종래의 시판품)

B…침전된 정제 백일해 항원-디프테리아 톡소이드-백일해 톡소이드 혼합백신(시판되는 생성물)

C…상기와 동일(〃)

D…상기와 동일(〃)

E… 실시예 1의 백신

F… 실시예 4의 백신

G… 실시예 8의 백신

H…0.2mg의 알루미늄을 함유한 PBS(염화나트륨 첨가 인산 완충액)(pH 6.7)(참고)

[주] : 시판되는 생성물 B,C 및 D는 각각 다른 회사에서 판매되고 있다.

그러므로, 본 발명은 출발 F-HA 및 LPF-HA를 쉽게 수득할 수 있기 때문에 적은 경비로 공업적 규모로 반응과 같은 부작용이 없는 개량된 백일해 성분 백신 및 백일해 항원-디프레이타 톡소이드-파상풍 톡소이드의 혼합백신을 고수율 및 고순도로 제공한다.

Claims

F-HA-함유 용액을 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔 및 교차결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔의 군에서 선택된 겔과 접촉시켜 F-HA를 흡착시키고, 흡착된 F-HA를 겔로 부터 용출시킴으로써 제조된 정제된 F-HA 또는 그의 톡소이드 및 정제된 LPF-HA 톡소이드를 혼합함을 특징으로 하는 백일해 성분 백신의 제조방법.
제1항에 있어서, 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔 및 교차결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔로 부터 선택된 겔을 pH 6.0~9.0 및 비전도도 5.0~25.0ms/cm의 완충액으로 미리 평행시키고, F-HA를 흡착시키는 방법.
제1항에 있어서, 흡착을 pH 6.0~8.0, 온도 0~30℃ 및 비전도도 5.0~25.0ms의 조건하에 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 겔로 부터 F-HA의 용출을 pH 5.0~10.0 및 비전도도 25.0~130ms/cm의 완충액을 수행하는 방법.
제4항에 있어서, F-HA-흡착된 겔을 용출전에 pH 5.0~10.0 및 비전도도 5.0~25.0ms/cm의 완충액으로 세척하는 방법.
제1항에 있어서, 셀룰로오스 설페이트가 결정성 셀룰로오즈 및 결정성 부분과 비결정성 부분을 갖는 셀룰로오즈로 부터 선택된 셀룰로오즈의 황산에스테르인 방법.
제1항에 있어서, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드겔이 덱스트란 설페이트-아가로즈겔, 덱스트란 설페이트-덱스트란겔 및 덱스트란 설페이트-셀룰로오즈겔인 방법.
제1항에 있어서, 교차 결합된 폴리사카라이드 셀페이트가 교차결합된 덱스트란 설페이트, 교차결합된 아가로즈 설페이트 및 교차결합된 셀룰로오즈 설페이트의 군에서 선택된 것인 방법.
제8항에 있어서, 교차결합된 덱스트란 설페이트가 에피클로히드린-교차결합 덱스트란 설페이트인 방법.
제8항에 있어서, 교차결합된 아가로즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차결합된 아가로즈 설페이트인 방법.
제8항에 있어서, 교차결합된 셀룰로오즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차결합된 셀룰로오즈 설페이트인 방법.
제1항에 있어서, 정제된 LPF-HA가 LPF-HA-함유 용액을 리간드로 합토글로빈 또는 세룰로플라스민을 사용하여 친화 크로마토그래피하여 LPF-HA를 흡착시키고, LPF-HA를 용출시킴으로써 제조되는 방법.
제12항에 있어서, LPF-HA-함유용액을 리간드로 합토글리빈 또는 세룰로플라스민을 사용하여 친화 크로마토그래피 하기전에 히드록시 인회석으로 처리함으로써 부분 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 정제된 LPF-HA가 LPF-HA-함유 용액을 리간드로 변성된 세룰로플라스민을 사용하여 친화 크로마토그래피하여 LPF-HA를 흡착시키고, LPF-HA를 용출시킴으로써 제조되는 방법.
제14항에 있어서, 친화 크로마토그래피를 Ph 4.0~10.0으로 조절된 LPF-HA-함유용액에 수행하는 방법.
제14항에 있어서, 변성된 세룰로플라스민이 인체-또는 기타 동물-유래의 세룰로플라스민인 방법.
제14항에 있어서, 변성된 세룰로플라스민이 인체-또는 기타 동물-유래의 세룰로플라스민을 60~85℃에서 1~24시간동안 열처리함으로써 수득되는 방법.
제14항에 있어서, 변성된 세룰로플라스민이 인체-또는 기타 동물-유래의 세룰로플라스민을 환원제, 시아노화합물 및 킬레이트화제의 군에서 선택된 변성제로 처리하여 구리이온을 환원시키거나 구리이온의 일부 또는 전체를 제거시킴으로써 수득되는 방법.
제14항에 있어서, 리간드에 흡착된 LPF-HA를 카오트로픽 베이스, 에틸렌글리콜, 디옥사느 우레아, 구아니딘히드로클로라이드 및 EDTA의 군에서 선택돤 용리제로 용출시키는 방법.
제1항에 있어서, 정제된 LPF-HA가 LPF-HA-함유 용액을 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔 및 교차결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔의 군에서 선택된 겔과 접촉시켜 LPF-HA를 흡착시키고, 흡착된 LPF-HA를 겔로 부터 용출시킴으로써 제조되는 방법.
제20항에 있어서, 흡착을 pH 5.0~9.0, 온도 0~30℃ 및 비전도도 0.5~5.0ms/cm의 조건하에 수행하는 방법.
제20항에 있어서, 겔로부터 LPF-HA의 용출을 비전도도 5.0~100.0ms/cm의 완충액으로 수행하는 방법.
제22항에 있어서, LPF-HA-흡착된 겔을 용출전에 비전도도 0.5~5.0ms/cm의 완충액으로 세척하는 방법.
제20항에 있어서, 셀룰로오즈 설페이트가 결정성 셀룰로오즈 및 결정성 부분과 비결정성 부분을 갖는 셀룰로오즈로 부터 선택된 셀룰로오즈의 황산에스테르인 방법.
제20항에 있어서, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔이 덱스트란 설페이트-아가로즈겔, 덱스트란 설페이트-덱스트란 설페이트-덱스트란 겔 및 덱스트란 설페이트-셀룰로오즈 겔인 방법.
제20항에 있어서, 교차결합된 폴리사카라이드 설페이트가 교차결합된 셀룰로오즈 설페이트, 교차결합된 아가로즈 설페이트 및 교차결합된 덱스트란 설페이트의 군에서 선택된 것인 방법.
제26항에 있어서, 교차결합된 셀룰로오즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차결합 셀룰로오즈 설페이트인 방법.
제26항에 있어서, 교차결합된 아가로즈 설페이트가 에피클로로히드린-교차결합된 아가로즈 설페이트인 방법.
제26항에 있어서, 교차결합된 덱스트란 설페이트가 에피클로로히드린-교차결합된 덱스트란 설페이트 방법.
제1항에 있어서, F-HA 또는 LPF-HA의 톡소이드가 공지의 포르말린화에 의해 제조되는 방법.
F-HA-함유 용액을 셀룰로오즈 설페이트 겔, 덱스트란 설페이트와 화학적으로 결합된 폴리사카라이드 겔 및 교차결합된 폴리사카라이드 설페이트 겔의 군에서 선택된 겔과 접촉시켜 F-HA를 흡착시키고 흡착된 F-HA를 겔로 부터 용출시킴으로써 제조된 정제된 F-HA 또는 그의 톡소이드 및 정제된 LPF-HA 톡소이드를 혼합함으로써 백일해 성분 백신을 제조하고, 이 백일해 성분 백신에 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드를 가함을 특징으로 하는 백일해 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 혼합 백신의 제조방법.