JP2002526420A

JP2002526420A - 脊椎動物における実質的に無毒で生物学的に活性な粘膜アジュバント

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Publication number: JP2002526420A
Application number: JP2000573387A
Authority: JP
Inventors: ハーマン・エフ・スターツ; バートン・エフ・ヘインズ; ダバルクマー・ディ・ペイテル; グレゴリー・ディ・センポースキー
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1998-10-08
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2002-08-20
Also published as: AU758111B2; IL142534A0; US20010041180A1; CA2346864A1; EP1121147A1; EP1121147A4; US6270758B1; WO2000020028A1; NZ511445A; US7041294B2; EA200100429A1; AU6413999A

Abstract

(57)【要約】脊椎動物体において抗原に対する免疫応答を誘発させる方法であって、抗原および粘膜組織において生物学的活性を有する実質的に無毒なアジュバント分子を包含する抗原−アジュバント組成物を提供し、該抗原−アジュバント組成物を、初期接触が脊椎動物体の粘膜組織中で起こるような方法で該脊椎動物体に投与することにより免疫応答を誘発させる、段階を包含する方法。サイトカインが好ましいアジュバントであり、好ましいサイトカインはインターロイキン−１α(ＩＬ−１α)およびインターロイキン−１β(ＩＬ−１β)である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、脊髄対象における粘膜アジュバントとして実質的に非毒性、生物学
的活性物質の使用に関係する。より特に、本発明は、脊髄対象における粘膜アジ
ュバントとして、インターロイキン−１α(ＩＬ−１α)およびインターロイキン
−１β(ＩＬ−１β)のようなサイトカインの使用に関係する。

【０００２】グラントの陳述本成果は、National Institute of Health (NIH)のグラント５ＵＯ１ＡＩ３
５３５１−０４により支援された。米国政府は本発明において特定の権利を有す
る。

【０００３】略語表ＣＴコレラ毒素ＣＴＬ細胞毒性Ｔリンパ球ＤＣ樹状細胞ＤＴＨ遅延型過敏性ＥＧＦ上皮増殖因子ＦＫＮフラクタルカイン(fractalkine) ＧＡＬＴ消化管−付随リンパ組織ＧＣＳＦ顆粒性白血球コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ顆粒性白血球−マクロファージコロニー刺激因子ＨＩＶヒト免疫不全ウイルスＨＳＶ単純ヘルペスウイルスＩＤＣ未成熟樹状細胞ＩＦＮインターフェロンＩｇ免疫グロブリンＩｇＡ免疫グロブリンＡＩＧＦ−１インシュリン様増殖因子ＩｇＧ免疫グロブリンＧＩＬインターロイキンＬＡＲＣ肝臓および活性化調節ケモカインＬＴ熱−不安定性毒素ＭＤＣマクロファージ誘導性ケモカインＰＡＲＣ肺および活性化調節ケモカインＰＴ百日咳毒素ＲＳＶＲＳウイルスＳＬＣ二次リンパ組織ケモカインＴＡＲＣ胸腺および活性化調節ケモカインＴＧＦ形質転換増殖因子Ｔｈ１Ｔヘルパー細胞型１Ｔｈ２Ｔヘルパー細胞型２ＴＮＦ腫瘍壊死因子ＴＴ破傷風トキソイド

【０００４】技術背景分泌性ＩｇＡ産生および粘膜細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答のような抗原特
異的免疫応答は、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、単純ヘルペスウイルス(ＨＳ
Ｖ)、Bordetella pertussis、およびSalmonella typhimuriumを含む、宿主の粘
膜表面を介して感染する感染性病原体に対するヒト防御において重要な役割をし
得る。Ogra in Mucosal Vaccines. p.3 (1996)参照。

【０００５】効果的な粘膜ワクチンを発達させる道程の主要な障害は、安全かつ効果的な粘
膜アジュバントの同定である。実際、粘膜アジュバントの非存在下では可溶性タ
ンパク質またはペプチド免疫原による粘膜免疫化は、経口耐容性として知られる
抗原−特異的免疫学的耐容性、または適当な、粘膜性誘導耐容性の状態を誘導す
る傾向にある。例えば、Mowat in Handbook of Mucosal Immunology. p.185 (19
94)；Husby et al., Journal of Immunology 152:4663(1994)；Staines et al.,
Clinical & Experimental Immunology 103:368 (1996)参照。

【０００６】対照的に、可溶性タンパク質抗原、またはコレラ毒素(ＣＴ)、百日咳毒素(Ｐ
Ｔ)、または熱−不安定性毒素(ＬＴ)のような粘膜アジュバントを共投与された
ペプチドによる粘膜免疫化は、強力な全身性および粘膜性、体液性および細胞仲
介免疫応答を誘導し得る。事実、最も強力であり、最も研究されている粘膜アジ
ュバントはコレラ毒素(ＣＴ)である。Elson et al., in Handbook of Mucosal I
mmunology, p. 391(1994)参照。しかし、ＣＴは、ヒトの粘膜アジュバントとし
ての使用は、わずか５マイクログラム(μｇ)のＣＴがヒト志願者の胃の中に投与
すると、ひどい下痢となるため、安全であるとは言えないようである。Levine e
t al., Microbiological Reviews 47:510 (1983)参照。更に、研究に粘膜アジュ
バントとしてＣＴを使用する場合、動物は、抗原特異的ＩｇＥ応答および致死性
過敏症反応を伴う。例えば、Snider et al., J Immunol 153:647(1994);Marinar
o et al., J Immunol 155:4621(1995)参照。

【０００７】毒性アジュバントに付随する毒性を抑制するために、変異ＣＴ、ＬＴ、および
ＰＴ分子を、粘膜アジュバント活性が維持される間、毒性活性の減少または非検
出性を示すように作成する。O'Hagan, Journal of Pharmacy and Pharmacology
49:1(1997)参照。これらの分子は、毒性の減少を伴う強力なアジュバント活性を
有するけれども、実験動物に投与すると免疫誘発性を維持する。例えば、Douce
et al., Infection & Immunity 65:2821(1997)参照。そのため、これら変異毒性
分子の免疫原性はまた、ＣＴに対する先在免疫によりアジュバント活性が減少す
る粘膜アジュバントとして、広範囲および反復の使用を防止する。Wuet al., Va
ccine 12:215(1994)参照。

【０００８】 PillaiらのＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０１１４３には、懸濁中のミネラルに吸
着するＩＬのアジュバント量および抗原の混合物、および保存薬を含む、インタ
ーロイキン(ＩＬ)含有ワクチン組成物が記載されている。当該ミネラルは、好ま
しくはミョウバンとして記載されている。ミョウバンは、ＩＬの生物学的活性を
安定化するとして記載されている。ＩＬの例には、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−７が含まれる。
ミョウバン非存在下では、ＩＬの半減期は短くなることが注目される。癌細胞に
おいて唯一見られ、またはアレルゲンに付随して見られる炭水化物含有ユニット
は、特に抗原として記載されている。しかし、抗原の経口性または粘膜性誘導耐
容性に付随する問題は記載されていない。

【０００９】 Pillaiらにより発表されている１９９４年８月２日付け米国特許番号５,３３
４,３７９には、結合ワクチンのケモカインおよびホルモン担体が記載されてい
る。この特許に記載される抗原は、免疫修飾活性を有するサイトカイン、リンフ
ォカイン、ホルモンまたは増殖因子に結合するか、または遺伝学的に融合する。
特に、予想される抗原には、細菌においてしばしば見られる炭化水素含有抗原が
含まれる。典型的なサイトカイン、リンフォカインおよびホルモンには、ＩＬ−
１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、プロラクチン、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＧＣＳＦ、ＩＧＦ−１、ソマトトロピンまたはインシュリンである。当該結合体
は、任意の既知複合体、炭化水素含有抗原または他の抗原を担体に結合するため
の生物学的に融和な方法により調製され得る。共有結合が好ましい方法として記
載されている。事実、実施例１および２には、抗原をサイトカイン、リンフォカ
イン、ホルモンまたは増殖因子に結合(conjugate or bind)させる必要のある念
入な反応が記載されている。しかし、抗原の経口性または粘膜性誘導耐容性に付
随する問題は記載されていない。

【００１０】 Immunology & Cell Biology 73:389(1995)における、Kramerら、標題"Cytokin
e Mediated Effects in Mucosal Immunology"による最近の論評記事では、粘膜
ＩｇＡ応答の誘導におけるＩＬ−５、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βの役割について
考察されている。特に、この雑誌では、機能的にＩＬ−５またはＩＬ−６遺伝子
を欠損するマウスにおける実験の開示結果について考察されている。生存するワ
クシニアウイルスにおけるワクチン抗原によるＩＬ−５またはＩＬ−６共発現に
ついて記載されており、ＩＬ−５またはＩＬ−６の共発現が粘膜ＩｇＡ応答を促
進することが記載されている雑誌においても考察されている。しかし、当該記事
によると、複合送達方法が粘膜へのサイトカインの送達に必要となることが提唱
される。

【００１１】 Journal of Pharmacy and Pharmacology 49:1(1997)のO'Haganら、標題"Recen
t Advances in Vaccine Adjuvants for Systemic and Mucosal Adjuvants"によ
る他の最近の論評記事では、全身性および粘膜投与用のアジュバントの使用状態
について考察されている。この論評記事では、粒子(すなわち、ミクロスフェア)
、水中油形乳剤、および熱−不安定性エンテロトキシン(ＬＴ)およびコレラ毒素
(ＣＴ)の変異型を含む粘膜投与ワクチンによる使用として多種のアジュバントが
考察されている。しかし、この記事では、粘膜ワクチンアジュバントとしてのサ
イトカインの使用は記載されていない。

【００１２】 Clinical Infectious Diseases 21:1439(1995)のLinら、標題"Present Status
of the Use of Cytokines as Adjuvants with Vaccines to Protect Against I
nfectious Diseases"による雑誌記事では、アジュバントとしての選択サイトカ
イン(ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩ
Ｌ−１２)；腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)；インターフェロン；およびＧＭ−ＣＳＦの
使用が考察されている。しかし、粘膜ワクチンアジュバントとしてのサイトカイ
ンの使用は、この記事では提唱されていない。

【００１３】 Nashら、標題"Recombinat Cytokines as Immunological Adjuvants", Immunol
ogy and Cell Biology 71:367(1993)の雑誌記事では、アジュバントとして組換
えヒツジＩＬ−２、ＩＬ−１αおよび腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)の使用が考
察されている。水酸化アルミニウム(ａｌｕｍ)の形成は、第二体液応答を促進し
得るアジュバントとする使用ついて記載されている。しかし、ＩＬ−１αの粘膜
投与の提唱はない。

【００１４】実質的に非毒性および生物学的活性を有する、インターロイキンのようなサイ
トカインの性質にも拘わらず、アジュバントのような分子の認可使用は、複合結
合または形成技術を必要とする。更に、粘膜免疫化の強力な利点の観点において
、上記経口耐容性の問題が解決されなければならない。そのため、安全で、効果
的であり、かつ容易に製剤される粘膜アジュバントは、効果的粘膜ワクチンの発
達の促進に必要である。

【００１５】本発明の要約本発明により、脊椎対象における抗原に対する免疫応答を顕在化する方法を提
供する。当該方法は、抗原を含む抗原−アジュバント組成物および粘膜組織にお
いて生物学的活性を有する実質的に非毒性なアジュバント分子または分子群を提
供すること、および当該抗原−アジュバント組成物を、初期接触が脊椎対象の粘
膜組織で生ずる方法で脊椎対象に投与し、それにより免疫応答を顕在化するステ
ップを含む。好ましくは、免疫応答には、全身性および／または粘膜免疫応答が
含まれる。

【００１６】従って、本発明の目的は、粘膜免疫化の機能的方法を提供することである。

【００１７】本発明の他の目的は、安全で効果的な粘膜アジュバントを提供することにより
、粘膜免疫化において経口耐容性を取り扱うことである。

【００１８】また、本発明の他の方法は、容易に製剤化され、また免疫化される対象に対し
実質的に非毒性である粘膜アジュバントを提供することである。

【００１９】上記している本発明の目的の幾つか、他の目的は、以下の最善の記載として添
付の図面と合せると、記載書面としての証明となり得る。

【００２０】図面の簡単な説明図１は、表２に示すように鼻腔内免疫化後の血清抗原−特異的ＩｇＧ終点滴定
(逆数)を示す棒グラフである。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；＃３＝実験＃
３である。実験＃１の結果は、４２日目の血清を示す。実験＃２および＃３の結
果は、２１日目の血清を示す。実験あたり、グループあたり３から４(３−４)匹
のマウスを用いた。ａ＝“なし”対照よりも有意に大きかった(ｐ＜０.０５)。

【００２１】図２は、表２に示すように鼻腔内免疫後の膣抗原−特異的ＩｇＡ終点滴定(逆
数)を示す棒グラフである。実験あたり、グループあたり３から４(３−４)匹の
マウスを用いた。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；＃３＝実験＃３である。実
験＃１の結果は、４２日目のサンプルを示し、その一方、実験＃２および＃３の
結果は、２３日目の膣洗浄サンプルを示す。黒の棒(solid bar)＝ＩｇＡ；白の
棒(open bar)＝ＩｇＧである。膣洗浄サンプルは各グループで保存した。

【００２２】図３は、表２に示すように鼻腔内免疫後の抗原−特異的ＤＴＨ耳腫脹応答を示
す棒グラフである。実験あたり、グループあたり３から４(３−４)匹のマウスを
用いた。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；＃３＝実験＃３である。実験＃１、
＃２および＃３の結果は、それぞれ、４３、４９および３５日目の耳腫脹応答を
示す。ａ＝“なし”対照よりも有意に大きかった(ｐ＜０.０５)。ｂ＝なし、Ｃ
Ｔ×３、ＣＴ×１、ＩＬ−１α×１およびＩＬ−β１×１グループよりも有意に
大きかった。

【００２３】図４は、表２に示すように免疫化動物由来の脾細胞における抗原−特異的リン
パ球増殖応答を示す棒グラフである。脾細胞は、実験＃２および＃３用に５６日
目に回収した。黒四角(solid box)は、培養培地中でのみ培養した脾細胞の分あ
たりのカウントを示し、その一方、白四角(open box)は、破傷風トキソイド条件
下で０.１μｇ／mlで培養した脾細胞の分あたりのカウントを示す。３から４(３
−４)匹のマウスの脾細胞をグループごとに保存した。

【００２４】本発明の詳細な説明本発明により、脊椎対象において抗原に対する免疫応答を顕在化する方法を提
供する。当該方法は、抗原を含む抗原−アジュバント組成物および粘膜組織にお
いてアジュバントおよび他の生物学的活性を有する実質的に非毒性な生物学的に
活性なアジュバント分子を提供すること、および当該抗原−アジュバント組成物
を、初期接触が脊椎対象の粘膜組織で生ずる方法で脊椎対象に投与し、それによ
り免疫応答を顕在化するステップを含む。可溶性タンパク質抗原のみによる粘膜
免疫化により抗原特異的(経口)耐容性を誘発し、その一方、本発明による粘膜ア
ジュバントの存在下、抗原による粘膜抗原化により、抗原特異的全身性および粘
膜体液性および細胞仲介免疫応答を誘発する。そのため、本発明は、粘膜性、経
口性、抗原特異的耐容性の問題に取り組む。

【００２５】以下の語句が、当分野において十分定義された意味を有すると考えられるにも
拘わらず、以下の定義を記載し、本発明の解釈を促進させる。

【００２６】語句“免疫システム”は、非特異的および特異的カテゴリーに含まれる、細胞
、組織、システム、構造および過程すべてを含み、脊椎対象において強力な病原
体を含む“非自己”に対し防御を提供する。

【００２７】当分野に既知であるように、非特異的免疫システムには、好中球、単核白血球
、組織マクロファージ、Kupffer細胞、肺胞マクロファージ(alveolar macrophag
e)、樹状細胞および小膠細胞のような食細胞性細胞が含まれる。特異的免疫シス
テムは、宿主内において特異的免疫性を伝達する細胞および他の構造について記
載する。これらの細胞に含まれるものは、リンパ球、特にＢ細胞リンパ球および
Ｔ細胞リンパ球である。これら細胞には、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞も含まれ
る。更に、Ｂリンパ球のような抗体産生細胞、および抗体産生細胞により産生す
る抗体もまた“免疫システム”なる語句に含まれる。

【００２８】 “実質的に非毒性”なる語句は、脊椎対象に投与する際に、有害な効果の少な
いアジュバント分子について述べることを意味する。有害な効果の例には、コレ
ラ毒素のような標準的アジュバントの使用を通じて観察される吐き気およびアナ
フィラキシーショックが含まれる。そのため、“実質的に非毒性”なる語句は、
既知標準としてのコレラ毒素との比較により定量することができる。更に“実質
的に非毒性”は、持続的なおよび主要な副作用がないことを意味し、それには、
体重の減少および発熱の持続が含まれ、そして、以下に限らないが、発熱のよう
なインフルエンザ様症状、持続性の筋肉痛もしくは関節痛、または血圧低下(シ
ョック)が含まれ、それらは、当分野で現在使用されている幾つかの予防接種で
観察される。

【００２９】本発明に従い使用する“実質的に非毒性”なる語句の更なる説明として、下記
２つのアジュバント、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、何れもヒトのフェーズＩ
／II臨床試験で使用されている。これらヒトの試験では、ＩＬ−１αおよびＩＬ
−βが化学治療を行う癌患者において使用された。ＩＬ−１は、毎日ＩＶドリッ
プにより通常投与される。ＩＬ−１は、インフルエンザ様症状を含む副作用が見
られ、それらには、発熱、悪寒および寒気、吐き気、嘔吐、疲労、頭痛、筋肉痛
および関節痛、血圧低下、頻脈、腹通、末梢静脈炎、混乱および傾眠、呼吸困難
ならびに腎前性窒素血症(prerenal axotemia)が含まれる。例えば、Veltri et a
l., Stem Cells 14:164-176(1996); Rinehart et al., Can. Invest. 15:403-41
0(1997); Verschraegen et al., Eur. J. Can. 32A:1609-1611(1996); Janik et
al., J. Nat. Can. Inst. 88:44-49(1996); Weisdorf et al., Blood 84:2044-
2049(1994)参照。

【００３０】使用者は、本発明の操作の任意の特定理論と結合させようとは思わないが、多
くの副作用がＩＶ投与および体全体をＩＬ−１にさらすことに起因すると考えら
れている。従って、サイトカインおよび本明細書に記載の他のアジュバントを局
所的に投与するため、サイトカインの内粘膜(intramucosal)(例えば鼻腔)投与は
全身毒性を制限することを適用者は予想する。また、下記のように、マウスで、
“高”用量のＩＬ−１を用いると(例えば、週毎に３用量あたり４μｇ)、マウス
に乱れた毛並み(ruffled fur)または明白な体重減少のような明白な毒性効果は
観察されなかった。以下において記載するウサギの他の研究においても、８０μ
ｇＩＬ−１βの鼻腔投与により、鼻腔投与後、３−４時間、１.０−１.５℃の熱
を生じた。しかし、体温は、２４時間以内にもとに戻り、体重減少は観察されな
かった。そのため、“実質的に非毒性”なる語句は、本発明の予想アジュバント
を上記のような化学治療の成分として静脈注射で投与するときに観察される全身
毒性と比較して、本発明のアジュバントを粘膜内的に投与するときに全身毒性は
観察されないを含むことも意味する。

【００３１】 “粘膜投与”および“粘膜内投与”なる語句は、投与形態、それによって本発
明の抗原−アジュバント組成物を、初期接触が脊椎対象の粘膜組織で生ずる方法
で投与することを述べることも意味する。粘膜組織の例には、鼻腔膜組織、膣膜
組織、直腸膜組織、胃膜組織が含まれる。そのため、本発明の方法による予想投
与技術には、他の粘膜内投与技術において鼻腔内投与、腟内投与および直腸内が
含まれる。

【００３２】 “生物学的活性”なる語句は、脊椎対象において生物学的または生理学的効果
を有する分子について述べることを意味する。アジュバント活性は、生物学的活
性の一例である。アジュバント活性を有する他の生物学的分子の活性化または誘
導産物は、予想される生物学的活性でもある。

【００３３】 “アジュバント活性”なる語句は、抗原に対する脊椎対象の免疫システムの応
答を促進するかまたは他に修飾する能力を有する分子について述べることを意味
する。

【００３４】 “免疫応答”なる語句は、脊椎対象の免疫システムによる抗原または抗原性決
定因子に対する任意の応答を述べることを意味する。典型的な免疫応答には、以
下に定義のように、体液性免疫応答(例えば、抗原特異的抗体の産生)および細胞
仲介免疫応答(例えば、リンパ球増殖)が含まれる。

【００３５】 “全身性免疫応答”なる語句は、リンパ節−、脾臓−、または消化管付随リン
パ球組織における免疫応答を述べることを意味し、その場合、免疫システムのＢ
リンパ球のような細胞が発達する。例えば、全身性免疫応答は、血清ＩｇＧの産
生を含み得る。更に、全身性免疫応答は、血流を循環する抗原−特異的抗体およ
び脾臓およびリンパ節のような全身部分におけるリンパ組織の抗原−特異的細胞
を述べる。対照的に、消化管付随リンパ組織(ＧＡＬＴ)は、消化管抗原／病原体
に応答する抗原−特異的細胞がＧＡＬＴで誘導され検出可能であるため、粘膜免
疫システムの成分となる。

【００３６】 “粘膜免疫応答”なる語句は、脊椎対象の粘膜組織における免疫応答について
述べることを意味する。当該粘膜免疫応答は、本発明による抗原−アジュバント
組成物の粘膜投与部位から離れている脊椎対象の位置の粘膜組織において、Ｉｇ
Ａ、特に二次ＩｇＡの産生を含み得る。

【００３７】 “体液免疫性”または“体液免疫応答”なる語句は、抗体分子が抗原性刺激に
応答して分泌する、獲得免疫の形成を述べることを意味する。

【００３８】 “細胞−仲介免疫”および“細胞−仲介免疫応答”なる語句は、犠牲細胞近位
にＴ細胞リンパ球が入るときにそのＴ細胞リンパ球が防御を提供するように、リ
ンパ球により提供される免疫学的防御について述べることを意味する。細胞−仲
介免疫応答もまたリンパ球増殖をも含む。“リンパ球増殖”を測定すると、特低
抗原に対する応答におけるリンパ球増殖能が測定される。リンパ球増殖は、Ｂ細
胞、Ｔ−ヘルパー細胞またはＣＴＬ細胞増殖を述べることを意味する。

【００３９】 “ＣＴＬ応答”なる語句は、特異的抗原を発現する細胞を溶解し死滅させる、
抗原特異的細胞の能力を述べることを意味する。標準的な当分野で認識されるＣ
ＴＬアッセイを実施し、ＣＴＬ活性を測定する。

【００４０】長期にわたる特許実務に従い、“ａ”および“ａｎ”なる語句は、特許請求の
範囲を含む本出願で使用する際に“１つまたはそれ以上”を意味する。

【００４１】本発明により、アジュバントは、以下に限らないが、サイトカイン、ケモカイ
ン、増殖因子、脈管形成因子、アポトーシス阻害剤およびその組合せを含む群か
ら所望により選択され得る。サイトカインをアジュバントとして選択するとき、
サイトカインは、以下に限らないが、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ
−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むイ
ンターロイキン；形質転換増殖因子β(ＴＧＦβ)；顆粒性白血球マクロファージ
コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)；インターフェロン−ガンマ(ＩＦＮα)；また
はアジュバント活性を有する他のサイトカインを含む群から選択され得る。

【００４２】サイトカインの組合せは、以下の実施例に示すように、本発明の方法による使
用が含まれる。他に、特に含まれる実施態様には、本発明の方法による粘膜アジ
ュバントと組み合わせるＩＬ−１２およびＩＬ−１８の使用が含まれる。サイト
カインを組合せて使用するとき、含まれる用量範囲は、それぞれサイトカインご
とに、約０.３μｇ／mlから約５０μｇ／mlである。更に、含まれる用量範囲を
以下に記載する。

【００４３】サイトカイン部分、またはムテインまたはサイトカイン擬似体(またはそれら
の組合せ)は、アジュバント活性または他の生物学的活性を有し、また、本発明
の方法に使用し得る。

【００４４】ケモカインをアジュバントとして選択すると、ケモカインは、以下に限らない
が、ＬＡＲＣ、ＰＡＲＣ、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＳＬＣおよびＦＫＮを含む群から
所望により選ばれ得る。アポトーシス阻害剤をアジュバントとして選択すると、
当該アポトーシス阻害剤は、以下に限らないが、ｔｏｓｏ、カスパーゼ−８およ
びその組み合わせを含む群から所望により選ばれ得る。脈管形成因子は、塩基性
繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、ヒアルロナン
(ＨＡ)断片およびそれらの組み合わせを含む群から所望により選ばれ得る。実際
、プラス(＋)およびマイナス(−)脈管形成因子をアジュバントとして選択し得る
。

【００４５】実質的に非毒性、生物学的に活性な、本発明の粘膜アジュバントの他の例には
、ホルモン、増殖因子、またはその生物学的活性部分が含まれる。そのホルモン
、増殖因子、またはその生物学的活性部分は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ
、ネコ、ウマ、またはトリを源とし、例えば、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、プロラク
チン、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、顆粒性白血球コロニー刺激因子(ＧＣＳＦ)、
インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ−１)、ソマトトロピン(増殖ホルモン)またはイ
ンシュリン、レセプターが免疫システムの細胞において発現する任意の他のホル
モンまたは増殖因子であり得る。

【００４６】サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、脈管形成因子、アポトーシス阻害剤お
よびホルモンは、任意の適当な源から得られる。それらは、組換えＤＮＡ技術よ
り作成される。例えば、幾つかのヒトインターロイキンをコードする遺伝子をク
ローニングし、種々の宿主システムにおいて発現させ、大量の精製ヒトインター
ロイキンを産生し得る。更に、特定Ｔリンパ球系は、高レベルのインターロイキ
ンを産生し、それによりサイトカインの源を提供する。

【００４７】抗原−アジュバント組成物は、好ましくは、医薬的に許容される媒体で投与さ
れる。好ましい媒体は、生理食塩水であるが、蒸留水もまた媒体として使用し得
る。さらに、好ましくは、抗原−アジュバント組成物は、ミョウバンのような、
ミネラル性アジュバント、保存料または安定化剤を含まない。また好ましくは、
抗原−アジュバント組成物は結合していない。むしろ、抗原およびアジュバント
は単に溶解されており、および／または媒体中に懸濁されている。

【００４８】本発明によると、抗原は、実質的に非毒性、生物学的活性アジュバントと組合
せて、好ましくは週毎または二週間毎に、“防御”免疫応答を刺激すべく合計３
回免疫化するため粘膜内的に投与される。保護免疫応答は、細菌の毒性産生に対
する(破傷風トキソイド、コレラ毒素、E. coli不安定性毒素、ジフテリア毒素、
百日咳毒素)、およびワクチンが望まれる特定病原体または病原体群による産生
感染に対する免疫化生体の保護に十分な免疫応答である。

【００４９】他に記載されるように、抗原−アジュバント組成物は、１から３週間に渡る期
間の間、週に一度、または２から６週間に渡る期間の間、２週間に一度所望によ
り投与され得る。他に、抗原−アジュバント組成物は、第１週に一度投与され得
、次いで、抗原のみを、第１週後、１から２週間の期間に渡る期間、週に一度ブ
ースター免疫化として投与され得る。更に、抗原アジュバント組成物は、最初の
２週間に一度投与され、次いで、抗原のみを、最初の２週間後、２から４週間に
渡る期間、２週間に一度、ブースター免疫化として投与され得る。

【００５０】例えば、第一免疫化の間に抗原により共投与すると、ＩＬ−１αまたはＩＬ−
１βは粘膜アジュバントとして機能する。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βを粘膜ア
ジュバントとして用いると、抗原による２付加ブースター免疫化(two additiona
l booster immunization)は、望ましいレベルの免疫応答を有意に維持するのみ
である。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントは、脊椎対象の体重kgあたり
約１０から約１０００マクログラムの範囲の量で抗原−アジュバント組成物中に
望ましくは存在する。より好ましくは、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバン
トは、脊椎対象の体重kgあたり約５０から５００マイクログラムの範囲の量で抗
原−アジュバント組成物中に存在する。さらにより好ましくは、ＩＬ−１αまた
はＩＬ−１βアジュバントは、脊椎対象の体重kgあたり約６０から約２００マイ
クログラムの範囲の量で抗原−アジュバント組成物中に存在する。

【００５１】所望により、ＩＬ−１βは、組換えＩＬ−１βを含み得る。その場合、組換え
ＩＬ−１βは、脊椎対象の体重kgあたり約１から約１００ミリグラムまでの範囲
の量を所望により存在し得る。より好ましくは、組換えＩＬ−１βは、脊椎対象
の体重kgあたり約５から約５０ミリグラムまでの範囲の量の抗原−アジュバント
組成物中に存在し得る。より好ましくは、組換えＩＬ−１βは、脊椎対象の体重
kgあたり約１０から約２０ミリグラムまでの範囲の量の抗原−アジュバント組成
物中に存在し得る。

【００５２】本発明の方法に用いるアジュバントの量は、用いる抗原の同一性により変化す
る。種々の抗原に対する適応のための、上記アジュバント用量範囲の調節および
操作は、当業者の能力の範囲内である。本発明のアジュバント−抗原組成物、ま
たはワクチンは、未成熟および成熟恒温動物の両方を含む脊椎対象の処置の使用
を目的とする。典型的な恒温脊椎対象には哺乳類および鳥類が含まれる。哺乳類
は、最も好ましい対象を含むヒトと共に、好ましい対象である。事実、本発明に
より、粘膜部位の保護を必要とする感染に対するワクチンを、ヒトまたは他の恒
温対象動物に投与するように製剤化し得る。更に、本発明の使用は、予防薬的適
用に限らず、治療適用もまた含まれ(例えば、ＡＩＤＳ予防および治療)、同様に
免疫集中(immune focusing)により、増殖、生成または生殖を変化させる。

【００５３】特定型の免疫応答は、従来の方法と比べて本発明の方法により、より容易に産
生する。例えば、本発明による好ましい全身性免疫応答には、少なくとも約１：
１０,０００の力価の抗原−特異的ＩｇＧの産生を含み、少なくとも約１：２０,
０００より好ましい力価を伴う。当業者に明らかなように、少なくとも約１：１
０,０００の力価または少なくとも約１：２０,０００の力価は、例えば、１：１
０,０００希釈または１：２０,０００希釈のサンプルをそれぞれ調製後のＥＬＩ
ＳＡアッセイにおいて抗原−特異的抗体(またはＩｇ)の検出可能定量を維持する
ことを意味する。

【００５４】本発明の好ましい粘膜免疫応答には、アジュバントの投与部位から離れた部位
の脊椎対象における粘膜組織内のＩｇＡ産生が含まれる。実際、下記実施例に示
すように、本発明によるアジュバントの投与なくして、粘膜ＩｇＡ応答は、対象
において典型的には観察されない。更に、本発明の方法により投与された幾つか
の抗原の場合、抗原−特異的ＩｇＡは少なくとも約１：１００の力価で産生され
る。更に、本発明の方法により投与された他の抗原の場合、抗原−特異的ＩｇＡ
は少なくとも１：５００の力価で産生される。当業者に明らかなように、少なく
とも１：１００の力価または少なくとも約１：５００の力価は、例えば、１：１
００希釈または１：５００希釈のサンプルをそれぞれ調製後のＥＬＩＳＡアッセ
イにおいて抗原−特異的抗体(またはＩｇ)の検出可能定量を維持することを意味
する。

【００５５】特に、望ましい細胞仲介免疫応答は、リンパ球増殖を含む。より特に、望まし
いリンパ球増殖は、更に非免疫状態と比較するとリンパ球増殖は少なくとも約１
０倍となることが特徴である。また更に特に、リンパ球増殖は、更に非免疫状態
と比較するとリンパ球増殖は少なくとも約５０倍となることが特徴である。

【００５６】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、本発明の粘膜アジュバントの好ましい例であ
る。ＩＬ−１αおよびＩＬ−βは、種々の免疫応答のアジュバントとしての役割
をし、その応答には、脾臓から単離した細胞中の、抗原特異的血清ＩｇＧ、膣Ｉ
ｇＡ、全身性遅延型過敏性(ＤＴＨ)応答、およびリンパ球増殖応答が含まれる。
事実、以下の本データが示すのは、サイトカインは、リンパ球増殖および遅延型
過敏性(ＤＴＨ)により１)抗原特異的抗体(全身性ＩｇＧ、粘膜ＩｇＡ)および２)
細胞仲介免疫を促進するアジュバントとして作用することである。そのため、本
発明により、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを、免疫部位から離れた部位で検出さ
れる抗原特異的ＩｇＡを誘導する粘膜アジュバントとして使用する(アジュバン
トの非存在下で誘導されるＩｇＡ応答を１０倍以上促進する；アジュバントとし
てＣＴを用いて誘導するＩｇＡ応答を２から４倍以上促進する)。さらに特に、
哺乳類試験対象における鼻腔内免疫の後、抗原特異的ＩｇＡは、雌の生殖系の分
泌物において検出された。アナフィラキシーのような非毒性効果が、粘膜アジュ
バントとしてのＩＬ−１(αおよびβ)の使用で認められる。そのアジュバントは
、種々の病原体に対するワクチン仲介保護として有用である。より更に、そのア
ジュバントは、ＨＩＶのように宿主の粘膜表面を介して感染する病原体に対する
ワクチン仲介保護に有用である。

【００５７】本発明の抗原アジュバント組成物において使用し得る適当な抗原には、タンパ
ク質、ペプチド、ホルモンおよびグリコプロテインのような可溶性抗原が含まれ
る。特に目的の抗原は、ウイルス、菌類、寄生体または細菌性抗原、アレルゲン
、自己免疫関連抗原、または腫瘍付随抗原である。当該抗原は、天然の源から得
られるか、または組換えＤＮＡ技術または他の人工的手段により生成される。本
発明による使用で予想される特定の抗原は、下記実施例に記載する。

【００５８】目的の細菌性抗原の中には、ヒトおよび動物細菌性病原体に付随するものがあ
り、以下に限らないが、例えば、病型および非病型のHaemophilus influenzae、
Escherichia. coli、Neisseria meningitidis、Streptococcus pneumoniae、Str
eptococcus pyogenes、Branhamella catarrhalis、Vibrio cholerae、Corynebac
teria diphtheriae、Neisseria gonorrhoeae、Bordetella pertussis、Pseudomo
nas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae および Clos
tridium tetaniが含まれる。幾つかの特定細菌性抗原には、細菌性表面および外
膜タンパク質(Haemophilus influenzae、Neisseria meningitidis、Neisseria g
onorrhoeaeまたはBranhamella catarrhalis)および細菌性表面タンパク質(例え
ば、Streptococcus pyogenes由来のＭタンパク質)が含まれる。

【００５９】病原体ウイルス由来の膣抗原には、以下に限らないが、ＨＩＶ(ＩおよびII型)
、ヒトＴ細胞白血病ウイルス(Ｉ、IIおよびIII型)、ＲＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝
炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(Ｉおよ
びII型)、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエン
ザウイルス、ポリオウイルス、ロータウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス
、麻疹ウイルス、水痘ウイルス、Epstein Barrウイルス、アデノウイルス、パピ
ローマウイルスおよび黄熱ウイルスが含まれる。

【００６０】これら病原体ウイルスの幾つか特定ウイルス抗原には、Ｆタンパク質(Paradis
oらのＷＯ８９／０２９３５中に記載)ならびにＲＳＶのＮおよびＧタンパク質；
ＶＰ４(ＶＰ３として以前から知られている)；ロータウイルスのＶＰ６およびＶ
Ｐ７ポリペプチド；ＨＩＶのエンベロープグリコプロテイン；ならびにＢ型肝炎
およびヘルペスグリコプロテインＢおよびＤの表面および前表面(presurface)抗
原が含まれる。

【００６１】菌類から誘導される菌類性抗原には、以下に限らないが、Candida spp.(例え
ば、albicans)、Cryptococcus spp.(例えば、neoformas)、Blastomyces spp.(例
えば、dermatitidis)、Histoplasma spp.(例えば、capsulatum)、Coccidroides
spp.(例えば、immitis)、Paracoccidroides spp.(例えば、brasiliensis)および
Aspergillus ssp.が含まれる。寄生体抗原の例には、以下に限らないが、Plasmo
dium spp.、Eimeria spp.、Schistosoma spp.、Trypanosoma spp.、Babesia spp
.、Leishmania spp.、Cryptosporidia spp.、Toxoplasma spp.およびPneumocyst
is spp.が含まれる。

【００６２】また、目的は、慢性関節リウマチおよび紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患に付
随する種々の抗原である。

【００６３】他の適用はまた、細胞性モディファイアーの安定性または相互作用を刺激また
は阻害する免疫応答の顕在化を含み、相当するレセプターまたは結合成分をとも
なるホルモンが含まれる。この例では、免疫応答を用い、増殖、生殖、分化、お
よび能力すべてを阻害／促進し得る。

【００６４】上記考察からわかることは、抗原なる語句の使用は、決定因子の抗原全体また
はその１つの何れかを含むことを意味する。抗原の前述の一覧は、例示を目的と
するのみである。本発明の抗原アジュバント組成物に使用され得る更なる抗原は
、当業者により容易に確認される。更に、本発明の抗原アジュバント製剤は、一
定期間安定しており、重要なことに、ワクチン製剤の製造、出荷および保存を可
能とする。

【００６５】下記実施例は、本発明の好ましい形式を説明するために含まれる。下記実施例
の特定の態様は、本発明を十分に実施する本発明者により発見され、また予想さ
れた技術および方法について述べている。これら実施例は、本発明者の標準的な
研究室での実施における使用によって例示する。本発明の開示および当分野の一
般的技術レベルを考慮すると、当業者は、下記実施例は例示のみを目的とするも
のではなく、多くの変化、修飾および変更が本発明の精神および範囲から出発せ
ずとも行い得ることを認識するであろう。

【００６６】実施例実施例１粘膜アジュバントとしてのＩＬ−１αおよびＩＬ−１β 動物.雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬマウス、１６−１８グラムをFrederick
Cancer Research and Developmental Center, National Cancer Institute, Fr
ederick Marylandから購入した。動物をフィルタートップケージで飼育し、餌お
よび水を自由に与えた。マウスの使用および世話の全ての手続は、Duke Univers
ity's Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。

【００６７】免疫化.マウスを先の記載、J Immunol 157:462(1996); Porgador et al., J I
mmunol 158:834(1997); Staats et al., AIDS Researhc & Human Retrovisuses
13:945(1997)のように、鼻腔内的に免疫化した。簡単に、マウス(１グループ当
たり、３−４匹のマウス)に、示す濃度(表２)の卵白アルブミン(#A-5503 SIGMA,
St. Louis, MO)または破傷風毒素(Dr. John Eldridge, Myeth-LKederle Vaccin
es and Pediatricsから贈与された)、および総量１５μl(７.５μl／鼻孔)のア
ジュバントで、鼻腔内的に免疫化した。粘膜アジュバントコレラ毒素をList Bio
logical Laboratories, Inc. (Campbell, CA)から得た。組換えヒトＩＬ−１α
およびＩＬ−１βをNational Cancer Institute Biological Resources Branch,
Division of Cancer Treatment, FCRDC (Frederick, MD)から得た。抗原調製物
を滅菌蒸留水で適当な濃度に希釈し、７.５μlの抗原混合物を、マウスをイソフ
ラン麻酔(IsoFlo, USP: SOLVAY Animal Health, Inc., Mendota Heights, MN)し
ながら、各鼻孔に入れた。

【００６８】サンプル回収.マウスをイソフラン麻酔しながら、血液をヘパリン処理Natelso
n毛管(Baxter Healthcase Corporation, McGaw Park, IL)を使用して、レトロオ
ービタルプレキサスから回収した。膣洗液サンプルを、マウスをイソフランで麻
酔しながら、膣腔を１００μl滅菌ＰＢＳで洗浄することにより得た。この方法
は膣サンプルの約１０倍希釈をもたらす、Staats et al., J Immunol 157:462(1
996)。全てのサンプルを抗原特異的抗体に関してアッセイするまで−２０℃で貯
蔵した。

【００６９】ＥＬＩＳＡ.酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して、血清および膣洗液
中の抗原特異的抗体の存在を測定した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＥＬＩＳＡプレ
ートを卵白アルブミンまたは破傷風毒素５μg／mlでコートした以外、先の報告
、Staats et al., J Immunol 157:462(1996); Staats et al., AIDS Research &
Human Retroviruses 13:945(1997)のように行った。終点タイターは、最後のサ
ンプルの相互の希釈を示し、その光学密度は対応するそのままのサンプルの光学
密度よりも２倍高い。小膣洗浄サンプルサイズのため、膣ＩｇＧおよびＩｇＡ応
答は、全ＩｇＧおよびＩｇＡ濃度に基づいた標準化の代わりに、終点ＥＬＩＳＡ
タイターとして報告する、Staats et al., J Immunol 157:462(1996); Staats e
t al., AIDS Research & Human Retroviruses 13:945(1997)。

【００７０】細胞単離および増殖アッセイ.脾臓(ＳＰ)を無菌的に回収し、単一細胞懸濁液
を、脾臓を小片(〜５mm×５mm)に切断し、細胞を５ccシリンジプランジャーの滅
菌端を有する脾臓カプセルから発現させることにより作った。赤血球細胞をCAPP
EL(登録商標)Lymphocyte Separation Media(ICN Biomedical, Aurora, Ohio)で
の遠心により回収した。細胞を完全Ｔ細胞培地(RPMI1640、１０％ＦＢＳ、HEPES
、Pen/Strep、２−ＭＥ)中に２×１０^６細胞／mlに調節した。等量の細胞に、等
量の完全Ｔ細胞培地、または０.２μg／mlの適当な抗原(卵白アルブミンまたは
破傷風毒素)を含む培地を添加した。細胞(１００ml)を丸底９６ウェルマイクロ
タイタープレートにトリプリケートで添加し、３７℃、空気中１０％ＣＯ_２、湿
潤環境で５日間インキュベートした。回収の４−６時間前、０.５μCi[^３Ｈ]−
チミジン(NEN Research Products, Boston, MA)を各ウェルに添加した。細胞をP
HD(登録商標)サンプルハーベスター(Cambridge Technology Inc., Watertown, M
A)を使用してガラスフィルターに回収した。取りこみを、フィルターをSCINTIVE
RSE BD(登録商標)シンチレーション溶液(FISHER, Pittsburgh, PA)に置き、2000
CA TRI-CARB@D(登録商標)液体シンチレーションアナライザー(Packard, Downers
Grove, Illinois)で計数した。

【００７１】遅延型過敏(ＤＴＨ).ＤＴＨ応答の測定のために、耳腫脹アッセイを、先の記
載、Staats et al., J Immunol 157:462(1996); Staats et al., AIDS Research
& Human Retroviruses 13:945(1997)のように用いた。簡単に、右耳に１０μl
滅菌ＰＢＳ中２５μgの免疫化抗原を注射し、一方１０μl滅菌ＰＢＳを左耳にコ
ントロールとして注射した。耳腫脹を注射後２４−４８時間に、ダイアル厚さゲ
ージ(ミツトヨ, Japan, code #7326)で測定した。抗原特異的耳腫脹を、抗原注
射耳の腫脹からＰＢＳ注射耳の腫脹を引くことにより計算した。

【００７２】統計的分析.統計的有意を、ANOVA(登録商標)を使用して、Bonferroni(Dunn)T
検定、Sidak T検定およびSAS(登録商標)ソフトウェア(SAS Institute, Cary, No
rth Carolina)でのTukey's Studentized Range Testを使用した複数の手段と比
較して決定した。３つの試験のうち２つが有意差を示す場合、差異は有意と見な
した。使用した有意のレベルは０.０５であった。

【００７３】結果.ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、可溶性タンパク質抗原として鼻腔内投
与されたとき、血清抗原特異的ＩｇＧ応答を促進させる。ＩＬ−１αまたはＩＬ
−１βが粘膜アジュバント活性を有するかを測定するために、ＢＡＬＢ／ｃまた
はＣ５７ＢＬ／６マウスを抗原単独または、ＣＴ、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１β
(表２)存在下の抗原で鼻腔内的に免疫化した。実験１において、ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスを１００μgの卵白アルブミンで０、１４および２８日に、アジュバントの
不存在下、または全ての免疫化と共に、または１回目の免疫化と共にのみに投与
する(表２)１μgのＣＴ、４μｇＩＬ−１αまたは４μg ＩＬ−１β投与の存
在下、鼻腔内的に免疫化した。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方とも、全ての
免疫化(３回)または最初の免疫化のみ(１回)に卵白アルブミンと共に鼻腔内投与
したとき、粘膜アジュバントとして作用することができた。全３つの免疫化にお
いて共投与したとき、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＣＴグループの４２日血清
抗卵白アルブミンＩｇＧタイターは、各々１：２６２,１４４、１：１０４,０３
１および１：１３,００４であった(図１、＃１)。

【００７４】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはまた１回目の免疫化のみに投与したとき、アジ
ュバントとして有効である。このような投与は、各々１：２６,００８および１
：１３,００４の血清抗卵白アルブミンＩｇＧタイターをもたらす。抗卵白アル
ブミンＩｇＧタイターは、アジュバントなしまたは１回目の免疫化のみＣＴと投
与したマウスから集めた血清で１：１００より小さかった(図１、＃１)。

【００７５】より適切なワクチン抗原と共投与したとき、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−
１βが粘膜アジュバント活性を示すかを測定するために、Ｃ５７Ｂ３／６(実験
＃２)またはＢＡＬＢ／ｃ(実験＃３)マウスを鼻腔内的に５０μg破傷風毒素(Ｔ
Ｔ)単独で、またはアジュバントの存在下(表２)で、免疫化した。他の公開され
た粘膜免疫化プロトコール、Xu-Amano et al., Journal of Experimental Medic
ine, 178:1309(1993); Marinaro et al., J Immunol 155:4621(1995)に従うため
に、マウスを実験２番および３番に関して０、７および１４日に免疫化した(表
２)。

【００７６】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、５０μg ＴＴと共に０、７および１４日に
鼻腔内投与したとき、Ｃ５７ＢＬ／６(実験＃２)およびＢＡＬＢ／ｃ(実験＃３)
マウスの両方で有効な粘膜アジュバントであった(アジュバントなしコントロー
ルと比較してｐ＜０.０５)。全３回の免疫化(３回)で共投与したとき、ＩＬ−１
αおよびＩＬ−１βの２１日血清抗−ＴＴタイターは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで
各々１：１５５,８７２および１：２０８,０６４、ＢＡＬＢ／ｃマウスで各々１
：１６５,１４０および１：２０８,０６４であった(図１、＃２、＃３)。ＩＬ−
１αはまたＢＡＬＢ／ｃマウスにＴＴと０日のみに鼻腔内投与したときも有意な
アジュバント活性を示した(アジュバントなしコントロールと比較してｐ＜０.０
５)。同じ実験で、ＣＴ、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントグループの
間に統計的有意差はなかった。

【００７７】抗原特異的ＩｇＧサブクラス終点タイターを測定し、ＩＬ−１αおよびＩＬ−
１βにより誘導される抗原特異的ＩｇＧサブクラス応答と、ＣＴにより誘導され
るものを比較した。粘膜アジュバントとしてのＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの使
用と関連する抗原特異的ＩｇＧサブクラスプロフィールは、粘膜アジュバントと
してのＣＴの使用により誘導されるものと同等であった(表３)。

【００７８】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、粘膜アジュバントとして使用したとき、粘膜
ＩｇＡ応答を誘導する。膣洗液サンプルを、抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの存
在に関してモニターし、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βが、粘膜ワクチンアジュバ
ントとして使用したとき、抗原特異的ＩｇＡ応答の産生を促進できるかを測定し
た。全ての実験で、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは抗原特異的粘膜ＩｇＡおよび
ＩｇＧ応答産生の誘導をする能力に関して、ＣＴと同様に有効であった(図２)。
実験＃１において、アジュバントを全３回の免疫化で使用したとき、ＩＬ−１α
およびＩＬ−１βに関する４２日膣抗卵白アルブミンＩｇＡタイターは、各々１
：３２および１：１２８であり、ＣＴグループにおける検出不可能な抗卵白アル
ブミンＩｇＡと比較した(図２、＃１)。１回目の免疫化にのみ使用したときでさ
え、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、膣洗液サンプルで検出可能な抗卵白アルブ
ミンＩｇＡ応答を誘導した(図２、＃１)。実験＃２および＃３において、ＩＬ−
１αおよびＩＬ−１βの全３回の免疫化(３回)での使用は、ＣＴにより誘導され
るものの２−８倍高い抗原特異的膣ＩｇＡタイターを一貫して誘導した(図２、
＃２および＃３)。ＴＴと１回目の免疫化のみ投与したとき、ＩＬ−１α(実験＃
３)およびＩＬ−１β(実験＃２および＃３)は抗ＴＴ膣ＩｇＡ応答の産生を誘導
した。

【００７９】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、粘膜アジュバントとして使用したとき、細胞
介在免疫応答を誘導する。耳腫脹遅延型過敏(ＤＴＨ)応答を、可溶性抗原単独ま
たはＣＴ、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの存在下での鼻腔内免疫化後の、インビ
ボ細胞介在免疫応答のインビボのインディケーターとして使用した。全３回の免
疫化に関して卵白アルブミンと鼻腔内投与したとき(実験＃１)、ＩＬ−１αおよ
びＩＬ−１βは、他のグループにより誘導されたものより有意に大きいＤＴＨ耳
腫脹応答(各々１１４＋８.９、１０６＋７.６ＤＴＨ単位)を誘導した(ｐ＜０.０
５、図３)。続く実験において、ＩＬ−１α(３回、実験＃３)およびＩＬ−１β(
３回、実験＃２)は、アジュバントのフ存在下で誘導されるよりも有意に大きい(
ｐ＜０.０５)、そしてＣＴにより誘導されるのと同等なＤＴＨ耳腫脹応答を誘導
した。ＩＬ−１の１回目の免疫化のみの使用は、有意に上昇したＤＴＨ耳腫脹応
答を誘導しなかった。抗原誘導リンパ球増殖応答をまた抗原特異的、細胞介在免
疫応答のインディケーターとしてモニターした。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは
全ての３つの実験でＣＴにより誘導されるのと同等なリンパ球増殖応答を誘導し
た(図４)。

【００８０】考察.本実施例の結果は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βが、可溶性タンパク質
抗原と共に鼻腔内投与したとき、粘膜アジュバントとして働くことができること
を示す。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは抗原特異的血清ＩｇＧ、膣ＩｇＡ、なら
びにインビボおよびインビトロ細胞介在免疫応答の誘導に、ＣＴと同様に有効で
あった。多くの報告がＩＬ−１が抗原特異的免疫応答の誘導のアジュバントとし
て作用できることを示しているが(例えば、Lin et al., Clinical Infectious D
iseases 21:1439(1995); Hakim et al., Journal of Immunology 157:5503(1996
)参照)、本発明は、可溶性抗原と鼻腔内投与したときのＩＬ−１の粘膜アジュバ
ント活性の最初の証拠を提供する。

【００８１】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、マクロファージ、ＰＢＭＣ、線維芽細胞、お
よび腸上皮細胞系を含む多くの細胞タイプにより産生される炎症誘発性サイトカ
インである(例えば、Bromander et al., Journal of Immunology 146:2908(1991
); Bromander et al., Scandinavian Journal of Immunology 37:452(1993); Di
narello, C.A., Blood 87:2095(1996); Dinarello, C.A., Faseb J 8:1314(1994
); Dinarello, C.A., Chemical Immunology 51:1(1992); Krakauer, T., Cellul
ar Immunology 172:224(1996)参照)。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは同じ細胞表
面レセプター、タイプＩおよびタイプIIを利用するが、タイプＩＩＬ−１レセ
プターのみがレセプターのＩＬ−１とのライゲーションに応答したシグナルを伝
達する。(例えば、Dinarello C.A., Blood 87:2095(1996); O'Neill, L.A.J., B
iochimica et Biophysica Acta 1266:31(1995); Bankers-Fulbright et al., Li
fe Sciences 59:61(1996)参照)。ＩＬ−１はそれ自体ならびにＩＬ−２、ＩＬ−
３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＧＦ
−β３、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩ
Ｌ−２レセプターを含む多くの他のタンパク質の遺伝子発現を誘導する(例えば
、Dinarello, C.A., Blood 87:2095(1996); Krakauer, T., Cellular Immunolog
y 172:224(1996)参照)。

【００８２】サイトカインの産生を誘導する能力が免疫応答の誘導に関与するため、ワクチ
ンアジュバントとしてのＩＬ−１の可能性は明白である。しかし、ＩＬ−１はヒ
トで非常に研究されており、静脈内投与後、非常に毒性であることが判明してい
る。(例えば、Dinarello, C.A., Chemical Immunology 51:1(1992); Rinehart e
t al., Cancer Investigation 15:403(1997); Verschraegen et al., European
Journal of Cancer, 32A:1609(1996)参照)。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方
で、観察される主な副作用は熱、悪寒、低血圧および嘔吐であった。このような
実験で、ＩＬ−１は静脈内(Ｖ)経路により投与され、毎日４から１４日間投与さ
れた。

【００８３】際立った対比として、本発明の方法において毒性副作用(ラッフルドファー、
体重減少)は如何なる時も観察されなかった。更に、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１
βを局所的に投与し、週１回(実験＃２、＃３)または２週間間隔(実験＃１)で投
与したとき、有効なアジュバントであった。ある場合、ＩＬ−１は一連の免疫化
において１回目の免疫化のみ投与して、有効なアジュバントであった。粘膜状日
細胞のＩＬ−１刺激が、タイプＩＩＬ−１レセプターの発現をダウンレギュレ
ートするため、粘膜アジュバントとして使用するＩＬ−１の炎症性活性は最小化
される。(例えば、McGee et al., Cellular Immunology 168:276(1996)参照)。

【００８４】ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、それらが“自己”タンパク質であるため、Ｃ
Ｔよりも優れており、粘膜アジュバントとして関連した分子である。ＣＴは、毒
であることに加えて、強い粘膜アジュバントであり、実際それは非常に免疫原性
であるが、粘膜アジュバントとして繰り返し使用したとき、その効果が減少する
。実際に、ＣＴに対する先在する免疫性は、粘膜アジュバントとしてのその効果
を減少させる。(例えば、Lyce et al., Scand J Immunol 33:691(1991); Wu et
al., Vaccine 12:215(1994)参照)。アジュバント活性の存在下での減少した毒性
にかかわらず、変異ＣＴ分子はその免疫原性を維持し、それはまたヒトにおいて
粘膜アジュバントとして繰り返し使用することを妨げる。(例えば、Douce et al
., Infection & Immunity 65:2821(1997); Fontana et al. Infection & Immuni
ty 63:2356(1995); de Haan et al., Infection and Immunity 64:5413(1996)参
照)。

【００８５】ＣＴと対照的に、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは“自己”タンパク質であり、
したがって実質的に非免疫原性である。違う言い方で、ＩＬ−１αおよびＩＬ−
１βはＣＴおよび変異ＣＴアジュバントよりも実質的に低い免疫原である。種特
異的サイトカインをアジュバントとして使用するため、宿主はサイトカインを外
来物質として認識しない。したがって、宿主はサイトカインに対して免疫応答を
上昇させず、“先在”免疫性は問題にならない。したがって、サイトカインは“
抗サイトカイン”抗体がそのアジュバント活性を中和し、粘膜アジュバントとし
てのその効果を減少させるという懸念なしに繰り返し使用し得る。

【００８６】粘膜から伝染させたＨＩＶに対する保護免疫性の相関は知られていない。しか
し、ＨＩＶ特異的ＣＴＬおよび粘膜ＩｇＡの両方が重要であるように見える。(
例えば、Mazzoli et al., Nature Medicine 3:1250(1997); De Maria et al., H
Journal of Infectious Diseases 170:1296(1994)参照)。これまでヒトにおける
ＨＩＶ粘膜ワクチン実験は、安全で有効な粘膜ワクチンアジュバントの欠如のた
めに阻害されてきた。本発明の方法の使用を介して観察された結果は１)ＩＬ−
１αおよびＩＬ−１βが全身および粘膜免疫応答の誘導のために有効な粘膜アジ
ュバントである、および２)サイトカインは鼻腔内投与したとき、生物学的に活
性であることを示す。サイトカインの免疫アジュバントとしての使用は、したが
ってヒトにおける全身および粘膜免疫応答の誘導に有用である。

【００８７】

【表１】

【表２】

【００８８】

【表３】表２.ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの粘膜アジュバント活性を上昇させるための
免疫化プロトコール。グループ当たり、実験当たり、３−４匹のマウスであった
。免疫化に関する技術的詳細は、材料および方法参照。

【００８９】

【表４】表３.材料および方法ならびに表２に記載のような鼻腔内免疫化後の抗原特異的
血清ＩｇＧサブクラスプロフィール。実験＃１は３５日応答を示すが、実験＃２
および＃３の結果は２１日応答を示す。グループ当たり、実験当たり３−４匹の
マウスからの血性を貯蔵し、抗原特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまた
はＩｇＧ３終点タイターをアッセイした。

【００９０】

【表５】

【００９１】表４において、ＩｇＧおよびＩｇＡタイターは、抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセ
イにおいて陽性応答を提供するサンプル(各々血清または膣洗液)の最終希釈を示
す。リンパ球増殖応答は、インビトロで０.１μg／mlの免疫化抗原で刺激され、
５日培養した脾細胞の“カウント／分”で示す。

【００９２】各カテゴリー(血清ＩｇＧ、膣ＩｇＡ、または脾細胞増殖応答)に関して、アジ
ュバントなしを超える増加の倍率を、アジュバントの存在下で誘導された応答ア
ジュバントの不存在下で誘導された応答で割って計算した。ＣＴ陽性コントロー
ルを超える倍率を計算するために、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの存在により誘
導された応答を陽性コントロールとしてＣＴを使用したときに誘導される応答で
割った。

【００９３】表４において、マウスを、実験＃１では１、１４および２８日に１００μg卵
白アルブミンで、実験＃２および＃３では０、７および１４日に５０μg破傷風
毒素で免疫化した。ＣＴを陽性コントロール粘膜アジュバントとして使用し、各
免疫化(３回)に１μgの用量で投与した。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを４μgの
用量で粘膜アジュバントとして試験した。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βを１回目
の免疫化のみ(１回)または全３回の免疫化(３回)投与した。

【００９４】表４はＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方が、抗原特異的血清ＩｇＧ、膣Ｉｇ
Ａ、および脾細胞増殖応答の誘導を促進する能力により測定されるように(アジ
ュバント不存在下で誘導される応答と比較して)、可溶性タンパク質抗原と共に
鼻腔内に投与したとき、粘膜アジュバント活性を示す。ある場合、ＩＬ−１αお
よびＩＬ−１βは陽性コントロールアジュバントであるＣＴにより誘導されるよ
りも高く抗原特異的応答を誘導した。

【００９５】実施例２粘膜アジュバントとしての合成ＩＬ−１βペプチド組換えインターロイキン１βおよび合成ＩＬ−１βペプチド１６３−１７１は
、各々本発明の方法にしたがって粘膜アジュバント活性を有する。本実施例にお
いて、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをCharles River Laboratoriesから購入し、グルー
プ当たり３から４匹のマウスのグループに分けた。全てのマウスを、全量１５μ
Lの蒸留水中に希釈した１００μg卵白アルブミンで鼻腔内免疫化した(鼻孔当た
り７.５μL)。全５グループを使用して、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−
１βペプチドを、コレラ毒素のアジュバント活性と比較して試験した(表４)。マ
ウスを全３回、２週間間隔で３回免疫化した(０日、１４日および２８日)。血清
を３５日に回収し、抗卵白アルブミンＩｇＧの存在に関して、上記のようにＥＬ
ＩＳＡでアッセイした。ＤＴＨ応答を１０μLの滅菌ＰＢＳを左耳介に注射し、
３０μg卵白アルブミン含有１０μLＰＢＳを右耳に注射することにより４２日に
測定した。耳腫脹を２４時間後に測定した；抗原特異的ＤＴＨ応答を、卵白アル
ブミン(右)耳腫脹からＰＢＳ(左)耳腫脹を引くことにより計算した。耳腫脹単位
は１×１０^−４インチに対応する。

【００９６】

【表６】

【００９７】本実施例において、ＩＬ−１αおよびＩｌ−１βは、２００μg／kg(高用量)
および６７μg／kg(低用量)の投与量で抗原と鼻腔内投与したと、有効であった
。１６３−１７１ＩＬ−１βペプチドは１１.２５mg／kgの投与量で使用した
。

【００９８】実施例３粘膜アジュバントとしてのＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦの使用本発明の方法にしたがって、ＩＬ−１５またはＧＭ−ＣＳＦを１００μg C4-
V4 Roman IIIB HIVペプチドワクチン(Ｔ−ヘルパー、Ｖ−細胞およびＣＴＬエピ
トープを含む)と混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに０、７、１４および２１日に経
鼻的に投与した。コントロールマウスはペプチドのみ(陰性コントロール)または
ペプチドとコレラ毒素(陽性コントロール)を投与された。血清を２８日に採取し
、抗-C4-V3 IIIB IgGの存在に関して試験した。陰性コントロールグループの検
出不能血清ＩｇＧ応答、および陽性コントロールグループにおける１：４１,２
８５のタイターと比較して、ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦグループの両方の１
：１６,３８４の抗原特異的血清ＩｇＧ応答の検出により示されるように、ＩＬ
−１５およびＧＭ−ＣＳＦの両方が粘膜アジュバントとして作用した。

【００９９】ＩＬ−１５またはＧＭ−ＣＳＦが、ペプチドおよびＣＴでの鼻腔内免疫化によ
り誘導される免疫応答を促進するかを測定するために、マウスをペプチド、ＣＴ
およびＩＬ−１５；またはペプチド、ＣＴおよびＧＭ−ＣＳＦで免疫化した。Ｃ
ＴとＧＭ−ＣＳＦの組合わせはＧＭ−ＣＳＦ単独またはＣＴ単独を超えなかった
。しかし、ＣＴとＩＬ−１５の組合わせは、ＩＬ−１５により誘導されるより１
０倍良好な、およびペプチドとＣＴにより誘導されるより４倍高い血清抗ペプチ
ドＩｇＧタイターを誘導した。

【０１００】これらの結果は１)ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦは、鼻腔内的に送達された
とき、活性である、そして２)ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦは、ペプチドワク
チンと鼻腔内送達されたとき、粘膜アジュバント活性を示すことを示す。

【０１０１】免疫化スケジュール.ＢＡＬＢ／ｃマウスへの０、７、１４および２１日の、
単独または：ＣＴ(１μg) ＣＴおよびＩＬ−１５(各１μｇ) ＩＬ−１５(１μg) またはＧＭ−ＣＳＦ(１μg) ＣＴおよびＧＭ−ＣＳＦ(各１μｇ) との１００μg C4-V3 IIIB鼻腔内。

【０１０２】

【表７】

【０１０３】実施例４粘膜免疫化における実質的に非毒性な生物学的活性アジュバントの組合わせ上記のように、抗原特異的粘膜免疫化の誘導は、宿主の粘膜表面で感染を開始
する病原微生物のため、感染の予防に有利である。加えて、粘膜免疫応答は、粘
膜組織に転移する悪性腫瘍の処置に有利であり得る。粘膜免疫応答を誘導するた
めに、抗原を本発明の方法にしたがって粘膜経路を介して送達する。本実施例に
おいて、アジュバントとして選択された組み合わせにおけるサイトカイン／ケモ
カイン／成長因子／アポトーシス阻害因子の使用が、ワクチン抗原と共に鼻腔内
または他の粘膜経路(例えば、生殖器、直腸、または経口)を介して投与されたと
き、抗原特異的全身および粘膜免疫応答の誘導を促進すること関して記載する。

【０１０４】本発明により、ワクチン誘導免疫性は：１.免疫化の部位の血管形成の促進、およびしたがって免疫化部位への血流増加
。増加した血流は増加した数のリンパ球を免疫化の部位で産生し、これは、した
がってワクチン特異的免疫応答の誘導への関与に利用可能であり得る。２.樹状細胞および／またはリンパ球のサブセットの、免疫化部位への走化性の
促進。増加した数の局所樹状細胞は、したがって増加した抗原提示および免疫性
をもたらす。特異的リンパ球サブセットの免疫化部位での増加は、免疫化応答を
Ｔ−ヘルパータイプ１(Ｔｈ１)またはＴ−ヘルパータイプ２(Ｔｈ２)に向かって
歪める。これは、したがって、標的ワクチン対して１次抗体または細胞性免疫応
答が産生される機構の優れた候補である。３.抗原特異的リンパ球のアポトーシスの予防または阻害。これは増加した数の
ワクチン特異的リンパ球、ならびに、質的におよび量的に優れた免疫応答を導く
。４.上記の質と薬剤の合わせを、個々に使用する薬剤の効果の促進に使用し得る(
表７) である生物学的活性分子により促進される。

【０１０５】

【表８】本実施例に記載したアジュバント分子は、上記の投与範囲およびスケジュール
にしたがって投与する。

【０１０６】抗原因子：塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、およびヒアルロナ
ンフラグメント。Esser et al., J Cell Biol 140:947(1998); Arkonac et al.,
J Biol Chem 273:4400(1998); Qu et al., Int Arch Allergy Immunol 115:47(
1998)。

【０１０７】走化性因子：ＬＡＲＣ(Liver and Activation Regulated CHemokine)例えば、
Hieshima et al., Journal of Biological Chemistry 272:5846(1997)参照; Ｐ
ＡＲＣ(Pulmonary and Activation Regulated Chemokine)例えば、Hieshima et
al., Journal of Immunology 159:1140(1997)参照; ＭＤＣ(マクロファージ由来
ケモカイン)、例えば、Godiska et al., Journal of Experimental Medicine 18
5:1595(1997)参照; ＴＡＲＣ(Thymus and Activation Regulated Chemokine)例
えば、Imai et al., Journal of Biological Chemistry 271:21514(1996)参照;
ＳＬＣ(Secondary Lymphoid - Tissue Chemokine)例えば、Nagira et al., Jour
nal of Biological Chemistry 272:19518(1997)参照; フラクタルカイン(FNK)例
えば、Imai et al., Cell 91:521(1997)参照。

【０１０８】樹状細胞を免疫化の部位に誘引するケモカインは、アジュバント候補である。
ＬＡＲＣ(Liver and Activation Regulated CHemokine)により誘引される未成熟
ＣＣＲ６＋樹状細胞(ｉＤＣ)は、非常に食作用性であり、Ｔ細胞への後の提示の
ために十分抗原を取りこむ。ＧＭ−ＣＳＦおよび他のＴＮＦのようなサイトカイ
ンは、ＤＣ成熟を誘導し、ＤＣによる抗原提示を改善する。このように、ＬＡＲ
Ｃ単独、またはＧＭ−ＣＳＦまたは他のサイトカインとの組合わせは、優れたア
ジュバント候補物である。

【０１０９】ケモカインは、Ｔリンパ球のサブセットを免疫化の部位に誘引することにより
、免疫応答をＴｈ１vs.Ｔｈ２に歪める。樹状細胞により高度に発現され、ＣＣ
Ｒ４＋またはＣＣＲ８＋Ｔｈ２細胞を優勢に誘引するＭＤＣ(マクロファージ由
来ケモカイン)およびＴＡＲＣは、本応答を抗体産生に歪める。そのままのＴリ
ンパ球またはＣＤ８^＋Ｔリンパ球を誘引するＳＬＣ(Secondary Lymphoid Organ
Chemokaine)またはフラクタルカイン(ＦＫＮ)のようなサイトカインは、したが
って、ＣＴＬ応答を促進し得る。

【０１１０】アポトーシスの阻害：ｔｏｓｏ、カスパーゼ−８の阻害剤例えば、Hitoshi et
al, Immunity 8:461(1998)参照。

【０１１１】引用文献下記の引用文献ならびに明細書に引用した引用文献は、それらがその中で用い
ている方法、技術および／または組成物に関するバックグラウンドを補い、説明
し、提供する、または教示する程度に本明細書に引用して包含させる。 Annul Rev. Immunol. (1995) 13:251-276. Ari<onac et al. (1998) J Biol Chem 273:4400. Bankers-Fulbnght et al. (1996) Life Sciences 59:61. Boraschi et al. (1988) Journal of Experimental Medicine 168:675. Bromander et al. (1991 ) Journal of Immunology 146:2908. Bromander et al. (1993) Scandinavian Journal of Immunology 37:452. Cong et al. (1997) Journal of Immunology 159:5301. de Haan et al. (1996) Infection and Immunity 64:5413. De Maria et al. (1994) Journal of Infectious Diseases 170:1296. Di Tommaso et al. (1996) Infection & Immunity 64:974. Dinarello, C. A. (1992) Chemical Immunology 51:1. Dinarello, C. A. (1996) Blood 87:2095. Dinarello, C. A. (1994) Faseb J 8:1314. Douce et al. (1997) Infection & Immunity 65:2821. Eckmann et al. (1993) Gastroenterology 105:1689. Elson et al. (1984) J Immunol 132:2736. Elson et al. (1984) J Immunol 133:2892. Elson et al. (1987) Adv Exp Med Biol 216B:877. Elson et al. (1994) "Mucosal Adjuvants" In Handbook of Mucosal Immunolog
y. eds. Academic Press, Inc., San Diego, p. 391. Elson, C. O. (1996) "Cholera toxin as a mucosal adjuvant", In Mucosal Vaccines. eds. Academic Press, New York, p. 59. Esser et al. (1998) J Cell Biol 140:947. Fontana et al. (1995) Infection & Immunity 63:2356. Godiska et al. (1997) Journal of Experimental Medicine 185:1595. Hakim et al. (1996) Journal of Immunology 157:5503. Haynes et al. (1996) Science 271:324. Hieshima et al. (1997) Journal of Biological Chemistry 272:5846. Hieshima et al. (1997) Journal of Immunology 159:1 140. Hitoshi et al. (1998) Immunity 8:461. Hoyne et al. (1993) Journal of Experimental Medicine 178:1783. Husby et al. (1994) Journal of Immunology 152:4663. Imai et al. (1997) Cell 91:521. Imai et al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271 :21514. J. Immunol. (1996) 156:887-894. J. Immunol. (1998) 160:1742-1749. Janik et al. (1996) Journal of the National Cancer Institute 88:44. Kim et al. (1998) Journal of Immunology 160:1198. Krakauer, T. (1996) Cellular Immunology 172:224. Levine et al. (1983) Microbiological Reviews 47:510. Lin et al. (1995) Clincial Infectious Diseases 21:1439. Lindner et al. (1994) Scandanavian Journal of Immunology 40:564. Lofthouse et al. (1995) Vaccine 13:1277. Lycke et al. (1991 ) Scand J Immunol 33:691. Lycke et al. (1986) Immunology 59:301. Mannaro et al. (1995) J Immunol 155:4621. Mascarenhas et al. (1996) Immunological Investigations 25:333. Mazoli et al. (1997) Nature Medicine 3:1250. McGee et al. (1996) Cellular Immunology 168:276. McGee et al. (1993) Infection & Immunity 61:4637. McGee et al. (1995) Immunology 86:6. McGee et al. (1993) J Immunol 151:970. McGee et al. (1992) Immunology 77:7. Mowat, A. M. (1994) "Oral tolerance and regulation of immunity to dietar
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291.

【０１１２】本発明の種々の詳細を本発明の範囲から逸脱することなく変え得ることは、理
解されよう。さらに前記の記載は説明の目的のためのみであり、限定の目的はな
い − 本発明は特許請求の範囲により定義される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、表２に示すように鼻腔内免疫化後の血清抗原−特異的Ｉ
ｇＧ終点滴定(逆数)を示す棒グラフである。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；
＃３＝実験＃３である。実験＃１の結果は、４２日目の血清を示す。実験＃２お
よび＃３の結果は、２１日目の血清を示す。実験あたり、グループあたり３から
４(３−４)匹のマウスを用いた。ａ＝“なし”対照よりも有意に大きかった(ｐ
＜０.０５)。

【図２】図２は、表２に示すように鼻腔内免疫後の膣抗原−特異的ＩｇＡ
終点滴定(逆数)を示す棒グラフである。実験あたり、グループあたり３から４(
３−４)匹のマウスを用いた。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；＃３＝実験＃
３である。実験＃１の結果は、４２日目のサンプルを示し、その一方、実験＃２
および＃３の結果は、２３日目の膣洗浄サンプルを示す。黒の棒(solid bar)＝
ＩｇＡ；白の棒(open bar)＝ＩｇＧである。膣洗浄サンプルは各グループで保存
した。

【図３】図３は、表２に示すように鼻腔内免疫後の抗原−特異的ＤＴＨ耳
腫脹応答を示す棒グラフである。実験あたり、グループあたり３から４(３−４)
匹のマウスを用いた。＃１＝実験＃１；＃２＝実験＃２；＃３＝実験＃３である
。実験＃１、＃２および＃３の結果は、それぞれ、４３、４９および３５日目の
耳腫脹応答を示す。ａ＝“なし”対照よりも有意に大きかった(ｐ＜０.０５)。
ｂ＝なし、ＣＴ×３、ＣＴ×１、ＩＬ−１α×１およびＩＬ−β１×１グループ
よりも有意に大きかった。

【図４】図４は、表２に示すように免疫化動物由来の脾細胞における抗原
−特異的リンパ球増殖応答を示す棒グラフである。脾細胞は、実験＃２および＃
３用に５６日目に回収した。黒四角(solid box)は、培養培地中でのみ培養した
脾細胞の分あたりのカウントを示し、その一方、白四角(open box)は、破傷風ト
キソイド条件下で０.１μｇ／mlで培養した脾細胞の分あたりのカウントを示す
。３から４(３−４)匹のマウスの脾細胞をグループごとに保存した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ダバルクマー・ディ・ペイテルアメリカ合衆国27712ノースカロライナ州ダーラム、ディアチェイス・ワインド3012 番 (72)発明者グレゴリー・ディ・センポースキーアメリカ合衆国27703ノースカロライナ州ダーラム、アプリング・ウェイ3011番Ｆターム(参考） 4C085 AA38 BA10 BA12 BA13 BA14 BA16 BA17 BA19 BA20 BA21 BA53 BA55 BA56 BA57 BA63 BA69 BA71 BA75 BA77 BA79 BA83 BA88 BA89 BB03 BB06 BB07 DD22 EE01 FF24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脊椎動物体において抗原に対する免疫応答を誘発させる方法
であって、 (ａ)抗原、および粘膜組織において生物学的活性を有し、コレラ毒素より少ない
毒性と免疫原性を有するアジュバント分子を包含する抗原−アジュバント組成物
を提供し、そして (ｂ)該抗原−アジュバント組成物を、初期接触が脊椎動物体の粘膜組織中で起こ
るような方法で該脊椎動物体に投与することにより、免疫応答を誘発させる、段階を包含する方法。
【請求項２】該抗原−アジュバント組成物がさらに製薬的に許容される担
体を包含し、該抗原−アジュバント組成物がそれに担持されている、請求項１の
方法。
【請求項３】該製薬的に許容される担体が、蒸留水およびリン酸緩衝食塩
水からなる群から選ばれている、請求項２の方法。
【請求項４】該抗原−アジュバント組成物がミネラル・アジュバント、保
存剤または安定化剤を含まず、かつ抗原とアジュバントが互いに複合化していな
い、請求項１の方法。
【請求項５】該アジュバントがサイトカイン、ケモカイン、成長因子、血
管新生因子、アポトーシス阻害因子、ホルモンおよびそれらの組み合わせからな
る群から選ばれている、請求項１の方法。
【請求項６】該サイトカインがＩＬ、ＴＧＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα
およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれている、請求項５の方法。
【請求項７】該ＩＬがＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−５、Ｉｌ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびそれらの組み合
わせからなる群から選ばれている、請求項６の方法。
【請求項８】該ＩＬがＩＬ−１αまたはＩＬ−１βを含み、該ＩＬ−１α
またはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−アジュバント組成物中に、脊椎動物体
の体重１kg当たり約１０ないし約１０００マイクログラムの範囲で存在する、請
求項７の方法。
【請求項９】該ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−アジ
ュバント組成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約５０ないし約５００マイク
ログラムの範囲で存在する、請求項８の方法。
【請求項１０】該ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−ア
ジュバント組成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約６０ないし約２００マイ
クログラムの範囲で存在する、請求項９の方法。
【請求項１１】該ＩＬが組換えＩＬ−１βであり、抗原−アジュバント組
成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約１ないし約１００ミリグラムの範囲で
存在する、請求項７の方法。
【請求項１２】該組換えＩＬ−１βが、抗原−アジュバント組成物中に、
脊椎動物体の体重１kg当たり約５ないし約５０ミリグラムの範囲で存在する、請
求項１１の方法。
【請求項１３】該組換えＩＬ−１βが、抗原−アジュバント組成物中に、
脊椎動物体の体重１kg当たり約１０ないし約２０ミリグラムの範囲で存在する、
請求項１２の方法。
【請求項１４】該ケモカインがＬＡＲＣ、ＰＡＲＣ、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、
ＳＬＣ、ＦＫＮおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれている、請求項
５の方法。
【請求項１５】該アポトーシス阻害因子がｔｏｓｏ、カスパーゼ−８阻害
因子およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれている、請求項５の方法。
【請求項１６】該血管新生因子が塩基性繊維芽細胞成長因子、血管内皮細
胞成長因子、ヒアルロナン断片およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれ
ている、請求項５の方法。
【請求項１７】該投与の態様が鼻腔内投与、膣内投与および直腸内投与か
らなる群から選ばれている、請求項１の方法。
【請求項１８】該抗原−アジュバント組成物が、１ないし３週間の期間、
週１回投与される、請求項１の方法。
【請求項１９】該抗原−アジュバント組成物が、２ないし６週間の期間、
２週毎に１回投与される、請求項１の方法。
【請求項２０】該抗原−アジュバント組成物が最初の週に１回投与される
請求項１の方法であって、さらに抗原だけを最初の週に続く１ないし２週間の期
間、週１回投与する段階を含む方法。
【請求項２１】該抗原−アジュバント組成物が最初の２週間に１回投与さ
れる請求項１の方法であって、さらに抗原だけを最初の２週間に続く２ないし４
週間の期間、２週毎に１回投与する段階を含む方法。
【請求項２２】該免疫応答が全身的免疫応答である、請求項１の方法。
【請求項２３】該全身免疫応答が、少なくとも約１：１０,０００のタイ
ターでの抗原特異的ＩｇＧ群の生産を含むものである、請求項２２の方法。
【請求項２４】該全身免疫応答が、少なくとも約１：２０,０００のタイ
ターでの抗原特異的ＩｇＧ群の生産を含むものである、請求項２３の方法。
【請求項２５】該免疫応答が粘膜免疫応答である、請求項１の方法。
【請求項２６】該粘膜免疫応答が、投与部位から離れた脊椎動物体の部位
での粘膜組織中における抗原特異的ＩｇＡ群の生産を含むものである、請求項２
５の方法。
【請求項２７】該抗原特異的ＩｇＡ群が少なくとも約１：１００のタイタ
ーで生産される、請求項２６の方法。
【請求項２８】該抗原特異的ＩｇＡ群が少なくとも約１：５００のタイタ
ーで生産される、請求項２７の方法。
【請求項２９】該免疫応答が細胞介在免疫応答である、請求項１の方法。
【請求項３０】該細胞介在免疫応答がリンパ球の増殖を含むものである、
請求項２９の方法。
【請求項３１】該リンパ球の増殖が、非免疫状態に比してリンパ球が少な
くとも約１０倍に増えることでさらに特徴付けられる、請求項３０の方法。
【請求項３２】該リンパ球の増殖が、非免疫状態に比してリンパ球が少な
くとも約５０倍に増えることでさらに特徴付けられる、請求項３１の方法。
【請求項３３】該脊椎動物体が哺乳類である、請求項１の方法。
【請求項３４】該哺乳類がヒトである、請求項３３の方法。
【請求項３５】脊椎動物体において抗原に対する免疫応答を誘発させる方
法であって、 (ａ)抗原、および粘膜組織において生物学的活性を有するサイトカイン・アジュ
バント分子を包含する抗原−アジュバント組成物であって、該抗原−アジュバン
ト組成物はアルムを含まず、かつ抗原とアジュバントは互いに複合化していない
抗原−アジュバント組成物を提供し、そして (ｂ)該抗原−アジュバント組成物を、初期接触が脊椎動物体の粘膜組織中で起こ
るような方法で該脊椎動物体に投与することにより、免疫応答を誘発させる、段階を包含する方法。
【請求項３６】該抗原−アジュバント組成物がさらに製薬的に許容される
担体を包含し、該抗原−アジュバント組成物がそれに担持されている、請求項３
５の方法。
【請求項３７】該製薬的に許容される担体が、蒸留水およびリン酸緩衝食
塩水からなる群から選ばれている、請求項３６の方法。
【請求項３８】該サイトカインがＩＬ、ＴＧＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ
αおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれている、請求項３５の方法。
【請求項３９】該ＩＬがＩＬ−１,ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、
ＩＬ−５、Ｉｌ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびそれらの組み
合わせからなる群から選ばれている、請求項３８の方法。
【請求項４０】該ＩＬがＩＬ−１αまたはＩＬ−１βを含み、該ＩＬ−１
αまたはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−アジュバント組成物中に、脊椎動物
体の体重１kg当たり約１０ないし約１０００マイクログラムの範囲で存在する、
請求項３９の方法。
【請求項４１】該ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−ア
ジュバント組成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約５０ないし約５００マイ
クログラムの範囲で存在する、請求項４０の方法。
【請求項４２】該ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βアジュバントが、抗原−ア
ジュバント組成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約６０ないし約２００マイ
クログラムの範囲で存在する、請求項４１の方法。
【請求項４３】該ＩＬが組換えＩＬ−１βであり、抗原−アジュバント組
成物中に、脊椎動物体の体重１kg当たり約１ないし約１００ミリグラムの範囲で
存在する、請求項３９の方法。
【請求項４４】該組換えＩＬ−１βが、抗原−アジュバント組成物中に、
脊椎動物体の体重１kg当たり約５ないし約５０ミリグラムの範囲で存在する、請
求項４３の方法。
【請求項４５】該組換えＩＬ−１βが、抗原−アジュバント組成物中に、
脊椎動物体の体重１kg当たり約１０ないし約２０ミリグラムの範囲で存在する、
請求項４４の方法。
【請求項４６】該投与の態様が鼻腔内投与、膣内投与および直腸内投与か
らなる群から選ばれている、請求項３５の方法。
【請求項４７】該抗原−アジュバント組成物が、１ないし３週間の期間、
週１回投与される、請求項３５の方法。
【請求項４８】該抗原−アジュバント組成物が、２ないし６週間の期間、
２週毎に１回投与される、請求項３５の方法。
【請求項４９】該抗原−アジュバント組成物が最初の週に１回投与される
請求項３５の方法であって、さらに抗原だけを最初の週に続く１ないし２週間の
期間、週１回投与する段階を含む方法。
【請求項５０】該抗原−アジュバント組成物が最初の２週間に１回投与さ
れる請求項３５の方法であって、さらに抗原だけを最初の２週間に続く２ないし
４週間の期間、２週毎に１回投与する段階を含む方法。
【請求項５１】該免疫応答が全身的免疫応答である、請求項３５の方法。
【請求項５２】該全身免疫応答が、少なくとも約１：１０,０００のタイ
ターでの抗原特異的ＩｇＧ群の生産を含むものである、請求項５１の方法。
【請求項５３】該全身免疫応答が、少なくとも約１：２０,０００のタイ
ターでの抗原特異的ＩｇＧ群の生産を含むものである、請求項５１の方法。
【請求項５４】該免疫応答が粘膜免疫応答である、請求項３５の方法。
【請求項５５】該粘膜免疫応答が、投与部位から離れた脊椎動物体の部位
での粘膜組織中における抗原特異的ＩｇＡ群の生産を含むものである、請求項５
４の方法。
【請求項５６】該抗原特異的ＩｇＡ群が少なくとも約１：１００のタイタ
ーで生産される、請求項５５の方法。
【請求項５７】該抗原特異的ＩｇＡ群が少なくとも約１：５００のタイタ
ーで生産される、請求項５６の方法。
【請求項５８】該免疫応答が細胞介在免疫応答である、請求項３５の方法
。
【請求項５９】該細胞介在免疫応答がリンパ球の増殖を含むものである、
請求項３６の方法。
【請求項６０】該リンパ球の増殖が、非免疫状態に比してリンパ球が少な
くとも約１０倍に増えることでさらに特徴付けられる、請求項５９の方法
【請求項６１】該リンパ球の増殖が、非免疫状態に比してリンパ球が少な
くとも約５０倍に増えることでさらに特徴付けられる、請求項６０の方法。
【請求項６２】該脊椎動物体が哺乳類である、請求項３５の方法。
【請求項６３】該哺乳類がヒトである、請求項６２の方法。