DE69735856T2

DE69735856T2 - Il-12 als adjuvanz für bordetella pertussis impfstoffe

Info

Publication number: DE69735856T2
Application number: DE69735856T
Authority: DE
Inventors: H. Kingston MILLS; P. Bernard MAHON; S. Mark RYAN; Fiona Griffin
Original assignee: National University of Ireland Maynooth
Current assignee: National University of Ireland Maynooth
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2017-05-31
Also published as: AU724743B2; JP2001527516A; JP3737519B2; PT1015026E; US20060263379A1; EP1015026A2; EP1015026B1; JP2005112865A; EP1649868A1; US20060263380A1; AU3567097A; ES2262181T3; DE69735856D1; DK1015026T3; WO1997045139A3; WO1997045139A2; US6929794B1; US20060257419A1; US20050158276A1; ATE325621T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Impfstoffe gegen Bordetella-Spezies, die Interleukin 12 (IL-12) als ein Adjuvans enthalten, und Verfahren zur Verwendung von IL-12 als ein Adjuvans in oder in Kombination mit derartigen Impfstoffen.
Eine Kolonisierung der Atemwege durch das gramnegative Kugelbakterium Bordetella pertussis führt zu Keuchhusten, auch als Pertussis bezeichnet, eine signifikante Ursache für Morbidität und Mortalität von Kleinkindern. Zwei nah verwandte Isolate von Bordetella wurden ebenfalls in Menschen aufgefunden: B. parapertussis und B. bronchiseptica. Molekulargenetische Analysen legen nahe, dass diese drei Isolate zu nah miteinander verwandt sind um als separate Spezies klassifiziert zu werden (Gilchrist, M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5. Auflage, Hrsg. Balows et al., American Society for Microbiology, Washington, DC). Obwohl sich B. pertussis von B. bronchiseptica und B. parapertussis in der Art des Toxins, welches es produziert, unterscheidet, produzieren B. bronchiseptica und B. parapertussis aktive Toxine (Hausmann, S. Z. et al., 1996, Infect. Immun. 64: 4020-4026), und es gibt gewisse Hinweise, die andeuten, dass B. pertussis Organismen zum B. parapertussis Phänotyp konvertieren können (Gilchrist, M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5. Auflage, Hrsg. Balows et al., American Society for Microbiology, Washington, DC). Obwohl Bordetella Isolate manche Oberflächenantigene aufweisen, welche zwischen den Isolaten variieren, erkennen monoklonale Antikörper, die ein Isolat erkennen, oftmals mindestens ein weiteres Isolat (LeBlay, K. et al. 1996, Microbiology 142: 971-978). Der hohe Grad an molekularer Ähnlichkeit zwischen Bordetella Isolaten und die Kreuzreaktivität von monoklonalen Antikörpern gegen Bordetella Antigene legen nahe, dass die von einem Impfstoff gegen ein Bordetella Isolat erzeugte Immunreaktion die anderen Isolate ebenso betreffen würde.
Eine Immunisierung mit einem Bordetella pertussis Ganzzell-Impfstoff hat sich als wirksam herausgestellt um Pertussis zu kontrollieren, aber es gab Bedenken hinsichtlich seiner Reaktogenität. Zellfreie Pertussis Impfstoffe sind erheblich weniger reaktogen, aber von variierender Wirksamkeit. Bis vor kurzem wurde angenommen, dass das Bakterium während der Infektion eine rein extrazelluläre Nische einnimmt, und konsequenterweise wurde davon ausgegangen, dass humorale Immunmechanismen von größter Bedeutung für einen Schutz sind (Robinson, A. et al., 1985, Vaccine 3: 11-22). Es gibt jedoch aus Untersuchungen an Mensch und Maus zunehmend Hinweise dafür, dass B. pertussis auch eine intrazelluläre Nische einnehmen kann, durch Invasion und Überleben in Lungenmakrophagen und anderen Zelltypen (Friedman, R. L. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4578-4585; Saukkonen, K. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1143-1149). Diese Beobachtungen haben zu einer erneuten Untersuchung der Mechanismen der schützenden Immunität gegen B. pertussis geführt. Während Antikörper eine Rolle bei der Neutralisierung des bakteriellen Toxins und bei der Verhinderung der Anlagerung von Bakterien nach Transsudation von zirkulierendem Immunglobulin (Ig) in die Lunge spielen, spielt die Zell-vermittelte Immunität ebenfalls eine signifikante Rolle beim Schutz gegen B. pertussis (Mills, K. H. G. und K. Redhead, 1993, J. Med. Microbiol. 39: 163-164; Peppoloni, S. et al., 1991, Infect. Immun. 59: 3768-3773; Peterson, J. P. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4563-4570).
Das derzeitige Verständnis der Rolle von CD4⁺ T-Helferzellen (Th) bei der Immunität gegen Infektionskrankheiten ist, dass Antigen-spezifische Typ 1 T-Helferzellen (Th1), die Interferon γ (IFN-γ), Interleukin-2 (IL-2) und Tumornekrosefaktor β (TNF-β) sezernieren, zelluläre Immunität, Hypersensitivität vom verzögerten Typ und entzündliche Reaktionen vermitteln, während Typ 2 T-Helferzellen (Th2), welche die Interleukine IL-4, IL-5 und IL-6 sezernieren, als hauptverantwortlich für die Bereitstellung von spezifischer T-Zell-Hilfe für die Produktion von Antikörpern angesehen werden (Mosmann, T. R. und R. L. Coffman, 1989, Adv. Immunol. 46: 111-147). Frühere Studien unter Verwendung eines Atemwegsmodells aus Maus haben gezeigt, dass durch Infektion induzierte schützende Immunität gegen B. pertussis von einer CD4⁺ T-Zellpopulation vermittelt wird, die IL-2 und IFN-γ sezernierte (Th1 Zellen). Adoptive Transferexperimente zeigten, dass mit T-Zellen in Abwesenheit von nachweisbaren Antikörperreaktionen ein Schutz verliehen werden konnte. In einer Studie von Impfstoff-induzierter Immunität induzierte eine Immunisierung mit dem Pertussis Ganzzell-Impfstoff selektiv Th1 Zellen, während ein zellfreier Impfstoff, umfassend die B. pertussis Antigene enttoxifiziertes PT, FHA und Pertactin, Th2 Zellen induzierte. Weiterhin war die Induktion einer Th1 Reaktion infolge von Infektion oder Immunisierung mit dem Ganzzell-Impfstoff mit einer früheren bakteriellen Clearance nach respiratorischer Exposition assoziiert (Mills, K. H. G. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 399-410; Redhead, K. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198).
Die Polarisierung der Cytokinproduktion von CD4⁺ T-Zellen hin zu Typ 1 oder Typ 2 Reaktionen nach in vivo Initiierung scheint von einer Reihe von Faktoren gesteuert zu sein, umfassend die Art des Immunogens, den Immunisierungsweg, und die Antigen-präsentierende Zelle und das regulatorische Cytokinmilieu am Ort der T-Zell-Stimulierung (Barnard, A. et al., 1996, Immunol. 87: 372-380; Gajewski, T. F. et al., 1991, J. Immunol. 146: 1750-1758; O'Gara, A. und K. Murphy, 1994, Curr. Opin. Immunol. 6: 458-466). Das regulatorische Cytokin Interleukin 12 (IL-12) ist auch ein Schlüsselcytokin bei der Entwicklung von Typ 1 Reaktionen (Hsieh, C.-S. et al., 1993, Science 260: 547-549; Trinchieri, G., 1995, Annu. Rev. Immunol. 13: 251-276). IL-12 kann die Sezernierung von IFN-γ durch natürliche Killerzellen (NK) und durch CD4+ T-Zellen induzieren und die Differentiation und Entwicklung von Th1 Zellen aus Th0 Vorläuferpopulationen fördern (Bliss, J. et al., 1996, J. Immunol. 156: 887-894), McKnight, A. J. et al., 1994, J. Immunol. 152: 2172-2179; Seder, R. A. et al., 1993, PNAS USA 90: 10188-10192). Darüber hinaus könnte IL-12 auch die Produktion von opsonisierenden Antikörpern induzieren, durch Förderung von IFN-γ-vermitteltem Immunglobulin (Ig) Class Switching zugunsten von IgG2a in der Maus (Morris, S. C. et al., 1994, J. Immunol. 152: 1047-1056). Da Th1 Zellen eine wichtige Rolle in der Auflösung von Infektionen mit intrazellulären Organismen spielen, kann IL-12 den Verlauf von bakteriellen, viralen und parasitären Infektionen beeinflussen, indem es das Gleichgewicht von Th1 und Th2 Zellen zugunsten der Produktion von IFN-γ ändert (Flynn, J. L. et al., 1995, J. Immunol. 155: 2515-2524; Gazzinelli, R. T. et al., 1993, PNAS USA 90: 6115-6119; Heinzel, F. P. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 1505-1509; Hunter, C. A. et al., 1994, Infect. Immun. 62: 2818-2824; Sypek, J. P. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 1797-1802; Tripp, C. S. et al., 1994, J. Immunol. 152: 1833-1887; Urban, J. F. et al., 1996, J. Immunol. 156: 263-268; Wynn, T. A. et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1551-1561; Zhan, Y. und C. Cheers, 1995, Infect. Immun. 63: 1387-1390).
WO 91/01143 offenbart eine Impfzusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus einem Antigen und einer Adjuvansmenge bzw. einer förderlichen Menge an Interleukin, z.B. Interleukin-1α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, adsorbiert auf einem Mineral, und ein pharmazeutisch akzeptables Konservierungsmittel. WO 96/11019 offenbart eine Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus einem Antigen eines Virus aus der Familie Paramyxoviridae und eine effektive förderliche Menge an Interleukin-12. Weder WO 91/01143 noch WO 96/11019 offenbaren eine Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive förderliche Menge an Interleukin-12, wie von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Es gibt einen anhaltenden Bedarf für neue Zusammensetzungen, umfassend IL-12, welche die Wirkungen von Bordetella Impfstoffen verstärken oder ändern, und für Verfahren für deren Verwendung bei der Prävention, Behandlung oder Linderung von Bordetella Infektionen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Verwendung von IL-12 als ein Adjuvans in einem zellfreien Bordetella-Impfstoff dessen Schutzwirkung signifikant verbessert.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 und mindestens ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid, das zur in vivo Expression geeignet ist, um mindestens ein Bordetella pertussis Antigen zu produzieren.
Eine weitere Ausführungsform stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und ein für Interleukin-12 kodierendes Polynukleotid, das zur in vivo Expression geeignet ist, um eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 zu produzieren.
Eine weitere Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Prävention, Behandlung oder Linderung einer Infektion durch Bordetella pertussis in einem Wirt bereit, umfassend das Verabreichen dem Wirt einer Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert, oder wird als ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht, bei denen das Antigen in vivo exprimiert wird. Das interleukin-12 kann bevorzugt als ein für Interleukin-12 kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht werden, bei denen das Interleukin-12 in vivo exprimiert wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit um eine Immunreaktion gegen Bordetella pertussis auszulösen, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert, oder wird als ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht, bei denen das Antigen in vivo exprimiert wird. Das Interleukin-12 kann bevorzugt als ein für Interleukin-12 kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht werden, bei denen das Interleukin-12 in vivo exprimiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit um eine Immunreaktion gegen Bordetella auszulösen, umfassend das gleichzeitige Verabreichen einer ersten Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen, und einer zweiten Zusammensetzung, umfassend eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert, oder wird als ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht, bei denen das Antigen in vivo exprimiert wird. Das Interleukin-12 kann bevorzugt als ein für Interleukin-12 kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht werden, bei denen das Interleukin-12 in vivo exprimiert wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren bereit um die Beseitigung bzw. Clearance von Bordetella pertussis aus einem Wirt zu stimulieren, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert, oder wird als ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht, bei denen das Antigen in vivo exprimiert wird. Das Interleukin-12 kann bevorzugt als ein für Interleukin-12 kodierendes Polynukleotid unter Bedingungen verabreicht werden, bei denen das Interleukin-12 in vivo exprimiert wird.
Eine weitere Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Impfzusammensetzung bereit, umfassend das Kombinieren einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 mit einer Impfzusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Impfzusammensetzung bereitgestellt, umfassend das Kombinieren einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 mit einer Impfzusammensetzung, umfassend mindestens ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid, das zur in vivo Expression geeignet ist, um mindestens ein Bordetella pertussis Antigen zu produzieren.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Impfzusammensetzung bereitgestellt, umfassend das Kombinieren einer Impfzusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen, mit einem für Interleukin-12 kodierenden Polynukleotid, das zur in vivo Expression geeignet ist, um eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 zu produzieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt in einer Impfzusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und ein Adjuvans, die Verbesserung bereit, umfassend die Verwendung einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 als das Adjuvans. Bevorzugt ist das Antigen Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentöses Hämagglutinin oder Pertactin, oder ist an Alaun adsorbiert.
Die Erfindung stellt auch in einer Impfzusammensetzung, umfassend ein Adjuvans und mindestens ein für ein Antigen kodierendes Polynukleotid, das zur in vivo Expression geeignet ist, um mindestens ein Bordetella pertussis Antigen zu produzieren, die Verbesserung bereit, umfassend die Verwendung einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 als das Adjuvans.
Als eine weitere Ausführungsform wird auch in einer Impfzusammensetzung, umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und ein Adjuvans, die Verbesserung bereitgestellt, umfassend die Verwendung eines für Interleukin-12 kodierenden Polynukleotids, das zur in vivo Expression geeignet ist, um eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 zu produzieren, als das Adjuvans.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen davon offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Balkendiagramm, welches die Produktion von IL-12 und IFN-γ durch Makrophagen, stimuliert mit Bordetella Antigenen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigt.
2 ist ein Balkendiagramm, welches die Produktion von IL-5 und IFN-γ durch Milzzellen aus mit Bordetella Antigenen immunisierten Mäusen, danach stimuliert in vitro mit Bordetella Antigenen in Kombination mit IL-12, wie in Beispiel 4 beschrieben, zeigt.
3 ist ein Graph, der die Auszählungen von lebensfähigen B. pertussis Zellen in den Lungen von Mäusen zeigt, die mit B. pertussis Ganzzell-Impfstoffen oder zellfreien Impfstoffen mit oder ohne IL-12 immunisiert worden waren, danach lebendem B. pertussis ausgesetzt wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben.
4 ist ein Balkendiagramm, welches die Produktion von IL-2, IFN-γ und IL-5 durch Milzzellen aus Mäusen zeigt, die mit B. pertussis Ganzzell-Impfstoffen oder zellfreien Impfstoffen mit oder ohne IL-12 immunisiert worden waren, danach in vitro mit Bordetella Antigenen stimuliert wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die jetzigen Erfinder haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Aufnahme von IL-12 in einen zellfreien Impfstoff gegen Bordetella Zell-vermittelte Immunreaktionen erzeugte, ähnlich denjenigen, die mit Ganzzell-Impfstoffen beobachtet werden. Eine Reaktion von Typ 2 T-Helferzellen (Th2), welche normalerweise nach Immunisierung von Mäusen mit einem zellfreien Bordetella Impfpräparat induziert wird, kann durch Aufnahme von IL-12 in die Impfformulierung zu einer Th1/Th0 Reaktion umgeschaltet werden. Die Verwendung von IL-12 als ein Adjuvans in einem zellfreien Pertussis Impfstoff erhöhte dessen Schutzwirkung signifikant; die Geschwindigkeit der Clearance von B. pertussis aus den Lungen nach respiratorischer Exposition war gleich der, welche mit einem wirkvollen Ganzzell-Impfstoff beobachtet wird. Diese Feststellungen zeigen einen regulatorischen Einfluss von IL-12 auf die Induktion von B. pertussis-spezifischen Th1 Zellen nach Infektion oder Immunisierung, und liefern einen weiteren Hinweis für die Rolle von Th1 Zellen bei schützender Immunität gegen B. pertussis. Die vorliegende Erfindung stellt neue Bordetella Impfzusammensetzungen und Verfahren zur Förderung von Bordetella Impfstoffen bereit, die dazu vorgesehen sind, eine Zell-vermittelte Immunreaktion gegen Bordetella bereitzustellen, unter Verwendung von IL-12 als ein Adjuvans.
Wie hierin verwendet umfasst Bordetella Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica und jeden anderen Bordetella Stamm oder jedes andere Bordetella Isolat, der bzw. das ausreichend ähnlich ist, so dass eine Immunreaktion (umfassend Zell-vermittelte Immunität und/oder die Erzeugung von Antikörpern), hervorgerufen gegen in einem Isolat vorhandene Antigene, eine Wirkung gegen mindestens manche der anderen Stämme oder Isolate hat.
Ein Bordetella Antigen umfasst die Verwendung eines ganzen Bordetella Organismus, eines ganzen Organismus, der Bordetella Antigene exprimiert, einen antigenen Abschnitt des Bordetella Organismus, rekombinant produzierte Antigene oder Abschnitte davon oder Fusionsproteine, die Antigene umfassen, und funktionelle Äquivalente von Bordetella Antigenen. Antigene Abschnitte von Bordetella Organismen umfassen Lipopolysaccharid (LPS), filamentöses Hämagglutinin (FHA), Pertactin und Pertussis-Toxin (PT). Bordetella LPS ist bevorzugt gereinigt, beispielsweise mittels Gelfiltrationschromatographie. Pertussis-Toxin kann aktives oder unbehandeltes natives Pertussis-Toxin (aPT) sein. Bevorzugt kann Pertussis-Toxin inaktiviertes Pertussis-Toxin (iPT) sein, wie etwa durch Hitzebehandlung inaktiviertes Pertussis-Toxin, oder enttoxifiziertes Pertussis-Toxin (PTd), wie etwa ein durch Behandlung mit Formaldehyd chemisch enttoxifiziertes Pertussis-Toxin. Bordetella Antigene können an Alaun adsorbiert sein. Zusätzlich umfassen Antigene der vorliegenden Erfindung Polynukleotide, welche für Bordetella Antigene kodieren. Beispiele derartiger Polynukleotide sind diejenigen, welche die Gene für B. pertussis FHA (Renauld-Mongenie, G. et al., 1996, PNAS USA 93: 7944- 7949) und für Pertussis-Toxin (Steffen, P. et al., 1996, EMBO J. 15: 102-109) umfassen. Andere antigene Abschnitte von Bordetella Organismen, welche in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können vom Durchschnittsfachmann bestimmt werden.
Interleukin-12 (IL-12), ursprünglich als natürliche Killerzelle-stimulierender Faktor bezeichnet, ist ein heterodimeres Cytokin, das beispielsweise in M. Kobayashi et al., 1989, J. Exp. Med. 170: 827, beschrieben ist. IL-12 kann aus natürlichen Quellen gereinigt werden, durch chemische Synthese produziert werden, oder bevorzugt mittels rekombinanter DNA-Techniken produziert werden, beispielsweise durch die Expression und Isolierung von IL-12 Protein in rekombinanten Wirtszellen, wie ausführlich in der internationalen Patentanmeldung WO 90/05147, veröffentlicht am 17. Mai 1990, beschrieben (auch Europäische Patentanmeldung 441 900). Die DNA- und Aminosäure-Sequenzen der 30 kD und 40 kD Untereinheiten des heterodimeren humanen IL-12 sind in der vorstehend zitierten internationalen Anmeldung und in US Patent Nr. 5,571,515 angegeben. Mengen im Forschungsmaßstab von rekombinantem IL-12 aus Mensch und Maus sind auch vom Genetics Institute, Inc., Cambridge, Massachusetts, erhältlich.
Wie hierin verwendet bezeichnen "Interleukin-12" und "IL-12" Interleukin-12, seine individuellen Untereinheiten, Fragmente davon, die Adjuvansaktivität von IL-12 aufweisen, Polynukleotide, die für IL-12 kodieren, und funktionelle Äquivalente von "Interleukin-12" und "IL-12".
Funktionelle Äquivalente von Bordetella Antigenen und IL-12 umfassen modifizierte Bordetella Antigene und modifiziertes IL-12 Protein, so dass das resultierende Bordetella Antigen- oder IL-12-Produkt die gleiche antigene Aktivität bzw. Adjuvansaktivität wie hierin beschrieben aufweist, und Polynukleotidsequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für Bordetella Antigene oder IL-12 Polypeptide mit der antigenen Aktivität bzw. IL-12 Adjuvansaktivität wie hierin beschrieben kodieren. Ein funktionelles Äquivalent eines Bordetella Antigens oder von IL-12 kann beispielsweise einen "stillen" Codon- oder Aminosäureaustausch enthalten (beispielsweise den Austausch einer sauren Aminosäure gegen eine andere saure Aminosäure, oder der Austausch eines Codons für eine hydrophobe Aminosäure gegen einen anderen Codon für eine hydrophobe Aminosäure).
Fragmente von Bordetella Antigenen und von IL-12 sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst. Bevorzugt behalten derartige Fragmente die gewünschte antigene Aktivität oder Adjuvansaktivität bei, oder modifizieren sie um eine gewünschte Aktivität zu erzeugen. Fragmente von Bordetella Antigenen oder von IL-12 können in linearer Form vorliegen, oder sie können zyklisiert werden unter Verwendung bekannter Verfahren, wie beispielsweise in H. U. Saragovi et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) und in R. S. McDowell et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992) beschrieben. Die hierin bereitgestellten Bordetella Antigene und IL-12 Polypeptide umfassen auch Antigene und IL-12 Polypeptide, welche durch Aminosäuresequenzen ähnlich zu denjenigen von gereinigten Antigenen und IL-12 Polypeptiden gekennzeichnet sind, aber bei denen Modifikationen auf natürliche Weise bereitgestellt oder absichtlich eingebaut worden sind. Modifikationen in dem Antigen oder dem IL-12 Polypeptid oder in den Polynukleotidsequenzen welche für Antigen oder IL-12 kodieren, können beispielsweise vom Fachmann unter Verwendung bekannter Techniken eingeführt werden. Modifikationen von Interesse in Sequenzen des Bordetella Antigens oder des IL-12 Polypeptids können die Veränderung, Hinzufügung, Insertion, Deletion, Mutation, Substitution, den Austausch oder die Modifikation eines ausgewählten Aminosäurerests in der kodierenden Sequenz umfassen. Als ein Beispiel kann eine zusätzliche Aminosäure an den N-Terminus des Antigens oder von IL-12 hinzugefügt werden. Die Aminosäuresequenz des Antigens oder von IL-12 kann auch durch Zufallsmutationstechniken verändert werden. Es ist auch möglich, an Antigene oder an IL-12 andere Reste anzufügen, umfassend ohne Einschränkung Kohlehydrate, Lipide oder Polyethylenglykol, oder derartige Reste zu entfernen oder zu verändern. Techniken für derartige Veränderungen, Hinzufügungen, Insertionen, Deletionen, Mutationen, Substitutionen, Austausche oder Modifikationen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. US Patent Nr. 4,518,584). Bevorzugt behält eine derartige Veränderung, Hinzufügung, Insertion, Deletion, Mutation, Substitution, ein derartiger Austausch oder eine derartige Modifikation die gewünschte Aktivität des Bordetella Antigens oder von IL-12 bei, oder modifiziert sie, um eine gewünschte Aktivität zu erzeugen.
Die Erfindung umfasst auch allelische Varianten von offenbarten Polynukleotiden, die für Bordetella Antigen und IL-12 kodieren, das heißt natürlich vorkommende alternative Formen von isolierten Polynukleotiden, welche ebenfalls für Antigene oder IL-12 Polypeptide kodieren, welche identisch, homolog oder verwandt sind zu denjenigen, welche von den isolierten Polynukleotiden kodiert werden.
Verabreichung und Dosierung
Das IL-12 und das Bordetella Antigen können Wirten, bevorzugt Säugerwirten, die entweder mit Bordetella infiziert oder nicht infiziert sind, als ein prophylaktischer Impfstoff verabreicht werden. Das IL-12 und das Antigen können auch als ein therapeutischer Impfstoff infizierten Wirten verabreicht werden, und können zu einer Linderung oder Beseitigung des Erkrankungszustands aufgrund einer Infektion durch Bordetella Organismen führen.
Die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Menge an Bordetella Antigen ist eine Menge, welche eine effektive immunstimulatorische Reaktion im Wirt erzeugt. Eine effektive förderliche Menge von IL-12 ist eine Menge, welche bei Verabreichung zu einer verstärkten Immunreaktion führt, bezogen auf die Immunreaktion ohne eine Verabreichung von IL-12. Solche Mengen an IL-12 werden von der Art des Bordetella Antigens und den Dosierungsmengen des Antigens abhängen. Zusätzlich wird die dem Wirt verabreichte Menge an Bordetella Antigen und IL-12 in Abhängigkeit von einer Reihe anderer Faktoren variieren, umfassend das bzw. die verwendeten Antigene, die Größe, das Alter, Körpergewicht, die allgemeine Gesundheit, das Geschlecht und die Ernährung des Wirts, die Zeit oder Dauer der Verabreichung, und die besonderen Qualitäten der Bordetella Infektion, die zu behandeln ist oder gegen die geimpft werden soll. Als ein Beispiel beträgt eine effektive, förderliche Menge an IL-12 Polypeptid wünschenswert zwischen etwa 0,1 μg bis etwa 0,5 mg IL-12 Polypeptid pro etwa 25 μg Antigen. Die effektive, förderliche Menge für einen besonderen Impfstoff oder ein besonderes Antigen wird leicht definiert, indem die Wirksamkeit und Toxizität der Kombination von IL-12 und Antigen ausbalanciert werden. Die Einstellung und Manipulation von etablierten Dosisbereichen sind dem Können des Fachmanns zuzurechnen.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine effektive, förderliche Menge von IL-12 in Kombination mit einem Bordetella Antigen verabreicht, zu einem Zeitpunkt, der zeitnah zu der Immunisierung mit dem Bordetella Antigen ist, so dass eine verstärkte Immunreaktion erzeugt wird, bezogen auf eine Immunisierung, bei der IL-12 nicht verabreicht wird. Somit kann das IL-12 vor und bevorzugt direkt vor der Immunisierung, zum Zeitpunkt der Immunisierung (d.h. gleichzeitig) oder nach der Immunisierung (d.h. später) verabreicht werden. Wenn das IL-12 vor der Impfzusammensetzung verabreicht wird, ist es erwünscht, es etwa einen oder mehrere Tage vor der Immunisierung zu verabreichen. Zusätzlich kann das IL-12 vor der Immunisierung mit dem Bordetella Antigen verabreicht werden, gefolgt von späteren Injektionen von IL-12 nach der Immunisierung mit dem Antigen.
Das IL-12 und das Bordetella Antigen können einem Wirt auf eine Reihe von Arten verabreicht werden. Die Verabreichungswege umfassen intradermale, transdermale, (beispielsweise durch Polymere mit langsamer Freisetzung), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, aurale, epidurale, anale oder vaginale (beispielsweise mittels Suppositorien), und intranasale Wege. Jeder andere günstige Verabreichungsweg kann verwendet werden, beispielsweise Infusion oder Bolusinjektion, oder Absorption über Epithel- oder Schleimhautgewebe. Zusätzlich können das IL-12 und das Bordetella Antigen in Kombination mit anderen Komponenten oder biologischen Wirkstoffen, wie etwa anderen bekannten Adjuvantien (beispielsweise Alaun, MPL, QS21), pharmazeutisch akzeptablen oberflächenaktiven Substanzen wie etwa Glyceriden, Gleitmitteln wie etwa Laktose, Trägern, Streckmitteln und Vehikeln verabreicht werden. Falls gewünscht, können auch bestimmte Süßstoffe, Aromastoffe und/oder Farbstoffe zugegeben werden.
Bei Verwendung als ein Adjuvans für eine Impfzusammensetzung, die ein Bordetella Antigen enthält, wird IL-12 wünschenswert als ein Bestandteil der eigentlichen Impfzusammensetzung zugemischt und durch den gleichen Verabreichungsweg wie das Bordetella Impfantigen verabreicht. Alternativ kann die förderliche Wirkung von IL-12 genutzt werden, indem IL-12 separat von der Impfzusammensetzung verabreicht wird. Bei separater Verabreichung liegt das IL-12 wünschenswert in der Gegenwart eines geeigneten Trägers wie etwa Salzlösung und gegebenenfalls von herkömmlichen pharmazeutischen Mitteln, welche eine allmähliche Freisetzung von 1L-12 ermöglichen, vor. Die Menge an IL-12, welche bei diesem Impfmodus verwendet wird, ist ähnlich zu den vorstehend identifizierten Bereichen, wenn IL-12 ein Bestandteil der Impfzusammensetzung ist.
Weiterhin können Bordetella Antigene und/oder IL-12 verabreicht werden durch in vivo Expression im Wirt, von Polynukleotiden, die für mindestens ein Bordetella Antigen und/oder IL-12 kodieren. Polynukleotide, die für IL-12 oder ein Fragment davon kodieren, können als ein Adjuvans verwendet werden. Die Polynukleotide, bevorzugt in der Form von DNA, können an den geimpften Wirt abgeliefert werden für eine in vivo Expression von Bordetella Antigenen und/oder IL-12. So genannte "nackte DNA" kann verwendet werden, um Bordetella Antigene und/oder IL-12 in vivo in einem Wirt zu exprimieren (Cohen, J., 1993, Science 259: 1691-1692; Fynan, E. et al., 1993, PNAS USA 90: 11478-11482; und Wolff, J. A. et al., 1991, Biotechniques 11: 474-485 beschreiben ähnliche Verwendungen von "nackter DNA"). Beispielsweise können Polynukleotide, die für IL-12 oder Fragmente davon kodieren, in den eigentlichen Bordetella Organismus eingebaut oder transduziert werden, wenn der gesamte Bordetella Organismus als das Impfantigen verwendet werden soll. In einem anderen Beispiel können Polynukleotide, die für Bordetella Antigene kodieren, in Zellen eines anderen Organismus eingebaut oder transduziert werden, so dass die Bordetella Antigene auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden, welche dann als das Impfantigen verwendet werden können. Alternativ können Polynukleotide, die für IL-12 oder Fragmente davon kodieren, als Bestandteil der Bordetella Impfzusammensetzung oder separat aber zur gleichen Zeit mit dem Impfantigen verabreicht werden, beispielsweise mittels Injektion.
Nochmals weitere Modi der Ablieferung an den Wirt von Bordetella Antigenen und/oder IL-12 in der Form von für sie kodierenden Polynukleotiden sind dem Fachmann bekannt, und können anstelle einer Verabreichung von Bordetella Antigenen und/oder IL-12 Polypeptiden je nachdem wie gewünscht verwendet werden. Beispielsweise können Polynukleotide, die für IL-12 kodieren, als Teil eines Vektors oder als eine Kassette, welche die für Bordetella Antigene und/oder IL-12 kodierenden Sequenzen operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft, enthalten, verabreicht werden (siehe beispielsweise die internationale Patentanmeldung PCT WO 94/01139, veröffentlicht am 20. Januar 1994). In kurzen Worten kann die DNA, welche für die Bordetella Antigene und/oder IL-12 Protein oder gewünschte Fragmente davon kodiert, in eine Nukleinsäurekassette insertiert werden. Diese Kassette kann derart konstruiert werden, so dass sie zusätzlich zu der zu exprimierenden Antigen- oder IL-12-Sequenz andere optionale flankierende Sequenzen enthält, die deren Insertion in einen Vektor ermöglichen. Diese Kassette kann danach in einen geeigneten Vektor insertiert werden, stromabwärts von einem Promotor, einer mRNA-Leadersequenz, einer Initiationsstelle und anderen regulatorischen Sequenzen, welche die Replikation und Expression dieser Sequenz in vivo lenken können. Zusätzliche regulatorische Sequenzen können stromabwärts der zu exprimierenden kodierenden Sequenz insertiert sein. Dieser Vektor ermöglicht eine in vivo Expression der Bordetella Antigene und/oder der IL-12 Polypeptide in dem Wirt. Wenn 1L-12 Polynukleotide als das Adjuvans verwendet werden, können diese Polynukleotidsequenzen operativ mit Polynukleotidsequenzen verknüpft sein, die für ein oder mehrere Bordetella Antigene kodieren.
IL-12 könnte gegenüber bekannten Adjuvantien bevorzugt sein, aufgrund seiner Verstärkung der Impfwirksamkeit, wenn Zell-vermittelte Immunität erforderlich ist. IL-12 hat einen Vorteil gegenüber Alaun als ein Bordetella Impfadjuvans, da Alaun Th2 T-Helferzellen induziert anstelle von Th1 Zellen, die von IL-12 induziert werden. Somit könnten durch Alaun geförderte Impfstoffe für Organismen wie etwa Bordetella, gegen die eine TH1 Reaktion am wirksamsten ist, unwirksam sein. Zusätzlich ist IL-12 bakteriellen Adjuvantien wie etwa BCG, die zusätzlich zu IL-12 andere Mittel oder Ergebnisse induzieren könnten, welche nicht vorhersehbar oder unkontrollierbar sein könnten, überlegen. In hohem Maße wünschenswert sollte IL-12 als ein Adjuvans die unkontrollierte Produktion von anderen Cytokinen nicht induzieren, wie es bakterielle Adjuvantien tun, die IL-12 zusammen mit vielen anderen Cytokinen induzieren. Im Gegensatz zu bakteriellen Adjuvantien ist IL-12 humanen Ursprungs, und es ist damit unwahrscheinlich, dass es eine Sensibilisierung hervorruft. Darüber hinaus ist IL-12 im Gegensatz zu anderen Adjuvantien wie etwa IFN-γ oder IL-2 in vivo relativ stabil. Somit wird erwartet, dass IL-12 ein in hohem Maße nützliches Adjuvans zur Verwendung in Impfstoffen gegen Bordetella ist.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, sollen den Umfang der Offenbarung jedoch nicht einschränken.
BEISPIEL 1 – Analyse der Cytokinproduktion
Mäuse.
Weibliche BALB/c Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der Irischen Gesundheitsbehörde aufgezogen und gehalten. Zum Beginn dieses und der nachfolgenden Experimente waren alle Mäuse 8 bis 12 Wochen alt.
Cytokinproduktion.
Die Cytokinproduktion von T-Zellen wurde bewertet unter Verwendung von Milzzellen aus Maus, die mit B. pertussis Antigenen in vitro stimuliert wurden. Milzzellen (2 × 10⁶/ml) aus immunisierten oder naiven Kontrollmäusen wurden mit Antigenen oder nur mit Medium (Hintergrundkontrolle) kultiviert, und nach 24 Stunden wurden Überstände entfernt um die Produktion von IL-2 zu bestimmen, und nach 72 Stunden um die Konzentrationen an IFN-γ, IL-4 und IL-5 zu bestimmen. Die Freisetzung von IL-2 wurde bewertet anhand der Fähigkeit von Kulturüberständen, die Proliferation der IL-2 abhängigen Zelllinie CTLL-2 zu unterstützen. Die Konzentrationen von IL-4, IL-5 und IFN-γ aus Maus wurden durch spezifische Immunassays bestimmt, unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper (PharMingen, San Diego, CA, USA), wie früher beschrieben (B. P. Mahon, K. Katrak, A. Nomoto, A. J. Macadam, P. D. Minor und K. H. G. Mills, 1995, J. Exp. Med. 181: 1285-1292).
Die Konzentration von IL-12 wurde durch Immunassays und Bioassays bestimmt. Bei den Immunassays wurden kommerziell erhältliche monoklonale anti-IL-12 Antikörper C17.8 (IgG2a aus Ratte) und C15.6 (IgG1 aus Ratte) (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA), welche die p40 Untereinheit von IL-12 aus Maus als ein Monomer, ein Homodimer oder als Teil des p70 Heterodimers erkennen, zum Abfangen und für den Nachweis verwendet. Ein an alkalische Phosphatase konjugiertes anti-Ratte IgG1 aus Maus (PharMingen, San Diego, CA, USA) wurde verwendet um den zweiten anti-IL-12 Antikörper nachzuweisen. Bei den Bioassays wurden biologisch aktive IL-12 Konzentrationen hinsichtlich der Fähigkeit von Testüberständen, die Produktion von IFN-γ durch naive Milzzellpräparationen zu stimulieren, bewertet. Um sicherzustellen, dass die Produktion von IFN-γ durch die Gegenwart von IL-12 hervorgerufen wurde, wurden Testproben auch in der Gegenwart und Abwesenheit eines spezifischen neutralisierenden anti-IL-12 Antikörpers (2,5 μg/ml Protein G-gereinigter Antikörper aus Schaf gegen IL-12 aus Maus, Genetics Institute, Cambridge, MA, USA) getestet, der bis zu 5 ng/ml IL-12 vollständig neutralisieren kann. Cytokinkonzentrationen wurden bestimmt, indem entweder die Proliferation oder die OD₄₉₂ für Testproben mit einer Standardkurve für rekombinante Cytokine mit bekannter Konzentration verglichen wurde.
BEISPIEL 2 – Makrophagen sezernieren IL-12 in Reaktion auf Bordetella Antigene
Dieses Experiment testete die Fähigkeit von abgetötetem gesamten B. pertussis und von B. pertussis Komponenten, die Produktion von IL-12 durch Maus-Makrophagen zu stimulieren.
Makrophagen.
Peritoneale Makrophagen aus Maus wurden aus naiven Tieren erhalten durch die Adhäsion von Zellen, erhalten durch peritoneale Spülung, an Kunststoff. Milzmakrophagen wurden durch Adhäsion an Kunststoff präpariert und Alveolenmakrophagen wurden durch bronchoalveolare Spülung isoliert, wie früher beschrieben (K. Redhead, A. Barnard, J. Watkins und K. H. G. Mills, 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198). In den Studien der IL-12 Produktion wurde auch die Maus-Makrophagenzelllinie J774 verwendet. Makrophagen wurden mit einem lebensfähigen Phase I B. pertussis in einem Verhältnis von Bakterien zu Makrophagen von 5:1 infiziert, während zwei Stunden vor gründlichem Waschen. Extrazelluläre Bakterien wurden durch Behandlung mit Polymyxin B-Sulfat (100 μg/ml) während 40 Minuten, gefolgt von weiterem Waschen, abgetötet. Diese Behandlung verringert die Anzahl von extrazellulären Bakterien um 5,0 log CFU. Infizierte Makrophagen oder mit Hitze-inaktivierten Bakterien oder bakteriellen Antigenen stimulierte Makrophagen wurden bei 37°C bei 2 × 10⁵ Zellen/ml in einer 5% CO₂ Atmosphäre kultiviert. Nach 24 oder 48 Stunden Zellkultur wurden Überstände entnommen, und die Produktion von IL-12 durch Bioassay oder Immunassay, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Antigene.
Die dritte Britische Referenzpräparation für Pertussis-Impfstoff (88/522) wurde als der Ganzzell-Impfstoff verwendet. Hitze-abgetötete B. pertussis zur Verwendung in Proliferationsassays wurden hergestellt durch Inkubation von Zellen bei 80°C während 30 min. PT, FHA und Pertactin, hergestellt aus dem Stamm B. pertussis Tomaha, wurden freundlicherweise von Carine Capiau bei SmithKline Beecham, Rixensant, Belgien, zur Verfügung gestellt. Chemisch enttoxifiziertes PT (PTd) für die Immunisierung wurde hergestellt durch Behandlung mit 0,2% bis 0,5% Formaldehyd während sieben Tagen, gefolgt von Dialyse gegen PBS, enthaltend 0,01 % Formaldehyd. Inaktiviertes PT (iPT) zur Verwendung in Proliferationsassays wurde hergestellt durch Erhitzen von aktivem PT bei 80°C während 30 Minuten (aktives PT bezeichnet hierin durchgehend unbehandeltes, natives PT). LPS von B. pertussis W28 (89/670) wurde von The National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, Nerts, UK, erhalten. LPS aus E. coli (hergestellt durch Phenolextraktion und Gelfiltrationschromatographie) wurde von der Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, UK, bezogen.
1 zeigt die Produktion von IL-12 durch Makrophagen in Reaktion auf Ganzzell-B. pertussis und auf Komponenten. IL-12 wurde durch Immunassay (A) oder Bioassay (B) getestet. Ergebnisse aus dem Immunassay, der p40 und p70 erkennt, sind mittlere Konzentrationen in Überständen aus jeweils drei Kulturen von Milzmakrophagen, inkubiert mit Hitze-abgetötetem B. pertussis (1 × 10⁸/ml und 5,0 × 10⁸/ml), B. pertussis LPS (1 μg/ml), E. coli LPS (1 μg/ml), FHA (1 μg/ml), Pertactin (1 μg/ml), aktivem PT (1 μg/ml), enttoxifiziertem PT (PTd, 1 μg/ml), oder von peritonealen Makrophagen, inkubiert mit steigenden Dosierungen (10⁵ – 10⁸ CFU/ml) von Hitze-abgetötetem B. pertussis. Der Bioassay maß die Produktion von IFN-γ, produziert durch naive Milzzellen, die 24 Stunden mit Überständen von Milzmakrophagen (stimuliert durch Inkubation mit Antigen, wie vorstehend für den Immunassay beschrieben) in der Gegenwart oder Abwesenheit eines polyklonalen neutralisierenden anti-IL-12 Antikörpers in einer Konzentration von 2,5 μg/ml inkubiert worden waren. In der Gegenwart von anti-IL-12 Antikörper produzierte Gehalte von IFN-γ sind nur gezeigt, wenn bei Abwesenheit des Antikörpers positive Reaktionen beobachtet wurden, und für eine Dosis (5,0 × 10⁸/ml) der abgetöteten Bakterien. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte von jeweils drei Assays, und sind repräsentativ für vier unabhängige Experimente. Die Standardabweichungen betrugen weniger als 20% der Mittelwerte.
Adhärente Zellen aus der Milz von naiven Mäusen, stimuliert mit Hitzeabgetötetem B. pertussis, produzierten signifikante Gehalte von IL-12, wie durch einen für p40 und p70 spezifischen Immunassay nachgewiesen (1A). Moderate Gehalte von IL-12 wurden auch in den Überständen von Makrophagen nachgewiesen, die mit LPS aus entweder B. pertussis oder einem anderen gramnegativen Bakterium, E. coli, inkubiert worden waren. Diese Gehalte waren erhöht, wenn IFN-γ zu den Kulturen zugegeben wurde (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurde wenig oder kein IL-12 von Makrophagen produziert, die mit FHA, PTd oder Pertactin, den Komponenten des zellfreien Impfstoffs, stimuliert worden waren (1A). Peritoneale Makrophagen produzierten ebenfalls IL-12 in Reaktion auf Stimulierung mit Hitze-abgetöteten B. pertussis in einer von der Dosis abhängenden Weise (1A).
Um zu zeigen, dass das produzierte IL-12 biologisch aktiv war, testeten wir die IL-12 Produktion auch unter Verwendung eines Bioassays, der die Stimulierung von IFN-γ durch Milzzellen aus Maus in der Gegenwart oder Abwesenheit eines neutralisierenden polyklonalen anti-IL-12 Antikörpers maß. Überstände von Milzmakrophagen, die mit abgetöteten Bakterien oder gereinigtem LPS stimuliert worden waren, induzierten naive Milzzellen dazu, hohe Gehalte an IFN-γ zu produzieren, was durch den anti-IL-12 Antikörper inhibiert wurde (1B). Obwohl Überstände von Milzzellen, die mit aktivem PT stimuliert worden waren, die Produktion von IFN-γ stimulierten, konnte diese Reaktion nicht durch die Zugabe des anti-IL-12 Antikörpers beseitigt werden. Weiterhin wurde IL-12 in Überständen von PT-stimulierten Makrophagen unter Verwendung des Immunassays nicht nachgewiesen (1A). Es ist daher unwahrscheinlich, dass aktives PT IL-12 von Makrophagen induziert. Aktives PT ist mitogen für T-Zellen aus Maus, und wir haben festgestellt, dass es die Produktion von IFN-γ durch gereinigte T-Zellen aus Milz in der Gegenwart von bestrahlten akzessorischen Zellen fördert (Ryan und Mill, nicht veröffentlichte Beobachtungen). Es ist daher wahrscheinlich, dass das IFN-γ, das in dem IL-12 Bioassay unter Verwendung von Überständen von mit aktivem PT stimulierten Makrophagen nachgewiesen wurde, aus einer direkten Stimulierung von T-Zellen in der Milzzellpopulation durch aktives PT, das in die Überstände der Makrophagen mitgeschleppt wurde, resultiert.
Lebende B. pertussis können von Makrophagen aufgenommen werden und in ihnen überleben, daher wurde auch die Produktion von IL-12 durch Makrophagen nach Infektion mit B. pertussis untersucht. Tabelle 1 zeigt die Sezernierung von IL-12 durch Makrophagen aus Maus in Reaktion auf eine Infektion mit B. pertussis. Die Makrophagen wurden während zwei Stunden mit B. pertussis infiziert und gründlich gewaschen und mit Polymyxin B behandelt um extrazelluläre Bakterien vor Kultivierung in der Gegenwart oder Abwesenheit eines neutralisierenden anti-IL-12 Antikörpers abzutöten. Die IL-12 Produktion wurde bewertet unter Verwendung eines Bioassays, der die Produktion von IFN-γ durch naive Milzzellen maß, die während 24 Stunden mit Überständen von infizierten Makrophagen oder nicht infizierten Kontrollmakrophagen inkubiert worden waren. Die Ergebnisse sind angegeben als die mittleren (± SD) Konzentrationen von IFN-γ in den Überständen von jeweils drei Kulturen, gemessen mittels Immunassay.
Tabelle 1
Obwohl die Gehalte an IL-12 nicht so hoch waren wie diejenigen, die nach Stimulierung von peritonealen Makrophagen mit abgetöteten Bakterien beobachtet wurden (wie in 1A), kann dies die in diesem Experiment verwendete niedrigere Konzentration an lebenden Bakterien widerspiegeln. In anderen Experimenten wurden höhere Gehalte an lebensfähigen B. pertussis verwendet, führten jedoch zu Zelltod der in vitro verwendeten Makrophagenpopulationen. In separaten Experimenten wurde festgestellt, dass Überstände von alveolaren, peritonealen, J774 und Milzmakrophagen, entnommen 24 und 48 Stunden nach Infektion mit B. pertussis, ebenfalls IL-12 enthielten, nachgewiesen durch den Immunassay (Daten nicht gezeigt). Weiterhin sezernierten peritoneale Makrophagen, entnommen aus Mäusen 24 Stunden nach interperitonealer Injektion mit lebenden B. pertussis, signifikante Gehalte an IL-12 (569 pg pro ml Kulturüberstand in einem Experiment), ohne eine weitere Stimulierung in vitro.
BEISPIEL 3 – IL-12 stimuliert die Proliferation von Immunzellen in Reaktion auf B. pertussis Antigene
Wir testeten die Fähigkeit von IL-12, Immunreaktionen auf B. Pertussis in vivo zu modulieren, durch Immunisierung von Mäusen mit FHA und PTd in der Gegenwart oder Abwesenheit von Alaun. Milzzellen von immunisierten Mäusen oder Kontrollmäusen wurden auf in vitro Proliferation getestet, gegen Hitzeabgetöteten B. Pertussis (10⁶/ml), Hitze-inaktiviertes PT (1,0 μg/ml), FHA (1,0 μg/ml), und Pertactin (1,0 μg/ml), wie früher beschrieben (K. H. G. Mills et al., 1993, Infect Immun. 61: 399-410).
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, dass eine Koinjektion mit IL-12 zelluläre Immunreaktionen auf B. pertussis Antigene erhöht. Zwei Wochen nach Immunisierung mit FHA und PTd in Lösung waren die in vitro proliferativen Reaktionen von Milzzellen gegen die spezifischen Antigene ähnlich denen, die gegen Medium alleine beobachtet wurden (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu führte eine Immunisierung mit FHA und PTd in der Gegenwart von IL-12 zu verstärkten proliferativen Reaktionen auf FHA, iPT (Tabelle 2) und abgetötete ganze Bakterien (Daten nicht gezeigt). Die Zugabe von IL-12 zu den an Alaun adsorbierten Antigenen erhöhte ebenfalls die B. pertussis-spezifischen proliferativen Reaktionen, obwohl dies kein statistisch signifikantes Niveau erreichte (Tabelle 2).
Koinjektion von löslichen Antigenen und IL-12 verstärkte den Gehalt an IFN-γ, der in vitro von durch Antigen stimulierten Milzzellen sezerniert wurde; IL-5, ein Cytokin vom Th2 Typ, wurde nicht aus Milzzellen von diesen Tieren nachgewiesen (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu sezernierten Milzzellen aus Mäusen, die mit FHA und PTd in der Gegenwart von Alaun immunisiert worden waren, hohe Gehalte an IL-5 und moderate Gehalte an IFN-γ, was die bekannte Wirkung von Alaun, die Induzierung von Reaktionen vom Th2 Typ in Mäusen zu begünstigen, bestätigt. Die Koinjektion von IL-12 mit FHA und PTd, adsorbiert an Alaun, führte jedoch zu einer Verringerung der IL-5 Produktion, aber nicht zu einer signifikanten Erhöhung des Gehalts an sezerniertem IFN-γ, im Vergleich mit Milzzellen aus Tieren, die mit Alaun formulierte Antigene in der Abwesenheit von IL-12 empfangen hatten (Tabelle 2).
BEISPIEL 4 – IL-12 stimuliert die Produktion von IFN-γ durch Immunzellen aus Mäusen, welche mit Bordetella Antigenen immunisiert worden waren
Die Zugabe von IL-12 in vitro erhöht die Produktion von IFN-γ durch Immunzellen aus Mäusen, welche für eine Th2 Reaktion vorbereitet waren, wie in 2 gezeigt. Die Mäuse wurden mit FHA und PTd in Alaun immunisiert, und Milzzellen wurden in vitro mit FHA, inaktiviertem PT (iPT, 1,0 μg/ml) oder Medium alleine in der Gegenwart von 0, 0,2 und 2,0 ng/ml rekombinantem IL-12 aus Maus stimuliert. Die Gehalte an IFN-γ und IL-5 wurden nach 72 Stunden in Überständen der Milzzellen getestet. Die Ergebnisse sind angegeben als die mittlere (± SE) Cytokinkonzentration für stimulierte Milzzellen von vier Mäusen pro Gruppe, dreifach getestet.
Die Immunisierung von Mäusen mit an Alaun adsorbiertem FHA und PTd erzeugte eine starke Th2 Reaktion; ex vivo produzierten Milzzellen hohe Gehalte an IL-5 und niedrige Gehalte an IFN-γ nach spezifischer Antigenstimulation in vitro (2). Die Zugabe von 0,2 oder 2,0 ng pro ml von rekombinantem IL-12 aus Maus zu den Milzzellen während der Stimulation mit Antigen in Kultur führte jedoch zu signifikant erhöhten Konzentrationen von IFN-γ und geringfügig erniedrigten Gehalten von IL-5 (2), was zeigt, dass IL-12 das Muster der in vitro Sezernierung von Cytokinen durch in vivo geprimte T-Zellen modulieren kann.
BEISPIEL 5 – Adjuvanswirkung von IL-12 bei Immunisierung mit einem zellfreien Pertussis-Impfstoff
Da wir früher gezeigt hatten, dass ein sehr gut schützender Ganzzell-Impfstoff eine Th1 Reaktion induziert, entschieden wir, die Immunreaktionen und den Schutz, die mit einem Ganzzell-Impfstoff induziert werden, mit einem zellfreien Impfstoff, verabreicht in der Gegenwart oder Abwesenheit von IL-12, zu vergleichen. In diesen Studien über die Adjuvanswirkung von IL-12 bei Immunisierung mit einem zellfreien Bordetella pertussis Impfstoff empfingen Gruppen von 20 Mäusen zwei intraperitoneale (i.p.) Immunisierungen in einem Abstand von vier Wochen, mit 1/5 einer humanen Dosis (0,8 IU) des Ganzzell-Impfstoffs (88/522), oder mit einem zellfreien Impfstoff, umfassend jeweils 5 μg FHA, Pertactin und PTd, mit oder ohne rekombinantes IL-12 aus Maus (0,5 μg/Maus). Kontrollmäuse empfingen nur PBS Medium. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse entweder geopfert um Immunantworten zu bewerten, oder der Exposition mit B. pertussis ausgesetzt.
Aerosol-Infektion.
Infektion der Atemwege von Mäusen wurde initiiert durch Aerosol-Exposition unter Verwendung des ursprünglich von Sato et al. (1980, Infect. Immun. 29: 261-266) beschriebenen Verfahrens, mit den nachfolgenden Modifikationen. B. pertussis W28 Phase I wurde bei 36°C unter Bewegung in Stainer-Scholte-Flüssigmedium gezüchtet. Bakterien aus einer 48 Stunden-Kultur wurden in einer Konzentration von etwa 2 × 10¹⁰ Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) pro ml in physiologischer Salzlösung, enthaltend 1 % Casein, erneut suspendiert. Das Impfmaterial für die Exposition wurde während eines Zeitraums von 12 Minuten unter Verwendung eines Zerstäubers als ein Aerosol verabreicht, das in eine Aerosolkammer geführt wurde, die Gruppen von 20-24 Mäusen enthielt. Vier Mäuse aus jeder Versuchsgruppe wurden nach 2 Stunden und nach 2, 5 und 9 Tagen nach der Aerosol-Exposition geopfert um die Anzahl von lebensfähigen B. pertussis in den Lungen zu bewerten.
Auszählung von lebensfähigen Bakterien in den Lungen.
Lungen wurden aseptisch entfernt und auf Eis im 1 ml steriler physiologischer Salzlösung mit 1 % Casein homogenisiert. 100 μl unverdünntes Homogenisat oder von in Reihe verdünntem Homogenisat von individuellen Lungen wurden jeweils dreifach auf jeweils drei Bordet-Gengou Agarplatten aufgetropft, und die Anzahl von CFU wurde nach 5-tägiger Inkubation abgeschätzt. Die Ergebnisse sind angegeben als der Mittelwert von lebensfähigen B. pertussis für individuelle Lungen von vier Mäusen. Die Nachweisgrenze betrug etwa log₁₀ 0,5 CFU pro Lunge.
BALB/c Mäuse wurden zu den Zeitpunkten 0 und 4 Wochen mit einem Ganzzell-Impfstoff (WCV, whole cell vaccine), einem zellfreien Impfstoff (ACV, acellular vaccine; jeweils 5 μg lösliches PTd, FHA und Pertactin) mit oder ohne 0,5 μg IL-12, oder nur PBS (Kontrolle) immunisiert. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse durch Aerosolimpfung einer Exposition mit B. pertussis ausgesetzt. Der Verlauf der Atemwegsinfektion wurde verfolgt, indem zu regelmäßigen Zeitabständen nach der Exposition Auszählungen von lebensfähigen Bakterien durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind die mittleren (± SE) CFU-Zahlen von individuellen Lungen, jeweils dreifach durchgeführt, von vier Mäusen pro Gruppe zu jedem Zeitpunkt.
IL-12 als ein Adjuvans verstärkt die Schutzwirkung eines zellfreien Pertussis-Impfstoffs, wie in 3 gezeigt. In den Kontrollmäusen waren die Bakteriengehalte neun Tage nach der Exposition immer noch hoch (3). Der Zeitverlauf der Atemwegsinfektion in Mäusen, die mit dem Ganzzell-Impfstoff immunisiert worden waren, war sehr kurz, mit einer vollständigen Clearance an Tag 5. Die Clearance von Bakterien in Mäusen, die mit dem zellfreien Impfstoff immunisiert worden waren, war langsamer; eine vollständige Clearance trat bis Tag 9 nach der Exposition nicht auf. Die Zugabe von IL-12 zu der zellfreien Impfformulierung verstärkte deren Schutzwirkung jedoch signifikant. Die Clearance von Bakterien war am Tag 5 vollständig, und die Bakterienlast an Tag 2 war niedriger als die, welche in Mäusen, die mit dem Ganzzell-Impfstoff immunisiert worden waren, beobachtet worden war (3).
Um unsere früheren Vermutungen über die schützende Rolle von Th1 Zellen zu bestätigen, und um nachzuweisen, dass die bessere Schutzwirkung, die mit dem zellfreien Impfstoff bei gleichzeitiger Injektion von IL-12 beobachtet wurde, auf einer verstärkten Zell-vermittelten Immunität beruhte, testeten wir die Immunreaktion der immunisierten Mäuse auch am Tag der Exposition. IL-12 schaltet die Immunreaktion von Milzzellen, die mit einem zellfreien Pertussis-Impfstoff stimuliert worden waren, von einer Th2 Reaktion zu einer Th1/Th0 Reaktion um, wie in 4 gezeigt. Mäuse wurden wie vorstehend für 3 beschrieben mit einem Ganzzell-Impfstoff (WCV), einem zellfreien Impfstoff (ACV; jeweils 5 μg lösliches PTd, FHA und Pertactin) mit oder ohne 0,5 μg IL-12, oder nur PBS (Kontrolle) immunisiert. Die Sezernierung von IL-2, IFN-γ und IL-5 wurde nach Stimulierung von Milzzellen aus immunisierten Mäusen mit iPT (0,2-1,0 μg/ml), FHA (0,2-5,0 μg/ml) und Pertactin (0,2-5,0 μg/ml) getestet. Die Ergebnisse sind angegeben als die mittlere (± SE) Cytokinkonzentration bei der optimalen Antigenkonzentration für Milzzellen von vier Mäusen pro Gruppe, jeweils dreifach getestet.
Proliferative Reaktionen gegen ganze abgetötete B. pertussis, FHA, inaktiviertes PT und Pertactin wurden in Milzzellen aus Mäusen, die mit dem zellfreien Impfstoff immunisiert worden waren, festgestellt, aber diese waren in der Gegenwart von IL-12 signifikant verstärkt und näherten sich den Werten, die mit dem Ganzzell-Impfstoff beobachtet worden waren (Lit. 20 und Daten nicht gezeigt). Eine Untersuchung der Cytokinprofile, die von mit spezifischem Antigen in vitro stimulierten Milzzellen produziert wurden, zeigte, dass Milzzellen, die von Mäusen stammten, die mit dem Ganzzell-Impfstoff immunisiert worden waren, IL-2 und IFN-γ sezernierten, aber kein nachweisbares IL-5 (4). Im Gegensatz dazu sezernierten Milzzellen aus Mäusen, die den zellfreien Impfstoff in der Abwesenheit von IL-12 empfangen hatten, niedrige Gehalte an IL-2 und IFN-γ, und niedrige aber nachweisbare Gehalte an IL-5. Milzzellen aus Mäusen, die den zellfreien Impfstoff in der Gegenwart von IL-12 empfangen hatten, sezernierten jedoch signifikante Gehalte von IL-2 und IFN-γ. Interessanterweise schien IL-12 unterschiedliche Wirkungen auf T-Zellen unterschiedlicher Antigenspezifität zu haben, wobei die Produktion von IL-2 durch für FHA und Pertactin spezifische T-Zellen, und die Produktion von IFN-γ durch für PT spezifische T-Zellen verstärkt wurde. Insgesamt wird die Immunreaktion, die mit dem zellfreien, IL-12 als ein Adjuvans enthaltenden Impfstoff induziert wird, am besten als ein gemischtes Th1/Th2 oder Th0 Profil beschrieben.
Diese signifikanten neuen Feststellungen sind, dass Gewebemakrophagen, umfassend die aus der Lunge, Milz oder Bauchhöhle von naiven Mäusen gewonnenen, nach einer Exposition an lebende oder abgetötete B. pertussis IL-12 produzieren, und dass die Zugabe von IL-12 als ein Adjuvans zu einem zellfreien Pertussis-Impfstoff dessen Schutzwirkung verstärkt, durch Förderung einer Typ 1 T-Zell-Cytokinproduktion. Wir haben gezeigt, dass Immunisierung von Mäusen mit einem zellfreien Pertussis-Impfstoff, umfassend an Alaun adsorbiertes PTd, FHA und Pertactin, eine Th2 Reaktion in Mäusen erzeugte und mit einer verzögerten Clearance von Bakterien nach Exposition der Atemwege assoziiert war.

Claims

Zusammensetzung umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentösem Hämagglutinin und Pertactin.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Antigen an ein Alaun adsorbiert ist.
Zusammensetzung umfassend eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 und zumindest ein Antigen-kodierendes Polynukleotid geeignet zur in vivo Expression, um mindestens ein Bordetella pertussis Antigen zu produzieren.
Zusammensetzung umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen und ein Interleukin-12-kodierendes Polynukleotid geeignet zur in vivo Expression, um eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 zu produzieren.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 um eine Infektion durch Bordetella pertussis in einem Wirt zu verhindern, zu behandeln oder zu verbessern, eine Immunantwort gegen Bordetella pertussis auszulösen oder die Beseitigung von Bordetella pertussis in einem Wirt zu stimulieren.
Impfzusammensetzung umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verfahren zur Herstellung einer Impfzusammensetzung umfassend Kombinieren einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 mit einer Impfzusammensetzung umfassend mindestens ein Bordetella pertussis Antigen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipopolysaccharid, Pertussis-Toxin, filamentösem Hämagglutinin und Pertactin.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Antigen an ein Alaun adsorbiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Impfzusammensetzung umfassend Kombinieren einer effektiven, förderlichen Menge von Interleukin-12 mit einer Impfzusammensetzung umfassend zumindest ein Antigen-kodierendes Polynukleotid, geeignet zur in vivo Expression, um mindestens ein Bordetella perfussis Antigen zu produzieren.
Verfahren zur Herstellung einer Impfzusammensetzung umfassend Kombinieren einer Impfzusammensetzung umfassend mindestens ein Bordetella perfussis Antigen mit einem Interleukin-12-kodierenden Polynukleotid, geeignet zur in vivo Expression, um eine effektive, förderliche Menge von Interleukin-12 zu produzieren.