JP2002505302A

JP2002505302A - Ｉｌ−１２の鼻腔内イノキュレーションによる免疫の増強

Info

Publication number: JP2002505302A
Application number: JP2000534236A
Authority: JP
Inventors: メッツガー，デニス，ダブリュ．; アルラナンダム，ベルナルド，ピー．
Original assignee: ザメディカルカレッジオブオハイオ
Priority date: 1998-03-05
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2002-02-19
Also published as: EP1058557A1; CA2322337A1; CN1298307A; NZ506650A; WO1999044635A1; AU747917B2; AU2980899A

Abstract

(57)【要約】本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の鼻腔内投与を用いる、宿主における病原体への免疫応答を増強する方法に関する。１つの態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体への免疫応答を誘導する方法に関する。他の態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体への免疫応答を増強する方法に関する。特定の態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における粘膜病原体への免疫応答を誘導する方法に関する。また、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体へのＴｈ１様免疫応答を誘導する方法を包含する。本発明はまた、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体への粘膜免疫応答を増強する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本願は、１９９８年３月５日に出願された米国出願第０９／０３５，１８８号
の一部継続出願であり、その全教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【０００２】発明の背景粘膜表面は細菌およびウイルスの侵入の主な入口であり、それゆえ、宿主の防
御の第一線をなす。そういうものとして、粘膜免疫を増強する免疫化戦略は感染
症を防ぐための実際的な重要性を有する。しかしながら、ほとんどの非経口的に
投与されるワクチンは、最適な粘膜免疫の誘導において部分的に有効であるのみ
である。従って、粘膜免疫を増強し、安全で非侵襲的な様式で送達され得るアジ
ュバントが必要とされる。

【０００３】発明の概要本明細書に記載のように、鼻腔内インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）処理
は抗原特異的免疫応答を効果的に増強し得、粘膜ワクチンについての免疫化戦略
を増強し得る。従って、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原（例
えば、タンパク質、炭水化物、脂質、組換えＤＮＡ、生物体そのもの、毒素、有
機分子）を宿主に鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与する工程を含む、宿主（例えば、ヒト
を含む哺乳動物）における病原体に対する免疫応答（例えば、全身性、粘膜）を
増強および／または誘導する方法に関する。本明細書に記載のように、免疫応答
は抗原特異的であり得る。さらに、免疫応答はＴｈ１型サイトカイン応答（例え
ば、インターフェロン−γの発現）および／または体液性応答（例えば、ＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）の発現の増強をもたらし得る。

【０００４】１つの態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主における病原体に対する免疫応答を増強
する方法に関する。別の態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病
原体の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主における病原体に対する
免疫応答を誘導する方法に関する。

【０００５】特定の態様において、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主における粘膜病原体に対する免疫応答を
誘導する方法に関する。

【０００６】本発明はまた、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与
する工程を含む、宿主における病原体に対するＴｈ１様免疫応答を誘導する方法
を包含する。

【０００７】本発明はまた、ＩＬ−１２の有効量および病原体の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与
する工程を含む、宿主における病原体に対する粘膜免疫応答を増強する方法に関
する。

【０００８】本明細書に記載の、ｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２が粘膜区画および全身性区
画の両方における抗原特異的応答の増大に有効であるとの知見は、ＩＬ−１２の
ｉ．ｎ．投与を用いて、粘膜病原体等の病原体に対する免疫化戦略に有効な強力
なワクチンアジュバントを得ることができることを示す。

【０００９】発明の詳細な説明本明細書に記載のように、ハプテン−キャリヤー抗原で免疫化したマウスにお
ける全身性および粘膜サイトカインならびに抗体産生が調べられている。結果は
、ｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２は、処理マウスの脾臓および肺の両方において
Ｔｈ１様サイトカインおよび抗体のパターンを誘導することを示す。該知見は、
ＩＬ−１２のｉ．ｎ．イノキュレーションは粘膜免疫および全身性免疫の両方に
影響を与える強力な手段であることを示す。

【００１０】従って、本発明は、ＩＬ−１２の有効量および病原体（例えば、粘膜病原体）
の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主における病原体（１種または
それ以上）に対する免疫を増強および／または誘導する方法に関する。本発明の
方法を用いて、霊長類（例えば、ヒト）、ネズミ、ネコ、イヌ、ウシまたはブタ
宿主等の哺乳類動物宿主における抗原に対する免疫応答を増強することができる
。

【００１１】本明細書で使用されている、「増強する（enhance）」及び／又は「増強すること（enhancing）」という用語は、病原体に対する既存の免疫応答を強化すること（増加すること）をいう。また、該用語は、病原体に対する免疫応答（の始
動、誘導）の始動（initiation）をいう。

【００１２】本発明の方法における使用のための抗原（１種以上）には、限定されないが、
タンパク質若しくはその断片（例えば、タンパク質の分解断片）、ペプチド（例
えば、合成ペプチド、ポリペプチド）、糖タンパク質、炭水化物（例えば、多糖
類）、脂質、糖脂質、ハプテンコンジュゲート、組換えＤＮＡ、微生物そのもの
（死滅化（ｋｉｌｌｅｄ）又は弱毒化）若しくはその一部、毒素及び変性毒素（
例えば、破傷風菌、ジフテリア、コレラ）、及び／又は有機分子が含まれる。本
発明における使用のための抗原の特定の例には、インフルエンザウィルスから得
られるか、又は由来するヘマグルチニン（赤血球凝集素）及びノイラミニダーゼ
が含まれる。

【００１３】抗原は、細菌（例えば、バチルス（bacillus）、グループＢストレプトコッカ
ス（streptococcus）、ボルデテラ（Bordetella）、リステリア（Listeria）、バチルス・アンスラシス（anthracis）、Ｓ．ニゥモニエ（pneumoniae）、Ｎ．メニンジティディス、Ｈ．インフルエンザ（influenza）、ウィルス（例えば、肝炎、麻疹、ポリオウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス
、パラインフルエンザウィルス、呼吸器多核体ウィルス、マイコバクテリア（Ｍ
．ツベルクローシス（tuberculosis））、寄生体（リーシュマニア（Leishmania
）、住血吸虫、トランパノソーム（Tranpanosomes）、トキソプラズマ（toxopla
sma）、ニューモシスチス（pneumocystis））、及び真菌（例えば、カンジダ（C
andida）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、コクシジオド（Coccidiodes）、アスペルギルス（Aspergillus））等の、宿主において免疫応答が所望される種々の病原体又は生物から得ることができ、又は由来しうる。病原体の抗原は、
当該分野において知られた技術を用いて得ることができる。例えば、抗原は、病
原体から直接単離（精製、本質的に純粋）すること、化学合成を用いて誘導する
こと、又は組換え手法を用いて得ることができる。また、抗原は市販の供給源か
ら得ることができる。本発明における使用のための好適な抗原は、少なくとも１
種のＢ及び／又はＴ細胞エピトープ（例えば、ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ
細胞エピトープ）を含むものである。本発明の組成物において有用な他の好適な
抗原は、当業者により決定されうる。

【００１４】ＩＬ−１２は、最近、７５ｋＤａの分子量を有し、かつジスルフィド結合した
４０ｋＤａのサブユニットと３５ｋＤａのサブユニットとからなるヘテロ二量体
のサイトカインであると特徴付けられている。それは、マクロファージや樹状細
胞等の抗原提示細胞から産生され、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞上
のレセプターに結合する（デサイ（Ｄｅｓａｉ），Ｂ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．、１４８：３１２５−３１３２（１９９２）；ボゲル（Ｖｏｇｅｌ），Ｌ
．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：１９５５−１９６２（１９９６））
。それは、１）Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖の増強、２）Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマ
クロファージの細胞傷害活性の増加、３）ＩＦＮ−γ産生、及びより少ない程度
でＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦの誘導、並びに４）ＴＨ１細胞の活性化を含む、
いくつかの効果を有する（トリンチエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ），Ｇ．，ら、
Ｂｌｏｏｄ，８４：４００８−４０２７（１９９４））。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１
クローンにおける増殖の重要な副刺激物質（costimulator）であることが示され
ており（ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４
：２２７１−２２７８，１９９４）、ｉ．ｐ．投与されると血清中のＩｇＧ２ａ
抗体の産生の増加を導く（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ），Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５２：１０４７−１０５６（１９９４）；ジャーマン（Ｇｅｒｍａｎ
ｎ），Ｔ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：８２３−８２９（１
９９５）；シェア（Ｓｈｅｒ），Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，７９５：２０２−２０７（１９９６）；ブチャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ），Ｊ
．Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍ．，７：１５１９−１５２８（１９９５）；メツガー
（Ｍｅｔｚｇｅｒ），Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：１９
５８−１９６５（１９９７））。ＩＬ−１２のｉ．ｐ．投与により、また、Ｉｇ
Ｇ１抗体の産生を一時的に減少させることができ（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ），Ｓ
．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０４７−１０５６（１９９４）；マ
ックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ），Ａ．Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２
１７２−２１７９（１９９４）；ブチャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ），Ｊ．Ｍ．ら
、Ｉｎｔ．Ｉｍｍ．，７：１５１９−１５２８（１９９５））、これはＴｈ２応
答の抑制を示す。ＩＬ−１２の精製及びクローニングは、ＰＣＴ公開番号国際
公開第９２／０５２５６号パンフレット及び第９０／０５１４７号パンフレット
、欧州特許公開番号第３２２，８２７号明細書（「ＣＬＭＦ」と同一）に開示さ
れている。

【００１５】本明細書で使用されているように、「インターロイキン−１２」及び「ＩＬ−
１２」は、インターロイキン１２タンパク質、その個々のサブユニット、その個
々のサブユニットの多量体、ＩＬ−１２の機能的断片、並びに「インターロイキ
ン−１２」及び「ＩＬ−１２」の機能的同等物及び／又はアナログをいう。本明
細書で定義されているように、ＩＬ−１２の機能的断片とは、ｉ．ｎ．投与され
る場合に、宿主における抗原に対する免疫応答を調節する断片である。また、本
明細書で定義されているように、「インターロイキン−１２」及び「ＩＬ−１２
」の機能的断片又は同等物は、得られるＩＬ−１２産物が本明細書に記載された
ＩＬ−１２と類似の活性（例えば、ｉ．ｎ．投与される場合に、免疫応答を増強
する能力）を有するように修飾されたＩＬ−１２タンパク質を含む。「インター
ロイキン−１２」の機能的同等物又は断片はまた、本明細書に記載されたＩＬ−
１２機能又は活性（例えば、ｉ．ｎ．投与される場合に、免疫応答を増強する能
力）を有するタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ、
ＲＮＡ）及びその一部を含む。また、該用語は、遺伝コードの縮重を介してＩＬ
−１２と類似のペプチド遺伝子産物をコードし、かつ本明細書に記載されたＩＬ
−１２活性を有するヌクレオチド配列を含む。例えば、「インターロイキン−１
２」及び「ＩＬ−１２」の機能的同等物には、「サイレント」コドン置換（例え
ば、あるアミノ酸をコードする一つのコドンの、同じアミノ酸をコードする別の
コドンでの置換）を含むヌクレオチド配列、又は「サイレント」アミノ酸置換（
例えば、一つの酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸での置換）を含むアミノ酸配列
が挙げられる。

【００１６】本発明の方法における使用に適するＩＬ−１２は、種々の供給源から得ること
ができ、又は公知の技術を用いて合成することができる。例えば、ＩＬ−１２は
、天然源（例えば、ヒト等の哺乳類供給源）から精製（単離、本質的に純粋）さ
れ得、化学合成により製造され得、又は組換えＤＮＡ技術により製造することが
できる。また、本発明での使用のためのＩＬ−１２は、市販の供給源から得るこ
とができる。

【００１７】宿主における抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強する量である、
ＩＬ−１２の有効量が、本発明の方法においてｉ．ｎ．投与される。特に、「Ｉ
Ｌ−１２の有効量」とは、宿主にＩＬ−１２の有効量をｉ．ｎ．投与しない場合
の宿主における抗原に対する免疫応答に比べ、宿主に抗原をｉ．ｎ．投与した場
合に、本明細書に記載のように、宿主における抗原に対する免疫応答を増強する
ような量である。すなわち、ＩＬ−１２の「有効量」とは、ＩＬ−１２を宿主に
ｉ．ｎ．投与しない場合の抗原に対する免疫応答と比べ、抗原をｉ．ｎ．投与し
た場合に、本明細書に記載のように、宿主における抗原に対する免疫応答を増強
する量である。

【００１８】ＩＬ−１２および／または抗原は、予防ワクチンまたは治療ワクチンとしてｉ
．ｎ．投与され得る。すなわち、宿主において出現している、および／または顕
在化している病原体の影響の前（予防するため）またはかかる影響の後（治療す
るため）に、ＩＬ−１２は投与され得る。従って、ＩＬ−１２および／または抗
原は、抗原が得られるまたは由来する病原体により引き起こされる疾患状態を示
す宿主に対し、または抗原が得られるまたは由来する病原体により引き起こされ
る疾患状態をまだ示さない宿主に対し投与され得る。従って、ＩＬ−１２および
／または抗原は、疾患状態が宿主において顕在化する前または後に宿主に投与さ
れ得、抗原が得られるまたは由来する病原体により引き起こされる疾患状態の発
症において予防、改善、排除又は遅延をもたらし得る。

【００１９】本明細書に記載のように、ＩＬ−１２および抗原を宿主にｉ．ｎ．投与する。
ｉ．ｎ．投与のいずれの簡便なルートも使用することができる。例えば、上皮内
層（linings）または皮膚粘膜内層を介する吸収（例えば、鼻ミスト（nasal mis
t）を用いるＩＬ−１２および／または抗原の投与；点眼剤を用いる目へのＩＬ −１２および／または抗原の投与、かかる場合、ＩＬ−１２および／または抗原
は鼻腔に排出される）を使用し得る。さらに、ＩＬ−１２および抗原を、他の成
分またはアジュバント（例えば、ミョウバン）等の生物学的に活性な薬剤、製薬
学的に許容され得る界面活性剤（例えば、グリセリド）、リポソーム、賦形剤（
例えば、ラクトース）、担体、希釈剤およびビヒクル（vehicle）と共に投与し得る。所望の場合、特定の甘味剤、着香剤および／または着色剤も添加し得る。

【００２０】さらに、抗原がタンパク質（ペプチド）である態様においては、ＩＬ−１２お
よび／または抗原を、かかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのインビ
ボ発現により、宿主にｉ．ｎ．投与し得る。例えば、ＩＬ−１２または抗原を、
肝臓ベクターを用いて宿主に投与し得る。その際、ＩＬ−１２および／または抗
原核酸配列を含む肝臓ベクターは、ＩＬ−１２および／または抗原がインビボで
発現される条件下にｉ．ｎ．投与される。また、ＩＬ−１２タンパク質またはペ
プチドと組み合わせて、または、ＩＬ−１２タンパク質をコードし、インビボで
該ＩＬ−１２タンパク質を発現するベクターと組み合わせて、抗原をコードし、
インビボで該抗原を発現するベクターを宿主にｉ．ｎ．注射することができる。
他方、ペプチドまたはタンパク質の形態の抗原と組み合わせて、または、抗原を
コードし、インビボで該抗原を発現するベクターと組み合わせて、ＩＬ−１２を
コードし、インビボで該ＩＬ−１２を発現するベクターを宿主にｉ．ｎ．注射す
ることができる。抗原およびＩＬ−１２タンパク質をコードする配列を含む単一
のベクターも本発明の方法に有用である。

【００２１】数種の発現ベクター系が市販され入手可能であり、または組換えＤＮＡ技術お
よび細胞培養技術に従い再現することができる。例えば、酵母もしくはワクシニ
アウイルス発現系等のベクター系、またはウイルスベクターを本発明の方法およ
び成分に用いることができる（Kaufman,R.J.,A J.of Meth.in Cell and Molec.B
iol.,2:221-236(1990)）。ネイクド（naked）プラスミドまたはＤＮＡ、および標的化リポソーム中にまたは赤血球ゴースト（ghosts）中に包まれたクローン化
遺伝子を用いる他の技術を用いて、ＩＬ−１２ポリヌクレオチドを宿主に導入す
ることができる（Freidman,T.,Science,244:1275-1281(1991);Rabinovich,N.R.,
et al.,Science,265:1401-1404(1994) ）。発現ベクターの構築およびベクターおよび核酸の種々の宿主細胞への導入は、本明細書に参照により組み込まれるも
のである、モレキュラークローニングアンドカレントプロトコルズイン
モレキュラーバイオロジーのようなマニュアルに記載の遺伝子工学技術を用いて
、または市販され入手可能なキットを用いることにより行うことができる（Samb
rook,J.,et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Press,1989;Ausubel,F
.M.,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience,1989）。

【００２２】本明細書に記載のように、ＩＬ−１２および抗原の宿主へのｉ．ｎ．投与は、
受容宿主における免疫応答を増強する。例えば、本発明は、ＩＬ−１２の有効量
および病原体の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主における病原体
に対するＴｈ１様免疫応答を誘導する方法に関する。本発明はまた、ＩＬ−１２
の有効量および病原体の抗原を宿主にｉ．ｎ．投与する工程を含む、宿主におけ
る病原体に対する粘膜免疫応答を増強する方法に関する。本明細書に記載の方法
はＩＦＮ−γの発現の増強をもたらし得る。さらに、体液性免疫を宿主において
誘導および／または増強することができ、それは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよ
び／またはＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらし得る。免疫応答は抗原特異的で
あり得る。

【００２３】宿主において抗原に対する免疫応答を増強する方法においては、ＩＬ−１２の
有効量を宿主にｉ．ｎ．投与する。かかる有効量とは、宿主における抗原に対す
る免疫応答を増強および／または誘導し、宿主の状態の改善（すなわち、抗原が
得られ、または誘導される病原体の存在により引き起こされる疾患または傷害を
防ぎ、排除し、または減少する）をもたらす量である。宿主において抗原に対す
る免疫応答を増強するために用いられるＩＬ−１２の量は、宿主の大きさ、年齢
、体重、一般の健康状態、性別および食事、ならびに投与の時期、疾患の状態の
継続期間または特定の症状等の種々のファクターにより変わるであろう。ＩＬ−
１２の適切な投与量範囲は、一般に、体重１ｋｇ当たり約０．５μｇ〜約１５０
μｇである。１つの態様において、投与量範囲は体重１ｋｇ当たり約２．７５μ
ｇ〜約１００μｇである。他の態様において、投与量範囲は体重１ｋｇ当たり約
５μｇ〜約５０μｇである。有効投与量は、インビトロでまたは動物モデル試験
系において得られるドーズレスポンスカーブから外挿してもよい。

【００２４】本発明の方法においては、ＩＬ−１２の有効量は抗原と組み合わせてｉ．ｎ．
投与される。すなわち、ＩＬ−１２は抗原による宿主の免疫化に密に関連する時
点で投与され、その結果、ＩＬ−１２を投与していない宿主の免疫化に比べ、抗
原に対する免疫応答が宿主において誘導または増強される。従って、ＩＬ−１２
は、免疫化の前、好ましくは免疫化の直前に；免疫化の時点で（すなわち、同時
に）；または免疫化後（続いて）にｉ．ｎ．投与され得る。さらに、ＩＬ−１２
を、抗原で免疫化する前にｉ．ｎ．投与し、その後、抗原で免疫化後、ＩＬ−１
２の続く投与を行うことができる。

【００２５】本明細書に記載のように、ｉ．ｎ．および非侵襲的な様式で与えられたＩＬ−
１２は、粘膜区画の免疫系をＴｈ１型サイトカインおよび抗体のプロファイルに
再び仕向ける。また本明細書に記載のように、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．送達は、遠
隔の全身性区画の免疫系におけるサイトカインおよび抗体発現のパターンを調節
する。

【００２６】ＤＮＰ−ＯＶＡおよびＩＬ−１２でｉ．ｎ．免疫化されたマウスは、６時間後
に肺におけるＩＦＮ−γｍＲＮＡのレベルの増強を示し、２４時間で最高の発現
が認められた。ＩＬ−１２のｉ．ｎ．投与後、脾臓においてＩＦＮ−γｍＲＮＡ
が同様に増強された。ＩＦＮ−γはＴｈ細胞サブセットおよびそれらのエフェク
ター機能の強力な免疫調節因子である（Trinchieri,G.,et al.,Res.Immunol.,14
6:423-431(1995);Trinchieri,G.,Immunol.Today,14:335-338(1993)）。特に、Ｉ
ＦＮ−γは、マクロファージを活性化し、Ｔｈ１型免疫応答に特徴的であるＩｇ
Ｇ２ａ抗体産生およびＩｇＧ３抗体産生へのアイソタイプスイッチ（isotype sw
itching）を媒介することが示されている（Snapper,C.M.,et al.,Science,236:9
44-947(1987);Snapper,C.M.,et al.,J.Immunol.,140:2121-2127(1988);Finkelma
n,F.D.,et al.,J.immunol.,140:1022-1027(1988)）。同様に、Ｔ細胞応答の重要
なネガティブ調節因子はインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である（Meyaar
d,L.,et al.,J.Immunol.,156:2776-2782(1996)）。ＩＬ−１０は主にＴ細胞およ
び単球により産生され、抗原提示細胞に対する作用を介してその調節効果を発揮
する（Fiorentino,D.F.,et al.,J.Immunol.,146:3444-3451(1991);Ding,L.,et a
l.,J.Immunol.,148:3133-3139(1992)）。最近、数人の研究者らが、ＩＬ−１２はヒトＴ細胞にＩＬ−１０を分泌させ得るということを見出している（Meyaard,
L.,et al.,J.Immunol.,156:2776-2782(1996);Daftarian,P.M.,et al.,J.Immunol
.,157:12-20(1996);Gerosa,F.,et al.,J.Exp.Med.,183:2559-2569(1996)）。これらの研究に照らし、肺および脾臓の両方においてＩＬ−１０ｍＲＮＡを誘導す
る、ｉ．ｎ．で与えられたＩＬ−１２の能力を評価した。結果は、ＩＬ−１０ｍ
ＲＮＡを誘導する、ＩＬ−１２の能力を明確に示す。しかしながら、最高発現は
、イノキュレーション後、２４時間に認められただけであった。ＩＬ−１２処理
後のＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現の誘導の遅延は、このサイトカインが、ＩＬ−１２
／ＩＦＮ−γの影響を調節するようにデザインされたフィードバック機構に関与
することを示唆する。Ｔｈ２分化の特異的マーカーとしてのＩＬ−５ｍＲＮＡも
解析し、ＩＬ−１２で処理されたマウスの肺においてＩＬ−５ｍＲＮＡの明確な
減少を見出した。かかる知見は、全身性免疫に対するｉ．ｐ．で与えられたＩＬ
−１２の影響を調べた他者（Trinchieri,G.,et al.,Res.Immunol.,146:423-431(
1995);Trinchieri,G.,Immunol.Today,14:335-338(1993);Manetti,R.,et al.,J.E
xp.Med.,177:1199-1204(1993);Hsieh,C.S.,et al.,Science,260:547-549(1993) ）と一致し、ＩＬ−１２の免疫調節機能に、さらなる裏付けを加える。結果は、
ｉ．ｎ．ＩＬ−１２投与が全身性区画および粘膜区画の両方においてＴｈ１型サ
イトカイン応答を誘導し得ることを明確に示す。

【００２７】インビボで合成されるサイトカインは免疫応答の際に産生される抗体のプロフ
ァイルを決定し得るので（Finkelman,F.D.,et al.,Ann.Rev.Immunol.,8:303-333
(1990)）、ＢＡＬ、血清および糞（fecal）抽出物における抗原特異的抗体レベルを調べた。抗原およびＩＬ−１２の鼻腔内送達はＢＡＬＩｇＧ２ａ抗体レベ
ルの明確な増強をもたらした。これは、ｉ．ｎ．ＩＬ−１２投与がマウスにおい
て呼吸部（respiratory）抗体応答を調節し得ることの最初の証拠である。Ｙａｎｇら（Yang,Y.,et al.,Nature Med.,1:890-893(1995)）は以前、ＩＬ−１２お
よび組換えアデノウイルスの気管内イノキュレーションが、ＩｇＧレベルを全く
変化させずにＢＡＬにおける抗原特異的ＩｇＡの減少をもたらすことを示した。
しかしながら、この系におけるＩＬ−１２の効果は、ＩｇＧアイソタイプの点で
完全には特徴付けられず、それゆえ、ＩＬ−１２が呼吸部抗体応答において果た
す役割についての情報は少ない。さらに、気管内ルートは侵襲的で、ワクチン接
種プロトコルに関連していなかった。本明細書に記載する知見は、ＩｇＧ抗体と
関連している、ウイルス感染に対する気道下部の防護としての宿主防御の点で重
要である（Palladino,G.,et al.,J.Virol.,69:2075-2081(1995)）。さらに、ネズミ抗体のＩｇＧ２ａアイソタイプは、オプソニン作用および補体結合において
非常に有効であることが知られており、原始的な機構としては、Ｓ．ニゥモニエ
（pneumoniae）およびＮ．メニンジティディス（meningitidis）等の呼吸部病原
体のクリアランスに関与すると考えられている。

【００２８】以前の業績では、ｉ．ｐ．で与えられたＩＬ−１２がニワトリ卵白リゾチーム
（ＨＥＬ）に対するマウスのアイソタイプ拘束抗体応答を変え得ることが示され
た（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995);Metzger,D.W.,et
al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,795:100-115(1996)）。ＩＬ−１２およびＨＥＬの非経口注射はＨＥＬ特異的血清ＩｇＧ２ａを非常に上昇させ、一時的にＩｇＧ１抗体
産生を抑制した。さらに、他者（McKnight,A.J.,et al.,J.Immunol.,152:2172-2
179(1994);Morris,S.C.,et al.,J.Immunol.,152:1047-1056(1994);Germann,T.,e
t al.,Eur.J.Immunol.,25:823-829(1995);Wynn,T.A.,et al.,J.Immunol.,157:40
68-4078(1996);Bliss,J.,et al.,J.Immunol.,156:887-894(1996)）は、ｉ．ｐ．
ＩＬ−１２投与がタンパク質抗原に対する血清ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩ
ｇＧ３抗体応答を増強させることを示している。

【００２９】本明細書において、非侵襲的なルートによりｉ．ｎ．送達されるＩＬ−１２は
類似の様式で血清抗体応答に影響し得るという事実を記載する。抗原およびＩＬ
−１２でｉ．ｎ．免疫化されたマウスは、抗原のみを与えられた動物と比較して
、血清ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のレベルを著しく上昇させた。Ｉ
ｇＧ２ａおよびＩｇＧ３レベルの観察された増加は、ＩｇＧ２ａ抗体およびＩｇ
Ｇ３抗体両方の応答の強いスイッチファクターであるＩＦＮ−γを誘導する、Ｉ
Ｌ−１２の能力と一致する（Metzger,D.W.,et al.,Eur.J.Immunol.,27:1958-196
5(1997);Snapper,C.M.,et al.,Science,236:944-947(1987);Snapper,C.M.,et al
.,J.Exp.Med.,175:1367-1371(1992);Collins,J.T.,et al.,Int.Immunol.,5:885-
891(1993)）。さらに、ＩＬ−１２処理で見られる初期ＩｇＧ１抑制は２８日までに消失した。これは、以前の知見と一致する（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Imm
unol.,7:1519-1528(1995);Metzger,D.W.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,795:100-11
5(1996)）。これらの結果は、ＩＬ−１２を非侵襲的な様式でｉ．ｎ．送達して、非経口投与と類似の様式で体液性応答に影響を与え得ることを示す。従って、
ｉ．ｎ．ＩＬ−１２投与はタンパク質ワクチン送達のための安全で有効なアジュ
バントであろう。

【００３０】また、本明細書に記載のように、ｉ．ｎ．または非経口的に投与されるＩＬ−
１２は糞ＩｇＧ２ａ抗体レベルの増強をもたらすということを見出した。対照的
に、ＩＬ−１２によるｉ．ｎ．処理はＩｇＡ発現の減少をもたらしたが、ＩＬ−
１２の非経口送達はＩｇＡレベルを増強した。これらの結果は、２つの異なるル
ートの投与を介して与えられるＩＬ−１２の重要な特異的効果を示す。最近、本
明細書に記載のデータとは対照的に、Ｏｋａｄａら（Okada,E.,et al.,J.Immuno
l.,159:3638-3647(1997)）は、ＩＬ−１２発現プラスミドにおけるＨＩＶＤＮ
Ａワクチンによるｉ．ｎ．免疫化は糞ＩｇＡ抗体レベルを修飾しないということ
を報告した。さらに、Ｍａｒｉｎａｒｏら（Marinaro,M.,et al.,J.Exp.Med.,18
5:415-427(1997)）は、リポソームに包まれた形でのＩＬ−１２の経口送達はＩｇＡレベルを変えず、それにより、非経口投与が糞ＩｇＡ応答の減少をもたらす
ということを報告した。Ｍａｒｉｎａｒｏらの研究においては、マウスをＩＬ−
１２の両ルートによる送達で抗原により経口的に免疫化しており、それゆえ、抗
原およびＩＬ−１２の異なるルートによる送達を利用した本明細書に記載の知見
と直接比較することは困難であろう。結果は、免疫化のルートによって糞抗体応
答に特異に影響する、ＩＬ−１２の能力を明確に示している。

【００３１】一連の感染症に対する、安全で、より強力かつよりよい標的化ワクチンアジュ
バントの開発にたえまない関心がある（Van Regenmortel,M.,ASM News,63:136-1
39(1997)）。これは、ミョウバン等の、ヒトの使用が承認されている現在のアジ
ュバントは、特定の疾患に対する防護に重要な細胞媒介性免疫を発現する能力を
いくぶん欠いているということによる（Gupta,R.K.,et al.,「ワクチンに対する
免疫応答の調節におけるアジュバントおよび送達系の役割（"The role of adjuv
ants and delivery systems in modulation of immune response to vaccines）
」 In Novel Strategies in Design and Production of Vaccines,Eds.Cohen,S.
and Shafferman,A.,Plenum Press,New York,1996,105-113 頁）。ワクチン開発
の状況において、適切なＴｈ細胞の活性化は、免疫応答の調節に絶対必要である
。例えば、Ｔｈ１型免疫応答は、リーシュマニア（Leishmania）感染（Muller,I
.,et al.,Immunol.Rev.,112:95-113(1989)）およびリステリア（Listeria）感染
（Kratz,S.S.,et al.,J.Immunol.,141:598-606(1988)）に対し防護的であること
が示されている。ＩＬ−１２は、Ｔｈ細胞をＩＦＮ−γ分泌の増強およびＩｇＧ
２ａ抗体レベルの上昇を伴うＴｈ１表現型へ仕向ける能力から、免疫調節におけ
る重要なサイトカインである。それゆえ、本明細書に記載の知見は、アジュバン
トとしてのＩＬ−１２のｉ．ｎ．での使用はワクチン免疫を増強することを示す
。さらに、現時点では臨床的な使用に適切な粘膜アジュバントは存在しない。こ
のルートにより与えられるＩＬ−１２の即時の用途としては、現在の臨床試験に
おける経鼻インフルエンザワクチンと共の使用であろう。インフルエンザに対す
る防護はＩｇＧ抗体により媒介されるので（Palladino,G.,et al.,J.Virol.,69:
2075-2081(1995)）、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．共投与は、インフルエンザに対する粘膜および全身性両方の抗体応答を増加する手段であろう。これに関し、本明細
書に示すように、サブユニットインフルエンザワクチンおよびＩＬ−１２のｉ．
ｎ．投与は全身性および呼吸部ＩｇＧ２ａレベルを著しく増強する。

【００３２】本明細書に記載のように、非侵襲的なｉ．ｎ．送達系を用い、免疫系の粘膜成
分および全身性成分の両方を調節する、ＩＬ−１２の能力を評価した。ＣＴＢお
よびＩＬ−１２と組み合わせたＯＶＡに結合させたＤＮＰ（ＤＮＰ−ＯＶＡ）に
よりｉ．ｎ．免疫化したマウスは、ＩＬ−１２を与えられていないマウスと比較
して、肺および脾臓の両方においてＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０ｍＲＮＡ転写物
のレベルが上昇したことを見出した。さらに、肺ＩＬ−５ｍＲＮＡの発現が阻害
された。ＩＬ−１２処理後のＢＡＬの解析により、ＩｇＧ２ａの有意な増加と、
ＩｇＧ１およびＩｇＡ抗ＯＶＡ抗体レベルを変えないことが明らかとなった。血
清ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３抗ＤＮＰ抗体レベルは、ｉ．ｎ．で与
えられたＩＬ−１２により有意に増加したが、血清ＩｇＧ１抗体レベルは抑制さ
れた。かかる結果は、全身性抗原およびＩＬ−１２投与後にみられるのと類似し
ている。ＩＬ−１２のｉ．ｎ．送達はまた、糞ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ抗体両方
の発現を増加する非経口処理とは対照的に、糞ＩｇＧ２ａレベルを増強し、Ｉｇ
Ａレベルを抑制した。これらの結果は、ｉ．ｎ．ＩＬ−１２処理は抗原特異的免
疫応答を効果的に調節し、粘膜ワクチンについての免疫化戦略を増強し得るとい
うことを示す。

【００３３】概して、結果は、粘膜区画および全身性区画の両方における抗原特異的応答の
増加に対する、ｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２の有効性を明確に示す。かかる知
見は、ＩＬ−１２を粘膜病原体に対する免疫化戦略のための強力なワクチンアジ
ュバントとして使用し得ることを示す。

【００３４】従って、該方法および本明細書に記載のものを使用して、宿主において１以上
の抗原を有する病原体に関連する疾患または症状を治療および／または防ぐこと
ができる。本明細書に記載の方法は、同じ病原体に由来し得る、異なる種の病原
体に由来し得る、または異なる病原体に由来し得る単一の抗原または多様な抗原
と組み合わせて、ＩＬ−１２の有効量を利用し得る。従って、ＩＬ−１２および
１以上の抗原を用いて、１または複数の抗原が由来する、１または複数の病原体
に関連する１以上の疾患または症状を防ぎおよび／または治療することができる
。

【００３５】本発明を以下の実施例により説明するが、それらはいずれにも限定することを
意図するものではない。

【００３６】実施例実施例１：鼻腔内インターロイキン１２送達による粘膜免疫および全身性免疫の調節材料および方法マウス６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを国立癌研究所（the National Cancer
Institute）（Bethesda,MD）から入手した。マウスをオハイオ州立医科大学（th
e Medical College of Ohio）の動物施設に収容し、食事と水を随意に与えた。動物の世話および実験方法は、オハイオ州立医科大学の制度としての動物の世話
および使用に関する委員会〔the Institutional Animal Care and Use Committe
e (IACUC)〕に従った。

【００３７】鼻腔内免疫化プロトコルそれぞれ、マウス１匹当たり８０ｍｇおよび１６ｍｇの濃度での、ケタミン−
ＨＣＬ（ketamine-HCL）（Fort Dodge Laboratories,Fort Dodge,IO）およびキシラジン（Xylazine）（Bayer Corporation,Shawnee Mission,KA）の組み合わせ
による腹膜内（ｉ．ｐ．）麻酔をかけたマウスに鼻腔内処理を行った。０日目に
、マウスをオバルブミンに結合させたジニトロフェニルハプテン（ＤＮＰ−ＯＶ
Ａ；Biosearch Technologies,San Raphael,CA）１００μｇとコレラトキシンＢ −サブユニット（ＣＴＢ；Sigma,St.Louis,MO）１０μｇを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌでｉ．ｎ．免疫化した。この後、０、１、２およ
び３日目に、１％正常ＢＡＬＢ／ｃマウス血清（ＰＢＳ−ＮＭＳ）を含むＰＢＳ
中の組換えネズミＩＬ−１２１μｇの鼻腔内ｉ．ｎ．で行い、または対照マウ
スの場合、ＰＢＳ−ＮＭＳのみで行った。マウスを１４日目および２８日目に同
量のＤＮＰ−ＯＶＡおよびＣＴＢでｉ．ｎ．追加免疫した。２８日目に、さらに
マウスにＰＢＳ−ＮＭＳ中のＩＬ−１２１μｇまたはＰＢＳ−ＮＭＳのみを与
えた。ｉ．ｐ．イノキュレーションのために、マウスを０日目に完全フロイント
アジュバント（ＣＦＡ；Life Technologies,Gaithersburg,MD）中のＤＮＰ−ＯＶＡ１００μｇで免疫化した後、０、１、２および３日目に、ＰＢＳ−ＮＭＳ
中のＩＬ−１２１μｇの注射を行った。対照マウスには抗原およびＰＢＳ−Ｎ
ＭＳのみを与えた。マウスを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；Life Tec
hnologies）中のＤＮＰ−ＯＶＡで１４日目および２８日目に同ルートにより追加免疫した。２８日目に、さらにマウスにＰＢＳ−ＮＭＳ中のＩＬ−１２または
ＰＢＳ−ＮＭＳのみをｉ．ｐ．注射した。マウスの眼窩叢から採血することによ
り血清を調製した。

【００３８】ＲＮＡの単離スナップ（snap）凍結脾臓および肺からの全ＲＮＡの単離は製造業者の指示に
従いトリゾール（Trizol）試薬（Gibco-BRL Gaithersburg,MA）で行った。すなわち、凍結組織を乳鉢と乳棒でホモジナイズし、直ちにトリゾール試薬２．０ｍ
ｌを含むポリスチレン製チューブに移した。ホモジナイズした試料を室温で５分
間インキュベートして核タンパク質複合体を溶解させ、４℃で１０分間１２，０
００ｇにて遠心分離した。上清液をクロロホルム０．４ｍｌと１５秒間混合し、
氷上で１５分間インキュベートし、４℃で１５分間１２，０００ｇにて遠心分離
した。遠心分離後、水相中のＲＮＡをイソプロパノール１．０ｍｌを加えて１時
間、−２０℃にて沈澱させた。試料を１２，０００ｇにて１５分間遠心分離し、
ＲＮＡペレットを７５％エタノール１．０ｍｌで二度洗浄した。ペレットを２〜
５分間、風乾し、ＤＥＰＣ処理水中に溶解させ、−８０℃にて保存した。全ＲＮ
Ａの濃度を一本鎖ＲＮＡについてのＡ２６０値（１Ａ２６０ユニット＝１ｍｌ
当たり一本鎖ＲＮＡ４０μｇ）により計算した。全ＲＮＡの最終調製物は２６０
／２８０比で１．７〜２．０を示した。

【００３９】第１鎖ｃＤＮＡ合成第１鎖ｃＤＮＡ合成を製造業者の指示（Gibco-BRL）に従い行った。すなわち、オリゴ（ｄＴ）１μｇ、全ＲＮＡ３μｇ、および滅菌ＤＥＰＣ処理水を最終容
量１１μｌで滅菌エッペンドルフチューブに添加した。混合物を１０分間７０℃
でインキュベートし、次いで氷上で冷却した。次いで、以下の成分を順に添加し
た：５×第１鎖緩衝液４．０μｌ、０．１ＭＤＤＴ２μｌ、およびｄＮＴＰ混
合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各１０ｍＭ）１μｌ。チュ
ーブの内容物を緩やかに混合し、４２℃で２分間インキュベートした後、スーパ
ースクリプトＩＩ（Superscript II）逆転写酵素（ＲＴ）１μｌ（２００Ｕ）を
添加した。反応混合物を緩やかに混合し、４２℃で１時間インキュベートし、次
いで７０℃で１５分間のインキュベーションにより終結させた。

【００４０】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応混合物５０μｌを以下の成分により滅菌エッペンドルフチューブ中に調製
した：ＤＥＰＣ処理水３１．３０μｌ、５倍トリス−ＨＣＬ緩衝液（最適なマグ
ネシウムおよびｐＨは各プライマーセットについて決定した）１０．０μｌ、第
１鎖合成由来ｃＤＮＡ２μｌ、プライマー（２０μｍストック濃度）２μｌ、ｄ
ＮＴＰミックス（２．５ｍＭｄＡＴＰ、２．５ｍＭｄＣＴＰ、２．５ｍＭ
ｄＧＴＰ、および２．５ｍＭｄＴＴＰ、ｐＨ８．０）（Invitrogen Corporati
on）５．０μｌ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Gibco-BRL）０．５μｌ（２．５Ｕ）。チューブをパーキンエルマーサーマルサイクラー４８０（Perkin
Elmer Cetus,Norwalk,CT）のウェルに置き、９５℃で５分間インキュベートし、次いで以下の増幅プロファイルに供した：９５℃で１分、５６℃で１分および
７２℃で１分の３５サイクルの継続。この後、７２℃で１０分間インキュベーシ
ョンし、４℃での浸漬（soak）サイクルを行った。ＰＣＲ産物を２．５％アガロ
ースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。バンドをＵＶトランス
イルミネーションにより可視化し、写真撮影した。ヒポキサンチンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をハウスキーピング対照として用い、全レー
ンにおけるＲＮＡの等量でのロードを確保した。また、１００ｂｐＤＮＡラダー
（Gibco-BRL）を分子量マーカーとして用いた。

【００４１】プライマー配列ＨＰＲＴ 5'GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT G 3'（配列番号：１） 5'GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C 3'（配列番号：２）ＩＬ−５ 5'GAC AAG CAA TGA GAC GAT GAG 3'（配列番号：３） 5'GTT ATC CTT GGC TAC ATT ACC 3'（配列番号：４）ＩＬ−１０ 5'ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT T 3'（配列番号：５） 5'ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG GTT T 3'（配列番号：６）ＩＦＮ−γ 5'TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG 3'（配列番号：７） 5'CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG 3' （配列番号：８）

【００４２】気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および糞抽出物の採取ＢＡＬの採取のため、マウスを屠殺し、それらの気管を露出させ、０．５８ｍ
ｍＯＤポリエチレンカテーテル（Becton Dickinson,Sparks,MD）を挿管した。
肺を５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで２〜３回洗浄した。マウス１匹当たり約１
．５ｍｌの洗浄液を得て、血液汚染をヘマスチックス（Hemastix）（Bayer Corp
oration,Elkhart,IN）を用いて追跡した。回収されたＢＡＬ液を４℃で５分間、
１２，０００ｇにて遠心分離し、使用するまで−７０℃にて上清を保存した。糞
抽出物をｄｅＶｏｓとＤｉｃｋの方法により調製した（deVos,T.,et al.,J.Immu
nol.Meth.,141:285-288(1991))。すなわち、各マウス由来の糞材料０．１ｇをＰ
ＢＳ１ｍｌと混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、試料を５分
間ボルテックスし、１０分間、１２，０００×ｇにて遠心分離した。次いで、上
清を−７０℃で保存した。

【００４３】ＥＬＩＳＡによる抗体およびアイソタイプレベルの検出抗ＤＮＰ抗体および抗ＯＶＡ抗体のレベルを記載（Buchanan,J.M.,et al.,Int
.Immunol.,7:1519-1528(1995);Metzger,D.W.,Eur.J.Immunol.,27:1958-1965(199
7)）のようにしてＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち、マイクロタイタープレ
ート（Nalge Nunc International,Rochester,NY）を、ＰＢＳ中の、１０μｇ／ｍｌのＤＮＰ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１００μｇ／ｍｌのＯＶＡ
で一夜コートした。プレートを０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチンおよび０．０５％
（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、血清またはＢＡ
Ｌ液の連続希釈物を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレ
ートを再度洗浄し、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ１
、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３（Southern Biotechnology Associate
s,Birmingham,AL）と共に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐ− ニトロフェニルホスファターゼ基質を添加し最適な発色を得た。プレートをＥＬ
ＩＳＡマイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments,Winooski,VT）により４０５ｎｍにて読んだ。ＩｇＡを検出するため、ウェルをビオチンに結合させた
ヤギ抗マウスＩｇＡ（Sigma,St.Louis,MO）と共にインキュベートし、洗浄し、基質の添加前に、ストレプトアビジンに結合させたアルカリホスファターゼ（Bi
orad,Richmond,CA）と共にインキュベートした。プレートを１０μｇ／ｍｌのア
フィニティー精製したヤギ抗マウスＩｇ（Southern Biotechnology Associates ）でコートしたことを除き、全免疫グロブリンを同じ要領で測定した（Buchanan
,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995)）。全ての場合において、二次抗体コンジュゲートの適切な実施希釈およびアイソタイプ特異性を精製ミエロー
マタンパク質の既知のアイソタイプ（Sigma,St.Louis,MO）を用いて決定した。さらに、アッセイの抗原特異性をＢＳＡのみでコートしたプレートを用いて確立
した。統計的有意性を両側スチューデントｔ検定により決定した。データはｐ値
が＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。

【００４４】結果鼻腔内ＩＬ−１２送達は肺および脾臓においてＴｈ１様応答を誘導する抗原およびＩＬ−１２の鼻腔内送達が肺においてサイトカインｍＲＮＡ発現を
調節するか否かを決定するため、マウスをＤＮＰ−ＯＶＡおよびＣＴＢ＋／−Ｉ
Ｌ−１２で免疫化し、個々の動物の肺におけるサイトカインｍＲＮＡのレベルを
６時間および２４時間後にＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＩＬ−１２処理後６時
間にマウスにおいてＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現の顕著な増加が見出され、この発
現はＩＬ−１２に曝されずに免疫化されたマウスと比較して少なくとも２４時間
上昇を維持した。６時間後、ＩＬ−１２処理マウスの肺において見られたＩＬ−
１０ｍＲＮＡ発現に差はなかったが、発現の増加はイノキュレーションの２４時
間後に観察された。ＩＦＮ−γｍＲＮＡはＩＬ−５等のＴｈ２型サイトカインを
ダウンレギュレートすることが見出されているので（Mosmann,T.R.,et al.,Annu
.Rev.Immunol.,7:145-173(1989);Coffman,R.L.,et al.,Immunol.Rev.,123:189-2
07(1991)）、ＩＬ−５ｍＲＮＡの発現も調べ、６時間までに劇的な減退が観察さ
れ、それは２４時間後も未だ明白であった。

【００４５】肺におけるサイトカイン発現を、抗原およびＩＬ−１２のｉ．ｎ．イノキュレ
ーション後の脾臓におけるサイトカイン発現と比較した。ＩＬ−１２処理後６時
間で脾臓ＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現が増強された。この増加は２４時間でもなお明
白であったが、無処理マウスではこの時点でＩＦＮ−γｍＲＮＡはほとんど検出
されないレベルであった。ＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルの増加がまた、ＩＬ−１２
処理マウスの脾臓で検出され、無処理対照と比較して２４時間で発現が最高に達
した。全身性ＩＬ−１０発現を誘導するＩＬ−１２ｉ．ｐ．投与の能力は以前
に他者により示された（Meyaard,L.,et al.,J.Immunol.,156:2776-2782(1996);D
aftarian,P.M.,et al.,J.Immunol.,157:12-20(1996);Gerosa,F.,et al.,J.Exp.M
ed.,183:255902569(1996)）。最後に、ＩＬ−５は、ＩＬ−５ｍＲＮＡはｉ．ｎ．抗原処理後に検出されたがＩＬ−１２の共投与で抑制された肺とは対照的に、
ＩＬ−１２処理マウスの脾臓でも対照マウスの脾臓でも検出されなかった。ＨＰ
ＲＴｍＲＮＡの同時増幅では、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応で等量のＲＮＡを利用す
ることを確認した。これらの結果は、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．投与は粘膜区画およ
び全身性区画の両方で抗原誘導サイトカイン応答を調節し、ＩＦＮ−γおよびＩ
Ｌ−１０ｍＲＮＡ発現の有意な増強をもたらし得るということを明確に示す。こ
れらの知見はまた、Ｔｈ２関連サイトカインであるＩＬ−５の発現をダウンレギ
ュレートする、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．送達の能力についての強力な証拠を提供す
る。

【００４６】鼻腔内ＩＬ−１２投与は呼吸部抗体応答を調節する以前の業績（Buchanan,R.I.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995);Metzge
r,D.W.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,795:100-115(1996);McKnight,A.J.,et al.,J
.Immunol.,152:2172-2179(1994);Morris,S.C.,et al.,J.Immunol.,152:1047-105
6(1994);Germann,T.,et al.,Eur.J.Immunol.,25:823-829(1995);Wynn,T.A.,et a
l.,J.Immunol.,157:4068-4078(1996);Bliss,J.,et al.,J.Immunol.,156:887-894
(1996)）は、タンパク質およびハプテン−キャリヤ抗原に対する血清ＩｇＧ２ａ
抗体応答を増強する、ＩＬ−１２の非経口送達の能力を示した。ＩＬ−１２はま
た、一時的にＩｇＧ１産生を抑制する（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:
1519-1528(1995);Metzger,D.W.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,795:100-115(1996) ）。本明細書に記載するように、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．投与は類似の様式で呼吸
部抗体応答を調節することがここに見出された。ＢＡＬ液を免疫応答の３５日目
に採取し、ＥＬＩＳＡで解析した。ＤＮＰ−ＯＶＡで免疫化し、ＩＬ−１２でｉ
．ｎ．処理したマウスはＩＬ−１２に曝されずに免疫化されたマウスと比較して
ＩｇＧ２ａ抗ＯＶＡ抗体レベルの劇的な増強（ｐ＜０．０５）を示した（Ｆｉｇ
ｕｒｅ１Ａ〜１Ｃ）。対照群と実験群との間でＩｇＧ１またはＩｇＡ抗ＯＶＡ
抗体レベルに差はなかった。血液汚染は呼吸部分泌物におけるアルブミンの非存
在によりないものとみなした。これらの結果は、呼吸部抗体応答を変化させる、
ＩＬ−１２のｉ．ｎ．送達の能力についての最初の証拠を提供する。

【００４７】鼻腔内ＩＬ−１２投与は血清抗体応答を調節する１４日目の血清のＥＬＩＳＡ解析により、ＤＮＰ−ＯＶＡおよびＩＬ−１２の
ｉ．ｎ．イノキュレーションはまた、ＤＮＰ−ＯＶＡおよびビヒクル（vehicle ）を与えられた対照マウスと比較して、血清ＩｇＧ２ａ抗ＤＮＰ抗体レベルの有
意な増加（ｐ＜０．０５）を引き起こすことが明らかとなった（Ｆｉｇｕｒｅ
２Ａ〜２Ｅ）。さらに、ＩＬ−１２処理後、血清ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３抗Ｄ
ＮＰ抗体レベルが有意に増強（ｐ＜０．０５）された。重要なことに、血清Ｉｇ
Ｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３抗ＤＮＰ応答がｉ．ｎ．ＩＬ−１２処理後２
８日でもなお上昇した。ＩＬ−１２処理マウスにおいて１４日目の血清ＩｇＧ１
抗ＤＮＰ抗体産生も抑制されたが、ＩｇＡ抗ＤＮＰ抗体レベルの変化はほとんど
なかった。しかしながら、ＩＬ−１２処理で観察された初期のＩｇＧ１抑制は免
疫応答の２８日目までに消失し、ＩｇＧ１の抑制は単に一時的な効果であること
を示した。全（非特異的）ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清レベルに対するｉ．
ｎ．ＩＬ−１２処理の効果も調べた。ＩＬ−１２処理マウスは処理後１４日で血
清ＩｇＧ２ａの対応する増加およびＩｇＧ１の減少を有することが見出された（
Ｆｉｇｕｒｅ３Ａ〜３Ｂ）。このパターンはＩＬ−１２イノキュレーション後
４週間でもなお観察された。

【００４８】糞抗体に対するＩＬ−１２の影響糞抗体応答に対するｉ．ｎ．またはｉ．ｐ．で与えられたＩＬ−１２の効果を
調べた。いずれのルートで抗原およびＩＬ−１２を与えられたマウスも、ＩＬ−
１２に曝されずに免疫化されたマウスと比較して糞ＩｇＧ２ａ抗ＤＮＰ抗体レベ
ルの有意により高いレベル（ｐ＜０．０５）を有した（Ｆｉｇｕｒｅ４Ａ〜４
Ｆ）。実際、非経口的に抗原のみを与えられたマウスは、糞抽出物中に検出可能
なＩｇＧ２ａを有していなかった。抗原およびＩＬ−１２による非経口処理はま
た、糞ＩｇＡレベルの増強（ｐ＜０．０５）をもたらしたが、ＩＬ−１２のｉ．
ｎ．送達はＩｇＡ抗体レベルの減少（ｐ＜０．０５）をもたらした。非経口ルー
トによる免疫化またはｉ．ｎ．ルートによる免疫化の後で、ＩＬ−１２処理群と
対照群との間の糞ＩｇＧ１抗体レベルに有意な差はなかった。これらの結果は、
ＩＬ−１２および抗原のｉ．ｎ．送達は、ＩＬ−１２の非経口注射後に見られる
のと類似のＩｇＧ産生における変化（shifts）を誘導することを示す。しかしな
がら、ＩＬ−１２の非経口投与のみが、粘膜ＩｇＡ抗体レベルの増強をもたらす
。

【００４９】インフルエンザウイルス由来の精製ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを用
いた全身性抗体応答に対するＩＬ−１２の効果全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２の効果をインフルエン
ザウイルス由来の精製ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ（ＨＡＮＡ）を用
いて調べた。マウスを０日目にＨＡＮＡでｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および
３日目にＩＬ−１２またはＰＢＳビヒクルでｉ．ｎ．処理した。１４日目の血清
抗ＨＡＮＡ抗体レベルを、ＨＡＮＡでコートしたマイクロタイタープレートを用
いるアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｆｉｇｕｒｅ５Ａ〜５Ｂ
を参照のこと。さらに、マウスをＨＡＮＡで０日目にｉ．ｎ．免疫化し、０、１
、２および３日目にＩＬ−１２またはＰＢＳビヒクルでｉ．ｎ．処理し、１４日
目に追加免疫した。２８日目の血清抗ＨＡＮＡ抗体レベルを、ＨＡＮＡでコート
したマイクロタイタープレートを用いるアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡにより測
定した。Ｆｉｇｕｒｅ６Ａ〜６Ｂを参照のこと。

【００５０】呼吸部粘膜応答に対するｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２の効果呼吸部粘膜応答に対するｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２の効果を調べた。マウ
スを０日目にＨＡＮＡで免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ−１２または
ＰＢＳビヒクルで処理し、１４日目および２８日目に追加免疫した；２８日目に
、マウスにはまた、ＩＬ−１２またはビヒクルを与えた。マウスを３５日目に屠
殺し、ＢＡＬ液をＨＡＮＡでコートしたマイクロタイタープレートを用いるＥＬ
ＩＳＡにより抗ＨＡＮＡ抗体レベルについてアッセイした。Ｆｉｇｕｒｅ７Ａ
〜７Ｂを参照のこと。

【００５１】実施例２：鼻腔内インターロイキン−１２は防護粘膜免疫のための強力なアジュバントである方法マウス６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを国立癌研究所（the National Cancer
Institute）（Bethesda,MD）から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６ＩｇＭ欠損（μＭＴ
）マウスをジャクソン（Jackson）研究所（Bar Harbor,ME）から購入した。マウ
スをオハイオ州立医科大学（the Medical College of Ohio）の動物施設に収容し、食事と水を随意に与えた。全ての動物の世話および実験方法は、制度として
の動物の世話および使用に関する委員会〔the Institutional Animal Care and
Use Committee (IACUC)〕のガイドラインに従って行った。

【００５２】免疫化鼻腔内処理を、ケタミンＨＣＬ（Fort Dodge Laboratories,Fort Dodge,IO ）
およびキシラジン（Bayer Corporation,Shawnee Mission,KA）の組み合わせでｉ
．ｐ．麻酔したマウスに対し行った。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８／３４
から精製された可溶性ヘマグルチニンサブタイプ１（Ｈ１）およびノイラミニダ
ーゼサブタイプ１（Ｎ１）からなるサブユニットインフルエンザワクチン（ニュ
ーヨーク州立医科大学（New York Medical College）、New York,NY のＤｏｒｉ
ｓＢｕｃｈｅｒ博士により提供された）１μｇを含む滅菌ＰＢＳ２５μｌで、
マウスを０日目にｉ．ｎ．免疫化した。この後、０、１、２および３日目に、１
％正常ＢＡＬＢ／ｃマウス血清（ＰＢＳ−ＮＭＳ）を含むＰＢＳ中の組換えネズ
ミＩＬ−１２１μｇのｉ．ｎ．イノキュレーションで、または対照マウスの場
合にはＰＢＳ−ＮＭＳのみで行った。マウスを１４日目および２８日目に同量の
ワクチンでｉ．ｎ．追加免疫した。２８日目に、マウスにまた、ＰＢＳ−ＮＭＳ
中のＩＬ−１２またはＰＢＳ−ＮＭＳのみを与えた。この処理養生法に毒性は観
察されなかった。マウスの眼窩叢から採血することにより血清を調製した。

【００５３】ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲスナップ（snap）凍結脾臓および肺からの全ＲＮＡの単離は製造業者の指示に
従いアンビオン（Ambion）全ＲＮＡ単離キット（Austin,TX）で行った。すなわち、凍結組織を乳鉢と乳棒でホモジナイズし、直ちに変性溶液１．０ｍｌを含む
チューブに移した。フェノール−クロロホルム抽出の後、ホモジナイズした試料
を４℃で１０分間１０，０００×ｇにて遠心分離した。上清に対しもう一度フェ
ノール−クロロホルム抽出を行い、得られたＲＮＡをイソプロパノールで沈澱さ
せ、７５％エタノールで二度洗浄し、ＤＥＰＣ処理水中に溶解させた。全ＲＮＡ
の濃度を２６０ｎｍにおける分光測光法的解析により測定した。全ＲＮＡ３μｇ
を、オリゴ（ｄＴ）_16-18プライマーを利用する逆転写キット（Life Technolog
ies,Gaithersburg,MD）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プライマーを対照として、得られたｃ
ＤＮＡをＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０に特異的なプライマーを用いて増幅した。
利用したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは以下の配列を有した
：ＩＦＮ−γ 5'-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3'（配列番号：７）および 5'-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG-3' （配列番号：８）；ＩＬ−１０ 5'-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTT-3'（配列番号：５）および 5'-ATTTCGGAGAGAGGTACAAACGAGGTTT-3'（配列番号：６）；ＨＰＲＴ 5'-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3' （配列番号：１）および 5'-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3' （配列番号：２）。

【００５４】６０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．４ｍＭＭｇＣｌ₂中、最終容量５０μｌにて、ｃＤＮＡ２μｌ、０．２５ｍＭ
ｄＮＴＰｓ（Invitrogen Corporation,San Diego,CA）、０．８μＭプライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies）２．５Ｕを混合することにより、ＰＣＲ増幅を行った。混合物を９５℃で５分間インキュベートし、
次いで、以下の増幅プロファイルに供した：９５℃で１分、５６℃で１分および
７２℃で１分の３５サイクルの継続。この後に、７２℃で１０分間の最終伸長を
行った。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイ
ドで染色し、ＵＶトランスイルミネーションにより可視化した。

【００５５】リボヌクレアーゼプロテクションアッセイサイトカインｍＲＮＡレベルを、製造業者の指示に従い、ＲｉｂｏＱｕａｎｔ
マルチプローブリボヌクレアーゼプロテクションアッセイシステム（Pharmingen
,San Diego,CA）を利用して測定した。すなわち、全ＲＮＡ１０μｇを５６℃で一夜³²Ｐ標識ＲＮＡプローブにハイブリダイズさせた。一本鎖核酸を３０℃で４
５分間、リボヌクレアーゼで消化し、フェノール−クロロホルム抽出に供し、６
％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。転写物レベルをストーム（Storm ）８４０ホスファーイメージャー（PhosphorImager）（Molecular Dynamics,Sun
nyvale,CA）上で定量した。全ＲＮＡをハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに対し標準化し、相対的なサイト
カインｍＲＮＡレベルを任意値として表した。

【００５６】気管支肺胞洗浄液の採取ＢＡＬ液の採取のため、マウスを屠殺し、それらの気管に０．５８ｍｍのＯＤ
ポリエチレン製カテーテル（Becton Dickinson,Sparks,MD）を用いて挿管した。
次いで、肺を５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで２〜３回洗浄した。回収したＢＡ
Ｌ液を４℃で５分間１２，０００×ｇで遠心分離し、使用するまで−７０℃で上
清を保存した。

【００５７】ＥＬＩＳＡによる抗体およびアイソタイプレベルの検出血清およびＢＡＬにおける抗Ｈ１Ｎ１レベルを、少しの改変を伴い本質的に記
載（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995);Buchanan,R.M.,et
al/.J.Immunol.,161:5525-5533(1998)）のようにしてＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち、マイクロタイタープレート（Nalge Nunc International,Rochest
er,NY）をＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのＨ１Ｎ１で一夜コートした。プレートを０．３％Ｂｒｉｊ−３５（Sigma,St.Louis,MO）を含むＰＢＳで洗浄し、５％ウシ胎仔血清（Hyclone Laboratories,Logan,UT）および０．１％Ｂｒｉｊ−３５を含むＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。血清の連続希釈物を添加し、プレー
トを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、アルカリホスファタ
ーゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（Southern Biotechno
logy Associates,Birmingham,AL）と共にインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ基質
を添加して、発色を得た。プレートをＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Bi
o-Tek Instruments,Winooski,VT）により４０５ｎｍにて読んだ。ＩｇＡを検出するため、プレートをビオチンに結合させたヤギ抗マウスＩｇＡ（Sigma）と共にインキュベートし、次いで、洗浄し、アルカリホスファターゼに結合させたス
トレプトアビジン（BIO RAD,Richmond,CA）と共にインキュベートした。プレートを１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇ（Southern Biotech
nology Associates）でコートしたことを除き、全免疫グロブリンを同様に測定した（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995)）。全ての場合において、二次抗体コンジュゲートの適切な実施希釈およびアイソタイプ特異性
を精製ミエローマタンパク質の既知のアイソタイプ（Sigma）を用いて決定した。統計的有意性を両側スチューデントｔ検定により決定した。データはｐ値が＜
０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。

【００５８】ウイルス攻撃プロテクション研究のため、マウスをＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワ
クチン１μｇを含むＰＢＳ２５μｌで０日目にｉ．ｎ．免疫化した。この後、０
、１、２および３日目に、ＰＢＳ−ＮＭＳ中のＩＬ−１２１μｇのｉ．ｎ．イ
ノキュレーションで、またはＰＢＳ−ＮＭＳのみで行った。マウスにはＰＢＳ−
ＮＭＳ中のＩＬ−１２のみ、またはＰＢＳ−ＮＭＳのみ（Ｈ１Ｎ１サブユニット
ワクチンなし）を与えられたものもいた。一次免疫後の約４〜５週に、滅菌ＰＢ
Ｓ４０μｌ中の感染性Ａ／ＰＲ８／３４インフルエンザウイルス（Ｄｏｒｉｓ
Ｂｕｃｈｅｒ博士により提供された）を、麻酔されたマウスにｉ．ｎ．投与して
ウイルス攻撃を行った。マウスの体重を毎日測定し、罹病率と死亡率を追跡した
。

【００５９】血清とＢＡＬ液の受身伝達受身伝達実験のために、Ｈ１Ｎ１サブユニットワクチンによるｉ．ｎ．免疫化
後の２８日目に血清を得た。マウスに、プールされた血清の１：１０希釈物１０
０μｌをｉ．ｐ．注射し、感染性インフルエンザウイルスｉ．ｎ．で５時間後に
攻撃した。Ｈ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワクチンでｉ．ｎ．免疫化後の
３５日目にマウスから採取したＢＡＬ液を遠心分離して細胞を除去し、上清を全
量４０μｌでウイルスと共に麻酔したマウスにｉ．ｎ．投与した。

【００６０】結果鼻腔内ＩＬ−１２投与は、免疫化マウスの肺および脾臓におけるＴｈ１型サイト
カイン応答の発現を誘導する非経口的に与えられたＩＬ−１２は、優先的にＴｈ１およびＮＫ細胞を活性化
する能力を介する免疫系に対する強い調節効果を有し、ＩＦＮ−γ産生を誘導す
る（Trinchieri,G.,et al.,Res.Immunol.,146:423-431(1995);Gately,M.K.,et a
l.,Annu.Rev.Immunol.,16:495-521(1998)）。本明細書に記載のように、呼吸部サイトカイン遺伝子発現に対するＩＬ−１２のｉ．ｎ．投与の効果をここで調べ
た。ＩＬ−１２またはＰＢＳビヒクルおよびＨ１Ｎ１サブユニットインフルエン
ザワクチンの単回ｉ．ｎ．イノキュレーション後の個々のマウス（１群当たり３
匹のマウス）の肺におけるサイトカインｍＲＮＡ発現の解析。処理後の２４時間
または４８時間にマウスを屠殺し、全肺ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲにより示される
サイトカインの発現についてアッセイした：ＩＬ−１０（４５５ｂｐ）、ＩＦＮ
−γ（４５９ｂｐ）およびＨＰＲＴ（１６２ｂｐ）。Ｈ１Ｎ１サブユニットイン
フルエンザワクチンおよびＩＬ−１２によるマウスのｉ．ｎ．処理は、ワクチン
のみでの免疫化と比較して２４時間以内の肺ＩＦＮ−γｍＲＮＡレベルの発現に
対する増強効果を有することが見出された。ＩＦＮ−γｍＲＮＡレベルのこの増
加はＩＬ−１２イノキュレーション後４８時間でも明白であった。

【００６１】ＩＬ−１２による処理はＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現を増強することが以前に示
されている（Meyaard,L.,et al.,J.Immunol.,156:2776-2782(1996);Daftarian,P
.M.,et al.,J.Immunol.,157:12-20(1996);Gerosa,F.,et al.,J.Exp.Med.,183:25
59-2569(1996)）。本明細書に記載のように、Ｈ１Ｎ１ワクチンおよびＩＬ−１２のｉ．ｎ．送達はまた、肺ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現の劇的な増加を引き起こし
た。対照的に、ワクチンのみを与えられたマウスにおいてはＩＬ−１０ｍＲＮＡ
は存在しなかった。ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現は、ワクチンだけを与えられた動物
と比較して、ＩＬ−１２処理マウスの肺において４８時間後いまだ有意に上昇さ
れた。ＩＬ−５ｍＲＮＡの発現も調べ、ＩＬ−１２処理後、差は見出されなかっ
た。

【００６２】ＩＬ−１２の局所粘膜送達は遠隔の全身性区画を調節し得るかどうか決定する
ために、免疫化マウスの脾臓におけるサイトカインｍＲＮＡパターンを調べた。
ＩＬ−１２またはＰＢＳビヒクルおよびＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワ
クチンの単回ｉ．ｎ．イノキュレーション後の個々のマウス（１群当たり３匹の
マウス）の脾臓におけるサイトカインｍＲＮＡ発現の解析。処理後の２４時間ま
たは４８時間にマウスを屠殺し、全脾臓ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲにより示される
サイトカインの発現についてアッセイした：ＩＬ−１０（４５５ｂｐ）、ＩＦＮ
−γ（４５９ｂｐ）、およびＨＰＲＴ（１６２ｂｐ）。Ｈ１Ｎ１サブユニットワ
クチンおよびＩＬ−１２の鼻腔内投与は、ワクチンだけを与えられたマウスと比
較して２４時間以内の脾臓ＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現の実質的な増加をもたらした
。ＩＦＮ−γレベルの上昇はＩＬ−１２処理マウスにおいて４８時間でも明白で
あった。脾臓ＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルはＩＬ−１２処理後２４時間および４８
時間の両時点で上昇が維持された。最終的に、ＩＬ−５ｍＲＮＡはＩＬ−１２処
理動物または対照動物のどちらの脾臓においても検出された。ＨＰＲＴｍＲＮＡ
の同時増幅により、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応において等量のＲＮＡが利用された
ことを確認した。インフルエンザワクチンによるｉ．ｎ．免疫化後に観察された
サイトカインｍＲＮＡ転写物のレベルをさらに定量するために、肺および脾臓に
おけるサイトカインｍＲＮＡレベルをリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ
により解析した。ワクチンだけを与えられたマウスと比較して、Ｈ１Ｎ１および
ＩＬ−１２による処理後２４時間および４８時間で動物の肺においてＩＦＮ−γ
ｍＲＮＡレベルは２倍増加することを見出した（表）。さらに、ＩＬ−１０ｍＲ
ＮＡ発現はＩＬ−１２処理後肺で５倍増強された。これらの動物の脾臓において
、ＩＦＮ−γｍＲＮＡは、ＩＬ−１２処理後、２４時間で５倍ならびに４８時間
で２倍上昇した。同様に、脾臓ＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルは、ＩＬ−１２処理後
、２４時間で８倍ならびに４８時間で５倍増加した。

【００６３】

【表１】

【００６４】鼻腔内ワクチンおよびＩＬ−１２の共投与は全身性抗体応答に対し強い効果を有
するＩＬ−１２の非経口投与はニワトリ卵白リゾチームに対するアイソタイプ拘束
抗体応答を変化させることが以前示された（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol
.,7:1519-1528(1995)）。さらに、実施例１に記載のように、ｉ．ｎ．送達されるＩＬ−１２はＤＮＰハプテンに対する粘膜免疫および全身性免疫の両方を調節
する。この実施例において、ｉ．ｎ．送達されるＩＬ−１２はＨ１Ｎ１インフル
エンザワクチンに対する抗体応答に類似の効果を有することが示されている。ワ
クチン自身で、またはＩＬ−１２と共に免疫化後の１４日では、検出可能な血清
ＩｇＧ１抗Ｈ１Ｎ１抗体はあるにしても少なかった（Ｆｉｇｕｒｅ８Ａ〜８Ｂ
）。対照的に、ＩｇＧ２ａ抗Ｈ１Ｎ１抗体レベルは、ワクチンだけを与えられた
マウスと比較して、ＩＬ−１２処理後著しく増強された。それゆえ、ｉ．ｎ．Ｉ
Ｌ−１２処理は血清ＩｇＧ２ａ抗体応答の初期活性化をもたらした。

【００６５】類似の解析を３５日目の血清に対し行い、ｉ．ｎ．ＩＬ−１２処理の長期の影
響を決定した。この時点で、ＩＬ−１２処理マウスは、ワクチンだけにより免疫
化されたマウスよりも６倍高いレベルの全抗Ｈ１Ｎ１血清抗体を有した（Ｆｉｇ
ｕｒｅ９Ａ〜９Ｅ）。さらに、ｉ．ｎ．ＩＬ−１２処理後、全（非特異的）Ｉ
ｇが増加した。ＩｇＧ２ａ抗体レベルはＩＬ−１２を与えられたマウスにおいて
さらに劇的に増強された。さらに、実験群および対照群の両方において明白なＩ
ｇＧ１抗Ｈ１Ｎ１抗体は、ワクチンのみを与えられたマウスと比較して、ＩＬ−
１２処理マウスにおいて緩やかに上昇した。かかる観察は我々の以前の知見と一
致する（Buchanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995)）。いずれのマウスの血清においてもＩｇＡは検出されなかった。該結果は、アジュバントと
して共投与され、非侵襲的な形態で送達されるＩＬ−１２の、血清抗体レベルを
増強する能力を明確に示す。

【００６６】鼻腔内ＩＬ−１２送達は呼吸部抗体レベルを増強するｉ．ｎ．免疫化マウス由来のＢＡＬ液における抗体応答も評価した。免疫応答
の３５日目に採取したＢＡＬ液の解析により、ＩＬ−１２処理マウスはＨ１Ｎ１
サブユニットインフルエンザワクチンに対する粘膜抗体応答を増強したことが明
らかになった。１群として、ｉ．ｎ．ＩＬ−１２処理は、ワクチンだけにより免
疫化されたマウスと比較して、全抗Ｈ１Ｎ１呼吸部抗体産生の１５倍の増加をも
たらした（Ｆｉｇｕｒｅ１０Ａ〜１０Ｄ）。さらに、Ｈ１Ｎ１およびＩＬ−１
２ｉ．ｎ．を与えられたマウスのＢＡＬ液において全非特異的Ｉｇが１３倍増
加した。重要なことに、ＩＬ−１２で免疫化され、処理された動物は、ＩＬ−１
２に曝されていない動物と比較して、ＢＡＬ液ＩｇＡ抗Ｈ１Ｎ１抗体レベルの上
昇を示した。この結果は、これらのマウスの循環における検出可能なＩｇＡの非
存在とは全く対照的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗Ｈ１Ｎ１抗体の両方の
レベルは、ワクチンだけを与えられたマウスと比較して、ＩＬ−１２投与後にＢ
ＡＬ液において劇的に増強されることも見出された。これらの結果は、呼吸部抗
体発現の増加におけるｉ．ｎ．送達されるＩＬ−１２の影響を強固に確立するも
のである。

【００６７】ＩＬ−１２投与はインフルエンザサブユニットワクチン接種の防護効果を増加す
るインフルエンザウイルスによる攻撃後の生存結果および臨床結果に対するＩＬ
−１２およびＨ１Ｎ１のｉ．ｎ．共投与の影響も評価した。マウスを０日目にＨ
１Ｎ１ワクチンでｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ−１２１
μｇまたはＰＢＳビヒクルで処理した。マウスにはＩＬ−１２のみまたはＰＢＳ
ビヒクルのみを与えられたものもいた。免疫化後４〜５週に、マウスを感染性Ａ
／ＰＲ８／３４インフルエンザウイルスでｉ．ｎ．イノキュレートし、罹病率お
よび死亡率について毎日追跡した。最初の実験においては、ワクチンだけへの曝
露後５０％のマウスが生存できるウイルス投与量を用いた（Ｆｉｇｕｒｅ１１
Ａ〜１１Ｂ）。ワクチン接種の際のＩＬ−１２の包含は１００％の生存をもたら
し、ワクチンだけを与えられたマウスと比較して体重減少が低減したことから明
らかなように、疾患の有意な低減をもたらすことを見出した。ＩＬ−１２または
ＰＢＳ−ＮＭＳのみで予備処理されたマウス（Ｈ１Ｎ１サブユニットワクチンな
し）は、体重減少の進行を示し、ウイルス攻撃後１１日以内に全て死亡した。

【００６８】第二の実験において、Ｈ１Ｎ１だけによるワクチン接種に有意な防護があると
しても少ないように、より多い投与量のウイルスを攻撃に使用した（Ｆｉｇｕｒ
ｅ１１Ｃ〜１１Ｄ）。この場合、Ｈ１Ｎ１およびＩＬ−１２によるワクチン接
種は攻撃後５０％の生存をもたらすことを見出した。生存マウスにおける感染か
らの回復は体重の回復により明らかであった。期待されるように、ＩＬ−１２ま
たはＰＢＳ−ＮＭＳだけを与えられた動物はウイルス攻撃で生存しなかった。そ
れゆえ、ＩＬ−１２およびＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワクチンのｉ．
ｎ．共投与はワクチンの効力を増加し、生きたインフルエンザウイルスの致死量
に対し有意な防護を与えた。

【００６９】Ｈ１Ｎ１およびＩＬ−１２によるワクチン接種後のインフルエンザ感染に対する
防護の増強は抗体媒介性であるインフルエンザウイルス感染からの防護における体液性免疫の役割を確かめる
ため、Ｂ細胞を欠くμＭＴマウスのＩＬ−１２処理に対する応答を調べた（Kita
mura,D.,et al.,Nature,350:423-426(1991)）。ＰＢＳだけ、ワクチンだけ、またはワクチンおよびＩＬ−１２で予備処理された、全てのμＭＴマウスは、１０
日までに感染により死亡した（Ｆｉｇｕｒｅ１２Ａ〜１２Ｂ）。ＰＢＳだけで
予備処理された野生型マウスは感染後１２日に死亡した。さらに、全てのマウス
は、一定で進行性の体重減少を示した。従って、ＩＬ−１２処理により与えられ
る防護の増強はＢ細胞機能の増大の結果である。

【００７０】ワクチンおよびＩＬ−１２によりｉ．ｎ．イノキュレートされたマウスにおい
て観察されるインフルエンザウイルスに対する防護が抗体により媒介されるか否
かをさらに決定するため、我々はこれらのマウスからのプールされた血清をナイ
ーブ（naive）動物に移し、次いでそれらを５時間後にＡ／ＰＲ８／３４インフルエンザウイルスで攻撃した。ワクチンまたはＰＢＳ−ＮＭＳのみでイノキュレ
ートされたマウス由来の血清を与えられた動物の全てが感染により死亡した（Ｆ
ｉｇｕｒｅ１３）。しかしながら、ワクチンおよびＩＬ−１２により免疫化さ
れたマウス由来の血清を与えられた動物はウイルス攻撃後５０％の生存を示した
。

【００７１】免疫化されたマウスの呼吸部分泌物において生じた抗体がインフルエンザウイ
ルス感染に対する防護において重要な役割を果たすかどうかも決定した。ワクチ
ン接種していない動物またはＨ１Ｎ１±ＩＬ−１２で免疫化された動物から回収
されたＢＡＬ液を、生きたウイルスと共にナイーブマウスにｉ．ｎ．投与した。
結果は、ＰＢＳ−ＮＭＳだけで処理されたマウス由来のＢＡＬ液の受身伝達と共
のウイルス攻撃は７日までに１００％の死亡をもたらすことを示した（Ｆｉｇｕ
ｒｅ１４Ａ〜１４Ｂ）。Ｈ１Ｎ１だけで免疫化されたマウス由来のＢＡＬ液の
存在下におけるウイルス攻撃は８匹の感染マウスの中の１匹のみの生存をもたら
した。しかしながら、Ｈ１Ｎ１およびＩＬ−１２で処理されたマウス由来のＢＡ
Ｌ液を与えられた動物の１００％がウイルス感染に対し防護された。これらのマ
ウスは感染期間を通して一時的な体重減少を全く示さなかったが、両方の他の処
理群では進行性の体重減少を示し、死に至った。さらに、ワクチンだけで免疫化
された動物由来のＢＡＬ液を与えられたマウスは、感染後４日目に１０³ｐｆｕ
のウイルス肺タイターを有したが、ワクチンおよびＩＬ−１２により処理された
動物由来のＢＡＬ液を与えられたマウスは＜１００ｐｆｕのウイルス肺タイター
を有した。最終的に、Ｈ１Ｎ１およびＩＬ−１２をワクチン接種されたマウス由
来のＢＡＬ液を与えられた、ウイルス攻撃した動物の全体的な健康状態は、Ｈ１
Ｎ１だけをワクチン接種された動物由来のＢＡＬ液を与えられたマウスよりも顕
著により良好に維持された。従って、Ｈ１Ｎ１サブユニットワクチンおよびＩＬ
−１２により免疫化されたマウス由来のＢＡＬ液ｉ．ｎ．の受身伝達は、インフ
ルエンザウイルス攻撃に対する劇的な防護を提供した。

【００７２】考察本明細書に記載のように、インフルエンザサブユニットワクチンと共にｉ．ｎ
．送達されるＩＬ−１２は強力な粘膜アジュバントとして働き、続くウイルス感
染に対する防護の増加を付与する。Ｂ細胞欠損マウスならびに血清またはＢＡＬ
液の受身伝達の使用により、ＩＬ−１２により誘導される防護は抗体により媒介
されることが示された。

【００７３】ＩＬ−１２によるマウスのｉ．ｎ．処理後のサイトカインｍＲＮＡ産生の解析
により、２４時間以内の肺および脾臓の両方におけるＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現の
増強が明らかとなった。ＩＦＮ−γは種々の免疫調節機能を有しており、それに
はＴｈ１細胞の分化およびＮＫ細胞の活性化の誘導が含まれる（Boehm,U.,et al
.,Annu.Rev.Immunol.,15:749-795(1998)）。さらに、ＩＦＮ−γはＩｇＧ２ａ等
のオプソニン作用を有するネズミ抗体の産生を増強する（Buchanan,J.M.,et al.
,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995);Metzger,D.W.,et al.,Eur.J.Immunol.,27:19
58-1965(1997);McKnight,A.J.,et al.,J.Immunol.,152:2172-2179(1994);Wynn,T
.A.,et al.,J.Immunol.,157:4068-4078(1996)）。ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現も、ＩＬ−１２によるｉ．ｎ．処理により肺および脾臓において誘導された。ＩＬ−
１０は主にＴ細胞および単球により産生され、Ｔｈ１細胞の分化を阻害すること
が示されている（Fiorentino,D.F.,et al.,J.Immunol.,146:3444-3451(1991);Di
ng,L.,et al.,J.Immunol.,148:3133-3139(1992)）。他者（Meyaard,L.,et al.,J
.Immunol.,156:2776-2782(1996);Daftarian,P.M.,et al.,J.Immunol.,157:12-20
(1996);Gerosa,F.,et al.,J.Exp.Med.,183:2559-2569(1996)）はＩＬ−１２によ
る処理後のＩＬ−１０の誘導を示しており、かかる観察はＩＬ−１２およびＩＦ
Ｎ−γの炎症性の効果をダウンレギュレートするためにデザインされたフィード
バック機構を示唆する。

【００７４】実施例２において、臨床的に関連するインフルエンザサブユニットワクチンへ
の応答に対するｉ．ｎ．ＩＬ−１２の影響を調べた。ＩＬ−１２処理はＩｇＧ２
ａ抗Ｈ１Ｎ１抗体レベルの有意な増強により反映されるように、体液性応答の開
始初期に対する劇的な影響を有することが見出された。比較では、ワクチンだけ
を与えられた動物は初期ＩｇＧ２ａ応答を発現しなかった。ワクチンだけまたは
ワクチンおよびＩＬ−１２を与えられた動物における免疫応答の初期段階の際に
は検出可能なＩｇＧ１抗体は少なかった。３５日後では、ＩｇＧ２ａレベルはＩ
Ｌ−１２処理マウスにおいていまだ増強されており、ＩｇＧ１レベルもいくぶん
上昇していた。かかる観察は、リゾチーム系における以前の知見に一致する（Bu
chanan,J.M.,et al.,Int.Immunol.,7:1519-1528(1995)）。これらの結果は、ｉ．ｎ．送達されるＩＬ−１２の長期継続効果を示し、全身性体液性免疫を増加さ
せるための、このルートの投与の使用についてのさらなる証拠を提供する。

【００７５】ＩＬ−１２のｉ．ｎ．投与はまた、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗Ｈ１Ｎ１抗体レベル
等の呼吸部抗体レベルの有意な増加をもたらした。ＩｇＡは粘膜分泌物内の主な
抗体であり、粘膜上皮表面への病原体の付着を防ぐ際に主要な役割を果たしてい
ると思われる（Lamm,M.E.,Annu.Rev.Immunol.,51:311-340(1997)）。

【００７６】また、本明細書に記載のように、サブユニットインフルエンザワクチンおよび
ＩＬ−１２で免疫化されたマウスから採取された血清またはＢＡＬ液の受身伝達
は罹病率および死亡率からの有意な防護をもたらした。抗体レベルを増加し、イ
ンフルエンザウイルス感染に対する防護を増強する、ＩＬ−１２の能力は、μＭ
Ｔマウスにおいて完全に排除される。ここに観察されるＢＡＬ液の受身伝達によ
り与えられる防護の増加は、ＩＬ−１２のｉ．ｎ．処理後に観察される呼吸部抗
体レベルの有意な増強の結果であるようである。

【００７７】粘膜免疫応答を増強するために使用されているアジュバントは、種々の送達系
において利用されているＣＴやＬＴ等の微生物産物を含む（Staats,H.F.,et al.
,Curr.Opin.Immunol.,6:572-583(1994);Elson,C.O.,In Mechanisms in the Path
ogenesis of Enteric Disease,Paul,P.S.,et al.,eds.,(NY:Plenum Press),373-
385 頁(1997)）。ＣＴはＴｈ２型応答の強力なインデューサーであり、一方、Ｌ
ＴはＴｈ１とＴｈ２の混成の応答を顕現させる（Marinaro,M.,et al.,J.Exp.Med
.,185:415-427(1997);Takahashi,I.,et al.,Infect.Dis.,173:627-635(1996)）。しかしながら、これらのアジュバントは重度の下痢を起こさせ、ヒトにおける
粘膜アジュバントとしての使用には適していない。ＣＴは実際にＩＬ−１２産生
およびＩＬ−１２レセプター発現を抑制することを示唆する最近の報告も存在す
る（Braun,M.,et al.,J.Exp.Med., 印刷中(1999)）。さらに、呼吸器多核体ウイ
ルス肺感染において、Ｔｈ１応答は防護的であるが、Ｔｈ２応答は肺病理をもた
らす（Graham,B.S.,et al.,J.Clin.Invest.,88:1026-1033(1991);Graham,B.S.,e
t al.,J.Immunol.,151:2032-2040(1991)。それゆえ、インフルエンザワクチンの
防護効果を増強する、ｉ．ｎ．投与されるＩＬ−１２の能力は、粘膜ワクチン接
種プロトコルに直接適するものである。

【００７８】均等物本発明を、その好ましい態様を参照して特に示し、記載しているが、添付の特
許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、
形態および詳細において種々の変更を本発明において行ってよいということを当
業者は理解するであろう。当業者は、単なる日常の実験を用いて、特に本明細書
に記載されている本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確
認できるだろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１Ａ〜１Ｃは、呼吸部粘膜免疫応答に対する鼻腔内（ｉ．ｎ．
）投与されるＩＬ−１２の影響を示す棒グラフである；データは、１群当たり４
匹のマウスでの平均光学濃度（Ｏ．Ｄ．）＋／−ＳＥＭとして示される；気管支
肺胞洗浄（ＢＡＬ）を滴定曲線の直線部分に対応する希釈度（ＩｇＧ１およびＩ
ｇＡでは１：６４、ＩｇＧ２ａでは１：８）で試験した。

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２Ａ〜２Ｅは、全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩ
Ｌ−１２の影響を示す、血清希釈度の逆数対Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍのグラフである
；中実記号はＤＮＰ−ＯＶＡおよびＩＬ−１２を注射された動物を表し、中空記
号はＤＮＰ−ＯＶＡおよびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射された動物を
表す；各線は個々のマウス由来の抗体の結合を表わす。

【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３Ａ〜３Ｂは、全Ｉｇレベルに対するｉ．ｎ．投与されたＩＬ
−１２の影響を示す棒グラフである；データは、１群当たり４匹のマウスでの平
均Ｏ．Ｄ．＋／−ＳＥＭとして示される；血清を滴定曲線の直線部分に対応する
希釈度（ＩｇＧ１では１：６４００、ＩｇＧ２ａでは１：２００）で試験した。

【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４Ａ〜４Ｆは、糞粘膜応答に対するＩＬ−１２の非経口（ｉ．
ｐ．）投与およびｉ．ｎ．投与の影響を示す棒グラフである；示されるデータは
、ＩｇＡについての２１日目の抗体応答およびＩｇＧアイソタイプについての２
８日目の応答、各反応性応答のピークを示す；データは、１群当たり３〜４匹の
マウスでの平均Ｏ．Ｄ．＋／−ＳＥＭとして示される。

【図５】Ｆｉｇｕｒｅ５Ａ〜５Ｂは、全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩ
Ｌ−１２の影響を示す血清希釈度の逆数対Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍのグラフである；
マウスを０日目にインフルエンザウイルス（ＨＡＮＡ）由来の精製ヘマグルチニ
ンおよびノイラミニダーゼでｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ
−１２（中実三角形）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル（中空円
）でｉ．ｎ．処理した；１４日目の血清抗ＨＡＮＡ抗体レベルをＨＡＮＡコート
マイクロタイタープレートを用いるアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡにより測定し
た；各線は個々のマウス由来の抗体の結合を表わす。

【図６】Ｆｉｇｕｒｅ６Ａ〜６Ｂは、全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩ
Ｌ−１２の影響を示す、血清希釈度の逆数対Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍのグラフである
；マウスを０日目にＨＡＮＡでｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３日目にＩ
Ｌ−１２（中実三角形）またはＰＢＳビヒクル（中空円）でｉ．ｎ．処理し、１
４日目に追加免疫した；２８日目の血清抗ＨＡＮＡ抗体レベルをＨＡＮＡコート
マイクロタイタープレートを用いるアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡにより測定し
た；各線は個々のマウス由来の抗体の結合を表わす。

【図７】Ｆｉｇｕｒｅ７Ａ〜７Ｂは、呼吸部粘膜応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩ
Ｌ−１２の影響を示す、血清希釈度の逆数対Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍのグラフである
；マウスを０日目にＨＡＮＡで免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ−１２
またはＰＢＳビヒクルで処理し、１４日目および２８日目に追加免疫した；２８
日目に、マウスにまたＩＬ−１２またはビヒクルを与えた；マウスを３５日目に
屠殺し、ＢＡＬ液をＨＡＮＡコートマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳ
Ａにより抗ＨＡＮＡ抗体レベルについてアッセイした；各線は個々のマウス由来
の抗体の結合を表わす。

【図８】Ｆｉｇｕｒｅ８Ａ〜８Ｂは、サブユニットインフルエンザワクチンへの初期
全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩＬ−１２の影響を示すグラフによ
る表示である。マウスを０日目にＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワクチン
でｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ−１２（中実三角形）また
はＰＢＳビヒクル（中空円）でｉ．ｎ．処理した。１４日目の血清抗Ｈ１Ｎ１抗
体レベルをＨ１Ｎ１コートマイクロタイタープレートを用いるアイソタイプ特異
的ＥＬＩＳＡにより測定した。各線は個々のマウス（１群当たり４匹のマウス）
由来の抗体の結合を表わす。ワクチンおよびＩＬ−１２で免疫化したマウスとワ
クチンおよびＰＢＳビヒクルで免疫化したマウスとの間の結合の差は、ＩｇＧ２
ａではｐ＜０．０５で有意であった。

【図９】Ｆｉｇｕｒｅ９Ａ〜９Ｅは、サブユニットインフルエンザワクチンへの後期
全身性抗体応答に対するｉ．ｎ．投与されたＩＬ−１２の影響を示すグラフによ
る表示である。マウスを０日目にＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワクチン
でｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３日目にＩＬ−１２（中実三角形）また
はＰＢＳビヒクル（中空円）でｉ．ｎ．処理し、１４日目および２８日目にワク
チンで追加免疫した。２８日目に、マウスにＩＬ−１２またはビヒクルによる第
２回目の処理を施した。３５日目の血清抗Ｈ１Ｎ１抗体レベルをＨ１Ｎ１コート
マイクロタイタープレートを用いるアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡにより測定し
た。各線は個々のマウス（１群当たり４匹のマウス）由来の抗体の結合を表わす
。ワクチンおよびＩＬ−１２で免疫化したマウスとワクチンおよびＰＢＳビヒク
ルで免疫化したマウスとの間の結合の差は、ＩｇＧ２ａ、全Ａｂおよび全Ｉｇで
はｐ＞０．０５で有意であった。

【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ１０Ａ〜１０Ｄは、呼吸部粘膜応答に対するｉ．ｎ．投与され
たＩＬ−１２の影響を示すグラフによる表示である。マウスを０日目にＨ１Ｎ１
サブユニットインフルエンザワクチンでｉ．ｎ．免疫化し、０、１、２および３
日目にＩＬ−１２またはＰＢＳビヒクルでｉ．ｎ．処理し、１４日目および２８
日目にワクチンで追加免疫した。２８日目に、マウスにＩＬ−１２またはビヒク
ルによる第２回目の処理を施した。３５日目にマウスを屠殺し、ＢＡＬ液をＨ１
Ｎ１コートマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡにより抗Ｈ１Ｎ１抗体
レベルについてアッセイした。各線は個々のマウス（１群当たり４匹のマウス）
由来の抗体の結合を表わす。ワクチンおよびＩＬ−１２で免疫化したマウスとワ
クチンおよびＰＢＳビヒクルで免疫化したマウスとの間の結合の差は、全Ａｂ、
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡではｐ＜０．０５で有意であった。

【図１１】Ｆｉｇｕｒｅ１１Ａ〜１１Ｄは、インフルエンザサブユニットワクチンおよ
びＩＬ−１２の共投与が、続くインフルエンザウイルス感染からマウスを防護す
ることを示すグラフによる表示である。マウスをＨ１Ｎ１サブユニットワクチン
およびＩＬ−１２（中実三角形）、ワクチンおよびＰＢＳビヒクル（中空円）、
ＩＬ−１２のみ（中空菱形）またはＰＢＳビヒクルのみ（中空四角形）でｉ．ｎ
．免疫化した。次いで、全てのマウス（１群当たり８匹）を１０³ｐｆｕ（Ａ）
または２×１０³ｐｆｕ（Ｂ）のＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスで
４〜５週間後にｉ．ｎ．攻撃した。マウスを死亡率および体重減少について毎日
追跡した。ワクチンおよびＩＬ−１２で免疫化したマウスとワクチンおよびＰＢ
Ｓで免疫化したマウスとの間の生存の差は、ｐ＜０．０５で有意であった。

【図１２】Ｆｉｇｕｒｅ１２Ａ〜１２Ｂは、インフルエンザウイルス感染に対して、Ｉ
Ｌ−１２で誘導される防護はＢ細胞により媒介されることを示すグラフによる表
示である。μＭＴマウスをＨ１Ｎ１サブユニットワクチンおよびＩＬ−１２（中
実三角形）、ワクチンおよびＰＢＳビヒクル（中空円）またはＰＢＳビヒクルの
み（中空菱形）でｉ．ｎ．免疫化した。野生型（ＷＴ）マウスをＰＢＳビヒクル
（中空四角形）で予備処理した。次いで、全てのマウス（１群当たり８匹）を１
０³ｐｆｕのＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスで６〜７週間後にｉ．
ｎ．攻撃した。マウスを死亡率および体重減少について毎日追跡した。

【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ１３は、サブユニットインフルエンザワクチンおよびＩＬ−１
２で免疫化されたマウス由来の血清の受身伝達はインフルエンザウイルス攻撃に
対する防護を与えることを示すグラフによる表示である。血清をＨ１Ｎ１サブユ
ニットインフルエンザワクチンおよびＩＬ−１２（中実三角形）、ワクチンおよ
びＰＢＳ（中空円）またはＰＢＳビヒクルのみ（中空四角形）で免疫化したマウ
スから採取した。プールした血清を滅菌ＰＢＳで１：１０に希釈し、０．１ｍｌ
／マウスの投与量でｉ．ｐ．注射した。次いで、全てのマウス（１群当たり７〜
８匹）を１０³ｐｆｕのＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスで５時間後
にｉ．ｎ．攻撃した。ワクチンおよびＩＬ−１２で免疫化したマウスとワクチン
およびＰＢＳビヒクルで免疫化したマウスとの間の生存の差はｐ＜０．０５で有
意であった。

【図１４】Ｆｉｇｕｒｅ１４Ａ〜１４Ｂは、サブユニットインフルエンザワクチンおよ
びＩＬ−１２で免疫化されたマウス由来のｉ．ｎ．ＢＡＬ液の受身伝達はインフ
ルエンザウイルス攻撃に対する防護を与えることを示すグラフによる表示である
。ＢＡＬ液をＨ１Ｎ１サブユニットインフルエンザワクチンおよびＩＬ−１２（
中実三角形）、ワクチンおよびＰＢＳ（中空円）またはＰＢＳビヒクルのみ（中
空四角形）で免疫化したマウスから採取した。次いで、全てのマウス（１群当た
り８匹）を、プールしたＢＡＬ液および２×１０³ｐｆｕのＡ／ＰＲ／８／３４
インフルエンザウイルスでｉ．ｎ．イノキュレートした。ワクチンおよびＩＬ−
１２で免疫化したマウスとワクチンおよびＰＢＳで免疫化したマウスとの間の生
存の差はｐ＜０．０５で有意であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 33/00 33/00 37/04 37/04 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C076 AA12 BB25 CC06 DD23D DD26Z FF68 4C084 AA02 AA03 BA44 DA12 MA02 MA59 ZB022 ZB091 ZB092 ZB331 ZB351 ZC752 4C085 AA03 AA05 BA02 BA03 BA04 BA06 BA09 BA14 BA16 BA53 BA55 BA69 EE03 FF03 FF13 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−１２の有効量および病原体の抗原を宿主
に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体に対する免疫応答を誘導する
方法。
【請求項２】病原体が、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、寄生体およ
び真菌からなる群より選ばれるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】細菌が、Ｓ．ニゥモニエ、Ｎ．メニンジティディスおよびＨ
．インフルエンザからなる群より選ばれるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】ウイルスが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザ
ウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選ばれる
ものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】寄生体が、リーシュマニア、住血吸虫、トラパノソーム（Tr
apanosomes）、トキソプラズマおよびニューモシスチス（pneumocystis）からな
る群より選ばれるものである、請求項２記載の方法。
【請求項６】抗原が病原体の毒素由来のものである請求項１記載の方法。
【請求項７】免疫応答がＴｈ１型サイトカイン応答である請求項１記載の
方法。
【請求項８】Ｔｈ１型サイトカイン応答が宿主においてインターフェロン
−γの発現の増強をもたらすものである請求項７記載の方法。
【請求項９】免疫応答が体液性免疫応答である請求項１記載の方法。
【請求項１０】体液性免疫応答が抗原に特異的なＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ
およびＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらすものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】インターロイキン−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体に対する免疫応答を増強す
る方法。
【請求項１２】病原体が、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、寄生体お
よび真菌からなる群より選ばれるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】細菌が、Ｓ．ニゥモニエ、Ｎ．メニンジティディスおよび
Ｈ．インフルエンザからなる群より選ばれるものである、請求項１２記載の方法
。
【請求項１４】ウイルスが、インフルエンザウイルス、パラインフルエン
ザウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選ばれ
るものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】寄生体が、リーシュマニア、住血吸虫、トラパノソーム、
トキソプラズマおよびニューモシスチスからなる群より選ばれるものである、請
求項１２記載の方法。
【請求項１６】抗原が病原体の毒素由来のものである請求項１１記載の方
法。
【請求項１７】免疫応答がＴｈ１型サイトカイン応答である請求項１１記
載の方法。
【請求項１８】Ｔｈ１型サイトカイン応答がインターフェロン−γの発現
の増強をもたらすものである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】免疫応答が体液性免疫応答である請求項１１記載の方法。
【請求項２０】体液性免疫応答が抗原に特異的なＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ
およびＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらすものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】インターロイキン−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における粘膜病原体に対する免疫応答を誘
導する方法。
【請求項２２】病原体が、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、寄生体お
よび真菌からなる群より選ばれるものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】細菌が、Ｓ．ニゥモニエ、Ｎ．メニンジティディスおよび
Ｈ．インフルエンザからなる群より選ばれるものである、請求項２２記載の方法
。
【請求項２４】ウイルスが、インフルエンザウイルス、パラインフルエン
ザウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選ばれ
るものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】寄生体が、リーシュマニア、住血吸虫、トラパノソーム、
トキソプラズマおよびニューモシスチスからなる群より選ばれるものである、請
求項２４記載の方法。
【請求項２６】抗原が病原体の毒素由来のものである請求項２４記載の方
法。
【請求項２７】免疫応答が抗原に特異的なＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよび
ＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらすものである請求項２１記載の方法。
【請求項２８】インターロイキン−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体に対するＴｈ１様免疫応答
を誘導する方法。
【請求項２９】病原体が、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、寄生体お
よび真菌からなる群より選ばれるものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】細菌が、Ｓ．ニゥモニエ、Ｎ．メニンジティディスおよび
Ｈ．インフルエンザからなる群より選ばれるものである、請求項２９記載の方法
。
【請求項３１】ウイルスが、インフルエンザウイルス、パラインフルエン
ザウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選ばれ
るものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】寄生体が、リーシュマニア、住血吸虫、トラパノソーム、
トキソプラズマおよびニューモシスチスからなる群より選ばれるものである、請
求項２９記載の方法。
【請求項３３】抗原が病原体の毒素由来のものである請求項２８記載の方
法。
【請求項３４】Ｔｈ１様応答がインターフェロン−γの発現の増強をもた
らすものである請求項２８記載の方法。
【請求項３５】Ｔｈ１様免疫応答が抗原に特異的なＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２
ｂおよびＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらすものである請求項３４記載の方法
。
【請求項３６】インターロイキン−１２の有効量および病原体の抗原を宿
主に鼻腔内投与する工程を含む、宿主における病原体に対する粘膜免疫応答を増
強する方法。
【請求項３７】病原体が、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、寄生体お
よび真菌からなる群より選ばれるものである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】細菌が、Ｓ．ニゥモニエ、Ｎ．メニンジティディスおよび
Ｈ．インフルエンザからなる群より選ばれるものである、請求項３７記載の方法
。
【請求項３９】ウイルスが、インフルエンザウイルス、パラインフルエン
ザウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群より選ばれ
るものである、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】寄生体が、リーシュマニア、住血吸虫、トラパノソーム、
トキソプラズマおよびニューモシスチスからなる群より選ばれるものである、請
求項３７記載の方法。
【請求項４１】抗原が病原体の毒素由来のものである請求項３６記載の方
法。
【請求項４２】免疫応答がＴｈ１型サイトカイン応答である請求項３６記
載の方法。
【請求項４３】Ｔｈ１型サイトカイン応答が宿主においてインターフェロ
ン−γの発現の増強をもたらすものである請求項４２記載の方法。
【請求項４４】免疫応答が体液性免疫応答である請求項３６記載の方法。
【請求項４５】体液性免疫応答が抗原に特異的なＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ
およびＩｇＧ３抗体の発現の増強をもたらすものである請求項４４記載の方法。