JP2549225B2 - 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法 - Google Patents

百日咳菌外膜蛋白質の精製方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、分子量が約69,000ダルトンであり、以前に
は69kDaタンパク、また現在ではパータクチンと呼ばれ
る百日咳菌（Bordetella pertussis）の培養ブロス及
び細胞抽出液から得られる外膜蛋白質の新規な精製方法
に関するものである。本方法により得られるタンパク
は、百日咳疾患予防のための「コンポーネント」ワクチ
ンに使用される。
背景技術 百日咳疾患は、百日咳菌（Bordetella pertussis）
の感染によるもので、人間、特に幼児で重篤な衰弱性疾
患である。過去50年間に、本疾患は大規模な免疫プログ
ラムにより予防されてきた。北米で現在認可されている
ワクチンは、「全細胞型」ワクチンで、細菌を発酵槽内
で培養した後、得られた百日咳菌（B.pertussis）の細
胞をホルムアルデヒドなどの化学薬品で処理して殺菌
し、有毒なタンパクを不活化して調製する。この細胞を
再度懸濁した後、直接もしくはその他の抗原と混合して
使用する。このワクチンは効力が高いが、発熱、局所反
応、号泣及び痙攣などの臨床症状を併発する。これらの
症状とワクチンの関係は立証されていないにも関わら
ず、このワクチンに対する一般の許容は低下し、多数の
国、例えば日本、スウェーデン、英国などでは予防接種
率が減少し、百日咳疾患の大発生を招いている。さらに
限定的なワクチンの必要性が認められており、きわめて
精製度の高い少数のタンパクから成る有効な百日咳ワク
チンの開発に向け、多くの製薬会社及び研究者が大いに
努力してきた。このワクチンは、成分ワクチンと呼ばれ
ている。
この研究は、百日咳菌（B.pertussis）の病原性機序
に関する情報不足のため、あまり進歩していない。リン
パ球増多症促進因子（LPF）としても知られる百日咳毒
素（PT）、糸状血球凝集素（FHA）、アデニル酸シクラ
ーゼ（アデニレートシクラーゼ:adenylate cyclas
e）、リポ多糖体、凝集原及びその他の外膜タンパクな
ど毒性に関与する多数の因子は、コンポーネントワクチ
ンと比較して限定性が低い「無細胞」ワクチンに含める
べきだとされている。最近の臨床試験の結果、PT−トキ
ソイドのめから成るワクチンは、幼児の感染を部分的に
予防するに過ぎないことが指摘されている。PT/FHA混合
ワクチンは、効果がやや高いが、全細胞ワクチンと比較
すると、効果があることが知られている。
可能性の高い予防活性抗原の１つに、百日咳菌（B.pe
rtussis）の全ての有毒菌株で認められる分子量が約69,
000ダルトンの外膜タンパク（パータクチン）がある。
このタンパクは、細菌培養中に比較的大量に産生し、発
酵ブロスまたは細胞抽出液のいずれからも精製すること
ができる。本発明は、この精製を行うための新規な方法
を提供するものである。
ヒト百日咳ワクチンとしての本外膜タンパクの重要性
は、ブタの気管支敗血症菌（B.bronchiseptica）に対す
るを予防ワクチンの創製研究の結果から示唆された。す
なわち、気管支敗血症菌（B.bronchiseptica）の細胞表
面抽出液を用いて、雌ブタの免疫を試みたところ、分子
量が68,000ダルトンの細胞表面抗原に対する抗体量と、
ブタの新生仔の感染予防の間に相関が認められた。ほぼ
同じ分子量を有する抗原が、百日咳菌（B.pertussis、
約69,000ダルトン）及びパラ百日咳菌（B.parapertussi
s、約70,000ダルトン）で検出された。百日咳菌（B.per
tussis）から得られたタンパクで免疫を与えたマウス
は、生存菌を大脳に接種しても発病せず、この試験で、
タンパクに対する抗体が、マウスに受動的免疫を付与し
た。また、エーロゾル感染モデルにおいてもマウスの能
動的及び受動的な防御作用が報告されている。
発表されているパータクチンの精製手順では、精製度
の高い非発熱原性の安定した抗原を大量に産生すること
が不可能である。すでに報告されている方法（カナダ特
許第1,253,073号）は、細胞の酸グリシン抽出、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー及び分取型等電点電気泳動法
に関するものである。しかし、この方法により得られる
パータクチンは、さらに小さなフラグメントに分解し、
pHが低下すると分解し、またアデニル酸シクラーゼ活性
を有することが報告されている。このため、この抽出方
法はタンパクの大規模製造には望ましくないと思われ
る。また、等電点電気泳動法も、大量製造には不適当で
ある。第２の手順は、百日咳菌（B.pertussis）の非采
状な菌株の細胞から外膜タンパクを抽出するものであっ
た。このタンパクは、DEAE−セファロース及びアフイゲ
ル−ブルーによるクロマトグラフィーを併用して精製し
た。青色染料が精製物中に浸出する可能性があるため、
安全性に問題がある。ただし、いずれの場合にも、発酵
ブロスから直接パーメクチンを精製する方法は述べられ
ていない。
発明の概略 本発明を実施した場合、以下に記述する方法を用い
て、パータクチンは、好ましい製造源である発酵ブロス
から大量に、かつ精製された形で得ることができる。こ
のタンパクは、幼児の百日咳ワクチンとして広く用いる
製剤に封入することができる。
発酵槽内で細菌を培養し、遠心分離および濾過におよ
って細胞を除去し、上清を濃縮滅菌する。このブロスを
低イオン強度に希釈し、その他の抗原を除去した後、各
種の担体を用いたクロマトグラフィーで分離し、さらに
は原外濾過により、パータクチンを精製する。
また、本タンパクは、細胞から尿素で抽出し、遠心分
離し、さらに前記の方法で処理可能な溶液を調製するこ
ともできる。
ゆえに本発明は、１面では、パータクチン以外の百日
咳菌抗原の含有量はかなり低いが、夾雑物を含むパータ
クチン水溶液を供給し、前記の水溶液を微粒子のイオン
交換媒体及びゲル濾過媒体に順次通して接触させること
により、前記溶液中のパータクチンを精製し、得られた
精製溶液を限界濾過することからなるパータクチンの精
製方法を提供するものである。
本法により精製した場合、得られた精製物はきわめて
安定であり、アデニル酸シクラーゼ活性は検出されな
い。ゆえに、本発明の別の側面は、検出可能な量のアデ
ニル酸シクラーゼ活性を有さず、生物学的に純度が高く
かつ安定なパータクチンを提供するものである。
発明についての記述 本発明で記載する工程は、百日咳菌（B.pertussis）
のみを培養し、百日咳用コンポーネントワクチンとして
用いることのできる数種のタンパク抗原の精製を可能に
するものである。
本発明では、調節条件下の発酵槽内で百日咳菌（B.pe
rtussis）を培養する。各抗原について、特異的な酵素
免疫抗体法（ELISA）により測定した、百日咳菌タンパ
ク（PT,FHA及びパータクチン）が所定の濃度に達するま
で、炭素源及び増殖因子を発酵期間中に所定の間隔で連
続的、またはバッチに添加する。発酵槽内の培地を取り
出し、遠心分離により大部分の細胞を除去し、望ましく
は孔径約0.2μの既知のメンブランフィルターを用い
て、マイクロフィルトレーションとして殺菌する。限外
濾過薄膜により、この培地を約10倍に濃縮し、百日咳毒
素及びFHAの精製に用いる（ヨーロッパ特許出願公開第
0,336,736号；米国特許第4,997,915号参照、これらの特
許の開示内容をここに引用する）。取り出した細胞は、
凝集素を精製するために使用する。パータクチンは培地
または細胞のいずれからも精製することができる。タン
パクの大部分は培地中に存在することから、望ましくは
培地を用いる。
パータクチン精製の第１段階として、培地を低イオン
強度になるよう希釈し、PT及びFHA抗原を除去するた
め、パーライトまたはその他の適当な微粒子状の固体吸
収剤を用いたクロマトグラフィーを行うことが必要であ
る。これについては、前記のヨーロッパ特許出願公開第
0,336,736号、米国特許第4,997,915号に詳述されてい
る。このPT及びFHA抗原は、高イオン強度の水溶液によ
り吸収剤から溶出し、百日咳菌コンポーネントワクチン
に使用することができる。
ここで「低イオン強度」という用語は、電導度が約11
mS/cm以下、望ましくは4mS/cm以下の水溶液をさす。測
定単位のmS/cmは、ミリジーメンス／センチメートルの
ことである。ジーメンス（Ｓ）とは、電導度の単位であ
り、抵抗（Ω）の逆数に相当し、mhoと表示されること
もある。用いた「高イオン強度」は、電導度が約11mS/c
m以上、望ましくは少なくとも約50mS/cmの水溶液をさ
す。
ついで、残った混合液は、メンブランフィルターで濾
過して濃縮し、硫酸アンモニウムで析出し、生成したペ
レットをTris−HClなど低イオン強度の緩衝液pH6.0〜8.
5に溶解し、溶液の最終電導度を一般には約4mS/cm以
下、典型的には約3.4mS/cmとする。この溶液は、水酸化
隣灰石ヒドロキシアパタイトならびにＱ−セファローズ
などのイオン交換媒体を用いて連続的にクロマトグラフ
する。前記の緩衝液の電導度では、パータクチンは、両
カラムとも吸着されず、流出画分中に溶出する。しかし
水酸化燐灰石では電導度が1.5mS/cm以下、またＱ−セフ
ァローズでは2.8mS/cm以下の場合、パータクチンは両カ
ラムとも吸着され、水酸化燐灰石カラムでは電導度が1.
5mS/cm以上、またＱ−セファローズカラムでは2.8mS/cm
以上の緩衝液を用いて溶出することができる。
さらに、分画分子量（nominal molecular weight lim
it:NMWL）が約100〜300kDaの膜を用いた限外濾過法でパ
ータクチンを精製する。この場合、パータクチンは濾液
中に集まる。NMWL約30kDaまたはそれ以下の膜を用いて
濃縮し、殺菌濾過して、その他の百日咳菌抗原と混合し
てワクチンに使用する。
別の方法として、硫酸アモニウムを添加することによ
り、パータクチンをFHA及びPTとともに培養培地から沈
澱される。沈殿を培地から分離し、再溶解して適当な水
溶液を調製し、前記の方法で処理してまずPT及びFHAを
除去し、次にパータクチンを精製する。
パータクチンは、百日咳菌（B.pertussis）の細胞か
らも精製することが可能である。高濃度（例えば4M）の
尿素を含む溶液を用い、室温で約1.5時間細胞を、抽出
する。遠心分離により細胞の砕片を除去し、タンパクを
含む上清をNMWL100〜1000kDaの膜を用いて濾過する。凝
集素などの高分子タンパクは残るが、大部分のパータク
チンは濾過される。濾液を濃縮し、NMWL30kDaまたはそ
れ以下の膜を用いてダイアフィルトレーション（diafil
tration）した後、硫酸アンモニウムにより沈澱させ、
遠心分離により、前記の処理に用いるペレットを得る。
パータクチンは、蛋白解裂を受けやすいことが報告さ
れているが、本発明による方法を用いて精製した場合に
はきわめて安定である。SDS−PAGEにより分析したとこ
ろ、精製パータクチンは均質で、分子量が30〜40kDaの
分解物が微量認められるだけで、基本的には分解は認め
られなかった。２〜８℃、あるいはさらに高温（24℃、
37℃）で数か月保存した後も、分解または、免疫抗原性
の変化は認められなかった。先願の特許（カナダ特許第
1,253,073号）と比較して、本方法により調製されたパ
ータクチンはアデニン酸シクラーゼ活性を含まず、安定
性が増大することにより、百日咳菌（B.pertussis）の
予防に用いるコンポーネントワクチンとして理想的であ
る。
実施例 本発明で使用したタンパク生化学的および免疫化学的
方法は、本明細書ならびに本実施例で詳細には記載され
ていないが、関連する科学的文献には詳細に報告されて
おり、当該技術分野の専門家には十分理解できるもので
ある。
実施例 １ 本実施例では、培養槽中における百日咳菌（B.pertus
sis）の生育について説明する。
百日咳菌（B.pertussis）は、250Lのブロス（Stainer
−Scholteの改良培地）を含む培養槽に接種した。培養
期間中に、抗原の収量を増強するため、グルタミン酸一
ナトリウム塩、ならびにグルタチオン、硫酸第一鉄、塩
化カルシウム、アスコルビン酸、ナイアシンおよびシス
テイン等の生育要素を培地に添加した。48時間培養した
のち、培地を遠心分離してほとんどの細胞を除去し、P
T、FHAおよび大部分のパータクチンを含む上清を、酢酸
セルロース膜（孔径0.22μｍ）を用いた限外濾過によっ
てさらに精製した。殺菌した濾液をNMWL20 kDaの膜で
約倍に濃縮し、抗原特異性ELISAsによりタンパク濃度お
よび抗原を検定した。
実施例 ２ 本実施例では、パーライトカラムクロマトグラフィー
によるPTおよびFHAの大規模抽出について説明する。
実施例１と同様に調製した培地濃度液を水で希釈し
て、伝導度を4mS/cmまたはそれ以下とし、あらかじめ水
で平衡化したパーライトカラム（高さ12cm X直径37cm）
を用い、タンパク対パーライト比約3mg/ml、約100cm/時
間の直線流速でクロマトグラフィーを行った。パーライ
トに吸着されたタンパクのほとんどはPTおよびFHAであ
り、パータクチンは流出液中に検出された。
実施例 ３ 本実施例では、硫酸アンモニウム分画を用いたパータ
クチン沈澱の生成について説明する。
実施例２から得られたカラム流出画分を、NMWL10kDa
の膜を用いた限外濾過により約10Lに濃縮した。これに
より得られる溶液中のタンパク濃度は、通常１〜2mg/ml
であった。室温で撹拌しながら、硫酸アンモニウム（濃
縮液10Lに対して3.5Kgまたは35％w/v）をゆっくりと添
加し、混合液を放置して溶解させたのち、２〜８℃の冷
蔵庫に置き、さらに２時間、望ましくは１夜撹拌した。
遠心分離によって沈澱を集め、10mMのトリス・HC1緩衝
液、pH6.0〜8.5、2Lに溶解した。この2Lの溶液に硫酸ア
ンモニウム（500g）をゆっくりと添加し、溶液を２〜８
℃に冷却したのち、少なくとも２時間、通常は１夜撹拌
して２回目の硫酸アンモニウム分画（25％w/v）を行っ
た。最後に、遠心分離によって沈澱を集め、2Lのトリス
・HCl緩衝液、pH7.5、に溶解し、硫酸アンモニウム（伝
導度が3.4mS/cm以下の場合）または10mMのトリス・HCl
緩衝液、pH7.5（伝導度が3.4mS/cm以上の場合）のいず
れかを添加して伝導度を約3.4mS/cmに調整した。
実施例 ４ 本実施例では、百日咳菌培養培地の濃縮液からのパー
タクチンの沈澱化について説明する。
培養培地の濃縮液に硫酸アンモニウム（250g/L）を添
加し、混合液を２〜８℃に冷却したのち、２時間以上撹
拌した。遠心分離により沈澱を集め、10mMのトリス・HC
l緩衝液、pH7.5に溶解し、伝導度が4.0mS/cmまたはそれ
以下になるまで同一緩衝液を添加した。この溶液には、
PT、FHAおよびパーテクチンが含まれていた。この溶液
からPTおよびFHAを除くため、パーライトクロマトグラ
フィーを行い（実施例２と同様）、カラム流出液につい
て水酸化燐灰石およびＱ−セファローズクロマトグラフ
ィー（実施例５参照）を行った。
実施例 ５ 本実施例では、水酸化燐灰石およびＱ−セファローズ
によるパーテクチンのクロマトグラフィーについて説明
する。
水酸化燐灰石を適当な大きさ、望ましくは直径5cm X
高さ10cmのカラムに充填し、15mMの硫酸アンモニウムを
含む10mMのトリス・HCl緩衝液、pH7.5（伝導度約3.4mS/
cm）で平衡化した。Ｑ−セファローズも同じ大きさのカ
ラムに充填し、同一の緩衝液で平衡化した。Ｑ−セファ
ローズカラムの上に、水酸化燐灰石カラムを直列に接続
した。再溶解したパータクチン（実施例３で得られたも
の）は、直列に接続したカラムでクロマトグラフィーを
行った場合、吸着剤に吸着されなかったので、流出画分
を集めた。NMWL300kDaの膜で濾過し、パーテクチンを含
む濾液を濃縮し、NMWL30kDa以下の膜を用いてダイアフ
ィルトレーションを行い、最後に0.22μｍの膜を用いて
殺菌濾過した。
実施例 ６ 本実施例では、Ｑ−セファローズに対する吸着による
パータクチンの精製について説明する。
実施例２で得られたパーライトカラム流出画分を約7L
に濃縮した。この濃縮液中のタンパク濃度は、通常1.5
〜.3.0mg/mlの範囲内にあった。濃縮液に、硫酸アンモ
ニウムの結晶を約35％（w/v）の割合で添加した。これ
を２〜８℃で２時間以上撹拌した。集めた沈澱を、約50
0mlの10mMトリス・HCl緩衝液、pH8.0に溶解し、ついで
硫酸アンモニウム（100g/L）で沈澱させた。２〜８℃で
少なくとも２時間撹拌したのち、遠心分離によって上清
を分取した。さらに上清に硫酸アンモニウム（100g/L）
を添加し、パータクチンを沈澱させた。沈澱を10mMのト
リス・HCl緩衝液、pH8.0に溶解し、さらに伝導度を約3.
4mS/cmに調整した。実施例と同様に、水酸化燐灰石およ
びＱ−セファローズカラム（それぞれ直径11cmX高さ8c
m）に通して精製し、300kDa膜で限外濾過し、10〜30kDa
の膜で濃縮した。ついで、透析、ダイアフィルトレーシ
ョンまたは溶媒交換カラムを用いて、パータクチンを10
mMのトリス・HCl緩衝液、pH8.0（伝導度約0.6mS/cm）に
転溶させたのち、10mMのトリス・HCl緩衝液、pH8.0で平
衡化したＱ−セファローズカラム（直径11cm X高さ8c
m）に吸着させた。5mMの硫酸アンモニウムを含む10mMの
トリス・HCl緩衝液、pH8.0（伝導度約1.7ms/cm）でカラ
ムを洗浄し、10〜100mM（望ましくは50mM）の燐酸緩衝
液、pH8.0でパータクチンを溶出させた。精製したパー
タクチンをPBSに転溶させ、殺菌濾過した。
別の方法としては、硫酸アンモニウムによる沈澱化工
程ののち、イオン強度を約3.4mS/cmに調整したパータク
チン溶液を水酸化燐灰石カラムのみに通してもよい。カ
ラム流出画分を濃縮し、10mMのトリス・HCl緩衝液、pH
8.0に転溶させ、直接Ｑ−セファローズカラムに吸着さ
せる。5mMの硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス・HCl
緩衝液、pH8.0でカラムを洗浄したのち、10〜100mM（望
ましくは50mM）の燐酸緩衝液、pH8.0でＱ−セファロー
ズカラムからパータクチンを溶出させる。精製したパー
タクチンを300kDa膜に通して限外濾過し、濃縮し、10〜
30kDaの膜でダイアフィルトレーションし、殺菌濾過す
る。
実施例 ７ 本実施例では、百日咳菌（B.pertussis）の細胞から
パータクチンを抽出する方法について説明する。
百日咳菌（B.pertussis）細胞（５％w/v）を4Mの尿素
を含む燐酸緩衝食塩水（10mMの燐酸ナトリウム、pH7.5
と0.15Mの塩化ナトリウム｛BPS｝）に懸濁させ、15秒〜
60分間分散させ、室温で1.5時間撹拌した。５〜6000XG
で遠心分離を行って細胞の砕片を除去した。細胞抽出液
を100kDaまたは300kDa膜に通して、保持されたものを２
〜３倍量のBPSでダイアフィルトレーションした。膜を
通った濾液とダイアフィルトレーションされた濾液を一
緒にし、NWML30kDa以下の膜を用いてもとの容積の1/5に
濃縮し、さらに５倍量のPBSを用いてダイアフィルトレ
ーションした。
実施例 ８ 本実施例では、百日咳菌（B.pertussis）細胞抽出物
からのパータクチンの調製について説明する。
実施例７で得られた膜保持物に、室温で硫酸アンモニ
ウム（25％w/v）をゆっくりと添加して沈澱させ、混合
物を２〜８℃でさらに２時間、望ましくは１夜撹拌し
た。15mMの硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス・HCl
緩衝液、pH7.5と同じ伝導度（3.5mS/cm）が得られるよ
うに飽和硫酸アンモニウムを添加した10mMのトリス・HC
l緩衝液、pH7.5に溶解した。ついで、実施例５と同様
に、水酸化燐灰石/Q−セファローズクロマトグラフィー
によって純粋なパータクチンを得た。
実施例 ９ 本実施例では、その他の抗原と組み合わせたパータク
チンの免疫原性について説明する。精製パータクチンの
溶液を燐酸アルミニウム（3mg/ml）で希釈して調製した
各種用量（１〜20μｇ）のパータクチンに一定用量のPT
トキソイド、FHAトキソイドおよび凝集原を添加した。
試験０日目および21日目にモルモット（１群10匹、体重
範囲400〜450g）に注射し、試験28日目に採血した。パ
ータクチンは１μｇの低用量でも良好な抗体反応を示し
た。１〜10μｇの用量では抗体反応に顕著な差は認めら
れず、パータクチンのロット間でも変動は認められなか
った（下表Ｉ参照）。
実施例 10 本実施例では、精製したパータクチンの安定性につい
て説明する。
パータクチンのみの場合、燐酸アルミニウムと混合し
た場合およびその他の百日咳抗原と混合してワクチン製
剤にした場合についてパータクチン抗原の安定性を検査
した。パータクチン（燐酸アルミニウムを添加しないも
の）を−20℃、２〜８℃、24℃および37℃で所定時間保
存した。２ロットを用い、それぞれ保存剤（チメロサル
およびフェノキシエタノール）を添加して試験した。い
ずれの保存剤を添加した場合にも、少なくとも３カ月
間、パータクチン特異性ELISA値の減少は認められなか
った。保存剤としてフェノキシエタノールを使用した場
合には、６および12カ月時に特異性ELISA値の減少が認
められた。結果は下表IIに示す。
燐酸アルミニウムを用いて調製したワクチン製剤は、
２〜８℃、24℃および37℃で保存した。抗原の安定性
は、外観、パータクチン特異性ELISA、タンパク濃度、S
DS−PAGE、単一特異性抗パータクチン血清を用いたウエ
スタン分析およびモルモットを用いた免疫原性試験で評
価した。下表IIIに示したごとく、パータクチンは単独
でも、いずれのアジュバントまたはその他の抗原と混合
した場合にも、保存期間中に変化が認められなかった。
実験に使用した材料は、パータクチンのみを燐酸アルミ
ニウムアジュバントと混合したもの、および燐酸アルミ
ニウムを用いてワクチンに製剤したものである。
記述の要約 上記の記述を要約すると、本発明はコンポーネントワ
クチンの成分として配合するのに適した形のパータクチ
ンを、Bordetella種の培養生産物からのカラムクロマト
グラフィーと限外濾過を用て回収する新規な方法を提供
する。本発明の範囲ないで種々の変法が可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/34 Ｃ０７Ｋ 1/34 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 タン、ラリー カナダ国 エル５エル ３エヌ３ オン タリオ州 ミシソーガ フォークウェイ ドライヴ 2424 (72)発明者 チョン、ペイレイ カナダ国 エル４ジェイ ２エス４ オ ンタリオ州 ソーンヒル ブローズ ス トリート 20 (72)発明者 ヴォーズ、ジョン カナダ国 エル４ジー ５ダブリュ８ オンタリオ州 オーロラ デヴェリン プレイス 52 (72)発明者 クレイン、マイケル カナダ国 エム５エイ ３エム２ オン タリオ州 ウィロウダール マンロー ブールヴァード 16 (56)参考文献 Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．86，Ｎｏ．10, ｐ．3554−3558（1989)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】実質的に百日咳毒素（PT）および糸状血球
    凝集素（FHA）を含まない不純物含有のパータクチンの
    粗水溶液を供給し、 該粗水溶液を分離媒体であるヒドロキシアパタイト及び
    イオン交換媒体マトリックスへの接触に通して、前記パ
    ータクチタンを水溶液中で精製し、 得られた精製パータクチンの溶液を回収する ことを特徴とするパータクチンの製造方法。
  2. 【請求項２】前記粗水溶液が、 百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素
    （PT）、糸状血球凝集素（FHA）及び増殖菌体を含む培
    養物液を供給し、 該培養物液から前記増殖菌体を分離し、 該増殖菌体が分離された培養物液から、百日咳毒素（P
    T）、糸状血球凝集素（FHA）を選択的に除去してから、
    パータクチンを含む沈澱物を形成させ、 得られた沈澱物を溶解させることで前記粗水溶液を得る ことにより形成される請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記増殖菌体、百日咳毒素（PT）及び糸状
    血球凝集素（FHA）が除去された培養物液に、硫酸アン
    モニウムを添加することによって前記沈澱物を形成させ
    る請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記粗水溶液が、 百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素
    （PT）および糸状血球凝集素（FHA）及び増殖菌体を含
    む培養物液を供給し、 該培養物液から前記増殖菌体を分離し、 該増殖菌体が分離された培養物液から、パータクチン、
    百日咳毒素（PT）及び糸状血球凝集素（FHA）を含む沈
    澱物を形成させ、 得られた沈澱物の水溶液を形成し、 該沈澱物の水溶液から百日咳毒素（PT）及び糸状血球凝
    集素（FHA）を選択的に除去して前記粗水溶液を得る ことにより形成される請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記増殖菌体が除去された培養物液に、硫
    酸アンモニウムを添加することによって前記沈澱物を形
    成させる請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記粗水溶液が、 百日咳菌を培地中で培養し、 得られた増殖菌体からパータクチンを含む抽出物を調製
    し、 該抽出物を限外濾過にかけて、該抽出物から高分子量蛋
    白質が除去された限外濾過液を供給し、 該限外濾過液を更に限外濾過にかけて、該限外濾過液か
    ら低分子量蛋白質が除去された限外濾過保持液を供給
    し、 該限外濾過保持液からパータクチンを含む沈澱物を形成
    させ、 該沈澱物を溶解させることで前記粗水溶液を得る ことにより形成される請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記抽出物の限外濾過が、分画分子量が約
    100kDa〜1000kDaの膜を用いて行われる請求項６に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】パータクチンを含む沈澱物の形成に先だっ
    て前記限外濾過液に分画分子量が30kDa以下の膜でのダ
    イアフィルトレーションを行う請求項６または７に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】前記限外濾過保持液に、硫酸アンモニウム
    を添加することにより前記パータクチンを含む沈澱物の
    形成を行う請求項６、７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記パータクチンを含む沈澱物の形成
    を、pH約6.0〜約8.5の低イオン強度の緩衝液に溶解させ
    ることで行う請求項３または６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記緩衝液が約4mS/cm以下のイオン強度
    を有する請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記精製パータクチンの水溶液を更に分
    子量限界が約100kDa〜300kDaの膜を用いた限外濾過にか
    ける請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記精製パータクチン溶液の限外濾過処
    理液を、分画分子量が約30kDa以下の膜を用いて更に濃
    縮する請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記粗水溶液の前記分離媒体との接触
    は、該分離媒体に結合せずに通過流分中に含まれるパー
    タクチンと、該分離媒体に結合した不純物とを与え、こ
    れら分離媒体からの通過流分を集めて前記精製パータク
    チンの溶液を供給する請求項１〜13のいずれかに記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】前記粗水溶液の前記分離媒体との接触通
    したパータクチンの精製が、 該粗水溶液を、前記分離媒体としてのヒドロキシアパタ
    イト及びイオン交換媒体マトリックスの少なくとも一方
    へのパータクチンの結合のための伝導度で、これら分離
    媒体への接触に通した後、 これら分離媒体の少なくとも一方に結合したパータクチ
    ンをその溶出に必要な伝導度を有する緩衝液で選択的に
    溶出させる ことによって行われる請求項１〜13のいずれかに記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】限外濾過したパータクチンの溶液をイオ
    ン交換媒体マトリックスへの接触に通して該イオン交換
    媒体マトリックスにパータクチンを結合させ、該イオン
    交換媒体マトリックスから精製パータクチンを選択的に
    溶出させる請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】生物学的に純粋で、安定であり、アデニ
    ン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調
    製物。
  18. 【請求項１８】百日咳菌感染に対するワクチンであっ
    て、活性成分としての、生物学的に純粋で、安定であ
    り、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない免疫防御
    性精製パータクチン調製物と、該活性成分のキャリアー
    とを含むことを特徴とするワクチン。
  19. 【請求項１９】他の免疫防御性百日咳菌抗原の少なくと
    も１種を更に含む請求項18に記載のワクチン。
  20. 【請求項２０】他の百日咳菌抗原が百日咳毒素（PT）、
    糸状血球凝集素（FHA）及び凝集原であり、これらの少
    なくとも１種が追加された請求項19に記載のワクチン。
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