JPH05503628A

JPH05503628A - 新規なワクチン

Info

Publication number: JPH05503628A
Application number: JP2515782A
Authority: JP
Inventors: ロッホ，シャミル; ロベット，イーブス
Original assignee: スミスクライン　ビーチヤム　バイオロジカルズ（エス　ア）
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-26
Publication date: 1993-06-17
Also published as: CA2069622A1; PT96022B; AU6736390A; AU644828B2; DE69028785T2; NZ236230A; DE69028785D1; EP0502016B1; ATE143692T1; PT96022A; IE904274A1; EP0502016A1; HK1004569A1; WO1991008294A1; KR920703098A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規なワクチン発明の分野本発明は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒ４ｕｓｓｉｓ）毒素の遺伝子修飾と、免疫防圓量のタンパク質から成るワクチンに関する。

発明の背景ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｊｅｌｌａ）属の細菌は気道の感染に関与する病原微生物である。

この真は、４つの種−百日咳菌、バラ百日咳菌（Ｂ、ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　、気管支敗血症菌（Ｂ、　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）およびボルデテラ・アビウム（Ｂ、ａｖｉｕｍ）を含んでいる。

ヒトに対し最も毒性の強い種は百日咳菌てあり、百日咳の病原菌である。

現在の慣用百日咳ワクチンは不活化した百日咳菌の全細胞を含んでいる。このような細胞は、５６°Ｃて３０分の処理および／またはホルムアルデヒドでの処理により不活化される。不活化にもかかわらず、かかる全細胞ワクチンは実質的１の毒性を保持している。

その結果、代わりの百日咳ワクチンか利用されていて、百日咳菌の弱毒株または毒素欠損株から製造されている。しかしながら、これらのワクチンは、毒性の強い株から製造したものより防御力かはるかに弱いことか証明されている。例えば、Ｗａｒｄｌａｗ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　９：８９−１００　（１９７６）を参照。

百日咳菌は多くの毒素（百日咳毒素、アデニル酸ツクラーゼ、皮膚壊死毒素、および気管細胞毒素）を産生し、気道のクリアランスｎ溝を破壊したり、または免疫応答を阻害するＣＦ、　Ｍｏｏｉ、　Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、　５４：４６５−４７４　（１９８８））。ヒスタミン感作、インツユリン分泌、リンパ球増加促進および免疫強化作用のようなｒｙ：範囲の種々の生物学的作用か百日咳毒素に起因すると考えられる（Ｊ、Ｍｕｎｏｚ、　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　Ｔｏｘｉｎ、　ｐ、　ｌ−１８，５ｅｋｕｒａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｅｄｓ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ■唐刀A　Ｎｅｗ　Ｙａｒｋ、１９８５）。さらに百日咳菌毒素をマウスに投与すると、その後の攻！ ’　（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対して防御することか示されている（Ｍｕｎｏｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ　［ｍｍｕｎ　３２°２４３−２５０　（１９８１））。そｎ故、百日咳毒素は百日咳ワクチン中の重要な成分てあり、数カ山で試験されて使用されている無細胞成分ワクチンに含まれている（Ｓａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ、　＋９８４−Ｉ：１２２　（１９８４’））。逆説的に言うと、免疫応答を誘発てきる百日咳毒素それ自体か現在のワクチンに付随する危険な副作用の原因であり得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ、　８２：８７３３　（１９８５ ’））ａ　こ黷轤■■ 険な作用は単なる潮紅から木矢的な神経損傷へ、そしていくつかの例では死に至ることかある。

百日咳毒素は５つの異なるサブユニットから成り、これらのサブユニｙ　ｌ□は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気ン水動に基ついてＳｌから３５と称する。サブユニットはそれぞれｌ：ｌ：＋１２：ｌのモル比で会合し、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｒ＋）を形成している。機能的には、百日咳毒素はアデノンンジホスフェート（ＡＤＰ）−リホンル化活性を有するＡプロトマー（またはＳ１サブユニツト）と標的細胞受容体結合活性を存するＢ−才リゴマ−（サブユニｙ　トｓ：ｌ”ｓ５から成る）に分けられる。従って、Ｂ−才リゴマ−は陣的細胞膜にＡプロトマーを接触させるのに不可欠である。

Ｌｏｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：　１２５８−６４　（１９８６）は、百日咳毒素のサブユニットか接近して連結しているノストロ〉によりコードされることを開示している。ＬＯｃＭ　らはさらに、百日咳菌毒素遺伝子のヌクレオチド配列と個々のサブユニットのアミノ酸配列を開示している。

Ｌｏｃｈｊ　ｅｉ　ａｌ、、Ｎ（Ｒ１４，３２５１−６１（１９８６）は、少なくともＳ４サブユニツトともう一つのサブユニット遺伝子の一部を含む、百日咳菌毒素遺伝子からの４．５　ｋｂ　ＤＮＡ断片のクローニングを明らかにしている。配列分析により、成熟Ｓ４サブユニットは前駆分子のタンパク質加水分解切断により誘導されることかわかった。

Ｎ１ｃｏｓｉａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　５５：９６３− ７　（１９８７）は、５つの百日咳菌毒素サブユニットのそれぞれの発現を、ＤＮＡポリメラーゼＭＳ２への融合体として開示している。これらのタンパク質に対して誘導された抗血清はｉｎ　ｖｌｖｏてもｉｎ　ｖｉｔｒ。

ても免疫防御性かないことか判明した。

Ｌｏｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　５５：２５４６−２５５３　（１９８７）は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）＋：よる百日咳毒素の８１と３２サブニニノトの発現を、β−ガラクトノダーゼの６アミノ酸残基どこれに続くポリリンカーによりコートされる５アミノ酸への融合体として開示している。

組換えＳ１サブユニツトは酵素活性を示すことか開示された。最後の４８アミノ゛酸残基、すなわちカルボキシル木端、を欠く末端切断ＹのＳ１サブユニットか開示された。

５ｃｌａｖｏ　ＳｐＡ、　ＥＰ−Ａ−２３２，２２９（１９８７年８月１２日公開）は、大腸菌によるサブユニｙ　ト５ｌ−３５を含む百日咳菌毒素遺伝子のクローニングと発現を開示している。

Ｂｅ１ｔｉｎｉ　ｅｘ　ａｌ、、　ＥＰ−Ａ−２８１，５３０（１９８８年９月７日公開）は、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｕｔ　ｉ　１ｉｓ）での成熟百日咳菌サブユニットの発現を開示している。

Ｂｕｒｒｉｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰ−へ−３０６，３１８（１９８９年３月８日公開）は、大腸菌ての個々の百日咳菌毒素サブユニットのサブクローニングと発現を報告している。Ｂｕｒｎｅｔｔｅらは、Ｓ４サブユニツトかノグナルベプチトのコート配列の除去により発現されるであろうと開示している。また、Ｂｕｒｎｅｔｔｅらはアミノ酸Ｖａ１７−　Ｐｒｏ”の間に修飾を含む大腸菌により発現されたＳｌサブユニット類縁体ら開示している。

Ｂｕｒｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４．８４５．０３６号は、ホロトキシン（すなわちサブユニット５ｌ−３５）の解離による野生型百日咳菌Ｂ〜オリゴマー（すなわちサブユニッｌ−３２−８５）の単離法を開示している。

５ａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰ−Ａ−２９６，７６５（１９８８年１２月２８日公開）は、突然変異百日咳毒素タンパク質を産生ずる百日咳菌変異株を開示している。この変異味は毒性の強い百日咳菌を既知の突然変異誘発物質であるニトロソグアニジンにさらすことによ、　ｐ、　＋２１−１４５．　Ｗｉｔｅｙ　＆　５ｏｎｓ、チチェスター、１９８８）は、百日咳毒素リシン残基の、例えばアシル化のような、いくつかの化学的修飾により、全ての生物学的活性か消失することを開示している。百日咳毒素のメチル化も同じくリシン残基を修飾するか、（ＤＰ−リホンル化活性には影響を与えず、Ｂ〜ルオリゴマ−（！！連したいくつかの生物学的活性、例えばマイトジェン作用、グルコース酸化の促進、白血球増加促進およびヒスタミン感作作用を減退または消失させる。さらにＵｉは、二量体ＤＩ　（すなわち百日咳毒素サブユニット５２−５４）やサブユニットＳ５ではなく、二量体Ｄ２　＜すなわち百日咳毒素サブユニット５３−８４）のメチル化により、Ｂ−才リゴマ−に関連したマイトジェン作用か消失することを開示している。しかしながら、Ｂ−すりゴマ−のとの特定の領域または特定のりンン残基かメチル化またはアノル化に関与しているかに関する開示または示唆は何らない。

Ｈａｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　５７１７６０− ６４　（１９８９）は、百日咳毒素二量体サブユニットＤＩ　（すなわちＳ２− Ｓ４．＞と０２（すなわち５３−３４）を用いたマウスの免疫感作を開示している。これらの二量体に対して誘導された抗血清は百日咳菌毒素を認識し、ｉｎ　ｖｉｊｒｏでその毒性作用を中和することかできた。

Ｃａｐｉａｕ　ｅｌ　ａｌ、、米国特許出願第０７／２２２．９９１号（ＥＰ− Ａ−０３５２２５０）　（１９８８年７月２２日出願）は、百日咳菌毒素Ｓ１サブユニツトのアミノ酸２６位（すなわちトリプトファン）での修飾を開示している。こめ残基は、化学的にまたは部位特異的突然変異誘発により修飾すると、実質的に３１サブユニットの酵素活性を失活させる的部位特異的突然変異誘発方法を提唱している。Ｂｅ１ｌｉｎｉ　らは、彼らの方法か長い欠失を必要とする場合に特に価値かあると開示している。大腸菌−枯草菌シャトルヘクター上に位置する百日咳菌Ｓ２サブユニットングナル配列のコード領域の欠失か例示されている。

Ｂｌａｃｋ　ｅｔ：　ａｌ、、　ＥＰ−Ａ−２７５，６８９（１９８８年７月２７日公開）およびＩｎｆｅｃｔ　［ｍｍｕｎ　５５：２４６５−７０　（１９８７）は、大腸菌ての８４サブユニツトの発現を開示している。さらに、１３１ａｃｋらは、Ｂａ１３１エキノヌクレアーゼで発生させた欠失またはカナマイシン耐性遺伝子の挿入を含む百日咳菌毒素遺伝子の突然変異を開示している。これらの突然変異はその後百日咳菌の染色体に対立遺伝子交換で導入された。

Ｋｌｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰ−Ａ−３２２，１１５（１９８９年６月２８日公開）は、百日咳菌毒素の置換突然変異を開示している。また、ＫｌｅｉｎらはＳ１サブユニツトの欠失突然変異を開示している。しかしなから、開示された欠失突然変異のうちただ１つの突妖変異Ｇｌｕ””のみか８１サブユニット抗体に対して弱く反応しただけてあった。

本発明の目的は、免疫原性であるか無毒性である修飾百日咳菌毒素またはそのサブユニットを含む改良型百日咳ワクチンを提供することである。

発明の要約本発明は、野生型百日咳毒素に対する抗体に特異的に反応するか、百日咳毒素標的細胞受容体結合を欠損しているタンパク質をコートする組換えＤＮＡ分子に関する。

関連する態様として、本発明は、調節領域に機能しうる状態で連結された本発明の組換えＤＮＡ分子を含む組換えプラスミドである。前記調節領域は、本発明組換えプラスミドて形質転換された宿主細胞中てのタンパク質コード配列の転写とその後の翻訳に必要な調節配列を含む。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子によりコードされ、野生型百日咳毒素に対する抗体に特異的に反応するか百日咳毒素標的細胞受容体結合を欠損している百日咳毒素タンパク質に関する。

もう一つの態様では、本発明は百日咳に対する防御を刺激するワクチンであり、かかるワクチンは本発明の組換えＤＮＡ分子によりコートされる、免疫防１Ｉｌｔで無毒性量のタンパク質を含む。ワクチンのためには、本発明タンパク質は宿主細胞または細胞培地から分離・精製されても、あるいは宿主細胞の外表面膜に結合されていてもよい。

本発明はさらに、本発明タンパク質の生産方法に関する。この方法は、適切な培地中で本発明の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞を増殖させるこ本発明は、百日咳菌毒素Ｂ−オリゴマーＤＮＡコード配列の自然界に存在するアミノ酸残基の１個またはそれ以とを修飾することにより、百日咳毒素の標的細胞受容体への結合を著しく減退させ、それにより防御免疫原性応答を誘発する能力は保持しつつ百日咳毒素の毒性を多大に減退させるという発見に基づいている。

百日咳毒素（ＰＴ）の生物学的作用の、全ててはないにしても、多くは、３つの必須の分子段階の結果である。最初の段階はＰＴかＢ−才リゴマ−（サブユニット５２−３５）を介し標的細胞膜上の受容体に結合することを含む。次に、Ｓ１サブユニツトか標的細胞の細胞質に移動しなければならない。最後に、内在化したＳｔサブユニットかＮＡＤ−１１４加水分解とＡＤＰ−リポノル化を含むその酵素活性を発現しなければならない。（Ｕｉ、　Ｍ、、ｉｎ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、　ｐ、１２１−１４T．　Ｗａｒｄｌａｗ　ａｎｄ　Ｐａｒ（ｏｎ、　ｅｄｓ、、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、チチェスター１９８８を参照されたい）。これらの３段階のどれを除外しても、前記毒素の生物学的活性か劇的に減退する。それ故、標的細胞受容体に結合できない修飾百日咳毒素は、百日咳毒素に関係した毒性作用か劇的に減退している。

ＰＴか宿主細胞に付着または結合するのに関与しているＢ−才リゴマ−はサブユニットＳ２−５５から成る。Ｂ−才リゴマ−はさらに２つの二量体ＤｌとＤ２に分けられ、サブユニットＳ５によって連結している。二量体ＤＩはサブユニットＳ２と８４から成り、二量体Ｄ２はサブユニットＳ３と８４から成る（Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２１：５５１６−２２　（１，９８２）を参照）。各二量体は異なる標的細胞受容体分子と特異的に相互作用する。例えば、ＤＩはハプトグロビンまたはフヱチュインのような糖タンパク質へのＰＴの結合に関係しているように想、われ（Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　８９゜ｐ、２４３−２４７．　Ｌｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　F、−ヨーク州コールド　スプリング　ハーバ−、１９８９）　、一方Ｄ２はチャイニーズハムスのと推定される。

（＋９８６））により開示されている・１０１　Ｃ（ＪｕＧＧＣＧＧＴ　ＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＧＣＣＧＧＴＣＡＴＣ５０１ＧＡＣＧＧＧＡＴＧＣＧＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　ＧＧＣＡＡＴＴＣにＣＣＭＡＣＣＯ〕ＡＧＭＣＡＧＧＣＴＧ５５１　ＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧ　ＣＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧ　ＡＣＴＴＣＧＣＣＧＧ１９５１　ＡＴＴＡＣＧＡＣＴＡ　ＴＧＡＧＧＡＣＧＣＡ　ＡＣＧＴＴＣＧ八ＧＡ　ＣへｒＡＣＧＣｃｃＴ　ＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣ２００１　ＴＣＣＡＴＣＴＧＣＡ　ＡＴＣＣＴにＧＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡｒＧＣＴＧＡＧＡＣＧＣＴＴ　ＣＣＣＣＡ（ＴＣＧＡ３１０１　ＧＣＡＡＣＣＣＧｅＧ　Ｃ（？ＩＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧ　ＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧ　ＣＣＧＡＡＴＴＧＣＡ：］：Ｉ５１　ＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴ　ＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＭＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＴ　ＡＴＴＣＧＴＣＡＣＧ３４０１　ＧＡＣＧＧＧＣＡＡＴ　ＣＧＧＴＣＡＴＣＧＧ　ＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＡＴＧ　ＡＡＧにｅＡｃＧＴＡここで　Ｓ１サブユニツトはヌクレオチド５０７−１３１０によりコードされ：成熟Ｓ１サブユニツトはヌクレオチド６０９〜１３１０によりコートされる。Ｓ２サブユニツトはヌクレオチド＋３５３−２０３０によりコードされ、成熟Ｓ２サブユニツトはヌクレオチド１４３４−２０３０によりコートされる。

Ｓ４サブユニットはヌクレオチド２０９０−２４８２によりコートされ：成熟Ｓ４サブユニットはヌクレオチド２１５３−２−１８２によりコードされる。

Ｓ５サブユニットはヌクレオチド２４９７−２８５６によりコートされ、成熟Ｓ５サブユニツトはヌクレオチド２５５７−２８５６によりコートされる。Ｓ３サブユニツトはヌクレオチド２９４２−３６２２によりコードされ、成熟Ｓ３サブユニツトは３０２６−３６２２によりコートされる。

Ｓ２と８３はアミノ酸配列では７０％相同で、ヌクレオチド配列では７５％相同であるらず、機能的に活性な百日咳毒素ではＳ２と８３は互いに置換できない（Ｔａｍｕｒａ　ｅｒａｌ、　、同上）。さらに、Ｓ２と８３サブユニットのそれぞれが１つの８４サブユニットに結合している。従って、Ｂ−才リゴマ−機能での役割は全く異なっているが、２つの二量体ＤＩとＤ２は互いに密接に関係しているに違いない。

百日咳毒素を化学的に修飾すると、その生物学的活性に影響を及はすことができる。例えば、アノル化により、四次構造か崩壊するために、百日咳毒素に関係するか、ＡＤＰ−リホノル化活性には影響を与えず、Ｂ−才リゴマ−に関係した活性を減退または消失させる（ｕｉ、Ｍ、、ｉｎ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ｐ、　１２＋−１４５，Ｗａｒｄｌａｗ　ａｎｄ　Ｐａｒｔｏｎ、　ｅｄｓ、、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、チチェスタ−１９８８を参照）。さらにＵｌは、二量体Ｄ１でもサブユニットｓ５てもない、二量体ｏ２の、ｌチル化により、Ｂ−オリゴマゴこ関係したマイトジェン活性が消失すると開示している。かくして、Ｕｌは、リノン残基が宿主細胞表面へのＤ２の付着（１）Ｉの付着ではない）に何らかの役割を果たす、と結論している。

百日咳毒素のヨウ素化により、血球凝集作用やＣＨＯ細胞クラスター化のようないくつかの生物学的活性か著しく減退することも示されている。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ　ｉｍｍｕｎ、　５５：ｌ２９４−９９　（１９８７）参照。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらは、フエチュインーアがロースの存在下で野生型百日咳毒素を放射性ヨウ素化し、なお生物学的活性を保持する方法も開示している。このような方法を使用して、全てのＰＴサブユニットをヨウ素化したことか報告された。しかしながら、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらは、観察された生物学的活性の減退の機構は不明であると報告している。

このように、本発明は、標的細胞受容体結合活性を欠損し、好ましくはｓ１サブユニ、・ト酵素活性も同様に欠いているが、抗−百日咳毒素抗体により認識される能力をなお保持しているタンパク質をコートする百日咳菌毒素ＤＮＡ配列を記載すｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　ニューヨーク州コール１〜スプリング　バーバー１９８９＞により記載されるハブトグロビンー結合を用いて、あるいはＢｒｅｎｎａｎら（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６３：４８９５−９９（１９８８））またはＢｕｒｎＳら（ｌｎｆｅｃｔ　［ｍｍｕｎ、　５５：２４　（１９８７））により記載されるＣ）１０細胞結合／細胞毒性分析を用いて検定できる。Ｓ１サブユニツト酵素活性は、Ｂｕｒｎｅｊｔｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４２ニア２　（１９８８））により記載されるＡＤＰ−リホノル化検定で測定することかできる。

本発明の組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子は、既知の手法を使用して、例えば遺伝子バンクから遺伝子を単離し、ｍＲＮＡ鋳型からまたはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（米国特許第４．８００．１５９号を参照）により相補ＤＮＡすなわちｃＤＮＡを作製することにより、とんな百日咳菌株からでもまたは臨床検体の単離物からでも誘導できる。また、このような組換えＤＮＡ分子は標準ＤＮＡ合成技術により合成でキル。さらに、各種の百日咳菌株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣＸ米国メリ米国メリーランドピロツクビル商業上の寄託機関から入手できる。

ここで使用する場合、″野生型百日咳毒素に対する抗体に特異的に反応するか、百日咳毒素標的細胞受容体結合を欠ｔｕシているタンパク質をコードするＤＮＡ配列″という表現は、実質的にＬｏｃｈｔら（Ｓｃ＋ｅｎｃｅ　２３２：１２５８−６４　（１９８６））により記載されるような全てのサブユニット（Ｓｌ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５）から成るタンパク質をコートするコート配列とその全ての突然変異または突然変異体のような、野生型百日咳毒素に対して標的細胞結合活性は減退しているか、抗−百日咳毒素抗体により認識される能力はなお保持しているタンパク質をコードするＤＮＡコート配列を意味する。８−才リゴマ−またはＳ２またはＳ３サブユニツ）・に適用される“突然変異″もしくは″ 突然変異体″という用語は、標的細胞受容体結合を欠損しているか、抗−百日咳毒素抗体により認識される能力をまだ保持しているタンパク質をコードする本発明組換えＤＮＡ分子のあらゆる誘導体を含む。このような突然変異は、アミノ酸およびその核酸コート配列の欠失、付加、置換または転位により、あるいはその化学的修飾により作りだすことかてきる。

本発明組換えＤＮＡ分子の好ましい実施態様は、制限するものではないか、サブユニットＳ２のＡｓ口１０５またはＴＹ「ＩＯ２またはＴＹ、＋０２−１０ｆｆおよび／またはサブユニットＳ３のしｙｓ　ｌ　６　またはＴＹ、Ｊ２またはｌ　ｙ　ｓ　Ｉ　３　またはＬＹ　Ｓ　Ｉ　ＯＳまたはＴｙｒｌｏ！またはＴｙ、８１４−P ０″のアミノ酸欠失、またはサブユニットＳ２の、４ｓｎ１６ｓのＡｓｐへの置換といった単一アミノ酸置換を含む組換えＤＮＡ分子を含む。

最も好ましい実施態様は、制限するものではないか、サブユニットＳ２のＡｓ口ｌ　ＯＳまたはＴＹｒｌ　０２またはＴｙ、ｌ０ｆ−■および／またはサブユニットＳ３の１ｙｓｌｆ１５またはＴＹ「１０２またはＴｙ、ＩＯ２−１２の欠失を含む。

ｓｉの突然変異（例えばＴｒｐ！ｌまたはｔ（ｉｓ！ｓまたはＳｅ　ｒ　ｊ　６または（，１ｕ１２１の欠失）か米国特許出願第０７／３８１．８８８号（ＥＰ −Ａ−０３５２２５０）（１９８９年７月１８日出願）に開示されていて、その全開示をここに参照により引用するものとする。他の８１サブユニットアミノ酸残基の突然変異（例えばＡｒｇ”、Ａ、ｇＩｆ　、Ｇｉｕ１２９のｆ！換）　Ｌ！Ｐｉｚｚａ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：４９７−５００　（＋９８９）およびεＰ−Ａ−０３９６９６４およびＥＰ−Ａ−０３０６３１８にも開示されている。これらの参考文献をここに参照により引用するものとする。

好ましくは、本発明のＤＮＡコート配列は、三次構造かできるかぎり天然または野生型のタンパク質に似ているタンパク質、すなわち抗−百日咳毒素抗体に認識され得るか、しかも標的細胞受容体結合活性は欠損しているタンパク質をコードする。

本発明の組換えＤＮＡ分子の他の実施態様は、全部ではなく一部のサブユニｙ）をコートする百日咳毒素コード配列を含む。具体例としては、限定するものではないか、ＤＩ（Ｓ２とＳ４．）　、　Ｄ２（ＳａとＳ４）　、５ｌ−３２−３４，５ｌ−５３−８４およびＢ−才リゴマ−（Ｓ２　、　Ｓａ、Ｓ４およびＳ５）か含まれる。

もう一つの実施態様では、本発明の組換えＤＮＡ分子はハイブリッドの形であり得、すなわち他のＰＴサブユニット、例えば［Ｓ２エピトープ］−［Ｓ３サブ二二、ｌ・］等、他の百日咳菌抗原、または池の非百日咳菌抗原からの１またはそれ以上のエピトープをもつ別の配列を含む融合ポリペプチドをコードするコート配列であり得る。これとは別に、本発明の組換えＤＮＡ分子は、アノユハン［・の場合のように免疫ヤ１１激特性をもつか、そうでなければ百日咳菌毒素サブユニットに対する免疫応答を増強するか、あるいは百日咳菌毒素サブユニットの発現、精製または処方［二有用である、担体ポリペプチドのＤＮＡコート配列に融合することかできる。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えば調節要素、１またはそれ以上の選択マーカー、および１′！製と維持機能をコートする配列のような追加のＩＩＩＮＡ配列を含むことかてきる。調節領域は典型的には、本発明コート配列から上流に存在するプロモーターを含み、これはＲＮＡポリメラーゼの結合とＲＮＡ転写の開始に機能する。言い換えれば、調節要素または領域は、本発明コート配列とｎ、能しつる状態で連結される。調節領域の選択は使用する宿主細胞に左右されることか、当分野で習熟した者には理解されるであろう。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡプラスミドに関する本発明のもう一つの態様は、本発明の組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換した宿主細胞である。この種の宿主細胞は適切な培地中で増殖でき、本発明コード配列を発現できる。かかる宿主細胞は、本発明の方法を用いて、すなわち本発明プラスミドで望ましい宿主細胞を形質転換することにより作られる。このような形質転換は通常の形質転換技術を利用して達成される。さらに、本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えば相同的組換えのような慣用技術により宿主細胞のゲノムに組み込むことかできる。本発明の最も好ましい宿主細胞は、大腸菌種とボルデテラ属に属するものを含む。適切であり得る他の宿主細胞は、限定するものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、例えばストレプトマイセス（ＳｔｒｅｐｔＯｍＹＣｅＳ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモ不う（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ、）のような他の細菌細胞を含む。それ故、本発明とその生産物はいかなる特定の宿主細胞にも限定されない。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子によりコートされるタンパク質に関する。好ましくは、このようなタンパク質は本発明の形質転換宿主細胞により生産されるか、慣用ペプチド合成技術で製造することもてきる。

本発明タンパク質は、好ましくは、野生型百日咳毒素と比へて、約５０％を越えないハプトグロビン結合またはＣＨＯ細胞毒性を存する。最も好ましくは、本発明タンパク質は、野生型百日咳毒素と比・＼て、どちらの分析活性も１０％以下で、さらに好ましくは５％以下である。

本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子によりコートされるタンパク質の生産方法にも関し、この方法は、本発明の形質転換宿主を適切な培地で培養し、生産されたタンパク質を単離することから成る。′適切な培地“とは、かかる宿主に本発明ツー１〜配列を回収可能量で発現させることかできる培地を意味する。使用するのに適した培地は宿主細胞に左右されることか当分野で習熟した者には理解されよう。斯く生産されたタンパク質は、宿主の培養リセイトから、あるいは適宜に宿主の培地から直接用離で考、このような単離は通常のタンパク質分離技術により実施される。例えば、Ｂｕｒｎｓ　ｅｊ、　ａ、１．、米国特許第４．８４５．０３６号を参照。

本発明の好ましい実施態様では、本発明タンパク質のコート配列を形質転換百日咳菌宿主細胞に発現させて、免疫原性であるか実質的に不活化されたタンパク質、すなわち標的細胞受容体結合を欠損し、さらに場合によりＡＤＰ−リポノルトランスフェラーセ活性をも欠損するか、依然として抗−百日咳毒素抗体により特異的に認識されるタンパク質を生産させる。このような系では、百日咳菌毒素をコうなスイサイドベクターは、大腸菌またはいくつかの他の適切な宿主内でスイサイドベクターを増殖させるのに十分な量の細菌ＤＮＡを含む。かかるヘクターは、毒素遺伝子を欠損している百日咳菌宿主と異種毒素遺伝子の間で組換えが起こるように、毒素サブユニットコート配列に隣接して十分量の百日咳菌ＤＮＡを含む。

毒素遺伝子を欠く百日咳菌宿主の使用か絶対に必要であるというわけてはないか、組換え前の宿主に毒素遺伝子か存在しなければ、対象の遺伝子を組込んだ組換え宿主のスクリーニングと単離か容易になることか当分野で習熟した者には理解されよう。その後、このような相同的組換えから生しる組換え百日咳菌を標準技法で選別する。例えば５ｔｉｂｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　５０：ｌ３３−１４０　（１９８６）を参照。

本発明はさらに百日咳に対する免疫を誘発てきるワクチンを含む。このようなワクチンは免疫防画量で無毒性量の本発明タンパク質を含み、一般的にはｌ−５００μｇ、好ましくは５−２５μｇの本発明タンパク質を含むか、これらの量の使用に限定されない。

本発明の別の実施態様は、百日咳に対する防御を刺激する全細胞ワクチンを含む。このようなワクチンは本発明の形質転換宿主細胞の表面に発現される本発明タンパク質を含む。形質転換宿主細胞は免疫防御性で無毒性のワクチンを製造するために慣用技術により不活化される。

百日咳毒素と共に投与するのか望ましいとされる池の抗原を本発明ワクチンに含めてもよい。このような追加成分は当分野で習熟した者によく知られている。

好ましい追加成分は１ｉｆｆ傷風トキソイドおよび／またはノフテリアトキノイ］・並びに繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）　、凝集原２と３．６９　ｋＤ抗原、および／または百日咳菌の池の防御抗原を含む。

このようなワクチンの供給は、本発明のもう一つの態様、すなわち本発明ワクチンをヒトに投与することから成る百日咳に対してヒトを免疫化する方法を可能にする。

本発明ワクチンの投与方法は、免疫防御量の本発明タンパク質を宿主に伝達するいずれの適切な経路であってもよい。しかしなから、ワクチンは筋肉内または皮下経路で非経口的に投与するのか好ましい。所望により、経口投与または他の非経口経路すなわち皮肉、鼻内、静脈内のような投与方法も採用できる。

本発明ワクチンは、免疫防御性、無毒性および無菌の製剤学的に許容しうる担体を含む医薬組成物として製造できる。本発明ワクチンとしては本発明タンパク質の水溶液を直接使用できる。これとは別に、本発明タンパク質は、前凍結乾燥のあるなしに係わらず、種々の既知アジュバントと混合することかできる。ワクチンの投与か非経口的である場合は、本発明タンパク質を慣用アジュバントと混合するかまたはそれに吸着させて、免疫応答を増強することかできる。この種のアジュバントとしては、特に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ムラミルンベブチドおよびギルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）のようなサポニン類かある。本発明ワクチンの別の製造法としては、本発明タンパク質をリポソームのようなミクロ粒子内にカプセル化することかできる。さらに本発明ワクチンのもう一つの別の製造法では、本発明タンパク質を、例えば破傷風トキソイドのような免疫刺激巨大分子と共に投与することかできる。また、本発明タンパク質を含む水性懸濁液または溶液は生理学的ｐｌに緩衝化することか好ましい。本発明タンパク質を経口摂取用にｅｔ　ａｌ、、　（ｅｄｓ、）、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、メリーラント州バルチモア、　１９７８年に記載されている。リポソーム内のカプセル化はＦｕｌ　１ｅｒｔｏｎの米国特許第４．２３５．８Ｕ号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の複合は、例えばいｋｈｉｔｅの米国特許第４．３７２．９４５号とＡｒｍｏｒらの米国特許第４．４７４．７５７号に開示されている。

キルＡの使用はＤａ、ｌｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｃｔａ　Ｖｅｔ　５ｃａｎｄ　１８：３４９　（１９７７＞に開示され本発明のワクチンは、薬学的製剤の場合は、単位剤形であることが好ましい。

適切な予防効果量は当分野で習熟した者なら容易に定められるであろう。本発明ワクチンＩこ含まれるタンパク質の有効量は、慣用の百日咳菌無ｍ体または成分ワクチン中の抗原の有効量の範囲内、すなわち単位用量あたり５−２５μｇであり得る。この用量は、場合により、種々の量の繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（用量あたり約１（１−２５μｇ）および／または凝集原または他の抗原と共に投与できる。しかしなから、特定の患者のための特定の用量レベルは年齢、一般的健康状態、投与期間、投与経路、投与された池の薬削との相乗作用、要求される防ｉＩＩ程度なとの、種々の要因に左右されることか理解されよう。必要ならば、投与は適切な間隔て繰り返すことかできる。

以下の実施例は、本発明を説明するものであって、制限するものではない。制限酵素と他の試薬は実質的に販売元の指示に従って使用した。

実施例部位特異的突然変異誘発による百日咳ｔｉサブユニｙトの修飾実施例Ｉ　Ｓ２の突然変異誘発百Ｉ」咳毒素遺伝子の完全ヌクレオチド配列をコートするプラスミドｐＰＴＸ４２　（Ｌｏｃｈｔ　ｅｌ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２：１２５８−６４　（１９８６戸を、制限酵素ＸｂａｌとＸｍａ　Ｉて消化した。７５０塩基対（ｂｐ）断片を単離し、先にＸｂａ、　ＩとＸｍａ　Ｉて消化したＭ１３ｍｐ１９に連結させた。−末鎖または二本鎖産物として存在できるベクターＩＪＩ３ｍ１９は、部位特異的突然変異誘発に適する標準サブクローニングベクターであり、容易に人手てきる。Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　別刀二肋Ｚｙｍｏ１．１０１：２０−７８　（１９８３）を参照。得られたベクター（φＲ［Ｔ２Ｏ２００と称する）は、百日咳毒素の８２サブユニツトと５’　＋　３’非翻訳ＤＮＡをコートする。その後、二のベクターを後続の突然変異誘発実験に使用した部位特異的突然変異誘発は、。′オリゴヌクレオチド特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発系Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）に従って実施した。

突然変異誘発領域に特異的な合成オリゴマーを、−末鎖形態のφＲＩＴ２０２００にアニール化した。次いて、このアニール化オリゴマーをプライマーとして使って、合成オリゴマー領域に作られた特異的変化以外はφＲＩＴ２０２００に相補的なベクターを複製した。かくして、当業者は残りの核醜配列に影１を及はさずに、ベクターに特異的変化を速やかに誘導することかできる。アミノ酸１０２（チロノン）すなわちサブユニットＳ２のＴｙｒ１ｏ２を欠失するために、以下の合成オリゴヌクレオチドブライマー５’　ＣＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧＴＴ　３’を使用した。この得られたベクター（アミノ酸＋０２すなわちＴｙｒのコドンを欠く）はφＲＩＴ２０２０１と名つけた。その後、これは後続の突然変異誘発実験に使用したφＲＩＴ２０２０＋からチロノン１０３　（Ｔｙｒ””）を欠失するために、以下の突然変異誘発プライマー５’　ＴＧＡＣＧＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＧＴＴ　３’を使用した。１辱られたフｙ−ノ（Ｔｙｒｌｏ”とＴｙｒｌｏ２のコドンを欠く）をφＲＩＴ２０２０２と名づけだ。正しい突然変異か生し、Ｓ２サブユニツト遺伝子に望まない突然変異か導入されていないことを確かめるために、両方の突然変異ベクターの８２サブユニツトの配列解析を行った。次いて、二本鎖複製型ファージφＲＩＴ２０２０１とφＲＩＴ２０２０２をＸｂａｌとＸｍａ　ｌで消化し、Ｓ２突然変異をコートする７５０１）ｐ断片をプラスミドｐＩ？ｌＴｌ３０７０の、Ｘｂａｌ　とＸｎ＋ａ　１部位に挿入した。プラスミドｐＲＩＴ］３０７０　（Ｃａｐｉａｕｅｔ　ａｌ、、米国特許出願第０７／２２＝、９９１号（ＥＰ−Ａ−０３５２２５０）（１９８８年７月２２日出願）は、一般的なりローニングベクターであるｐＵｃ７　（Ｖｉｅｉｒａ　ｅｌ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、＋９：２５９−６８　（＋９８２））のＥｃｏＲ１部位に挿入した完全百日咳毒素構造遺伝子を含む組換えプラスミドである。

完全百日咳毒素構造遺伝子に挿入したＳ２突然変異ＴｙｒＩＦ！とＴｙｒｌｏ２ −ＩＯ２を含む組換えプラスミドをそれぞれＩ）Ｒ［Ｔｌ３２４１およびｐｌ’ ？ｌＴ１３２４２と名づけだ。これらのプラスミドの配列を再度解析して、その１１飾ヌクレオチド配列を確かめた。

Ｓ２サブユニットコトンアスパラギン１０５　（Ａｓｎ”’）を欠失するために、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を使用した（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４　（１９８５） ’）：　ＰＣＲ系は市販されているＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　（カルフォルニア州エメリービル）である。

Ａｓ口ｌ　ＯＳの突然変異誘発を以下の通りに実施した：ａ）プラスミドｐＲ（Ｔ１３０７０を最初に変性させ、次いて変性プラスミドの一本鎖に相補的な２つの合成オリゴヌクレオチドをアニール化した。第１のオリゴヌクレオチド（１）　５’　ＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧ　３’は突然変異を誘発すべき部位の５′側のＸｂａ　Ｉ制限部位をコードし、第２のオリゴヌクレオチド（Ｉｔ）　５’　ＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧ　３’は突然変異を誘発すべき部位にかかっている。その後、２つのアニール化オリゴヌクレオリド間のＤＮＡをＰＣＲて増幅する。

ｂ）第２工程で、工程（ａ）の反対のＤＮＡ　ｉｌＩに相補的な２つの別のオリゴヌクレオチドを、変性プラスミドＩＩＲＩＴ１３０７０にアニール化した。１つのオリゴヌクレオチド（ｌｌｉ）　５’　ＴＧＴＴ：ＣＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＧ　３ ’は突然変異を誘発すべき部位の３′側のＸｍａｌ制限部位をコードし、もう１つのオリゴヌクレオチド（ｍ　５’　ＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧ　３’は突然変異を誘発すべき部位にかかっており、１４ヌクレオチドの広がりかオリゴヌクレオチＦ（［１）と相補的である（すなわち塩基対を形成てきる）、アニール化すりゴヌクレオチド（［ｌＤ　と（１ｖ）の間のＤＮＡをＰＣＲて増幅した。最後に、２つの増幅ＤＮＡ断片を互いにアニール化し、ＸｂａｌとＸｍａ１部位間の突然変異誘発ＤＮＡ断片の増幅をＰＣＲで実施した。この増幅ＤＮＡ断片を制限酵素Ｘｂａ　ＩとＸｍａ　［て消化してから、未突然変異誘発ｐＲＩＴ１３０７０のＸｂａ　ｌとＸｍａ！部位に挿入した。

Ｓ２サブユニツトコドンアスパラギン（Ａｓｎ１６５）をアスパラギン酸（Ａｓ ρ）で置換するために、ＰＣＲ系を使用した。手法は、異なるオリゴヌクレオチド配列を使用すること以外は、上記のＡ　Ｓ　ｎ　＋　ｏ　Ｉの欠失と同様である。オリゴマー（Ｉｔ）と（ＩＶ’）は、それぞれオリゴ７−（ＩＩＳ）と（ＩＶｓ）（［［ｓ）　５’　ＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧ　３　’（ＴＶｓ）　５’　ＣＡＧＣ，ＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧ　３　’と置き換える。

形質転換後、組換え突然変異体プラスミドをＤＮＡ配列解析で分析し、その修飾ヌクレオチド配列を確かめた。

実施例２　Ｓ３の突然変異誘発制限酵素Ｐｓｔ［てのｐＰＴＺ４２　（Ｌｏｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、同上）の消化により、とりわけ、百日咳毒素の８３サブユニツトのコード領域を含む９６０　ｈｐ断片を得た。この断片を単離し、Ｍ１３ｍｐ９　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔａｔ、同上）のＰｓｔ１部位に連結した。φＲＩＴ２０３００と名つけた組換えファージを次いて以下の８３サブユニツト突然変異の誘発実験（上記のＡｍｅｒｓｈａｍ系）に使用した欠失　すリゴヌクレオチド配列　（５’　−３”ＩＬｙｓ　”　ＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＧＴｙｒ１２ＧＣＣＣＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＧＬｙｓ　”　ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＣＴｙｒ１０２　ＣＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴｙｒ’　”　ＴＧＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＬｙｓ　”　５ＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧ突然変異誘発後、部位特異的突然変異体の配列を決定し、正しい突然変異か導入されたことを確認した。ファージＤＮＡの二本Ｖ１復製型を川離し、Ｂｇｌ［Ｉ　とＭＩｕ［て消化した。次いて、種々の３３突然変異を含む６９０　ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離した。

プラスミドｐＲＩＴ１３ｏ７０　（上記）からの２．７　ｋｂｐ　Ｘｍａ！−ＥｃｏＲＩ挿入物は、標準の市販されているクローニングベクター１）ＵＣ９にクローン化した。この新しく作製したプラスミドをｐＰＴ３と名づけ、その後Ｂｇｌｌｌと！Ｊｌｕｌで消化した。このＢｇｌｉｌ−１Ｊｌｕ１部位に、先の種々の８３突然変異を含む６９０　ｂｐ　Ｂｇｌ［［−Ｍｌｕｌ断片を連結した種々の８３突然変異をコートするこれらの組換えプラスミドはＢａｍＨＩとＢｇＩ［［て順に消化した。長さ１７５０　ｂｐの断片を単離し、ｐＲ［Ｔｌ３０７０のＢａｍ［−Ｂｇｌ　［［部位に連結した。種々の単−Ｓ２およびＳ３突然変異を下の表１　（突然変異＃１−９）に総括するｐＰＴＸ４２　（Ｌｏｃｈｔ　ｅｔ　ａ、１．同上）を制限酵素５ａｕ３Ａで消化して、とりわけＳｌ百日咳毒素サブユニットのコート領域の殆とを含むか、カルボキシル末端コート領域を欠いている５６０　ｂｐ断片を生成させた。この断片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１８　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔａｌ、同上）のＢａｍＨ１部位に連結した。φＲＩＴ２０００１と名つけた組換えファージは、上記のＡｍｅｒｓｈａｍ″オリゴヌクレオチド−特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発系″ての突然変異誘発実験に使用した。

アミ入酸２６（トリプトファン）すなわちサブユニットＳ１のＴｒ　ｐ　２１を欠失するために、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマー５’　ＣＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＡＴ　３’を使用した。突然変異誘発後、部位特異的突然変異体の配列を決定し、正しい突然変異か導入されたことを確認した。ファージＤＮＡの二本ｊＪ！複製型を単離し、Ａｃｃｌで消化した。Ｓｔに突然変異を含む３００　ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離し、ｐＲＩＴ１３０７０　（同上）のＡｃｃ１部位に連結した。

同様の手法を用いて、９位（Ａｒｇ）、１３位（Ａｒｇ）、３５位（Ｈｉ　ｓ）、４０位（Ｓｅｔ）およζ１２９位（Ｇｌｕ）にサブユニットＳ＋の単一アミノ酸欠失または置換を導入した。Ｓ１サブユニツトの単一突然変異を下の表１　（突然変異ａｌｌ−２２）に示す。

実施例４　突然変異の組み合わせ実施例１からのｐＲＩＴ１３０７０由来プラスミド（すなわちＳ２突然変異体）をＸｂａ　１とＸｍａ　［て消化し、Ｓ２突然変異をコードする７５０１）ｐ断片を得る。Ｘｂａｌ−Ｘｍａｌ断片を、実施例３のｐＲＩＴ１３０７０由来プラスミド（すなわちＳＩ突然変異体）からのＸｂａｌ−Ｘｍａｌ断片と置き換え、サブユニットＳ１と３２に突然変異、例えばＴｒｐ”（Ｓｔ）−Ａｓｎ’”（Ｓ２）、を有する組換えＤＮＡ分子を得る。同様の方法で、実施例２のＩ］ＲＩＴ１３０７０由来プラスミド（すなわちＳ３突然変異体）をＢｇｌｌ［とＢａｍＨＴて消化てきる。次いで、単離したＤＮＡ断片（約１７５０　ｂｐ）を実施例３のｐＲＩＴＩ３０７０由来プラスミド（すなわちＳ１突然変異体）からのＢｇｌｌ（−ＢａｍＨＴ断片と置き換え、サブユニットＳ１と８３に突然変異、例えばＴｒｐ”（Ｓｌ）−Ｔｙｒ”””（Ｓ３）　、をつくる。かくして、当分野で習熟した者はこの開示に基づき、Ｓｌ、５ｌ−３２，５ｌ−３３、Ｓ２−３３あるいは５ｌ−３２−８３突然変異の別の組み合わせをつくることかできる。種々の突然変異の組み合わせを下の表１　（突然変異＃１０と２３−３１）に示す。

実施例５　百日咳菌宿主の毒素遺伝子の欠失■またはそれ以上の上記突然変異をコードする百日咳毒素遺伝子を発現させるために、宿主細胞から野生型百日咳菌毒素遺伝子を最初に欠失させることか望ましい。それにより、プラスミドによりコードされる毒素遺伝子は、細菌染色体上にコートされた毒素遺伝子との組換えを起こさないだろう。それ故、百日咳菌ＴＯｈａｍａ　［ワクチン株の百日咳毒素コート配列を以下の方法で欠失させたストレプトマイノン４００μｇ／ｍｌを含むＢＧ培地（脱線維素化ヒツノ血液２５％Ｖ／Ｖを補給したＢＧ寒天、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ミシガン州デトロイト））にプレートした。次いて、ストレプトマイノン耐性突然変異体を、ナリジキシン酸５０μｇ／ｍｌを含むＢＧ培地にプレートした。生したコロニーはストレプトマイシンとナリジキシン酸に耐性であり、次いて、接合実験に使用した。

プラスミドｐＴＯＸ９　（Ｂｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１ｎｆｅｃｔ　［ｍｍｕｎ、　５５：２４６５−７０　（１９８７’））は約１０ｋｂｐ百日咳ＤＮＡ断片上に百日咳毒素遺伝子を含む。プラスミドｐＴＯＸ９を制限酵素ＫｐｎｌとＢｇｌｉｌて消化し、次いてＢａ１３１エキソヌクレアーゼで処理し、最後に再連結した。この得られたプラスミドは百日咳毒素遺伝子を欠失しており、ＣＩａ［で消化した。これにより、欠失百日咳毒素遺伝子のフランキング領域を含む約７ｋｂｐ断片を得た。このＣ１ａｔ−Ｃ１ａｌ断片を末端味復し、単離し、次いてプラスミドｐＳＯＲＴＰ　ＩのＨｉｎｄｌ［＋　（末端修復済み）部位に連結した。プラスミドｐｓＯＲＴＰ　ｌはゲンタマイシン遺伝子か挿入されているプラスミドｐＲＴＰ１　（Ｓｔｉｂｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、５０１３３−１．１０　（＋９８６））から誘導された。それ故、ｐｓＯＲＴＰ　１はゲンタマイシン耐性遺伝子とストレプトマイシン耐性を付与する遺伝子を含む。プラスミドｐｓＯＲＴＰｌは百日咳菌ては自律複製をせず、かくして百日咳菌染色体との組換えを起こさなければならない。

組換えに先立って、百日咳毒素遺伝子に隣接するヌクレオチド配列を含むプラスミドｐｓＯＲＴＰｌを、大腸菌５Ｍｌ０株（Ｓｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉニア８４−７９１（＋９８３））に導入した。いくつかのコロニーか増殖し、それらのクローンの各々からのプラスミドＤＮＡを別個にＤＮＡ配列解析により分析し、同定し、欠失を確認した。

組換えプラスＥ　ｌ”　ｐｓＯＲＴＰｌを含む大腸菌５ｔＪ１０クローンは野生梨百日咳菌Ｔｏｈａｍａｔ株（上記）と接合した。この株はストレプトマイシン耐性（劣性形質）とナリジキシン酸耐性であった。次いて、百日咳菌受容菌をナリジキシン酸とゲンタマイシンを含むＢＧ寒天プレートに植菌した。ゲンタマイシン耐性コロニーは、ヌトレブトマイシン感受性てもあったか、完全な組換えプラスミドか百日咳菌染色体に組込まれた場合にのみ発生し得た。その後、ゲンタマイシン耐性コロニーを、ス］・レブトマイシン４００μｇ／ｍｌを含むＢＧプレートに植菌し、第２の組換え現象を選びたし、ストレプトマイノン耐性百日咳菌復帰細胞を得た。これらの復帰細胞は染色体と挿入プラスミド間の第２の相同的組換えにより生じた。得られたゲンタマイシン感受性てもあるストレプトマイシン耐性株の多くは、組換え現象で、野生型百日咳毒素を消失していた。コロニーをサザンブロノトハイブリダイゼーションにより分析し、野生型百日咳毒素遺伝子の消失を確認した。得られた百日咳菌株は百日咳毒素遺伝子を欠き、その後突然変異百日咳毒素遺伝子の発現に８２またはＳ３サブユニツトに上記突然変異を含むｐＲ＋Ｔ１３０７０由来プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩて消化した。得られた４、７ｋｂｐ断片をプラスミドｐＬＡＦＲＩＩ　（Ｆｒｉｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　１８：２８９−２９６　（１９８２戸の唯一のＥｃｏＲ［部位に連結した。プラスミドｐＬＡＦＲＩＩはテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、それ故このプラスミドを含む形質転換体はテトラサイクリン１２．５ μｇ／ｍｌ含有増殖培地で選択することかできる。その後、組換えプラスミドを大腸菌５Ｍｌ０に導入した。テトラサイクリン耐性形質転換体はさらに突然変異毒素遺伝子の存在についてＤＮＡ配列解析で分析した。希望の突然変異を含むコロニーを、実施例５に記載の通りに、百日咳毒素遺伝子を欠失させた百日咳菌株と接合させた。次いで、テトラサイクリン耐性百日咳菌株はテトラサイクリンｌＯμｇ／ｍｌを含む修飾ステイナー−ショルテ（Ｓｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏｌｔｅ）培地（Ｄｉｒｃｏ）で増殖させた。遠心分離で細胞を培地から分離した。細胞と培地の両方を百日咳毒素特異的モノクローナル抗体を使用してウェスタンプロット法て分析した（Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１ｎｖａＣＣＩｎｅ８９．ｐ、２４３−２４７．　Ｌｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ニーニーヨーク州り−ルド　スブリン比較のため、野生型百日咳菌株（Ｔｏｈａｍａ　Ｉ）に百日咳毒素を作らせ、培地中に分泌させた。百日咳毒素（ＰＴ）遺伝子か欠失している百日咳菌株は百日咳毒素を発現しなかった。しかしながら、この株を、吐ＡＦＲ１［（上記）に担持された野生梨ＰＴ遺伝子で形質転換した場合は、実施例７に記載したＥＬＩＳＡて測定したとき、やや低い（［であるか、匹敵するレベルのＰＴを発現した。突然変異百日咳毒素遺伝子を含むクロー肩よ、有意な量の、例えば１−４μｇ／ｍｌの、突然変異毒素タンパク質を生産し、これは培地中に分泌されることかわかった。

百日咳菌ての修飾百日咳毒素遺伝子の発現上記突然変異またはこれらの突然変異の組み合わせを含むｐＲ［Ｔ　１３０７０由来プラスミドを、百日咳毒素遺伝子か欠失している百日咳菌（実施例５に記ａ）にエレクトロポレーシヨンで形質転換した。エレクトロポレーションは以下の通りに実施した。百日咳菌を修飾ステイナー−ン３ルテ培地１０ｍ１で指数期まで増殖させた。細胞を遠心分離で集め、氷水で２回洗い、水２−５ｍ１に再懸濁した。この懸濁液８０μｌとプラスミドＤＮＡ　２μｌを混合し、０．８ｍｍ−ギヤツブキュベツト電極て１回の電気パルス（２，５Ｍ　、２００Ω、２５μＦ）を与えた。細胞を直接培地１ｍｌに移し、３７℃テ１−４時間インキュベートし、アンビンリンを含むポルデー−ジャングー培地にまいた。ｐＲＩＴ　１３０７０由来プラスミドは百日咳菌の中で複製できないので、アンピシリン耐性は、プラスミドと染色体間の相同的組換えによるプラスミドの組込みによってのみ獲得され得る。

アンピシリン耐性百日咳菌株を、アンビンリン５０μｇ／ｍｌを補給した修飾ステイナー−ショルテ培地で増殖させた。次いで、細胞を遠心分離で培地と分離した。

上澄みを、百日咳毒素特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体（上記）を使用して、ウェスタンプロット法とＥｌ、ＩｓＡて分析した。突然変異百日咳毒素遺伝子を含むクローンは存意な量（０，５−１０μｇ、／ｍ１．）の突然変異毒素タンパク質を生産し、培地中に分泌した。

実施例７　修飾百日咳毒素ポリペプチドの生物学的活性種々の遺伝子操作された修飾百日咳毒素タンパク質を産生ずる種々の百日咳菌株の培地を、Ｆｒａｎｃｏｔｊｅ　ｅｔ　ａｌ、、（同上）により記載されるハプトグロビン被覆マイクロタイタープレートを使用して、酵素イムノソルベントアッセイ（ＥＬ［ＳＡ）て分析した。吸光度を、培地中の種々の毒素類縁体の概算濃度と比較した。この分析により、ハプトグロビン結合活性か変化した突然変異体タンパク質を同定することかてきた。Ｓ３サブユニツトの突然変異はとれも、百日咳毒素の／’ｔブトグロビン結合能を有意に変化させなかった。Ｓ２サブユニツトの突然変異は百日咳毒素のハプトグロビン結合能を種々の量て減退させた。サブユニットＳ２のＴｙｒｌ　６２欠失を含む突然変異タンパク質は、約５０％の効率でハプトグロビンと結合した。二重欠失（すなわち７ｙ、１０２−１０＋）を含むＰＴタンパク質の結合能は、野生型分子に比へて、約４％に減少した。Ａｓｎ１ｆｌｓ欠失を含むＰＴタンパク質のハプトグロビン結合能は検出不能値（すなわち野生型活性の０．５％未満）に低下した。これらの結果から、Ｓ２サブユニツトのＡｓｎ１ＱＳかハプトグロビン−結合に必須であることか示唆される、　Ｓ３サブユニツトの同様の突然変異（ＬＹＳｌＧりは、ハプトグロビン−結合能に影響を及ぼさなかったので、ハプトグロビンまたはハプトグロビン様受容体への毒素の結合は二量体ｌ　（すなわちサブユニットＳ２と８．１）を介して特異的に生しることか示唆された。

上記のように、二量体２（サブユニットＳ３とＳ４）はＣＨＯ細胞膜に特異的に結合するよってある（Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｔ同上）。それ故、Ｓ３サブユニツトの変化を含む百日咳毒素類縁体は、このＣＨＯ〜細胞特異的細胞毒性に影響を与えるだろう。これらの実施例で分析した突然変異体タンパク質は細胞毒性の減少を呈し、サブユニットＳ３のＴｙｒ’°２−Ｉｎとｌ　ｙ　ｓ　ｉ　Ｏｆの欠失はかかる細胞毒性の存意な減退を呈した。これらの欠失すなわち７ｙ、１０２−ＩｎとＬＹＳｌＧ５では培地中に細胞毒性か検出されなかったので、見かけの解毒因子は少なくとも１００倍であることか示唆された。全ての突然変異体夕〉バク質か個々のサブユニットに対するモノクローナル抗体により認識されたことは注目に値する。

実施例８　非経口ワクチンの製造実施例６の方法に従って製造した突然変異毒素タンパク質５−２５μｇを水酸化アルミニウムのようなアルミニラｌ、アジュバントと混合し、非径口投与に適した画形のワクチンを製造する。

本発明は、上記の実施例中の特別な実施態様に限定されないことか理解されよう。それ故、本発明の全ての実施態様は以下の請求の範囲内に含まれると確信する。

表１国際調査報告１１Ｉ＋−一一一五−１’　−”　ＰＣＴ／ＥＰ　ｑｏｌｎｔｎｉａ国＠調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．野生型百日咳毒素に対する抗体に特異的に反応するが、百日咳毒素標的細胞受容体結合を欠損しているタンパク質をコードするＤＮＡコード配列を含む組換えＤＮＡ分子。２．突然変異型百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素Ｂ− オリゴマーをコードする、請求項１の組換えＤＮＡ分子。３．突然変異型二量体Ｄ１コード配列、または突然変異型二量体Ｄ１と突然変異型または野生型Ｓ１エサブユニットコード配列の両方を含み、Ｓ３とＳ５サブユニットコード配列を欠いている突然変異型百日咳菌毒素をコードする、請求項１の組換えＤＮＡ分子。４．突然変異型二量体Ｄ２コード配列、または突然変異型二量体Ｄ２と突然変異型または野生型Ｓ１サブユニットコード配列の両方を含み、Ｓ２とＳ５サブユニットコード配列を欠いている突然変異型百日咳菌毒素をコードする、請求項１の組換えＤＮＡ分子。５．Ｓ２サブユニットコード配列、またはＳ３サブユニットコード配列、もしくはＳ２とＳ３サブユニットコード配列の両方に突然変異を含む突然変異型百日咳菌毒素をコードする、請求項１の組換えＤＮＡ分子。６．百日咳菌毒素Ｓ２サブユニットコード配列中の置換または欠失突然変異をコードする、請求項１の組換えＤＮＡ分子。７．Ａｓｎ１０５のＡｓｐ１０５への置換をコードする、請求項６の組換えＤＮＡ分子。８．Ｓ２とＳ３サブユニットコード配列のいずれかまたは両方からの１−５個のアミノ酸コドンの欠失を含む、請求項５の組換えＤＮＡ分子。９．Ｓ２サブユニットコード配列の突然変異はＡｓｎ１０５、Ｔｙｒ１０２、およびＴｙｒ１０２−１０２のアミノ酸コドンの欠失から選ばれ、かつ／またＳ３サブユニットコード配列の突然変異はＬｙｓ１０５、Ｔｙｒ１０２、およびＴｙｒ１０２−１０２のアミノ酸コドンの欠失から選ばれる、請求項８の組換えＤＮＡ分子。１０．百日咳菌Ｓ１サブユニットコード配列か１またはそれ以上の突然変異を含み、それによりコードされる突然変異型百日咳毒素がＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を欠損している、請求項１の組換えＤＮＡ分子。１１．Ｓ１サブユニットコード配列の突然変異がアミノ酸Ａｒｇ９、またはＡｒｇ１３、またはＴｒｐ２６、またはＨｉｓ３５、またはＳｅｒ４０、またはＧｌｕ１２９の１またはそれ以上の欠失から選ばれる、請求項１０の組換えＤＮＡ分子。１２．調節領域に機能しうる状態て連結された請求項１のＤＮＡ分子を含む組換えプラスミド。１３．請求項１２の組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞。１４，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１３の宿主細胞。１５．宿主細胞のゲノムに組み込まれた請求項１の組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞。１６．百日咳菌である、請求項１５の宿主細胞。１７．免疫防御量で無毒性量の請求項１３の不活化宿主細胞を含む、百日咳に対する防御を刺激する全細胞ワクチン。１８．免疫防御量で無毒性量の請求項１５の不活化宿主細胞を含む、百日咳に対する防御を刺激する全細胞ワクチン。１９．請求項１の組換えＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質。２０．免疫防御量で無毒性量の請求項１９のタンパク質を含む、百日咳に対する防御を刺激するワクチン。２１．ヒトに安全かつ有効量の請求項２０のワクチンを投与することから成る、百日咳感染に付随する疾病症状からヒトを防御する方法。２２．（ａ）請求項１の組換えＤＮＡ分子を宿主細胞に導入し；そして（ｂ）前記宿主細胞を適切な培地で増殖させることから成る、請求項１の組換えＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質の生産方法。２３．宿主細胞が野生型百日咳菌毒素遺伝子を欠損している、請求項２２の方法。２４．生産されたタンパク質を単離することをさらに含む、請求項２２の方法。２５．請求項２４の方法により生産されたタンパク質。２６．免疫防御量て無毒性量の請求項２４の方法により生産されたタンパク質を含む、百日咳に対する防御を刺激するワクチン。２７．ヒトに安全かつ有効量の請求項２６のワクチンを投与することから成る、百日咳感染に付随する疾病症状からヒトを防御する方法。