PT96022B - Processo para a prparacao de toxina bordetella pertussis geneticamente modificada e de nova vacina contra a tosse convulsa contendo a referida toxina - Google Patents
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Classifications
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
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Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 96.022
REQUERENTE: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS, belga, industrial, com sede em Rue de 1'Institut 89, B-1330 Rixensart, Bélgica
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA NOVA
VACINA CONTRA A TOSSE CONVULSA CONTENDO TOXINA BORDETELLA PERTUSSIS MODIFICADA
INVENTORES:
CAMILLE
LOCHT e YVES LOBET
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
de Novembro de 1989 e em 22 de Dezembro de 1989 sob os Nos. 442,808 e 455.648 nos Estados Unidos da América do Norte
SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS,S.A.,
PROCESSO PARA A PREPARAçKO DE UMA NOVA VACINA CONTRA A TOSSE CONVULSA CONTENDO TOXINA BORDETELLA PERTUSSIS MODIFICADA
MEMÓRIA DESCRITIVA
RESUMO
O presente invento diz respeite a um processo para a preparação da toxina Bordetella pertussis a qual é geneticamente modificada de modo a expressar uma proteina de toxina a que falta a ligação ao receptor da célula alvo e que é usada numa vacina destinada è protecção contra a tosse convulsa.
Mais especificamente é preparada uma proteina codificada por uma molécula de DNA recombinante, compreendendo uma sequência codificadora do DNA que codifica uma proteina especificamente reactiva com anti-corpos contra a toxina tipo selvagem da tosse convulsa mas a que falta a ligação aos receptores das células alvo da toxina da tosse convulsa, através dos passos de: (a) introduzir a molécula de DNA recombinante numa célula
hospedeira; e (b> cultivar a referida célula hospedeira num de cultura, de forma a que a referida proteína seja expressa.
meia )
Campo do Invento
Este invento está relacionado com modificações genéticas da. toxina de Bordetella pertussis e com uma vacina contenda uma quantidade imunoprotectora de tal proteína.
Fundamento do Invento i
Os membros do género Bordetella são microorganismos patoqénicos envolvidos na infecção do tracto respiratório. 0 género é constituído por quatro espécies; B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica e B. avium. A espécie mais virulenta para o homem é B. pertussis, a qual é o agente etiológico da tosse convulsa.
As vacinas da tosse convulsa convencionais contêm células totais de B. pertussis mas inac tivada.s. Tais células são inactivadas por tratamento a 5ó°C durante 3Θ minutos e/ou tratamento com formaldeído. Apesar de tal inactivação as vacinas com células totais retêm uma quantidade substancial de toxicidade.
Como resultado disto, existem vacinas al são preparadas a partir de estirpes avirulentas ou toxina de E<. pertussis. No entanto, provou-se que são muito menos protectoras do que as preparadas estirpes virulentas. Ver por exemplo, Wardlaw Microbiol 9:89-100 (1976).
ternativas que deficientes em estas vacinas a partir das et al , , J___Hed
B. pertussis produz uma. série de toxinas (toxina, da. tosse convulsa, adenilato-ciclase, toxina dermonecrótica e cítotoxina traqueal) as quais destroem os mecanismos de eliminação do aparelho respiratório ou interferem com a resposta imune (F. Mooi, Hntonie van Leeuwenhoek, 54:465-474 (1983)). Uma larga variedade de a.ctividades biológicas, tais como sensibilização de histaminas, secreção de insulina, promoção da linfocitose e efeitos imunopotenciadores podem ser atribuídos à toxina da tosse convulsa (J. Munoz, em Pertussis Toxin, p. 1-18, Sekura et al. , Eds. Academic Press, New York, 1985). Em adição, mostrou-se que a administração da toxina de B. pertussis a murganhos protegeu-os contra subsequente exposição (Munoz et al, Infect Immunol 32:243-250 (1981)). A toxina da tosse convulsa é portante um constituinte importante numa vacina contra a tosse convulsa e está incluída nas vacinas com componente acelular a serem testadas e usadas em vários países (Sato et al., Lancet, 1984-1:122 (1934)). Paradoxal mente, a toxina da tosse convulsa, que é capaz de induzir uma resposta imune, pode ela própria ser responsável pelos efeitos secundários prejudiciais associados às vacinas correntes (Steinman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:8733 (1985)). Estes efeitos prejudiciais podem variar desde simples rubor até danificação neurológica permanente e, nalguns casos, morte.
A toxina da tosse convulsa é constituída por cinco subunidades diferentes, designadas SI migração electroforética em géis de subunidades associam-se na. proporção molar de 1:1:1:2:1, respectivamente, para, formar a holotoxina. Fu.nc iona Imen te a toxina da tosse convulsa pode ser dividida num promotor A, ou subunida.de SI, a qual contem actividade de adenosina-difosfato (ADP)-ribosilação e num oligómero B, constituído pelas subunidades S2 a S5, que contem as a.ctividades de ligação a receptores de célulasalvo. Assim o oligómero B é essencial para pôr o promotor A contacto com a. membrana da célula alvo.
a S5 com base na sua SDS-poliacrilamida. As em
Locht et ai, Science 252: 1253-64 (1936), dizem que as s;ubunidades da toxina da tosse convulsa são codificadas por cistrSes estreitamente ligados. Locht et al divulgam ainda, que a sequência de nucleótidos do gene da toxina da B. pertussis e as sequências de aminoácidos das subunidades individuais.
Locht et al , War 14:5251-61 {1986), revelou a clonagem de um fragmento de E>NA de 4,5 Kb do gene da toxina de B. pertussis contendo pelo menos a subunidade 54 e uma fracção de um gene de uma. outra subunidade. A análise da sequência revelou que a subunidade 34 madura deriva de uma molécula precursora por clivagem proteolítica.
Nicosia et al , Infect Immun 55:963-7 (1987), descreve a expressão de cacía uma das cinco subunidades da toxina de B. pertussis como fusões com a DMA-polimerase MS2. Encontou-se que os anti-sorcs induzido;;; contra estas proteínas não são imunoprotectores in vivo ou in vivo.
Locht et al, Infect Immun. 55:2546-2555 (1937), descrevem a expressão das subunidades 31 e 52 da toxina da tosse convulsa, em E coli como fusões a 6 resíduos de amirtoácidos da beta-galactosidade seguida de 5 aminoácidos codificados por um pol i--ada.pt.ador. Foi descrito que a subunidade recombinante SI apresenta actividades enzimáticas. Foi publicada uma versão truncada da. subunidade 51 em que os últimos 43 resíduos de aminoácidos, i.e., o extrema carbonilo, foi eliminado.
Sc lavo SpA , EF'-~A—232,229 , publicada em 12 de Aqosto, 1987, descrevem a clonagem e expressão de um gene da toxina de B. pertussis, o qual contem as subunidades 51 a 35 em E. coli.
Bellini, et al. , EP-A-281,530, publicada em 7 de setembro, 1988, descreve a expressão de subunidades maduras de B pertussis em B. subtil is.
Burnette et al., EP-A-306,318, publicada em 8 de Março, 1989, descreve a subclonagem e expressão de subunidades individuais de B. pertussis em E. coli. Burnette et al . descreve que a subunida.de 84 poderá ser expressa apenas quando da remoção da sequência codificadora do peptídeo sinal. Burnette et a 1. também descrevem que análogos da subunida.de 81 expressos em E. coli com 7 14 modificações entre os aminoácidos Vai e Pro
Burns et al . , Patente U.S. 4,845,036, descreve um método para, o isolamento do oligómero B tipo selvagem de B pertussis (i.e., subunidades S2-S5) por dissociação da holotoxina (i.e., subunidades 81-85).
Sato et al . , EP-A-296,765, publicada em 28 de Dezembro, 1983, descreveram variantes de B. pertussis que produzem proteínas mutantes da toxina da tosse convulsa. Os variantes surgem da exposição de B. pertussis virulenta a nitrosoguanidina, um mutagénio conhecido.
M. Ui, (em Pathoqenesis and Immunity in Pertussis, Wardlaw et aI., eds., p.121-145, Wiley & Sons, Chichester, 1988) descreve que certas modificações químicas, e.g., acilação, dos resíduas lisina de toxina da tosse convulsa eliminam toda a actividade biológica. A metilação da toxina da tosse convulsa, a qual também modifica resíduos lisina, não afecta a actividade de ADP-ribosi1 ação mas reduz ou anula certas actividades biológicas associadas ao oligómero B, por exemplo, actividade mitogénica, estimulação da oxidação de glucose, promoção da linfocitose e a actividade de sensibilização de histamina. Ui ainda descreve que
C7_ Cj tosse convulsa), mas não o dímero Dl (i.e., subunidades S2-S4 da toxina da tosse convulsa) ou subunidade S5, elimina a actividade mitogénica associada ao oligómero B. No entanto, não existe descrição ou sugestão de quais as regiões específicas ou. resíduos lisina específicos do oligómero B estão envolvidos na metilaçãc· ou acilação.
Hausman et al
Infect Immunol. 57:1760-64 (1989), descreve a imunização de murganhos com subunidades diméricas da toxina da. tosse convulsa, Dl (i.e., S2-S4) e D2 (i.e., S3-S4) . Os anti-soros induzidos contra estes dímeros foram capazes de reconhecer a toxina de B. pertussis e neutralizar os seus efeitos tóxicos in vitro.
Capiau et al., Pedido de Patente U.S.Número de Série 07/222,991, apresentado em 22 de Julho, 1988 (equivalente à Publicação do Pedido de Patente Europeia NO 035225O) descreve a modificação da subunidade SI da toxina de B. pertussis na posição de aminoácido 26 (i.e., triptofa.no) . Este resíduo pode ser modificado quimicamente ou por mutagénese dirigida para inactivar substancialmente a actividade enzimâtica da subunidade SI.
Bellini et al . , Gene, 69:325-35g> (1988), descreve um método geral para a mutagénese no DNA de plasmídeo de cadeia dupla. Bellini et al. descreve que o seu método é particularmente importante sempre que sejam necessitadas deleçSes longas. É exemplifiçada a deleção da região codificadora da sequência sinal da subunidade S2 de B. pertussis localizada num vector vai-vem E c o1i - B. subtil is.
Black et al., EP-A-275, 689, publicado em 27 de Julho, 1988 e Infect Imroun 55:2465-7© (1987), descreve a expressão da subunidade S4 em b. coli. mutaçSes no gene da toxina
Em adição, Black et al. descreve de B. pertussis que foram deleçSes gerados pela exonuclease Ba131 ou inserções com o gene de resistência à canamicina. Estas mutaçSes foram então introduzidas por permuta alélica no cromossoma de B. pertussis.
Klein et al . , EP-A-322,115, publicado em 28 de Junho, 1989, descreve mutaçSes por substituição da toxina de B. pertussis . Klein et al também descreve mutaçSes por deleção da subunidade SI. Mo entanto, das mutaçSes por deleção descritas, apenas 1 ^‘9 uma mutação, Glu , foi fracamente reactiva com anticorpos contra a subunidade SI.
é um objectivo deste invento proporcionar uma vacina melhorada para B. pertussis compreendendo unta toxina modificada de B. pertussis ou suas subunidades que são imunogénicas, ainda que não tóxicas.
Sumário do Invento presente invento está relacionada com uma molécula de DMA recombinante codificadora de uma proteína que reage especificamente com anticorpos contra a toxina da tosse convulsa tipo selvagem mas que é defectiva na ligação ao receptor de células alvo tía toxina da tosse convulsa.
Em aspectos relacionados este invento é um plasmídeo recombinante que compreende a. molécula de DMA recombinante deste inventa operacionalmente ligada a uma região reguladora. A referida reqião reguladora contem sequências reguladoras necessárias à transcrição da sequência codificadora da proteína e subsequente tradução numa célula hospedeira transformada com o plasmídeo recombinante do invento.
Este inventa também está relacionado com uma proteína da toxina. da tosse convulsa codificada pela molécula de DNA recombinante do invento, a qual reage especificamente com anticorpos contra a toxina da tosse convulsa tipo selvagem mas que ê também defectiva na ligação aos receptores da célula alvo da toxina da tosse convulsa.
Num outro aspecto, este invento é uma vacina para a estimulação da protecção contra a tosse convulsa em que tal vacina compreende uma quantidade imunoprotectora e não-tóxica da proteína codificada pela molécula de DNA recombinante do invento. Para fins de vacina, a proteína do invento pode ser purificada a partir da célula hospedeira ou de meio de cultura das células, ou alternativamente, ela pode estar associada à superfície externa da membrana da célula hospedeira.
Este invento está ainda relacionado com um processo para a preparação da proteína do invento. Este processo caracteriza-se pelo crescimento de uma célula hospedeira transformada com a molécula de DNA recombinante deste invento num meio de cultura adequado.
Descrição Detalhada do Invento presente invento baseia-se na descoberta de que a modificação de um ou mais dos resíduos de avn.inoácidos naturais da sequência de DNA codificadora do aligómero B da toxina de
Bordetella pertussis reduz grandemente a ligação da toxina da tosse convulsa a receptores da célula alvo reduzindo assim grandemente a toxicidade da toxina da tosse convulsa mas retendo
| ac mesmo protectora | tempo | a capacidade para | induzir uma | resposta imune |
| Muitas | , mas não todas as | actividades | biológicas da | |
| toxina da | tosse | c on vu1sa < PT) são | o resultado | de três passos |
moleculares essenciais. 0 primeiro passo envolve a ligação de PT aos receptores nas membranas das células alvo através do oligómero B (subunida.de S2 a S5) . Em seguida, a subunidade SI deve translocar-se para o citoplasma da célula alvo. F.inalmente, a subunidade SI internalizada tem de expressar a sua activida.de enzimática que inclui IMAD-g1ico-hidrólise e ABP-ribosilação. (Para uma revisão, ver Ui, M., em Pathoqenesis and Immunity in Pertussis, p. 121-145, Wardlaw and Parton, eds., Wiley and Sons, Chichester, 1988). A eliminação de qualquer um destes três passos reduz dràsticamente as actividades biológicas da referida toxina. Portanto, uma toxina da tosse convulsa modificada que é incapaz de se ligar a receptores de células alvo, reduzirá dràsticamente ou eliminará as actividades tóxicas associadas á toxina da tosse convulsa.
oligómero B, que está associado a aderência ou ligação de PT a células hospedeiras, é composto pelas subunidades 82-85. 0 oligómero B pode ainda ser dividido em dois dímeros, Dl e D5 ^uais estão ligados pela subunidade 51 □ dímero Dl compreende as subunidades 52 e S4, enquanto o dímero D2 compreende as subunidades 53 e S4 (ver Tamura et a.l . , Biochemistry, 21: 5561-22 (1982)). Cada um dos dímeros interactua com diferentesmoléculas receptor das células alvo. Por exemplo, Dl parece ser responsável pela ligação de PT a tais glicoproteínas como sejam haptoglobina ou fetuina (ver, Francotte et al. , em Vacoine 89. p.
243-247, Lerner et al . . eds-, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Sprinq Harbor,NY, 1989), enquanto D2 pode ligar—se especificamente a membranas de células de ovário de hamster chinês (CHO) (ver, Brennan et a 1 J . Biol , Chem. , 263:4895-99 (1988)). Presumiu-se que esta especificidade da ligação ê atribuída às diferenças estruturais entre 52 e S3.
A sequência de nucleót.idos para o gene da toxina de Bordetella pertussis foi descrita por Locht et a 1, (Science,
1258-64 (1986)):
| 1 | gaattcgtcg | CCTCGCCCTG | GTTCGCCGTC | ATGGCCCCCA | AGGGAACCGA |
| 51 | CCCCAAGATA | ATCGTCCTGC | TCAACCGCCA | CATCAACGAG | GCGCTGCAGT |
| 101 | CCAAGGCGGT | CGTCGAGGCC | TTTGCCGCCC | AAGGCGCCAC | GCCGGTCATC |
| 151 | GCCACGCCGG | ATCAGACCCG | CGGCTTCATC | GCAGACGAGA | TCCAGCGCTG |
| 201 | GGCCGGCGTC | GTGCGCGAAA | CCGGCGCCAA | GCTGAAGTAG | CAGCGCAGCC |
| 251 | CTCCAACGCG | CCATCCCCGT | CCGGCCGGCA | CCATCCCGCA | TACGTGTTGG |
| 301 | CAACCGCCAA | CGCGCATGCG | TGCAGATTCG | TCGTACAAAA | CCCTCGATTC |
| 351 | TTCCGTACAT | CCCGCTACTG | CAATCCAACA | CGGCATGAAC | GCTCCTTCGG |
| 401 | CGCAAAGTCG | CGCGATGGTA | CCGGTCACCG | TCCGGACCGT | GCTGACCCCC |
| 451 | CTGCCATGGT | GTGATCCGTA | AAATAGGCAC | CATCAAAACG | CAGAGGGGAA |
| 501 | GACGGGATGC | GTTGCACTCG | GGCAATTCGC | CAAACCGCAA | GAACAGGCTG |
| 551 | GCTGACGTGG | CTGGCGATTC | TTGCCGTCAC | GGCGCCCGTG | ACTTCGCCGG |
| 601 | CATGGGCCGA | CGATCCTCCC | GCCACCGTAT | ACCGCTATGA | CTCCCGCCCG |
| 651 | CCGGAGGACG | TTTTCCAGAA | CGGATTCACG | GCGTGGGGAA | ACAACGACAA |
| 701 | TGTGCTCGAC | CATCTGACCG | GACGTTCCTG | CCAGGTCGGC | AGCAGCAACA |
| 751 | GCGCTTTCGT | CTCCACCAGC | AGCAGCCGGC | GCTATACCGA | GGTCTATCTC |
| 801 | GAACATCGCA | TGCAGGAAGC | GGTCGAGGCC | GAACGCGCCG | GCAGGGGCAC |
| 851 | CGGCCACTTC | ATCGGCTACA | TCTACGAAGT | CCGCGCCGAC | AACAATTTCT |
| 901 | ACGGCGCCGC | CAGCTCGTAC | TTCGAATACG | TCGACACTTA | TGGCGACAAT |
GCCGGCCGTA
GGCACACCGG
ATCACAACGG
CGCTACGTCA
AAGGTCCGTA
GCGCTTGCAT
TCCGAACGCG
GTATTCGTTC
GCATGCCGAT
TTGGCCCTCC
CATTCCGCCG
GCGCGAACAA
GATCTGCAGG
GCTCTACGAT
ACGGAACACC
ACCACGCGCA
CACCGCCACT
TCGTCAGAAG
GGCAAGTACT
CTACGTGGCC
ATTACGACTA
TCCATCTGCA
CGCGCTGGCC
CCGAAAACAT
GAGACCACGA
TCGCGCCAAT
TCGGCACATT
GCCGAAAGCT
GATGGTTCTC
CCAGCCCCGC
ACGCTCTGCC
CGTGGCGCGG
TTACCCAGCA
CTGACCGTGG
TCATGTGACG
TCGGCGGCGA
TTCGACCTGA
ACCCGCAACG
CCAGCACCAA
GTCATTGGCG
GAGCCGGCTG
TACGCGTCCA
ACGTTCGAGA
ATCCTTATGC
TCCTCGCCGG
CGCATTCCGC
CATCACCGGC
GCCAGCAGAC
GCGTCGATCG
GGCGCGGCAG
CCGGCGAGGC
I
TAGACCTGGC
CGACCGCAAG
TCGGATCTCA
CAGGAACAGA
GACCCGTGCC
AGTACCTGCG
GGCACCTATC
CGGCGGCGCA
ATACGGGTGA
CGCCTGCTCT
CGGGCAACCG
GGAGCATGTA
GGCATCTCCG
TGAGGACGCA
ATCCTGGATC
ACCTACCAGA
CCGCAGGGTA
CCACGGAGTA
CCCAACCCCT
GGTGCATGGC
CCGAGGCGAT
GTGTACTACG
CCAACTCCGG
ATCTCCTGTC
GCCTCCACGC
TGGCAGCCCC
CGGAATTGCG
CGCGGCTGGT
ATATGGCGGÇ
AAACGACGTT
GATGACTACT
CAGCAGGCTA
CCTGCACCAG
CGGAAAATGC
TGTCAGCAAG
CTTACGCCCT
TGAGACGCTT
GCGAATATCT
ACGCGGGTCT
TTCCAACGCT
ACACATCGCG
GCCGGTGATA
GGCAGCCTGG
AAAGCATCGC
TAATTGAACA .CGTTCTGCCG
CAGGCATCGT
TATGGACGCT
CGGCAGCGGC
CAATATTTGC
GTGATCAAGG
CTGCATCATG
ACAGCAACGT
TGCGCGGTCT
CCCGTATGAC
TTTACCTGAT
GAAGAACAGT
TACCGGCATC
CCCCACTCGA
ACCACCGCCC CGGGACAGGG CGGCGCCCGG CGGTCGCGCG TGCGCGCCCT
| 2101 | GGCGTGGTTG | CTGGCATCCG | GCGCGATGAC | GCATCTTTCC | CCCGCCCTGG |
| 2151 | CCGACGTTCC | TTATGTGCTG | GTGAAGACCA | ATATGGTGGT | CACCAGCGTA |
| 2201 | GCCATGAAGC | CGTATGAAGT | CACCCCGACG | CGCATGCTGG | TCTGCGGCAT |
| 2251 | CGCCGCCAAA | CTGGGCGCCG | CGGCCAGCAG | CCCGGACGCG | CACGTGCCGT |
| 2301 | TCTGCTTCGG | CAAGGATCTC | AAGCGTCCCG | GCAGCAGTCC | CATGGAAGTC |
| 2351 | ATGTTGCGCG | CCGTCTTCAT | GCAACAACGG | CCGCTGCGCA | TGTTTCTGGG |
| 2401 | TCCCAAGCAA | CTCACTTTCG | AAGGCAAGCC | CGCGCTCGAA | CTGATCCGGA |
| 2451 | TGGTCGAATG | CAGCGGCAAG | CAGGATTGCC | CCTGAAGGCG | AACCCCATGC |
| 2501 | ATACCATCGC | ATCCATCCTG | TTGTCCGTGC | TCGGCATATA | CAGCCCGGCT |
| 2551 | GACGTCGCCG | GCTTGCCGAC | CCATCTGTAC | AAGAACTTCA | CTGTCCAGGA |
| 2601 | GCTGGCCTTG | AAACTGAAGG | GCAAGAATCA | GGAGTTCTGC | CTGACCGCCT |
| 2651 | TCATGTCGGG | CAGAAGCCTG | GTCCGGGCGT | GCCTGTCCGA | CGCGGGACAC |
| 2701 | GAGCACGACA | CGTGGTTCGA | CACCATGCTT | GGCTTTGCCA | TATCCGCGTA |
| 2751 | TGCGCTCAAG | AGCCGGATCG | CGCTGACGGT | GGAAGACTCG | CCGTATCCGG |
| 2801 | GCACTCCCGG | CGATCTGCTC | GAACTGCAGA | TCTGCCCGCT | CAACGGATAT |
| 2851 | TGCGAATGAA | CCCTTCCGGA | GGTTTCGACG | TTTCCGCGCA | ATCCGCTTGA |
| 2901 | GACGATCTTC | CGCCCTGGTT | CCATTCCGGG | AACACCGCAA | CATGCTGATC |
| 2951 | AACAACAAGA | AGCTGCTTCA | TCACATTCTG | CCCATCCTGG | TGCTCGCCCT |
| 3001 | GCTGGGCATG | CGCACGGCCC | AGGCCGTTGC | GCCAGGCATC | GTCATCCCGC |
| 3051 | CGAAGGCACT | GTTCACCCAA | CAGGGCGGCG | CCTATGGACG | CTGCCCGAAC |
| 3101 | GGAACCCGCG | CCTTGACCGT | GGCCGAACTG | CGCGGCAACG | CCGAATTGCA |
| 3151 | GACGTATTTG | CGCCAGATAA | CGCCCGGCTG | GTCCATATAC | GGTCTCTATG |
| 3201 | ACGGTACGTA | CCTGGGCCAG | GCGTACGGCG | GCATCATCAA | GGACGCGCCG |
| 3251 | CCAGGCGCGG | GGTTCATTTA | TCGCGAAACT | TTCTGCATCA | CGACCATATA |
| 3301 | CAAGACCGGG | CAACCGGCTG | CGGATCACTA | CTACAGCAAG | GTCACGGCCA |
| 3351 | CGCGCCTGCT | CGCCAGCACC | AACAGCAGGC | TGTGCGCGGT | ATTCGTCAGG |
| 3401 | GACGGGCAAT | CGGTCATCGG | AGCCTGCGCC | AGCCCGTATG | AAGGCAGGTA |
| 3451 | CAGAGACATG | TACGACGCGC | TGCGGCGCCT | GCTGTACATG | ATCTATATGT |
| 3501 | CCGGCCTTGC | CGTACGCGTC | CACGTCAGCA | AGGAAGAGCA | GTATTACGAC |
TACGAGGACG CCACATTCCA GACCTATGCC CTCACCGGCA TTTCCCTCTG
| CAACCCGGCA | GCGTCGATAT | GCTGAGCCGC | CGGCTCGGAT | CTGTTCGCCT |
| GTCCATGTTT | TTCCTTGACG | GATACCGCGA | ATGAATCCCT | TGAAAGACTT |
| GAGAGCATCG | CTACCGCGCC | TGGCCTTCAT | GGCAGCCTGC | ACCCTGTTGT |
| CCGCCACGCT | GCCCGACCTC | GCCCAGGCCG | GCGGCGGGCT | GCAGCGCTGT |
| CAACCACTTC | ATGGCGAGCA | TCGTGGTCGT | ACTGCCGCGG | CGGTCAGTGG |
| CCACGGTGAC | CATCGCCATA | ATCTGGGCGG | GCTACAAGCT | GCTGTTCCGG |
| CACGCCGATG | TGCTGGACGT | GGTGCGTGTG | GTGCTGGCGG | GAGCTGCTGA |
| TCGGCGCATC | GGCCGAAATC | GCTCGTTATC | TGCTGACCTG | AATCCTGGAC |
| GTATCGAACA | TGCGTGATCC | GCTTTTCAAG | GGCTGCACCC | GGCGCCGCGA |
| TGCTGATGGC | GTACCCGCCA | CGGCAGGCCG | TGTGCAGCCG | GCACCATTCC |
| CTGCTGGGCC | ATCTCGGTTC | AGCATCCGCT | TTCTGGCCTT | GTTTCCCGTG |
| GCATTGCTGG | CGATGCGGAT | CATGATCCGG | CGCGATGACC | AGCAGTTCCG |
| CCTGATC | e |
Onde: a subunidade SI é codificada pelos nucleótidos 507 a 1310; a subunidade 51 madura é codificada pelos nucleótidos 609 a. 1310. A subunidade S2 é codificada pelos nucleótidos 1353 a 2Θ30; a subunidade 52 madura é codificada pelos nucleótidos 1434 a 2030. A subunidade S4 é codificada pelos nucleótidos 2650 a 2482; a subunidade 54 madura é codificada pelos nucleótidos 2153 a 2482. A subunidade S5 é codificada pelos nucleótidos 2497 a 2482; a subunidade S5 madura é codificada pelos nucleótidos 2557 a 285. A subunidade S3 é codificada pelos nucleótiods 2942 a 3622; a subunidade S3 madura é codificada pelos nucleótidos 302óa 3622.
e 53 são 707. homólogos nas suas sequências de aminoá.cidos e 757. homólogos nas suas sequências de nucleótidos (ver, Locht et a 1. , Science, 232:1258-64 (198ó>). Apesar da sua homologia, S2 e 53 não se podem substituir mutuamente na toxina da tosse convulsa funcionalmente activa (ver, Tamura et al., supra). Em adição, cada uma das suhunidades S2 e 53 liga-se a uma subunidade 54. Portanto os dois dímeros, Dl e D2, devem estar estreitamente relacionados um com o outro se bem que as suas funções na função da oligómero B sejam bem distintas.
A modificação química da toxina da tosse convulsa pode afectar as suas actividades biológicas. Por exemplo, a acilação elimina toda a actividade biológica associada a toxina da tosse convulsa devido á disrupção da estrutura quaternária (ver, Noçimori et al . , Biochim Biophys Ac ta, 801:220-231 (1984)). A metilação da toxina da tosse convulsa que modifica os resíduos lisina, não afecta a actividade de ADP-ribosilaçã.o mas não reduz ou abole a actividade associada ao oligómero B (ver Ui, M., em Pathoqenesis and Immunitv in Pertussis. p. 121-145, Wardlaw and Parton, eds. Wiley and Sons, Chichester, 1988). Ainda, Ui descreve que a metilação do dímero d2, mas não o dímero Dl ou a subunidade S5, elimina a actividade mitogénica associada ao oligómero
B„ Portanto Ui conclui que os resíduos lisina desempenham um papel na ligação de D2 à superfície da célula hospedeira mas não na ligação de Dl.
Bemonstrou-se que a iodinaçã.o da toxina da tosse convulsa reduz severamente algumas das actividades biológicas, tais como hemaglutinação e agregação de células CHD. Ver, Armstrong et aI.. Infect Immun, 55:1294-99 (1987). Amstrong et al. também descrevem um método de radiodinação da toxina da tosse convulsa tipo selvagem na presença de fetuina-agarose e ainda retem actividade biológica. Foi descrito que usando tal método, todas as subunidades PT foram iodinadas. No entanto, Armstrong et al. descreve que se desconhece o mecanismo para a redução de actividade biológica observada.
presente invento descreve assim uma sequência de DNA da toxina de B. pertussis que codifica uma proteína defectiva na actividade de ligação aos receptores de células alvo e de preferência não possui igualmente actividade enzimática da subunidade SI, retendo no entanto a capacidade para ser reconhecido pelos anticorpos anti-toxina da tosse convulsa.
A actividade de ligação a receptores de células alvo pode ser testada pela ligação de haptoglobina como descrito por Francotte et al. (em Vaccine 89. p. 243-247, Lerner et al . , eds. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ou por ensaios de ligação a células CHO/citotoxicidade como descrito por Brennan et al (J„ Biol. Chem., 263:4395-99 (1988)) ou Burns et al. (Infect Immunol, 55:24 (19S7)). A actividade enzimática da subunidade SI pode ser medida pelo ensaia de ADP—ribosilação como descrito por Burnette et al. (Science.
242:72 (1989)).
DNA
,)
.)
Moléculas de DNA compreendendo a molécula de recombinante deste invento podem ser derivadas de qualquer uma das estirpes de B. pertussis usando técnicas conhecidas, e.g., isolamento do gene a partir de um banco de genes, obtenção de cDNAs a partir de um molde de mRNA ou via reacção em cadeia com polimerase (ver, Patente U.3. 4,800,159) ou a partir de isolados de amostras clínicas. Como alternativa, tal molécula de DNA recombinante pode ser sintetizada por técnicas de síntese de DNA convencionais. Ainda, várias estirpes de B. pertussis estão disponíveis ao pública em depositários comerciais, e.g., na American Type Culture Collection (ATCC), rockville, Maryland, U.S.A.
Tal como aqui è usado, o termo sequência de DNA que codifica uma proteína especificamente reactiva com anticorpos contra a toxina de tosse convulsa tipo selvagem que é defectiva na ligação a receptores da toxina da tosse convulsa em células alvo significa que uma sequência de DNA codificadora que codifica uma proteína com actividade de ligação a células alvo inferior á da toxina da tosse convulsa tipo selvagem mas que retem a capacidade de ser reconhecida pelos anticorpos anti-toxina da tosse convulsa, como seja a sequência codificadora de proteína compreendendo todas as subunidades (Sl, 52, S3, S4 e 55) substancialmente como descrito por Locht et al. (Science, 232;1258-64 (1986)) e todas as suas mutações ou mutantes. 0 termo mutações ou mutantes conforme se aplica ao oligómro B ou subunidades 52 ou S3 engloba qualquer derivado da molécula de DNA recombinante deste invento que codifica uma proteína defectiva na ligação a receptores de células alvo e ainda retem a capacidade de ser reconhecida por anticorpos anti-toxina da tosse convulsa. Tais mutações podem ser preparadas por deleção, adição, substituição ou rearranjo de aminoácidos e das suas sequências de ácido nucleico codificadoras, ou comes alternativa, ou por modificação química.
As- realizações preferidas da molécula de E>NA recombinante deste invento incluem, mas não estão limitadas a uma molécula de DMA recombinante contendo deleçSes de aminoácidos em ftsn^ljd ou Tuir^i ou Tir^*’5'^ da subunida.de S2 e/ou Lis^ ou
Tir ou Lis ou Lis ou Tir ou Tir da subunidade
S3, substituições de aminoácidos individuais, e.q., Asn^l'1u a Asp da subunidade S2.
As realizações mais limitadas a deleçSes de Asn^yj 105 10?
dade S2e/ou Lis ' ou Tir1' ou preferidas incluem mas não estão
-r- 102 T- 102-103 ou Tir ou Tir na subuniΤίΓ^'15· na subunidade S3.
As mutações na SI (e.g., deleçSes de Trp ou His’° ou 40 1^9
Ser ou Glu ~ ) estão descritas no F‘edido de Patente U.S. N2 de
Série 07/381,888, apresentado em 13 de Julho, 1989 (equivalente à publicação do Pedido de Patente Europeia IMS 0352250), toda a descrição do qual está aqui incluída como referência. As mutações de outros resíduos de aminoácidos da su.bu.nidade SI (i.e., substi9 13 ΐοφ tu.içSes de Arg , Arg , Glu * ) estão descritas por Pizza et al„, Science, 2436;497-500 (1939) e EP-A-0 396 964 e estão aqui incluídas como referência.
De preferência a sequência de DNA codificadora deste invento codificará, uma proteína que se assemelha à proteína natural ou. tipo selvagem tanto quanto possível na estrutura terciária, i.e., uma proteína que é capaz de ser reconhecida pelos anticorpos anti-toxina da tosse convulsa, ainda que seja deficiente na. activida.de de ligação a receptores em células alvo.
Outras realizações da molécula de DMA recombinante deste invento incluem uma sequência codificadora da toxina da tosse convulsa qu.e codi f ica algumas mas não todas as subunidades.
| Rea1i zações | e>· | sempi if icativas | incluem, mas | não estão | limitadas a |
| Dl <S2 e S4> | 5 | .02 (S3 e S4), | S1-S2-S4, SI | -S3-S4 e o | oligómero B |
| (S2, S3, Ξ4 | s | S5) . |
Numa outra realização a molécula de DMA recombinante do invento pode estar na forma de um híbrido que é uma sequência codificadora que codifica um polipeptídeo de fusão contendo sequências adicionais que podem ser portadoras de um ou mais epítopos de outras subunidades PT, por exemplo, tepítopo S21-tsubunidade S31 , etc., outros antigénios de B. pertussis ou outras antiçénios que não sejam de B. pertussis. Como alternativa, a molécula de DMA recombinante do inventa pode ser fundida com a sequência, de DMA codificadora de um polipeptídeo veículo que tem propriedades imuna-estimuladoras, como no caso de um adjuvante ou que de outra forma aumente a resposta imune à(s) subunidade(s) da toxina de B. pertussis ou que seja útil na expressão, purificação ou formulação da(s) subunidade(s) da toxina de B, pertusuuíTipr ϋβι ju e1emento
A molécula de er sequências r eg u. 1 a d o r , uma
E>HA recombinante de DMA adicionais.
ou ma i.
marcas deste invento pode s, incluindo e.g., um selectivas e sequências que codificam funções de replicação e manutenção. A região reguladora tipicamente contem um promotor encontrado a montante da sequência codificadora deste invento, a qual funciona na ligação de RMA-polimerase e na iniciação da transcrição de RNA. Por outras palavras, o elemento ou região regulador é operacionalmente ligado à sequência codificadora deste invento. Será apreciado pelos fami1iarizados com a matéria que a selecção de
Γ Θ Q Ϊ. Õ td hi reguladoras dependerá da célula hospedeira a ser empreEste invento também está relacionado com um plasmídeo de DNA recombinante compreendendo a molécula de DNA recombinante deste invento.
Um outro aspecto deste invento é uma célula hospedeira transformada com a molécula de DNA recombinante deste invento. Tal célula hospedeira é capaz de crescer num meio de cultura adequado e de expressar a sequência codificadora do invento. Tal célula hospedeira prepara-se pelo método deste invento, i.e., por transformação de uma célula hospedeira pretendida com o plasmídeo deste invento. Tal transformação é conseguida pela utilização de técnicas de transformação convencionais. Ainda, a molécula de DNA recombinante deste invento pode er integrada no genoma da. célula hospedeira por técnicas convencionais, e.g., recombinação homóloga. As células- hospedeiras mais preferidas deste invento incluem as pertencentes á da espécie E. co 1i e do género Bordete 11a. Outras células hospedeiras que podem ser adequadas incluem, mas não estão limitadas a células de insecto, leveduras e outras células bacterianas, e.g., Streptomyces, Bacillus e 5aImonella. Assim, este invento e o seu produto não está limitado a qualquer célula hospedeira específica, presente inventa também está relacionado com uma proteína codificada por uma molécula de DNA recombinante deste invento. Preferencialmente tal proteína é produzida pela célula hospedeira transformada deste invento, mas tal proteína pode ser preparada por técnicas de síntese peptídica convencionais.
A proteína deste invento preferencialmente não tem mais do que 507. de ligação a haptoglobina ou citotoxicidade para CHO comparada com a toxina da tosse convulsa tipo selvagem. Mais preferencialinente, a proteína deste invento tem menos de 107. e mais preferencialmente menos de 57. das actividades testadas comparado com a toxina da tosse convulsa tipo selvagem.
presente invento também está relacionado com um método de produção da proteína codificada pela molécula de DNA recombinante deste inveto que s-e caracteriza pela cultura do hospedeiro transformado do invento num meio de cultura adequado e isolamento de tal proteína. Por meio de cultura adequado pretende-se significar meios que permitirão a tal hospedeiro expressar a sequência codificadora do invento em quantidade recuperável. Será apreciado pelos fami1iarizados com a matéria que o meio de cultura adequado a usar dependerá da célula hospedeira empregue. 0 isolamento da proteína assim produzida è conseguido a partir de um lisado da cultura da célula hospedeira ou se apropriado, directamente a partir do meio de cultura do hospedeiro e tal isolamento é realizado por técnicas convencionais de isolamento de proteínas. Ver, por exemplo, Burns et al., Patente U.S. 4,845,036.
Numa realização preferida deste invento, a sequência codificadora da proteína do inventa é expressa numa célula hospedeira transformada de 5. pertussis para produzir uma proteína imunogénica ainda que substancialmente inactivada, i.e., uma proteína que é deficiente na ligação a receptores de células alvo e em adição, pode facultativamente ser deficiente em actividade de ADP-ribosiltransferase, mas que é ainda especificamente reconhecida pelos anticorpos ant.i-toxina da tosse convulse. Em tal sistema as sequências codificam toxinas de B„ pertussis estão tipicamente localizadas num vector suicida. Tal vector suicida contem uma quantidade suficiente de DNA bacteriano para propagar o vector suicida em E. co1i ou noutro hospedeiro adequado. Tal vector suicida também contem uma quantidade suficiente de DWA de B. pertussis delimitando a sequência codificadora da subunidade da toxina de forma a permitir recombinação entre um hospedeiro B. pertussis deficiente no gene da toxina e o gene heterólogo da toxina, é entendido pelos familiarizados com a matéria que não é essencial usar um hospedeiro B. pertussis deficiente no gene da to;··, ina, mas que a ausência do gene da toxina no hospedeiro antes da recombinação facilitará o rastreio e isolamento dos hospedeiros recombinantss que tenham incorporado o gene de interesse. Os recombinantes de B. pertussis que derivam de tal recombinação homóloga são então seleccionados por técnicas convencionais. Ver e.g.;, Stibitz et a 1. , Gene 50:133-140 (1986).
invento também engloba uma vacina capaz de induzir imunidade contra a tosse convulsa. Tal vacina compreende um quantidade imunoprotectora e não tóxica da proteína deste invento, mas não está limitado à utilização destas quantidades.
Outras realizações da presente invento incluem uma vacina com células completas para estimular a protecção contra a tosse convulsa. Tal vacina compreende a proteína deste invento expressa na superfície de células hospedeiras transformadas deste inventa. As células hospedeiras transformadas são subsequentemente inactivadas por técnicas convencionais para constituir uma vacina imunoprot.eetara e não tóxica.
Outros antigénios que são conhecidos como sendo desejável administrá-los em conjunção com a toxina da tosse convulsa podem também estar incluídos na vacina deste invento. Tais componentes adicionais são conhecidos dos fami1iarizados com a área. Componentes adicionais preferidos incluem toxóide do tétano e/ou toxóide da difteria assim comia hemaglutinina filamentosa (FHA), aqlutinogénias 2 e 3, a snt.igénia de 69 KD, e/ou qualquer outro antigénio protector de B. pertussis.
A obtenção de tal vacina permite assim um outra aspecto do presente invento, i.e., um método para imunização de um humano contra a tosse convulsa que se caracteriza pela administração da vacina do invento a um humano.
modo de administração da vacina do invento pode ser qualquer via adequada que liberte uma quantidade imunoprotectora da proteína do presente invento parai o hospedeiro. No entanto, a vacina é preferencialmente administrada parenteralmente pelas vias intramuscular ou subcutânea. Caso se pretenda podem ser enmpregues outros modos de administração, como seja administração oral ou através de outras vias parenterais, i.e., intradérmica, intranasal ou intravenosa.
A vacina do invento pode ser preparada como uma composição farmacêutica, contendo um veículo farmacêuticamente aceitável , imunoprotector, não tóxico e estéril. Ma vacina do invento, uma solução aquosa da proteína deste invento pode ser usada directamente. Como alternativa, a proteína deste invento com ou sem 1ioíi1ização prévia, pode ser misturada com qualquer um dos vários adjuvantes conhecidos. Sempre que a administração da vacina seja parenteral, a proteína do invento pode ser facultativamente misturada ou adsorvida a qualquer adjuvante convencional para aumentar uma resposta imune. Tais adjuvantes incluem entre outros, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, muramildipeptídeo e saponinas, tais como Qu.il A. Ainda como outro exemplo alternativo da preparação da vacina do invento, a proteína do invento pode ser encapsulada dentro de micropartícu1 as tais como lipossomas. Ainda num outro exemplo alternativo da preparação da vacina do invento, a. proteína do inventopode ser administrada com uma macromolécula imuno-estimuladora, por exempla toxóide do tétano.. Como a 1 ternativa, uma suspensão aquosa ou solução contendo a proteína do invento é de preferência tamponada a pH fisiológico. A proteína do invento pode também ser destinada è ingestão oral .
Pi preparação da vacina é geralmente descrita em New Tremias and Developinents in Vaccines, Voller et a 1 . , (eds.), University Park Presa, Baltimore, Maryland, 197S. A encapsulação em lipctssomas está descrita por Fullerton, Patente U.S. 4,235,877. A conjugação das proteínas a macrDmo1écu1as está descrita por exemplo por Likhite, Patente U.S. 4,372,945 e Armor et al, Patente U.S. 4,474,757. A utilização de Guil A foi descrita por Dalsgaard et al . , Ac ta Vet Scand 1.8:349 (1977).
É preferida que a vacina do invento, quando numa preparação farmacêutica, esteja presente em formas de dosagem unitária. A dose profiláticamente adequada eficaz pode ser determinada fácilmente pelos fami1iarizados com a matéria. A quantidade eficaz da proteína contida na vacina deste invento pode ser na gama de quantidades eficazes de antiqénio das vacinas convencionais acelulares de B. pertussis, i.e., 5-25 pg de proteína por dose unitária. Esta dose pode ser facultativamente libertada com várias quantidades de hemaglutinina filamentosa (FHA) (aproximadamente 10-25 pg por dose) e/ou aglutinogénios ou outros antigénios. No entanto será entendida que o nível de dosagem específico para qualquer doente particular dependerá de uma variedade de fsctores incluindo a idade, a saúde geral, a altura da administração, a via de administração, efeitos siner-gísticos com quaisquer outras drogas a ser administradas e o grau de protecção pretendida. A administração pode intervalos adequados se necessário.
ser repetida em
Os exemplos que se seguem são ilustrativos mas não limitantes do presente invento. As enzimas de restrição e outros reagentes foram usados substancialmente de acordo com as instruções do fornecedor.
EXEMPLOS
Modificação de subunidades da toxina da tosse convulsa por mutagénese dirigida:
Exemplo 1 Mutagénese de S2 convencional adequado fácilmente adquirido.
plasmídeo pF‘TX42, que codifica a sequência de nucleótidos completa do gene da toxina da tosse convulsa (Locht et al , Science, 252:1258-64 (1986)) foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e X.mal . Um fragmento de; 750 pares de bases (pb) foi isolado e ligado a M13mpl9 préviamente digerido com Xbal e Xmal 0 vector M13mpl9, que pode existir como uma entidade de cadeia simples ou de cadeia dupla, é um vector de subclonagem para a mutagénese dirigida e pode ser Ver J. Messinq, Meth Enzymol, 101:20-78 (1983). O vector resultante, designado 0RIT20200, codifica a subunidade 82 da toxina da tosse convulsa, mais DNA não traduzido 5’ + 3’. Este vector foi então usado para experiências subsequentes de mutagénese. A mutagénese dirigida foi feita de acordo com o 01igonuc1eotyide-Directed in vitro Mutagenesis System (Amersham, Arlington Heights, IL). Um oligómero sintético dirigido contra a região de mutagénese foi emparelhado com a forma de cadeia simples de 0RIT2O2O0. Este oligómero emparelhado foi então usado como iniciador para replicar um vector que era o complemento de 0RIT20200 excepto alterações específicas feitas ha região do oliqómero sintética. Assim, qualquer um familiarizado com a área é capaz de rápidamente induzir alteraçSes específicas num vector sem afectar as restantes sequências de ácido nucleico.
Para eliminar o aminoácido 102 (tirosina)
Tir
102 da subunidade S2, usou-se o seguinte oligonucleótido sintéticos
5’ CGTTGCTGTAGTGATCCGTT 3’
Este vector resultante, que não possui o codão do aminoácido 102 (i.e., Tir) foi designado #RIT20201. ele foi então usado em experiências de mutaqénese subsequentes.
Para eliminar a tirosina 103 (Tir10') de 0RIT20201, u.sou-se o iniciador de mutagénese que se segues
5’ TGACGTTGCTGTGATCCGTT □ faqo resultante sem os codSes para Tirrl02 T. 103 . . , .
e Tir , toi designado 0RIT12O202. Para, assegurar que se deram as mutações correctas e que não foram introduzidas mutaçSes indesejáveis no gene da subunidade 52, as subunidades S2 de ambos os vectores mutantes foram seqyuenciadas. A forma replicativa de cadeia dupla dos i fa.qos 0RIT20201 e 0RIT20202 foram então diqeridos com Xbal e Xmal t e os fragmentos de 750 pb codificadores das mutaçSes 52 foram inseridos nos sítios Xba.I e Xmal do plasmídeo pRIT13070. 0 plasmídeo pRIT13O70 (Capiau et al., Pedido de Patente U.S. Número de Série 07/222,991 apresentado em 22 de Julho, 1988, equivalente
J á Publicação do Pedido de Patente Europeia N90352250) é um plasmídeo recombinante contendo o gene estrutural completo da toxina da tosse convulsa inserido no sítio EcoRI do pUC7., o qual é um vector de clonagem comum (Vieira et al.. gene, 19;259-68 (1982)).
Os plasmídeos recombinantes, i_antertdo as mutações 52
102
Tir e Tir inseridas no gene estrutural completo da toxina da tosse convulsa, foram designados pRIT13241 e pRIT13242 respectivamente. Estes plasmídeos foram novamente sequenciados para verificar a sua sequência de nucleótidos modificada.
Para eliminar o codão asparagina 1Θ5 da subunidade 52 (Asn ^), usou—se a reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Saiki et al., Science 230:1550-1354 (1965)); o sistema PCR pode ser adquirido comercialmente à Perkin Elmer Cetus (Emeryville, California).
105
A mutaçénese de Asn foi realizada como se segue:
(a) 0 plasmídeo pRIT13070 foi primeiro desnaturado, em seguida dois oligonuc1eátidos sintéticos complementares de uma cadeia do plasmídeo desnaturado foram emparelhados. D primeiro oligonucleótido:
(I) 5’ CGTTCTAGACCTGGCCCAGCCCCG 3’ codifica um sítio de restrição XbaI 5’ relativamente ao sítio a ser mutagenizado, o segundo oligonucleótido:
(II) 5’ TGGCGGTGACGCTGTAGTAG 3’ abrange o sítio a ser mutagenizado. 0 DMA entre os dois oligonu··· cleótidos emparelhados foi então amplificado via PCR.
(b) Mo segundo passo, dois oligonucleótidos adicionais, complementares da cadeia de DMA oposta do passo (a), foram emparelhados com o plasmídeo pRIT13O70 desnaturado. Um oligonu.cl&otiuO.
(III) 5’ TGTCCCGGGGCGGTGGTTCGAGTG 3’ codifica um sítio de restrição Xmal 3’ re1ativamente ao sítio a ser mutagenizado e o outro oligonucleótido:
(IV) 5’ CAGCGTCACCGCCACTCGCCTGCTCTCCAG 3’ abrange o sítio a ser mutagenizado e é complementar (i.e., capaz da formação de pares de bases) do o1igonuc1eiótido (II) abrangendo 14 nucleótidos. 0 DNA entre os oligonucleótiods emparelhadas (III) e (IV) foi então amplificado via PCR. Finalmente, os dois fragmentos de DNA amplificados foram emparelhados um com o outro e a amplficação do fragmento de DNA mutagenizado entre os sítios Xbal e XmaI foi realizado via PCR. Este fragmento de DNA amplificado foi digerido com as enzimas· de restrição Xbal e XmaI e depois inserido nos sítios Xbal e Xmal de um pRIT13070 não mutagenizado.
Para substituir o codão asparagina (Asn^J) da subunidade Ξ2 com ácido sspártico (Asp), usou-se o sistema PCR. 0 processo é o mesmo da deleção de Asri descrito atrás, excepto serem usadas diferentes sequências de oligonucleótiodos. Os oligómeros (II) e (IV) foram substituídos pelos oligómeros (lis) e (IVs), respectivamente:
(IIs) 5’ TGGCGGTGACGTCGCTGTAGTAG 3’ (IVs) 5’ CAGCGACGTCACCGCCACTCGCCTGCTCTCCAG 3’
Após transformação, os plasmídeos mutantes recDmbinantes foram analisados por análise da sequência de DNA para verificar as suas sequências de nucleótidos modificadas.
Exemplo 2. Mutaqénese de S3
A digestão de pPTX42 (Locht et a 1. , referido atrás) com a enzima de restrição PstI deu, entre outros, um fragmento de 96õ pb contendo a região codificadora da subunidade S3 da toxina da tosse convulsa. Este fragmenta foi isolada e ligado no sítio PstI do M13mp? (Messing et a 1« , referido atrás). D fago recombinante, designado #RIT2030O foi então usado em experiências de mutagénese (sistema Amersham, supra) para as mutações da subunidade S3 que se segue:
Deleção Sequência de 01iqonucleótidos (5’ - 3’)
Lis10 TGAACAGTGCCGGCGGGATG Tir92 GCCCGGTCTTTATGGTCGTG Lis93 GTTGCCCGGTGTATATGGTC Tir1*2 CCTTGCTGTAGTGATCCGCA Tir100 TGACCTTGCTGTGATCCGCA Lis105 TGGCCGTGACGCTGTAGTAG
Após mutagénese, os mutantes específicos de sítio foram sequenciados parei assegurar que a mutação correcta foi introduzida. As formas repl ice.tivas de cadeia dupla do DNA fágico foram então isoladas e digeridas com Bq 111 e Μ1 u I. Os fragmentas de DNA de à'?0 pb, contendo a.s várias mutações S3, foram então isolados.
Uma. inserção Xmal-EcoRI de 2,7 kpb do plasmídeo pRIT13070 (referido atrás) foi clortado em pUCP, um vector de clonagem convencional e que pode ser adquirido comerciaImente.
Este plasmídeo criado, designado pPT3, foi subsequentemente digerido com Bq 111 e ΜI u I . Neste sítio BqlII-KluI foi ligado o fragmento Bq1II-N1uI de 690 pb referido atrás, contendo as várias mutações S3.
Estes plasmídeos recombinantss, codificadores das várias mutações S3, foram por sua. vec digeridos com BamI e Bq 1 11 . Os fragmentos, 1 750 pb de comprimento, foram isolados e ligados nos sítios BamHI-BqIII do pRIT13070. As várias mutações S2 e S3 estão resumidas na Tabela I mais adiante (mutações simples #1 a 9) .
Exemplo 3. Hutaqénese de SI
A digestão de pPTX42 (Locht et a 1 . , referido atrás) com a enzima de restrição Sau3A deu entre outros um fragmenta de 560 pb contenda a maior parte da. região codificadora da subunida.de Sí da toxina da tosse convulsa, mas sem a região codificadora do extremo carbonilo. Este fragmento foi isolado e ligado ao sítio BamHI do M13mpl8 (Messing et a 1 „ , referida atrás). 0 fago recombinarite, designado #RJ.T20O01 foi então usado para as experiências de mutagénese usando 01igonucleotide-Directed in vitro Mutagenesis Systems da Amersham, suara.
Para eliminar o aminoácido 26 (triptof ano) , i.e., Trp^ da subunidade SI, usou-se o seguinte o1igonuc1eótido sintético:
CGTTGTTTCCCGCCGTGAAT 3 ’
Após mutagénese, o mutante específico de sítio foi sequenciado para assegurar que a mutação correcta tinha sido
introduzido. A forma replicativa de cadeia dupla do DNA fágico foi então isolado e digerido com AccI. 0 fragmento de DNA de 300 pb, contendo a mutação em Sl, foi então isolado e ligado no sítio AccI do pRIT1307O (referido atrás).
Um processo semelhante foi usado para introduzir as deleçSes ou substituições de aminoácidos da subunidade Sl na posição 9 (Arg), 13(Arg), 35(His), 4Õ(Ser) e 129(Slu). As mutações simples na subunidade Sl estão apresentadas na Tabela I mais adiante (mutações #11 a 22).
Exemplo 4. Combinação de mutações
Os plasmídeos derivados de pRIT1307O do Exemplo 1 <i..e„, mutantes S2) foram digeridos com Xbal e Xmal para dar fragmentos de 750 pb que codificam mutações S2. Os fragmentos Xbal-Xmal substituirão o fragmento Xbal-Xmal de plasmídeos derivados do pRIT1307O do Exemplo 3 (i.e., mutantes Sl) para dar uma molécula de DNA recombinante tendo mutações em subunidades Sl e Ξ2 , e.g., plasmídeos derivados de pRIT13070 do Exemplo 2 (i.e., mutantes 53) podem ser digeridos com Bq 111 e BsmHI. Os fragmentos de DNA então isolados (aproximadamente 1 750 pb) substituirão o fragmenTrp^·^ (Sl )-Asn^ÍJ,J(S2) . De forma semelhante, os to BqIII-BamHI dos plasmídeos (i.e., mutantes Sl) para dar e.g., irp ~(Ξ1)-Tir ''(bi matéria é pois capazde criar derivados de pRIT13070 do Exemplo 3 mutações em subunidades Sl e S3;
. Ainda, alguém familiarizado com a mutações adicionais combinações de
Sl, 31-32, S1-S3, S2-S3 ou S1-S2-S3 baseado nesta divulgação. As várias combinações de mutações estão apresentadas na Tabela I mais adiante (mutações #10 e 23 a 31).
Exemplo 5. Deleção do gene da toxina de iim hospedeiro B. pertussis
Para expressar um gene da toxina da tosse convulsa codificador de uma ou. ma.is das referidas descritas, é desejável eliminar primeiro o gene da toxina tipo selvagem de B. pertussis da célula hospedeira. Assim o gene da toxina codificado por um plasmídeo não se recombinará com o gene da toxina codificado no cromossoma bacteriana. Assim, a sequência codificadora da toxina da tosse convulsa da estirpe vacinai B. pertussis Tohama I foi sujeita a deleçSes como se segue:
A estirpe de B. pertussis Tohama I (Sato, et al., em Manclark et a 1 . , (eds.), International Symposiunt on Pertussis. pp. 51-57, U.S. Departmente of Health, Education and Welfare, Washington, D.C. (1979) ou Kasuga et al. Kitasato ftrch. Exp. Med. 27:57-62) foi semeado em meio BG (agar £:S, Difco Laboratories (Detroit, MI), suplementado com sangue de carneiro desfibrinizado <25% v/v) e contenda 400 pg/ml de estreptomicina. Os mutantes resistentes â. estrept.omicina foram então semeados em meio BG contendo 50 pg/ml de ácido nalidixico. As colónias que surgiram, as quais eram resistentes à estreptomicina e ao ácido nalidixico foram então usados em experiências de conjugação.
plasmídeo pT0X9 (Black et a 1 . , Infect Iminun, 55:2465-70 (1987)) contem o gene da toxina da tosse convulsa num fragmento de DNA da tosse convulsa de aproximadamente 10 kpb. 0 plasmídeo pT0X9 foi digerido com as enzimas de restrição ΚρηI e Bq111 , em seguido tratado com a exonuclease Ba151 e finalmente novamente ligado. Este plasmídeo resultante, em que o qene da toxina da tosse convulsa foi eliminado, foi subsequentemente digerido com Ciai . Isto deu um fragmento de aproxiamdamente 7 Kpb contendo 55 regiSes delimitantes de um gene da toxina da tosse convulsa comi deleções. Este fragmento ClaI—Ciai foi preenchido nos extremos, isolado e depois religado no sítio HindIII (extremo preenchido) do plasmídeo pSORTF'1 . 0 plasmídeo pSORTPl foi foi derivado do plasmídeo pRTPl (Stibitz et al . , Ger>e, 50:155—140 (19E<ó)) no qual o gene da qentamicina foi inserido. Portanto, pSORTPl contem o gene de resistência á gentamicina assim como o gene que confere sensibilidade è estreptomicina. O plasmídeo pSORTPl não se replica autónomamente em B. pertussis e portanto deve recombinar-se com o cromossoma de B. pertussis.
Antes da recombinação, o plasmídeo pSORTPl contenda as sequências de nucleótidos delimitantes do gene da toxina da tosse convulsa, foi introduzido em E. coli estirpe SM10 (Simon et al, BioTechnoIoqv, l_:7S-4-791 (1983)). Foram cultivadas várias colónias e o DMA de plasmídeo de cada um daqueles clones foi individualmente analisado por análise da sequência de DNA para. identificar e verificar as deleçSes.
Um clc-ne E. coli SM10 contendo o plasmídeo recombinante pSORTPl foi conjugado com a estirpe tipo selvagem B. pertussis Toha.ma. I (descrito atrás). Esta estirpe era resistente è estreptomicina (uma característica recessiva) e resistente ao ácido nalidixico. Os exconjugados de B. pertussis foram então semeados em placas de agar BG contendo ácido nalidixico e gentamicina. As colónias resistentes à qentamicina, as quais eram também sensíveis á estreptomicina, surgiram apenas guando todo o plasmídeo recombinante foi integrado no cromossoma de B. pertussis. Os clones resistentes á gentamicina foram então semeadas em placas de BG contendo 400 pq/ml de estreptomicina para seleccionar um segunda casa de recombinação resultando em revertentes de B. pertussis resistentes à estreptomicina. Estes revertentes surgem devida a uma segunda recombinação homóloga entre o cromossoma e o plasmídeo inserido. Muitas das estirpes resultantes resistentes à estreptomícina que eram sensíveis è qentamicina novamente perderam a toxina da tosse convulsa tipo selvagem através da recombinação. As colónias foram analisadas por hibridaçã.o de transferências Southern para verificar a perda do gene tipo selvagem da toxina da tosse convulsa. A estirpe resultante de B. pertussis., que não possui o gene da toxina da tosse convulsa foi então usada na expressão dos genes da toxina da tosse convulsa mutagenizados.
Exemplo ó(a) . Expressão dos Genes Modificados da Toxina da Tosse Convulsa em B. pertussis com um plasmídeo que se replica
Os plasmídeos derivados de pRIT13070 contendo as mutações descritas nas suhunidades S2 ou S3 foram digeridos com a enzima de restrição EcoRI. Os fragmentos resultantes de 4,7 kpb foram ligados no único sitio EcoRI do plasmídeo pLAFRII (Friedman et al - , Gene, 03:259-290 (1932)). 0 plasmídeo pLAFRII contem um gene de resistência à tetracic1ina e portanto os transformantes com este plasmídeo podem ser seleccionados em meio de crescimento contendo 12,5 pg/ml de tetracic1ina. Os plasmídeos recombinantes foram então introduzidos em E. coli SM10. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram ainda analisados por sequenciaC ão dt
DMA relativamente presença dos genes da toxina. As colónias contendo as mutações pretendidas foram conjugadas com estirpe de pertussis, eliminado o gene da toxina da tosse convulsa, como descrito no Exemplo 5. As estirpes de B. pertussis rsistentes à tetraciclina foram então cultivadas em meio de Stainer-Scholte modificado (Difco) contendo 10pg/ml de tetraciclina. As células foram então separadas do meio de cultura por centrifugação. As células e o meio de cultura foram ambos analisados por transferências Western usando anticorpos monoclonais específicos contra a toxina da tosse convulsa (ver Francotte et a I . , Cold Spring Harbor Labotratory, Cold Spring Harbor,NY, 1989 e Frank et al . , Infect Immun, 48: 195-201 (1984)).
Para comparação, a estirpe tipo selvagem de 8. pertussis (Tohama I) produziu e secretou uma toxina da tosse convulsa para, o meio de cultura. A estirpe de 8. pertussis em que o gene da toxina da tosse convulsa (PT) foi eliminado não expressa uma toxina da tosse convulsa. No entanto, quando esta estirpe foi transformada com um gene PT tipo selvagem, inserido em pLAFRII(supra), PT foi expresso em níveis comparáveis mas ligeiramente inferiores conforme determinado por ELISA. (Ver Exemplo 7). Os clones contendo os genes mutantes da toxina da tosse convulsa produziram quantidades significativas, e.g., 1-4 pg/ml de proteínas toxina mutagenizadas que se mostrou serem secretadas para o meio de cultura.
Exemplo 8(b) Expressão dos genes mdificados da toxina da tosse convulsa em B. pertussis com um plasmídeo integrado no cromossoma
Os plasmídeos derivados de pRITl-3070 contendo as mutações ou combinações descritas destas mutações foram usados para transformar por electroporação 8. pertussis sem o gene da toxina da tosse convulsa (descrito no Exemplo 5). A electroporação foi realizada, como se segue. 8. pertussis foi cultivada em 1© ml de meio Stainef—Scholte modificado até à fase exponencial. As células foram colhidas por centrifugação, lavadas duas vezes em água arrefecida em gelo e ressuspensas em 2 a 5 ml de água. Sô μΐ desta suspensão e 2 pg de DNA do plasmídeo foram misturados e submetidos a um único pulso eléctrico (2,5 MW, 2Θ0Ω, 25pF) num eiectrodocuvete de 0,3 mm de intervalo. As células foram directamente transferidas para 1 ml de meio, incubadas a 37*C durante 1 a 4 horas e semeadas em placas Bordet-Gengou contendo ampicilina. Como os plasmídeos derivados de pRIT13070 são incapazes de se replicarem em B. pertussis, a resistência à ampicilina pode ser adquirida apenas pela integração do plasmídeo por recombinaçSo homóloga entre o plasmídeo e □ cromossoma.
As estirpes de B. pertussis resistentes à ampicilina foram cultivadas. em meio Stainer—Scholte suplementado com 50 p.q/ml de ampicilina. As células foram então separadas do meio por centrifugação. 0 scbrenadante foi então analisada par transferências Western e ELISAusando anticorpos monoclonais e policlonais específicos da toxina da tosse convulsa (supra ). Os clones contendo os genes rautantes da toxina da. tosse convulsa produziram quantidades significativas (0,5 - 10 pg/ml) de proteína da toxina mutagenizada para o meio de cultura.
Exemplo 7. Actividade Biológica dos Polipeptídeos da Toxina da Tosse Convulsa Modificados
Us meios de cultura das várias estirpes de B. pertussis produtoras de diferentes proteínas genét.icamente modificadas da toxina da tosse convu 1 safaram analisados por um ensaio iniunossorvente ligado enzimas (ELISA) usando placas de microtitu1ação revestidas com haptog1obina como descrita par Franctte et al . , (supra.) . A absorvância foi comparada com a concentração calculada dos vários análogos da toxina no meio de cultura. Esta análise permitiu, a identificação de proteínas mutantes; que possuíam actividade de ligação a haptog1obina modificada. Nenhuma das mutações na subunidade 33 alterou significativamente a. capacidade de ligação à haptoglobina da toxina, da tosse convulsa. A mutação na subunidade 32 diminuiu a capacidade de ligação à haptoglobina da. toxina da. tosse convulsa em várias quantidades. A proteína mutante contendo a deleção Iir * na subunidade S2 ligou-se à haptoglobina com aproximadamente 50'/. de eficácia. A capacidade de 107ligação da proteína PT contendo uma deleção dupla (i.e., Tir l0'-') -foi reduzida a aproximadamente 4%, comparado com a molécula tipo selvagem; a. capacidade de ligação à haptoglobina da proteína PT contendo a deleção Asn^J foi diminuída até níveis não detectáveis (i.e. menos de 0,57. da actividade tipo selvagem). Estes
105 resultados indicam que Asn ' da subunidade 32 é essencial para a ligação à haptoglobina. A mutação análoga na. subunidade 33 (Lis^K, J) não afectou a capacidade de ligação è haptoglobina, sugerindo que a ligação da toxina à haptoglobina e a receptores tipo haptoglobina ocorre especificamente via Dímero 1 (i.e., subunidades P;2 e S4).
Conforme indicado atrás, o Dímero 2 (subunidades S3 e s4> parece ligar-se específicamente a membranas de células CHD (Brennan et a. 1 . , supra) . Portanto, os análogos da toxina da tosse convulsa contendo alteraçSes na subunidade 33 podem afectar esta citotoxicida.de específica de células CHD. As proteínas mutantes analisadas nestes exemplos apresentaram redução de citotoxicidade
102-103 e as ueieçoes Tir e
Li<
10Σ na subunidade S3 apresentaram redução significativa em tal citotoxicidade. Para estas deleçSes,
i.e., Tir e Lis , nenhuma citotoxicidade foi detectável no meio de cultura, indicando um factor de desintoxicação aparente de pelo menos 100 vezes. Notou-se ainda que todas as proteínas mutantes foram reconhecidas pelos anticorpos raonoclonais contra as subunidades individuais.
Exemplo 8. Preparação de Vacina Parenteral
5-25 pg da proteína toxina mutagenizada, preparada de acordo com o método do Exemplo 6, foi misturada com um adjuvante de alumínio, como seja hidróxido de alumínio, para produzir uma vacina numa forma adequada à. incorporação numa forma de dosagem parentera1.
Foi apreciado que o invento não está limitado ás realizações particulares descritas atrás nos Exemplos. Portanto todas as realizações do invento, pensa-se estarem dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.
TABELA 1
| Mutação | S1 S2 S3 | PLASMIDEOS DERIVADOÍ PRIT13070 |
| 1 | Tyr102 -> Δ102 | pPTAs2Y102 |
| 2 | Tyr102-103 -> Δ102-103 | pPTAs2Y102-103 |
| 3 | Asn105 -> Δ105 | pPTAs2N105 |
| 4 | Lys10 -> Δ10 | pPTAs3K10 |
| 5 | Tyr92 -> Δ92 | pPTAs3Y92 |
| 6 | Lys93 -> Δ93 | ρΡΤΔδ3Κ93 |
| 7 | Tyr102 -> Δ102 | ρΡΤΔδ3Υ102 |
| 8 | Tyr102-103 -> Δ102-103 | ρΡΤΔδ3Υ102-103 |
| 9 | Lys105 -> Δ105 | ρΡΤΔε3Κ105 |
| 10 | Asn105 -> Δ105 Lys105 -> Δ105 | ρΡΤ-ΝΚ |
| 11 | Arg9 -> Δ9 | pPTSlR9A |
| 12 | Arg9 -> Lys9 | PPTS1R9K |
| 13 | Arg13 -> Δ13 | pPTSlR13A |
| 14 | Arg13 -> Leu13 | PPTS1R13L |
| 15 | W26 -> Δ26 | pPTSlW26A |
| 16 | W26 -> Thr26 | PPTS1W26T |
| 17 | W26 -> Ile26 | PPTS1W26I |
| 18 | His35 -> Δ35 | pPTSlH35A |
| 19 | Ser40 -> Δ40 | pPTSlS40A |
| 20 | GIU129 -> Δ129 | pPTSlE129A |
| 21 | Glu129 -> Asp129 | PPTS1E129D |
| 22 | Glu129 -> Gly 129 | PPTS1E129G |
| 23 | W26 -> Δ26 Glu129 -> Asp129 | pPTSlW26A/E129D |
| 24 | W26 -> Thr26 GIU129 -> Δ129 | pPTSlW26T/E129A |
| 25 | W26 -> Thr26 Glu129 -> Asp129 | pPTSl W26T/E129D |
| 26 | Arg9 -> Lys9 Glu129-> Gly 129 | pPTSl R9K/E129G |
| 27 | Arg13 -> Leu13 Glu129-> Gly 129 | pPTSl R13L/E129G |
| 28 | W26 -> IIe26 Glu129-> Gly 129 | pPTSl W26I/E129G |
| 29 | Arg9-> Lys9 Αεη105->Δ105 Lys105->Al05 Glu129-> Gly 129 | pPT-R9ENK |
| 30 | Arg13->Leu13 Asn105->A105 Lys105->A105 Glu129-> Gly 129 | PPT-R13ENK |
| 31 | W26 -> Ile26 Asn105 -> Δ105 Lys105 -> Δ105 | Glu129-> Gly 129 | pPT-WENK |
Claims (11)
- REIVINDICACSES lé - Processo para codificada por uma molécula de uma sequência codificadora do a preparação de uma proteína DMA recombinante, compreendendo DMA que codifica uma proteína especificamente reactiva com anti-corpcs contra a toxina tipo selvagem da tosse convulsa mas a que falta a ligação aos receptores das células alvo da toxina da tosse convulsa, processo esse carscterizado por compreender os passos de:(a) introduzir a molécula de DNA recombinante numa célula hospedeira; e (b) cultivar a referida célula hospedeira num meio de cultura de forma a que a referida proteína seja expresS3. .
- 2.ê - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por à célula hospedeira pertussis tipo se1 vagem.faltar o gene da toxina B.
- 3ã - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreeender ainda o isolamento da proteína assim produzida.
- 4A - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar um B-oligómero da toxina B. pertussis mutante.
- 5â - Processo de acorda com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar uma toxina Bordetella pertussis mutante compreendendo uma sequência cadificadora de um dímero Dl mutante, ou um dímero Dl mutante e uma sequência codificadora da sub-unidade SI mutante ou do tipo selvagem, e a que faltam as sequências codificadoras das sub-unidades S3 e S5.óê - Processo de acordo com qualquer unta das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar uma toxina Bordetella pertussis mutante compreendendo uma sequência codificadora de um dímero d2 mutante, ou um dímero d2 mutante e uma sequência codificadora da sub-unidade sl mutante ou do tipo selvagem, e a que faltam as sequências codificando as sub-unidades s2 e s5.
- 7è - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar uma toxina Bordetella pertussis mutante compreendendo mutações na sequência codificadora da sub-unidade S2, ou na sequência codificadora da sub-unidade S3, ou em ambas as sequências codificadoras das sub-unidades S2 e S3.3ê - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar uma mutação de substituição ou deleção na sequência codificadora da sub-unidade da toxina S2 da Bordetella pertussis.
- 9ã - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a molécula de DNA recombinante codificar uma substituição de Asniy5 por Asp1<55.iOé - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a molécula de DNA recombinante compreender a deleção de 1 a 5 codoes de aminoácidos de qualquer uma ou de ambas as sequências codificadoras das sub-unidades 32 e S3.111 - Processo de acordo com a reivindicação
- 10, caracterizado por as deleçSes na sequência codificadora da sub-unidade S2 serem seleccionadas entre as deleçSss dos codSes 105 i 00 10^-103.de aminoácidos piara. Asn ' , Tir e Tir ε/ou as deleçSes na sequência codificadoras na sub-unidade S3 serem seleccionadas entre as deleçSes dos codSes de aminoácidos para Lis 102-103T ir105Tir102121 - Processo de acordo com as reivindicações la
- 11, caracterizado por a sequência codificadora da sub-unidade SI da Bordetella pertussis compreender uma ou mais mutações de forma a que à toxina da tosse convulsa mutante por ela codificada falte actividade ADP-ribosi1transferase.131 - Processa de acordo com a reivindicação
- 12, caracterizado por as mutações na sequência codificadora da sub-unidade SI serem seleccionadas entre as deleçSes em um ou9 1“^ hS mais dos aminoáciods Arg , ou Arg ou Trp-4 , ou His-'' , ou „ 40 127Ser , ou Glu141 - Processo para a preparação de uma vacina para estimular a protecção contra a tosse convulsa, em que a referida vacina compreende uma quantidade imunoprotectora e não-tóxica da proteína produzida pelo processo de qualquer uma das reivindica— ções 1 a 13, caracterizado por compreender a mistura de uma quantidade imunoprotectora da referida proteína com um veículo ou adjuvante imunologicamente aceitável.)15â - Processo para a preparação de uma vacina para estimular a protecção contra a tosse convulsa, caracterizado por compreender os passos de:(a) transformar uma célula hospedeira com uma molécula de DNA compreendendo uma sequência codificadora do DNA que codifica uma proteína especificamente reactiva anticorpos contra a toxina da tosse com convulsa tipo selvagem, mas a que falta a ligação aos receptores da célula alvo da toxina da tosse convulsa; e (b) formular uma quantidade imunoprotectora e não-tóxica da estirpe transformada resultante de modo a obter-se uma vacina.lóé - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a sequência codificadora do DNA fazer parte de um plasmídeo recombinante.17â - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a sequência codificadora do DNA estar integrada no genoma da célula hospedeira.
- 13é - Processo de acordo com a reivindicação ló, caracterizado por a célula hospedeira ser a E.coli.19é - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a célula hospedeira ser a B. pertu.ssis.Lisboa, 23 de Novembro de 1991
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