ES2262181T3 - Il-12 como adyuvante en la vacuna contra la especie bordetella pertussis. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina 12.

Description

IL-12 como adyuvante en la vacuna contra la especie Bordetella pertussis.

Antecedentes de la invención

La presente invención se relaciona en lo general con vacunas contra la especie Bordetella que incluyen interleuquina-12 (IL-12) como un adyuvante, y con los métodos para usar IL-12 como un adyuvante o en combinación con esas vacunas.

La colonización del tracto respiratorio por parte del cocobacilo Bordetella pertussis gram-negativo da lugar a tos ferina, también llamada pertussis, una causa significativa de morbilidad y mortalidad en infantes humanos. Otros dos aislados cercanamente relacionados de Bordetella también se han encontrado en humanos: B. parapertussis y B. bronchiseptica. Los análisis de genética molecular sugieren que esos tres aislados están relacionados demasiado cerca como para clasificarse como especies separadas. (Gilchrist, M.J.R., 1991, "Bordetella", en Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C.) Mientras B. pertussis difiere de B. bronchiseptica y B. parapertussis en la naturaleza de las toxinas que produce, B. bronchiseptica y B. parapertussis sí producen toxinas activas (Hausman, S.Z. et al. 1996, Infect. Immun. 64: 4020-4026) y existe alguna evidencia para indicar que los organismos de B. pertussis pueden encubrirse en el fenotipo de B. parapertussis (Gilchrist, M.J.R., 1991, "Bordetella", en Manual of Clinical Microbiology, 5ª ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Aunque los aislados (isolates) de Bordetella exhiben algunos antígenos de superficie que difieren entre aislados, los cuerpos monoclonales que reconocen un aislado, con frecuencia reconocen por lo menos otro aislado (LeBlay, K. et al., 1996, Microbiology 142: 971-978). El alto grado de similitud molecular entre los aislados de Bordetella y la reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales con los antígenos de Bordetella indica que la respuesta de inmunidad producida por una vacuna contra un aislado de Bordetella afectaría probablemente a los otros aislados también.

La inmunización con una vacuna de Bordetella pertussis de célula entera ha probado ser eficaz en controlar pertussis, pero ha surgido una preocupación por su reactogenecidad. Las vacunas de Pertussis acelular son significativamente menos reactogénicas pero son de eficacia variable. Hasta hace poco se pensaba que la bacteria ocupaba un nicho puramente extracelular durante la infección y consecuentemente se suponía que los mecanismos de inmunidad humoral eran lo máximo en protección. (Robinson, A. et al., 1985, Vaccine 3: 11-22.) Sin embargo existe una evidencia creciente a partir de estudios en humanos y en murina de que B. pertussis puede también ocupar un nicho intracelular a través de invasión y supervivencia dentro de macrófagos y otros tipos de células. (Friedman, R.L. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4578-4585: Saukkonen, K. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1143-1149.) Estas observaciones han conducido a una reexaminación de los mecanismos de inmunidad protectora contra B. pertussis. Mientras que el anticuerpo juega un rol en la neutralización bacterial de la toxina y en la prevención de la adhesión bacterial que sigue a la trasudación de la inmunoglobulina circulante (lg) a los pulmones, la inmunidad mediada por células también juega un papel significativo en la protección contra B. pertussis (Mills, K.H.G. and K. Redhead, 1993, J. Med. Microbiol. 39: 163-164; Peppoloni, S. et al., 1991, Infect. Immun. 59: 3768-3773; Peterson, J.P. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4563-4570.)

La actual comprensión del papel de las células adyuvantes CD4+ T (Th) en la inmunidad frente a enfermedades infecciosas es que las células adyuvantes de tipo antígeno específico 1 T (Th1) que secretan \gamma interferón (IFN-\gamma), interleuquina - 2 (IL-2) y el factor-\beta de necrosis tumoral (TNF-\beta) median en la inmunidad celular, la hipersensibilidad de tipo retardado y las respuestas inflamatorias, mientras que las células adyuvantes de tipo 2 T (Th2) que secretan las interleuquinas IL-4, IL-5 e IL-6 se consideran las principales responsables del suministro de ayuda celular específica T para la producción de anticuerpos. (Mosmann, T.R. and R.L. Coffman, 1989, Adv. Immunol. 46: 111-147). Estudios previos que usan un modelo de respiración de murina han demostrado que la inmunidad protectora contra B. Pertussis inducida por infección es mediada por una población de células CD4^{+}T que secretó IL-2 e IFN-\gamma (células Th1). Los experimentos de transferencia adoptados demostraron que se puede conferir protección con células T en ausencia de respuestas de anticuerpos detectables. En un estudio de inmunidad inducida por vacuna, la inmunización con la vacuna de pertussis de célula entera indujo selectivamente células Th1, mientras que una vacuna acelular que comprende antígenos de B. pertussis, PT detoxificado, FHA y pertactina, indujo células Th2. Además, la inducción de una respuesta Th 1, siguiente a la infección o inmunización con la vacuna de célula entera, se asoció con un despeje bacterial previo que sigue al desafío respiratorio. (Mills, K.H.G. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 399-410: Redhead, K. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198.)

La polarización de la producción de citoquina de la célula CD4^{+} hacia respuestas de tipo 1 o tipo 2 que siguen a la imprimación in vivo aparece controlada por un número de factores que incluye la naturaleza del inmunógeno, la ruta de inmunización y la célula que presenta el antígeno y el entorno regulatorio de la citoquina en el sitio de la simulación de células T. (BaARNrd, A. et al., 1996, Immunol. 87: 372-380; Gajewski, T.F. et al., 1991, J. Immunol. 146: 1750-1758; O'Gara, A. and K. Murphy, 1994. Curr. Opin. Immunol. 6: 458-466.) La citoquina regulatoria interleuquina-12 (IL-12) también es una citoquina clave en el desarrollo de respuestas tipo 1 (Hsieh, C.-S. et al., 1993, Science 260: 547-549; Trinchieri, G., 1995, Annu. Rev. Immunol. 13: 251-276.) IL-12 puede inducir la secreción de IFN-\gamma por medio de células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés "Natural Killers") y por medio de células CD4^{+} y puede promover la diferenciación y desarrollo de células Th1 a partir de las poblaciones precursoras Th0 (Bliss, J. et al., 1996, J. Immunol. 156: 887-894; McKnight, A.J. et al., 1994, J. Immunol. 152: 2172-2179; Seder, R.A. et al., 1993, PNAS USA 90: 10188-10192.) Además, IL-12 puede también inducir la producción de anticuerpos que opsonizan anticuerpos promoviendo el cambio de inmunoglobulina mediado por IFN-\gamma a favor de IgG2a en un ratón. (Morris. S.C. et al., 1994, J. Immunol. 152: 1047-1056.) Puesto que las células Th1 juegan un papel importante en la resolución de infecciones con organismos intracelulares, IL-2 puede influenciar el curso de infecciones bacteriales, virales y parasíticas alterando el balance de células Th1 y Th2 a favor de la producción de IFN-\gamma. (Flynn. J.L. et al., 1995, J. Immunol. 155: 25-15-2524: Gazzinelli, R.T. et al., 1993, PNAS USA 90: 6115-6119; Heinzel, F.P. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 1505-1509; Hunter. C.A. et al., 1994. Infect. Immun. 62: 2818-2824; Sypek, J.P. et al., 1993. J. Exp. Med. 177: 1797-1802: Tripp, C.S. et al., 1994, J. Immunol. 152: 1833-1887; Urban, J.F. et al., 1996. J. Immunol. 156: 263-268; Wynn, T.A. et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1551-1561; Zhan. Y. and C. Cheers, 1995, Infect. Immun. 63: 1387-1390.)

WO 91/01143 divulga una composición de vacuna que comprende una mezcla de un antígeno y una cantidad adyuvante de interleuquina-1\alpha, por ejemplo: interleuquina-1\beta, interleuquina-2, interleuquina-3, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-7, absorbida en un mineral y un preservante farmacéuticamente aceptable. WO 96/11019 divulga una composición que comprende una mezcla de un antígeno de un virus de la familia Paramyxoviridae y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Ni WO 91/01143 como tampoco WO 96/11019 divulgan una composición que comprenda por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12, como se proporciona en la presente invención.

Existe un requisito continuo de nuevas composiciones que comprenden IL-12, que aumentarán o alterarán los efectos de vacunas de Bordetella, y de métodos para su uso en la prevención, tratamiento o mejoramiento de infecciones de Bordetella.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que el uso de IL-12 como un adyuvante en una vacuna acelular de Bordetella aumentó significativamente su eficacia protectora.

En una realización, la presente invención suministra una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferiblemente, el antígeno es un lipopolisacárido, una toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina o se adsorbe sobre alumbre.

En otra realización, la presente invención suministra una composición que comprende una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 y por lo menos un polinucleótido codificante de antígeno capaz de expresión in vivo para producir por lo menos antígeno de Bordetella pertussis.

Otra realización proporciona una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y un polinucleótido codante de interleuquina-12, capaz de expresión in vivo para producir una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.

Otra realización proporciona un método para prevenir, tratar o aliviar una infección por Bordetella pertussis en un huésped, que comprende administrar al huésped una composición que comprende por lo menos una antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferentemente, el antígeno es un lipopolisacárido, una toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina, o se absorbe en alumbre, se administra como un polinucleótido codante de antígenos en condiciones en las que el antígeno se expresa in vivo. Preferentemente, la interleuquina-12 puede administrarse como un polinucleótido codante de interleuquina-12 en condiciones en las que la interleuquina-12 se expresa in vivo.

En otra realización, la invención proporciona un método para obtener una respuesta inmune contra Bordetella pertussis que comprende administrar una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferiblemente, el antígeno es un lipopolisacárido, una toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina, o se adsorbe sobre alumbre o se administra como un polinucleótido codante de antígeno en condiciones en las que el antígeno se expresa in vivo. Preferiblemente, la interleuquina-12 se puede administrar como un polinucleótido codante de interleuquina-12 en condiciones en las que la interleuquina-12 se expresa in vivo.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para obtener una respuesta inmune contra Bordetella que comprende administrar simultáneamente una primera composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una segunda composición que comprende una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferiblemente, el antígeno es un lipopolisacárido, toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina, o se adsorbe en alumbre, o se administra como un polinucleótido codante de antígeno en condiciones en las que el antígeno se expresa in vivo. Preferiblemente, la interleuquina-12 se puede administrar como un polinucleótido codante de interleuquina-12 en condiciones en las que la interleuquina-12 se expresa in vivo.

Otra realización de la presente invención suministra un método para estimular el paso de Bordetella pertussis desde un huésped que comprende administrar una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferiblemente, el antígeno es un lipolisacárido, toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina o se adsorbe sobre alumbre, o se administra como un polinucleótido codante de antígeno en condiciones en las que el antígeno se expresa in vivo. Preferiblemente, la interleuquina-12 puede ser administrada como un polinucleótido codante de interleuquina-12 en condiciones en las que la interleuquina-12 se expresa in vivo.

Otra realización más proporciona un método para preparar una composición de vacuna efectiva que comprende combinar una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 con una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis. Preferiblemente, el antígeno es un lipopolisacárido, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, o pertactina o se adsorbe en alumbre.

También se proporciona un método para preparar una composición mejorada de vacuna que comprende combinar una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 con una composición de vacuna que comprende por lo menos un polinucleótido codante de antígeno capaz de una expresión in vivo para producir por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis.

En otro aspecto de la invención se proporciona un método para preparar una composición mejorada de vacuna que comprende combinar una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis con un polinucleótido, codante de interleuquina-12, capaz de expresión in vivo para producir una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.

Otra realización de la invención suministra, en una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y un adyuvante, el mejoramiento que comprende emplear como adyuvante una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12. Preferentemente, el antígeno es un lipopolisacárido, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa o pertactina, o se adsorbe en alumbre.

La invención también suministra, en una composición de vacuna que comprende un adyuvante y por lo menos un polinucleótido codante de antígeno capaz de expresión in vivo para producir por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis, el mejoramiento que comprende emplear como adyuvante una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.

También se ha proporcionado como otra realización más, en una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y un adyuvante, el mejoramiento que comprende emplear como el adyuvante un polinucleótido codante de interleuquina-12, capaz de expresión in vivo para producir una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán aparentes al considerar la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidos de la misma.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 es un gráfico de barras que muestra la producción de IL-12 e IFN-\gamma por macrófagos estimulada con antígenos de Bordetella como se describe en el ejemplo 2.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la producción de IL-5 e IFN-\gamma mediante células de bazo de ratones inmunizados con antígenos de Bordetella, estimuladas luego in vitro con antígenos de Bordetella en combinación con IL-12, como se describe en el ejemplo 4.

La figura 3 es un gráfico que muestra conteos de células viables de B. pertussis en los pulmones de ratones inmunizadas con células íntegras de B. pertussis o vacunas acelulares con o sin IL-12, desafiadas con B. pertussis viva, tal como se describe en el ejemplo 5.

La figura 4 es un gráfico de barras que muestra la producción de IL-2, IFN-\gamma e IL-5 por células de bazo de ratones inmunizados con vacunas de células íntegras de B. pertussis o acelulares con o sin IL-12, estimulados luego in vitro con antígenos de Bordetella, tal como se describe en el ejemplo 5.

Descripción detallada de la invención

Los inventores presentes han demostrado por primera vez que la inclusión de IL-12 en una vacuna acelular contra Bordetella generó respuestas inmunes, mediadas por células, similares a aquellas observadas con vacunas de células íntegras. Una respuesta de células adyuvantes (Th2) del tipo 2 T normalmente inducida siguiente a una inmunización de ratones con una preparación acelular de vacuna de Bordetella puede cambiar a una respuesta Th1/Th0 por la incorporación de IL-12 a la formulación de la vacuna. El uso de IL-12 como adyuvante en una vacuna acelular de pertussis aumentó significativamente su eficacia protectora; la velocidad de despeje de B. pertussis desde los pulmones siguiendo el desafío respiratorio fue igual a aquel observado con una potente vacuna de célula entera. Estos hallazgos demuestran una influencia regulatoria de IL-12 sobre la inducción de células Th1 específicas de B. pertussis siguiente a la infección o inmunización y proporciona más evidencia del rol de las células Th1 en la inmunidad protectora contra B. pertussis. La presente invención proporciona composiciones de vacuna de Bordetella novedosas y métodos de coadyuvar vacunas de Bordetella destinadas a proporcionar una respuesta inmune mediada por células contra Bordetella usando IL-12 como adyuvante.

Tal como se usa en el presente texto, Bordetella incluye Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica y cualquier otra cepa de Bordetella o aislado que sea suficientemente similar para que una respuesta inmune (incluyendo inmunidad mediada por células y/o la generación de anticuerpos) surgida contra antígenos presentes en un aislado tenga un efecto contra por lo menos algunas de las otras cepas o aislados.

Un antígeno de Bordetella incluye el uso de todo el organismo de Bordetella por completo, un organismo entero que expresa antígenos de Bordetella, una porción antigénica del organismo de Bordetella, antígeno producido de manera recombinante o porciones del mismo o proteínas de fusión que comprenden antígenos y equivalentes funcionales de antígenos de Bordetella. Las porciones antigénicas de organismos de Bordetella incluyen lipopolisacáridos (LPS), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina y toxina de pertussis (PT). LPS de Bordetella se purifica, por ejemplo mediante cromatografía de filtración de gel. La toxina de pertussis puede ser activa o toxina de pertussis nativa no tratada (aPT). Preferentemente, toxina de pertussis puede ser toxina de pertussis inactivada (iPT), tal como toxina de pertussis inactivada mediante tratamiento por calor, o toxina pertussis desintoxicada (PTd), tal como toxina de pertussis químicamente desintoxicada por tratamiento de formaldehído. Los antígenos de Bordetella se pueden adsorber en alumbre. Adicionalmente, los antígenos de la presente invención incluyen polinucleótidos codante de antígenos de Bordetella. Ejemplos de tales polinucleótidos son aquellos que comprenden los genes para B. pertussis FHA (Renauld-_Mongenie, G. et al., 1996, PNAS USA 93: 7944-7949) y toxina pertussis (Steffen, P. et al., 1996, EMBO J. 15: 102-109). Otras porciones antigénicas de organismos de Bordetella que se pueden usar en las composiciones y métodos de la presente invención se pueden determinar por parte de aquellos con habilidad ordinaria en el arte.

La interleuquina-12 (IL-12), originalmente llamada factor estimulante de células asesinas naturales, es una citoquina heterodimérica descrita, por ejemplo, en M. Kobayashi et al., 1989, J. Exp. Med. 170: 827. IL-12 se puede purificar a partir de fuentes naturales mediante técnicas de ADN recombinantes, por ejemplo mediante expresión y aislamiento de proteína IL-12 en células huéspedes recombinantes tal como se describe detalladamente en la Solicitud InteARNcional de Patente WO90/05147, publicada en mayo de 1990 (también la Solicitud de Patente Europea No. 441,900). Las secuencias de ADN y aminoácidos de las sub-unidades 30 kD y 40 kD de la IL-12 heterodimérica humana se proporcionan en la solicitud inteARNcional arriba citada y en la patente de Estados Unidos No. 5,571,515. Las cantidades de investigación de la IL-12 recombinante humana y de murina también están disponibles en el Genetics Institute, Inc., Cambridge, Massachusetts.

Tal como se usa en el presente texto, "interleuquina-12" e "IL-12" se refieren a interleuquina-12, sus sub-unidades individuales, los fragmentos de la misma que exhiben actividad adyuvante de IL-12, polinucleótidos codantes de IL-12 y equivalentes funcionales de "interleuquina-12" e "IL-12".

Los equivalentes funcionales de antígenos de Bordetella e IL-12 incluyen antígenos de Bordetella modificados y proteína de IL-12, tal que el antígeno de Bordetella resultante o el producto de IL-12 tengan la misma actividad antigénica o adyuvante, respectivamente, tal como aquí se describe, y las secuencias de polinucleótidos a través de la degeneración del código genético codifican antígenos de Bordetella o polipéptidos de IL-12 que tienen la actividad antigénica o adyuvante de IL-12, respectivamente, tal como se describe aquí. Por ejemplo, un equivalente funcional de un antígeno de Bordetella o de IL-12 puede contener un codón "silente" o una substitución de aminoácido (por ejemplo, sustitución de un aminoácido acídico por otro aminoácido acídico, o substitución de un codón por un amino ácido hidrofóbico por otro codón por un amino ácido hidrofóbico).

Los fragmentos de antígenos de Bordetella e IL-12 también son abarcados por la presente invención. Preferiblemente, tales fragmentos conservan la actividad antigénica o adyuvante deseada o la modifican para crear una actividad deseada. Los fragmentos de antígenos de Bordetella o IL-12 pueden estar en forma lineal o pueden ciclarse usando métodos conocidos, por ejemplo, tal como se describe en H.U. Saragovi, et al., Bio/_Technology 10, 773-778 (1992) y en R.S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992). Los antígenos de Bordetella y polipéptidos de IL-12 aquí proporcionados también incluye antígenos y polipéptidos de IL-12 caracterizados por secuencias de amino ácidos similares a aquellas de los antígenos y polipéptidos IL-12 purificados pero dentro de los cuales se proporcionan modificaciones natural o deliberadamente diseñadas. Por ejemplo, las modificaciones en el antígeno o en el polipéptido IL-12 o las secuencias polinucleótidas codantes de antígeno o IL-12 pueden hacerse por aquellos con habilidad en el arte usando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en el antígeno de Bordetella o en las secuencias de polipéptido IL-12 pueden incluir la alteración, adición, inserción, supresión, mutación, substitución, reemplazo o modificación de un residuo seleccionado de amino ácido en la secuencia de codificación. Como un ejemplo, se puede adicionar un amino ácido adicional al N-terminal del antígeno o de IL-12. También, la secuencia aminoácido del antígeno o de IL-12 se puede alterar usando técnicas de mutación aleatoria. También es posible pegar a los antígenos o a IL-12 otras fracciones moleculares, incluyendo sin limitación carbohidratos, lípidos o glicol de polietileno, o retirar o alterar tales fracciones. Las técnicas para tales alteraciones, adiciones, inserciones, supresiones, mutaciones, substituciones, reemplazos o modificaciones son bien conocidos para aquellos con habilidad en el arte (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No.4,518,584). Preferiblemente, tal alteración, adición, inserción, supresión, mutación, substitución, reemplazo o modificación conserva la actividad deseada del antígeno de Bordetella o IL-12, o la modifica para crear una actividad deseada.

La invención también abarca variantes alélicas de polinucleótidos codantes de antígenos de Bordetela e IL-12 divulgados; es decir, formas alteARNtivas de ocurrencia natural de polinucleótidos aislados que también codifican antígenos o polipéptidos de IL-12 que son idénticos, homólogos o relacionados a aquellos codificados por los polinucleótidos aislados.

Administración y dosificación

La IL-12 y el antígeno de Bordetella se pueden administrar como una vacuna profiláctica a los huéspedes, preferiblemente a huéspedes mamíferos, que estén infectados o no infectados con Bordetella. La IL-12 y el antígeno se pueden administrar también como una vacuna terapéutica a huéspedes infectados y puede resultar en mejoramiento o eliminación del estado de enfermedad debido a la infección por organismos de Bordetella.

La cantidad de antígeno de Bordetella usado en las composiciones y métodos de la presente invención es una cantidad que produce una respuesta inmunoestimulatoria efectiva en el huésped. Una cantidad efectiva adyuvante de IL-12 es una cantidad tal que cuando se administra da lugar a una respuesta inmune aumentada con relación a la respuesta inmune cuando no se administra IL-12. Tales cantidades de IL-12 dependerán de la naturaleza del antígeno de Bordetella y de las cantidades de dosificación del antígeno. Adicionalmente, la cantidad de antígeno de Bordetella y de IL-12 administrada al huésped variará dependiendo de una variedad de otros factores, incluyendo el (los) antígeno(s)
empleado(s), el tamaño, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del huésped, el tiempo de duración de administración y las calidades particulares de la infección de Bordetella que se está tratando o contra la que se ha vacunado. Como un ejemplo, una cantidad efectiva adyuvante de polipéptido es deseable entre cerca de 0,1 \mug hasta cerca de 0,5 mg de polipéptido de IL-12 por cerca de 25 \mug de antígeno. La cantidad efectiva adyuvante para cualquier vacuna particular o antígeno se definirá fácilmente balanceando la eficacia y toxicidad de la combinación de IL-12 y antígeno. El ajuste y la manipulación de los rangos de dosificación establecidos se encuentran dentro de la habilidad de aquellos diestros en el arte.

En el método de la presente invención se administra una cantidad efectiva adyuvante de IL-12 en combinación con un antígeno de Bordetella en un tiempo estrechamente relacionado con la inmunización mediante el antígeno de Bordetella para que se produzca una respuesta inmune aumentada relativa a una inmunización en la que IL-12 no se administra. Así, la IL-12 se puede administrar previamente y preferiblemente justo antes de la inmunización, en el momento de la inmunización (es decir, simultáneamente) o después de la inmunización (es decir, posteriormente). Si la IL-12 se administra antes de la composición de vacuna, es deseable administrarla cerca de uno o más días antes de la vacuna. Adicionalmente, la IL-12 se puede administrar previamente a la inmunización con el antígeno de Bordetella, seguida de inyecciones posteriores de IL-12 después de la inmunización con el antígeno.

La IL-12 y el antígeno de Bordetella se pueden administrar a un huésped en una variedad de formas. Las rutas de administración incluyen rutas intradermal, transdermal (por ejemplo, mediante polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, aural, epidural, anal o vaginal (por ejemplo, mediante supositorios), o intranasal. Cualquier otra ruta conveniente de administración se puede usar, por ejemplo infusión o inyección de bolo, o absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneo. Adicionalmente, la IL-12 y el antígeno de Bordetella se pueden administrar en combinación con otros componentes o agentes biológicamente activos, tales como otros adyuvantes conocidos (por ejemplo, alumbre, MPL, QS21), surfactantes farmacéuticamente aceptables tales como glicéridos, excipientes tales como lactosa, diluyentes soportes y vehículos. Si se desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, saborizantes y/o colorantes.

Cuando se usa como adyuvante para una composición de vacuna que contiene antígeno de Bordetella, la IL-12 se mezcla deseablemente como parte de la composición de la vacuna misma y se administra por la misma ruta que el antígeno de Bordetella de la vacuna. A modo de alteARNtiva, el efecto adyuvante de IL-12 se puede emplear administrando IL-12 por separado de la composición de vacuna. Cuando de administra por separado, la IL-12 se encuentra deseablemente en presencia de un soporte adecuado, tal como una salmuera y opcionalmente agentes farmacéuticos convencionales que permiten una liberación gradual de IL-12. La cantidad de IL-12 usada en este modo de vacunación es similar a los rangos identificados arriba cuando IL-12 es parte de la composición de la vacuna.

Además, los antígenos Bordetella y/o IL-12 se pueden administrar mediante expresión in vivo en el huésped de polinucleótidos codante de por lo menos un antígeno de Bordetella y/o IL-12. Los polinucleótidos codante de IL-12 o un fragmento de la misma se pueden usar como un adyuvante. Los polinucleótidos, preferiblemente en forma de ADN, se pueden entregar al huésped vacunado para expresión in vivo de antígenos de Bordetella y/o IL-12. El tal llamado "ADN desnudo" se puede usar para expresar antígenos de Bordetella y/o IL-12 in vivo en un huésped. (Cohen, J., 1993, Science 259: 1691-1692; Fynan, E. et al., 1993, PNAS USA 90: 11478-11482; y Wolff, J.A. et al., 1991, Biotechniques 11:_474-485 describen usos similares de "ADN desnudo"). Por ejemplo, los polinucleótidos codantes de IL-12 o fragmentos de la misma se pueden incorporar, o transducir, hacia el organismo de Bordetella mismo, si el organismo de Bordetella entero se va a emplear como antígeno de vacuna. En otro ejemplo, los polinucleótidos codantes de antígenos de Bordetella se pueden incorporar o transducir hacia las células de otro organismo, de tal manera que los antígenos de Bordetella se expresen sobre la superficie de las células que pueden luego ser empleadas como el antígeno de la vacuna. AlteARNtivamente, los polinucleótidos codantes de IL-12 o fragmentos de la misma se pueden administrar como parte de la composición de vacuna de Bordetella o por separado pero contemporáneo con el antígeno de la vacuna, por ejemplo, mediante inyección.

Son conocidos a aquellos con destreza en el arte otros modos de entregar los antígenos de Bordetella y/o IL-12 al huésped en forma de polinucleótidos que los codifican y se pueden emplear en vez de la administración de antígenos de Bordetella y/o polipéptidos de IL-12, como se desee. Por ejemplo, los polinucleótidos codantes de IL-12 se pueden administrar como parte de un vector o como un casete que contiene las secuencias codantes de los antígenos de Bordetella y/o IL-12 enlazados operativamente con una secuencia de promotor. (Ver, por ejemplo, la Solicitud InteARNcional de Patente PCT WO94/01139, publicada en enero 20, 1994). Brevemente, el ADN codante de los antígenos de Bordetella y/o la proteína de IL-12 o los fragmentos deseados de la misma pueden insertarse en un casete de ácido nucleico. Este casete se puede diseñar para contener, en adición al antígeno o a la secuencia de IL-12 que se va a expresar, otras secuencias flanqueantes opcionales que permiten su inserción a un vector. Este casete puede entonces insertarse en un vector apropiado corriente debajo de un promotor, una secuencia líder de mARN, un sitio de iniciación y otras secuencias regulatorias capaces de dirigir la replicación y la expresión de aquella secuencia in vivo. Secuencias regulatorias adicionales se pueden insertar corriente abajo de la secuencia codante que se va a expresar. Este vector permite expresión in vivo de los antígenos de Bordetella y/o polipéptidos de IL-12 dentro del huésped. Cuando se emplean polinucleótidos de IL-12 como adyuvante, estas secuencias polinucleótidas se pueden enlazar operativamente a secuencias polinucleótidas codantes del o de los antígenos de Bordetella.

IL-12 puede ser preferible a los adyuvantes conocidos debido a su aumento de la eficacia de la vacuna cuando se requiere inmunidad mediante células. IL-12 tiene una ventaja por sobre el alumbre como adyuvante de vacuna, puesto que el alumbre induce a células ayudantes Th2 T antes que las células Th1 inducidas por IL-12. Así, las vacunas adyuvadas por alumbre pueden ser ineficaces para organismos tales como Bordetella contra la cual una respuesta Th1 es lo más efectivo. Adicionalmente, IL-12 es superior a los adyuvantes bacteriales, tales como BCG, que puede inducir en adición a IL-12 otros agentes o resultados que pueden no ser deseados o controlados. Más deseablemente, IL-12 en calidad de un adyuvante no debe inducir la producción incontrolada de otras citoquinas, como sí lo hacen los adyuvantes bacteriales que inducen IL-12 junto con muchas otras citoquinas. A diferencia de los adyuvantes bacteriales, IL-12 es humana en origen y así es improbable que produzca cualquier sensibilización. Además, a diferencia de otros adyuvantes tales como IFN-\gamma o IL-2, IL-12 es relativamente estable in vivo. De esta manera, se espera que IL-12 sea un adyuvante altamente útil para uso en vacunas contra Bordetella.

Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la presente invención, pero no están destinados a limitar el alcance de la divulgación.

Ejemplo 1

Análisis de la producción de citoquina

Ratones. Ratones hembra BALB/c fueron criados y mantenidos bajo las guías del Departamento Irlandés de Salud. Todos los ratones eran de 8 a 12 semanas de edad en la iniciación de este y los otros experimentos.

Producción de citoquinas. La producción de citoquina de célula T fue evaluada usando células de bazo de ratones estimuladas con antígenos de B. pertussis in vitro. Las células de bazo (2 x 10^{6}/ml) de ratones de control inmunizados o nativos fueron cultivadas con antígenos o con medio solas (control de fondo) y los sobrenadantes se retiraron después de 24 horas para determinar la producción IL-12 y después de 72 horas para determinar las concentraciones de IFN-\gamma IL-4 e IL-5. La liberación de IL-2 se evaluó por la habilidad de los sobrenadantes de cultivo para apoyar la proliferación de la línea celular CTLL-2 dependiente de IL-2. Las concentraciones de IL-4, IL-5 y IFN-\gamma de murina fueron determinadas por ensayos de inmunidad específicos usando anticuerpos disponibles comercialmente (PharMingen, San Diego, CA, USA) tal como se describió previamente (B.P. Mahon, K. Katrak, A. Nomoto, A.J. Macadam, P.D. Minor, K.H.G. Mills, 1995, J. Exp. Med. 181: 1285-1292).

La concentración de IL-12 se determinó mediante ensayos de inmunidad y bioensayos. En los ensayos de inmunidad, los anticuerpos monoclonales anti-IL-12 disponibles comercialmente C17.8 (rat IgG2a) y C15.6 (rat IgG1) (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA), los cuales reconocen la subunidad p40 de IL-12 de murina como un monómero, un homodímero como parte del heterodímero p70, se usaron para captura y detección respectivamente. Un anti-rat IgG1 de ratón conjugado con fosfotasa alcalina (PharMingen, San Diego, CA, USA) se usó para detectar el segundo anticuerpo de anti-IL-12. En los bio-ensayos se evaluaron concentraciones de IL-12 biológicamente activa mediante la habilidad de los sobrenadantes para estimular la producción de IFN-\gamma mediante preparaciones de células nativas de bazo. Para asegurar que la producción de IFN-\gamma se debió a la presencia de IL-12, las muestras de ensayo también se ensayaron en la presencia y ausencia de un anticuerpo anti-IL-12 específico neutralizante (2,5 \mug/ml de proteína de IL-12 anti-murina de oveja G-purificada, Genetics Institute, Cambridge, MA, USA) que se puede neutralizar completamente hasta 5 ng/ml de IL-12. Las concentraciones de citoquina se determinaron comparando la proliferación o la OD492 para las muestras de prueba con una curva estándar para citoquinas recombinantes de concentración conocida.

Ejemplo 2

Los macrófagos secretan IL-12 en respuesta a antígenos de Bordetella

Este experimento ensayó la habilidad de toda la B. pertussis y los componentes de B. pertussis matados para estimular la producción de IL-12 por macrófagos de murina.

Macrófagos. Los macrófagos peritoneales de murina se obtuvieron a partir de animales nativos mediante adherencia plástica de células obtenidas por lavado peritoneal. Los macrófagos esplénicos se prepararon por adherencia plástica y los macrófagos alveolares se aislaron por lavado broncoalveolares como se describió previamente (K. Redhead, A. BaARNrd, J. Watkins, and K. H. G. Mills, 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198). La línea celular J774 de macrófagos de murina también se usó en estudios de producción de IL-12. Los macrófagos se infectaron con B. pertussis de fase viable I en una proporción de bacteria a macrófago de 5:1 por dos horas antes de lavar extensamente. Las bacterias extracelulares fueron muertas por tratamiento con sulfato B de polimixina (100 \mug/ml) durante 40 minutos seguido de otro lavado. Este tratamiento reduce el número de bacteria extracelular en 5,0 log CFU.

Los macrófagos infectados o macrófagos estimulados con bacterias desactivadas por calor o antígenos bacteriales se cultivaron en 2x10^{5} células /ml a 37°C en una atmósfera de CO_{2}. Después de 24 o 48 horas se retiraron los sobrenadantes del cultivo celular y la producción de IL-12 se determinó mediante bio-ensayo o inmuno-ensayo, como se describió arriba en el ejemplo 1.

Antígenos. La tercera preparación de referencia británica para vacuna de pertussis (88/522) se usó como la vacuna de célula entera. Mediante incubación de células a 80°C por 30 minutos se preparó B. pertussis matada por calor para uso en ensayos de proliferación. PT, FHA y pertactina, preparados a partir de cepa de B. Pertussis Tohama, fueron amablemente suministrados por Carine Capiau en SmithKline Beecham, Rixensant, Bélgica. PT (PTd) químicamente desintoxicada para inmunización se preparó mediante tratamiento con 0.2% a 0.5% de formaldehído por siete días seguido por diálisis contra PBS que contiene 0.01% de formaldehído. Se preparó PT desactivada (iPT) para uso en ensayos de proliferación calentando PT activa a 80°C por 30 minutos. (PT activa se refiere a PT nativa no tratada del todo) Se obtuvo LPS de B. Pertussis W28 (89/670) a partir de The National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, Herts, Reino Unido. LPS a partir de E. coli (preparada mediante extracción fenólica y cromatografía de filtración con gel) se adquirió en Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, Reino Unido.

La figura 1 muestra producción macrófaga de IL-12 en respuesta a B. Pertussis entera y componentes. Se ensayó IL-12 mediante inmuno-ensayos (A) o mediante bio-ensayos (B). Los resultados del inmuno-ensayo, que detecta p40 y p70, son concentraciones promedio en sobrenadantes de cultivos triplicados de macrófagos esplénicos incubados con B. pertussis matada con calor (1x10^{8}/ml y 5,0 x10^{8}/ml), B. pertussis LPS (1 \mug/ml), E. coli LPS (1 \mug/ml), FHA (1 \mug/ml), pertactina (1 \mug/ml),

PT activa (1 \mug/ml), PT desintoxicada (PTd, 1 \mug/ml), o macrófagos peritoneales incubados con dosis que se incrementan (10^{5}-10^{8} CFU/ml) de B. Pertussis matadas con calor. El bio-ensayo midió la producción de IFN-\gamma producida por células de bazo nativas incubadas por 24 horas con sobrenadantes de macrófagos esplénicos (estimulados mediante incubación con antígeno como se describe para el inmuno-ensayo) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-IL-12 policlonal neutralizante a 2,5 \mug/ml. Los niveles de IFN-\gamma producida en presencia de anticuerpo anti-IL-12 sólo se muestran cuando se observan respuestas positivas en ausencia del anticuerpo y con una dosis (5.0 x 10^{8}/ml) de las bacterias matadas. Los resultados son promedios para ensayos triplicados y son representativos de cuatro experimentos independientes. Las desviaciones estándar fueron menores del 20% de los valores promedios.

Las células adherentes de los bazos de ratones nativos estimuladas con B. pertussis matada por calor produjeron niveles significativos de IL-12; tal como se detectó mediante un inmuno-ensayo específico para p40 y p70 (figura 1A).

Niveles moderados de IL-12 también se detectaron en sobrenadantes a partir de macrófagos incubados con LPS derivada ya sea a partir de B. pertussis o bien de otra bacteria gram-negativa E. coli. Estos valores fueron incrementados cuando se adicionó IFN-\gamma a los cultivos (no se muestran los datos). En contraste, poca o ninguna IL-12 fue producida por macrófagos estimulados con FHA, PTd, o pertactina, los componentes de la vacuna acelular (figura 1A). Los macrófagos peritoneales también produjeron IL-12 en respuesta a la estimulación con B. pertussis matada con calor de una manera dependiente de la dosis (figura 1A).

Para demostrar que la IL-12 producida era biológicamene activa, también ensayamos producción de IL-12 usando un bioensayo que midió la estimulación de IFN-\gamma por células de bazo de murina en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-IL-12 policlonal neutralizante. Los sobrenadantes de los macrófagos esplénicos que habían sido estimulados con bacterias matadas o LPS purificada indujeron células nativas de bazo a producir altos niveles de IFN-\gamma lo cual fue inhibido por el anticuerpo anti-IL-12 (figura 1B). Aunque los sobrenadantes de las células de bazo estimuladas con PT activa sí estimularon la producción de IFN-\gamma esta respuesta no pudo ser retirada por la adición del anticuerpo anti-IL-12. Además, IL-12 no se detectó en sobrenadantes de macrófagos estimulados con PT usando el inmuno-ensayo (figura 1A). Por lo tanto, es improbable que la PT activa induzca IL-12 a partir de macrófagos. PT activa es mitogénica para células T de murina y hemos encontrado que promueve IFN-\gamma producido por células T esplénicas purificadas en presencia de células accesorias irradiadas (Ryan y Mill, observaciones no publicadas). Por lo tanto, el IFN-\gamma detectado en el bio-ensayo de IL-12 usando sobrenadantes de macrófagos estimulados con PT activa es probable que haya resultado de la estimulación directa de células T en la población celular del bazo por PT activa llevada a cabo en sobrenadantes de macrófagos.

Se puede hacer asimilar y sobrevivir la B. pertussis viva dentro de macrófagos para que la producción de IL-12 por macrófagos, siguiente a la infección con B. pertussis, se examine también. La tabla 1 muestra la secreción de IL-12 por parte de macrofagos de murina en respuesta a la infección con B. pertussis. Los macrófagos se infectaron con B. pertussis por dos horas y se lavaron extensamente y se trataron con polimixina B para matar bacterias extracelulares antes de cultivar en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-IL-12 neutralizante. La producción IL-12 se evaluó usando un bio-ensayo que midió la producción de IFN-\gamma por células de bazo nativas incubadas por 24 horas con sobrenadantes de macrófagos infectados o no infectados de control. Los resultados se expresan como el promedio (\pm SD) de las concentraciones de IFN-\gamma en los sobrenadantes de cultivos triplicados medidas por inmuno-ensayo

TABLA 1

	BFN-\gamma(pg/ml)
Macrófago	Infectado	Sin anticuerpo	+ anti-IL-12
Alveolar	-	< 50	< 50
	+	700 (41)	100 (16)
Peritoneal	-	<50	< 50
	+	30,000 (2,245)	75 (31)
J774	-	< 50	<50
	+	900 (66)	< 50

Aunque los niveles de IL-12 no son tan altos como los observados a continuación de la estimulación de macrófagos peritoneales con bacterias matadas (como en la figura 1A), esto puede reflejar la concentración más baja de bacterias vivas usadas en este experimento. Niveles más altos de B. pertussis viable se emplearon en otros experimentos pero dieron lugar a muerte celular de las poblaciones de macrófagos usadas in vitro. En experimentos separados, sobrenadantes de macrófagos alveolares, peritoneales, J774, y esplénicos retirados 24 y 48 horas después de la infección con B. pertussis también, se descubrió que contenían IL-12 detectada mediante inmno-ensayo (datos no mostrados). Además, los macrófagos peritoneales recuperados de ratones 24 horas después de la inyección peritoneal con B. pertussis viva secretaron niveles significativos de IL-12 (569 pg por ml de sobrenadante de cultivo en un experimento) sin más estimulación in vitro.

Ejemplo 3

IL-12 estimula proliferación de células inmunes en respuesta a antígenos de B. pertussis

Ensayamos la habilidad de IL-12 de modular respuestas inmunes a antígenos de B. pertussis in vivo mediante inmunización de ratones con FHA y PTd en presencia o ausencia de alumbre. Las células de bazo de los ratones inmunizados o los de control se ensayaron para proliferación in vitro frente a B. pertussis (106/ml) matada por calor, PT (1,0 \mug/ml) desactivada por calor, FHA (1,0 \mug/ml) y pertactina (1,0 \mug/ml) como se describió previamente (K.H.G. Mills, et al., 1993, Infect. Immuno 61: 399-410).

TABLA 2

Inmunización	Estimulación In vitro	Proliferación	IFN-\gamma (ng/ml)	IL-5 (pg/ml)
		CPM	SI
FHA + PTd	Medio	118 \pm40		-	-
	FHA	129 \pm53	1.1\pm0.4	1.8 \pm0.5	-
	iPT	98 \pm34	0.8 \pm0.4	2.2 \pm0.8	-
FHA + PTd+ IL-12	Medium	1,347 \pm191		-	-
	FHA	8,412 \pm1491	6.2* \pm0.9	12.3** \pm1.0	-
	iPT	8,985 \pm3793	6.7* \pm1.6	11.0** \pm0.9	-
FHA + PTd+ alumbre	Medium	2,380 \pm168		-	-
	FHA	13,264 \pm3.010	5.6 \pm2.8	5.7 \pm0.6	410 \pm70
	iPT	6,389 \pm2,123	2.7+0.8	12.1 \pm1.3	430 + 60
FHA + PTd+ alumbre + IL-12	Medium	1,546 \pm823		-	-
	FHA	17,953\pm4,436	11.6 \pm3.4	7.4 \pm3.0	140* \pm30
	iPT	7,706 \pm4.128	5.0 \pm3.0	16.3 \pm2.0	110*\pm20

La tabla 2 muestra que la co-inyección con IL-12 aumenta respuestas inmunes celulares a antígenos de B. pertussis. Dos semanas después de la inmunización con FHA y PTd en solución, las respuestas de proliferación in vitro de células de bazo contra antígenos específicos eran similares a aquellas observadas contra el medio solo (tabla 2). En contraste, la inmunización con FHA y PTd en presencia de IL-12 dio lugar a respuestas de proliferación aumentadas a FHA, iPT (tabla 2) y mató bacterias completas (datos no mostrados). La adición de IL-12 a los antígenos adsorbidos en alumbre también aumentaron las respuestas de proliferación específicas de B. pertussis, aunque no alcanzó un nivel de significancia estadística (tabla 2).

La co-inyección de antígenos solubles e IL-12 aumentó el nivel de IFN-\gamma secretado in vitro por células de bazo estimuladas por antígeno; IL-5, una citoquina tipo Th2, no se detectó a partir de células de bazo de estos animales (tabla 2). En contraste, las células de bazo de ratones inmunizados con FHA y PTd en presencia de alumbre secretaron altos niveles de IL-5 y niveles moderados de IFN-\gamma, confirmando el efecto conocido de alumbre para favorecer la inducción de respuestas tipo Th2 en ratones. No obstante, la coinfección de IL-12 con FHA y PTd adsorbido en alumbre dio lugar a una reducción en la producción de IL-5, pero no a un incremento significativo en el nivel de IFN-\gamma secretado, al comparar con células de bazo de animales que hubieran recibido antígenos formulados con alumbre en ausencia de IL-12 tabla 2)

Ejemplo 4

IL-12 estimula producción de IFN-\gamma por células inmunes de ratones inmunizados con antígenos de Bordetella

La adición de IL-12 in vitro aumenta la producción de IFN-\gamma por células de bazo provenientes de ratones preparados para una respuesta Th2, como se muestra en la figura 2. Los ratones se inmunizaron con FHA y PTd en alumbre y las células de bazo se estimularon in vitro con FHA, PT no activado (iPT; 1,0 \mug/ml) o el medio solo en presencia de 0,02 y 2,0 ng/ml de IL-12 de murina recombinante. Los niveles de IFN-\gamma e IL-5 se ensayaron en sobrenadantes de células de bazo después de 72 horas. Los resultados se expresan como el promedio (\pmSE) de la concentración de citoquina para células estimuladas de bazo, provenientes de cuatro ratones por grupo, ensayado por triplicado.

La inmunización de ratones con FHA y PTd adsorbido en alumbre generó una potente respuesta Th2; células de bazo ex vivo produjeron altos niveles de IL-5 y bajos niveles de IFN-\gamma siguiendo una estimulación de antígeno in vitro (figura 2). Sin embargo, la adición de 0,2 o 2,0 ng por ml de IL-12 recombinante de murina a las células de bazo durante la estimulación de antígeno en cultivo dio lugar a concentraciones significativamente incrementadas de IFN-\gamma y a niveles marginalmente reducidos de IL-5 (figura 2), demostrando que IL-2 puede modular el patrón de secreción de citoquina in vitro por parte de células T preparadas in vivo.

Ejemplo 5

Efecto adyuvante de IL-2 sobre la inmunización con una vacuna acelular de Pertussis

Puesto que habíamos demostrado previamente que una vacuna de célula entera altamente protectora induce una respuesta de Th1, decidimos comparar las respuestas inmunes y la protección inducida con una vacuna de célula entera con una vacuna acelular administrada en presencia o ausencia de IL-2. En estos estudios del efecto adyuvante de IL-12 sobre inmunización con una vacuna acelular de Bordetella pertussis, grupos de 20 ratones recibieron dos inmunizaciones intraperitoneales (i.p.) cuatro semanas en partes con 1/5 de dosis humana (0,8 IU) de la vacuna de célula entera (88/522), o con una vacuna acelular que comprende 5 \gammag de cada uno de los siguientes: FHA, pertactina y PTd con o sin IL-2 (0,5 \mug/ratón) recombinante de murina. Los ratones de control recibieron medio de PBS solamente. Dos semanas después de la segunda inmunización, los ratones fueron, o bien sacrificados para evaluar respuestas inmunes o desafiados con B. pertussis. Infección con aerosol. La infección respiratoria de ratones fue iniciada por un reto de aerosol usando el método originalmente descrita por Sato et al. (1980, Infect. Immun. 29: 261-266), con las siguientes modificaciones. La fase I de B. pertussis W28 fue producida en condiciones de agitación a 36°C en un medio líquido Stainer-Scholte. Las bacterias de un cultivo de 48 horas se resuspendieron a una concentración de aproximadamente 2x10^{10} unidades formadoras de colonia (CFU) por ml en salmuera fisiológica que contiene 1% de caseína. El inóculo de desafío se administró como un aerosol por un período de 12 minutos usando un nebulizador dirigido a una cámara de aerosol que contiene grupos de 20-24 ratones. Fueron sacrificados cuatro ratones de cada grupo experimental a las 2 horas y a los 2, 5 y 9 días después del desafío de aerosol para evaluar el número de B. pertussis viable en los pulmones.

Enumeración de bacterias viables en los pulmones. Se retiraron los pulmones de una manera aséptica y se homogenizaron en un 1 ml de salmuera fisiológica estéril con 1% de caseína sobre hielo. 100 µI de homogenizado no diluido o de homogenizado seriamente diluido de pulmones individuales fueron ubicados por triplicado en cada uno de tres platos de agar de Bordet-Gengouy, el número de CFU fue estimado después de 5 días de incubación. Los resultados se reportan como el promedio de B. pertussis viable para pulmones individuales de cuatro ratones. El límite de detección fue de aproximadamente log_{10} 0,5 CFU por pulmón.

Los ratones BALB/c se inmunizaron a 0 y 4 semanas con una vacuna de célula entera (WCV, por sus siglas en inglés "whole cell vaccine"), una vacuna acelular (ACV; 5 µg de cada uno de PTd soluble, FHA y pertactina) con o sin 0,5 \mug de IL-12 o sólo PBS (control). Los ratones fueron desafiados por inoculación con aerosol con B. pertussis dos semanas después de la segunda inmunización. Se siguió el curso de la infección respiratoria llevando a cabo conteos viables a intervalos después de cada desafío. Los resultados son conteos promedios de CFU (\pmSE) llevados a cabo en pulmones individuales por triplicado para cuatro ratones por grupo en cada punto del tiempo.

IL-12 como un adyuvante aumenta la eficacia protectora de una vacuna de pertussis acelular, como se muestra en la figura 3. Los niveles de bacteria en los ratones de control eran aún altos nueve días después del desafío (figura 3). El curso de tiempo de la infección respiratoria en ratones inmunizados con la vacuna de células enteras fue muy corto con un despeje completo para el día 5. El despeje de bacterias en ratones inmunizados con la vacuna acelular fue más lento; el despeje completo no ocurrió hasta el día 9 post-desafío. Sin embargo, la adición de IL-12 a la formulación de vacuna acelular aumentó significativamente su eficacia protectora. El despeje bacterial fue completo para el día 5 y la carga bacterial en el día 2 fue más baja que la observada en ratones inmunizados con la vacuna de célula entera (figura 3).

Para confirmar nuestras sugerencias anteriores sobre el rol protector de células Th1 y para establecer que la eficacia protectora superior observada con la vacuna acelular inyectada con IL-12 fue debido a inmunidad aumentada mediada por células, también ensayamos la respuesta inmune de los ratones inmunizados en el día del desafío. IL-12 cambia la respuesta inmune de células de bazo estimuladas con una vacuna acelular de pertussis de una respuesta de Th2 a una respuesta de Th1/Th0, como se muestra en la figura 4. los ratones se inmunizaron como se describe arriba para la figura 3 con una vacuna de célula entera (WCV), una vacuna acelular (ACV; 5 µg de cada soluble PTd, FHA, pertactina) con o sin 0.5 µg de IL-12, o PBS solo (Control). La secreción de IL-2, IFN-\gamma e IL-5 fue ensayada seguido de la estimulación de células de bazo provenientes de ratones inmunizados con iPT (0.2 - 1.0 \mug/ml), FHA (0.2 - 5.0 \mug/ml), y pertactina (0.2 - 5.0 \mug/ml). Los resultados se expresan como la concentración de citoquina promedio (\pm SE) a la concentración óptima de antígeno para células de bazo de cuatro ratones por grupo ensayados en triplicado.

Las respuestas de proliferación se detectaron frente a FHA de B. pertussis enteramente matada, PT inactivada y pertactina en células de bazo de ratones inmunizados con la vacuna acelular, pero estas fueron significativamente aumentadas en presencia de IL-12 y se acercaron a los niveles observados con la vacuna de célula entera (referencia 20 y datos no mostrados). Un examen de los perfiles de citoquina producida por células de bazo estimuladas con antígeno específico in vitro reveló que las células de bazo derivadas de ratones inmunizados con la vacuna de célula entera secretaron IL-2 e IFN-\gamma pero IL-5 no detectable (figura 4). En contraste, las células de bazo de ratones que recibieron la vacuna acelular en ausencia de IL-12 secretaron niveles bajos de IL-2 e IFN-\gamma y bajos niveles pero detectables de IL-5. Sin embargo, las células de bazo de ratones inmunizados con la vacuna acelular en presencia de IL-12 secretaron niveles significativos de IL-2 e IFN-\gamma. De manera interesante, IL-12 parecieron tener efectos diferenciales cobre las células T de diferente especificidad anfígena, potenciando producción de IL-2 por parte de células T específicas para producción de FHA, pertactina e IFN-\gamma por parte de células T específicas de PT. En general, la respuesta inmune inducida con la vacuna acelular que incorpora IL-12 como un adyuvante se describe de la mejor manera como un perfil Th1/Th2 o Th0.

Estos nuevos hallazgos significativos son que los macrófagos de tejido, que incluyen aquellos recuperados del pulmón, el bazo, o la cavidad peritoneal de ratones nativos, producen IL-12 seguido de la exposición a B. pertussis viva o matada y que la adición de IL-12 como un adyuvante a la vacuna acelular de pertussis aumenta su eficacia protectora promoviendo la producción de citoquina de células T tipo 1. Hemos demostrado que la inmunización de ratones con una vacuna acelular de pertussis que comprende PTd, FHA y pertactina adsorbida en alumbre, generó una respuesta de Th2 en ratones y se asoció con despeje bacterial retardado que sigue al desafío respiratorio.

Claims (12)

1. Una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina 12.

2. La composición de la reivindicación 1 en la cual el antígeno se selecciona del grupo que consiste en lipopolisacárido, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa y pertactina.

3. La composición de la reivindicación 2 en la cual el antígeno se adsorbe a alumbre.

4. Una composición que comprende una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 y por lo menos un polinucleótido codante de antígeno, capaz de expresión in vivo para producir por lo menos un antígeno Bordetella pertussis.

5. Una composición que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis y un polinucleótido codante de interleuquina-12, capaz de expresión in vivo para producir una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en la prevención, tratamiento o mejoramiento de infección por Bordetella pertussis en un huésped, obteniendo una respuesta inmune contra Bordetella pertussis o estimulando el despeje de Bordetella pertussis en un huésped.

7. Una composición de vacuna que comprende una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. Un método para preparar una composición de vacuna que comprende combinar una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 con una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis.

9. El método de la reivindicación 8 en el cual el antígeno se selecciona del grupo que consiste de lipopolisacárido, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa y pertactina.

10. El método de la reivindicación 9 en el cual el antígeno se adsorbe a alumbre.

11. Un método para preparar una composición de vacuna que comprende combinar una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12 con una composición de vacuna que comprende por lo menos un polinucleótido codante de antígeno, capaz de expresión in vivo para producir por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis.

12. Un método para preparar una composición de vacuna que comprende combinar una composición de vacuna que comprende por lo menos un antígeno de Bordetella pertussis con un polinucleótido codante de interleuquina-12, capaz de expresión in vivo para producir una cantidad efectiva adyuvante de interleuquina-12.