PL186847B1 - Konstrukcja DNA, wektor ekspresyjny, gospodarz, białko fuzyjne i sposób przygotowania bakterii - Google Patents
Konstrukcja DNA, wektor ekspresyjny, gospodarz, białko fuzyjne i sposób przygotowania bakteriiInfo
- Publication number
- PL186847B1 PL186847B1 PL94313979A PL31397994A PL186847B1 PL 186847 B1 PL186847 B1 PL 186847B1 PL 94313979 A PL94313979 A PL 94313979A PL 31397994 A PL31397994 A PL 31397994A PL 186847 B1 PL186847 B1 PL 186847B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- het
- tetc
- dna
- heterologous
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 11
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 32
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 102100023541 Glutathione S-transferase omega-1 Human genes 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 claims description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 16
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 12
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 24
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 15
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101710101517 Gluconate operon transcriptional repressor Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- 102100029173 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Human genes 0.000 description 2
- 101710100756 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920003134 Eudragit® polymer Polymers 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N (3s)-n-[(3s,5s,6r)-6-methyl-2-oxo-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-5-(2,3,6-trifluorophenyl)piperidin-3-yl]-2-oxospiro[1h-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3,6'-5,7-dihydrocyclopenta[b]pyridine]-3'-carboxamide Chemical compound C1([C@H]2[C@H](N(C(=O)[C@@H](NC(=O)C=3C=C4C[C@]5(CC4=NC=3)C3=CC=CN=C3NC5=O)C2)CC(F)(F)F)C)=C(F)C=CC(F)=C1F QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 101100404147 Bacillus subtilis (strain 168) nasE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 101710139711 IkB-like protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004099 anaerobic respiration Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 101150105804 cysG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150100899 nirC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150045642 nirD gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Konstrukcja DNA kodujaca fragment C toksyny tezcowej (TetC) i bialka antygenowego polaczone re- gionem zawiasowym, znamienna tym, ze konstrukcja ta obejmuje sekwencje DNA kodujaca bialko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a -Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tezcowej, Het oznacza heterologiczne bialko anty- genowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbe nie wieksza niz 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. 7. Wektor ekspresyjny zdolny do replikacji, obejmujacy konstrukcje DNA kodujaca fragment C toksyny tezcowej (TetC) i bialka antygenowego, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje DNA kodujaca bialko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a -Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tezcowej, Het oznacza heterologiczne bialko anty- genowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbe nie wieksza niz 4, (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. 14. Gospodarz, nie czlowiek, posiadajacy zintegrowana z chromosomalnym DNA konstrukcje DNA kodujaca fragment C toksyny tezcowej (TetC) i bialka antygenowego polaczone regionem zawiasowym, zna- mienny tym, ze zintegrowana w nim konstrukcja obejmuje sekwencje DNA kodujaca bialko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tezcowej, Het oznacza heterologiczne bialko antygeno- we, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbe nie wieksza niz 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. 21. Bialko fuzyjne kodowane przez konstrukcje DNA kodujaca fragment C toksyny tezcowej (TetC) i bial- ka antygenowego polaczone regionem zawiasowym, znamienne tym, ze konstrukcja ta obejmuje sekwencje DNA kodujaca bialko flizyjne o wzorze TetC-(Z)a -Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tezcowej, Het oznacza heterologiczne bialko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbe nie wieksza niz 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. 27. Sposób przygotowywania bakterii, polegajacy na transformowaniu bakterii konstrukcja DNA, znamienny tym, ze bakterie transformuje sie konstrukcja DNA kodujaca fragment C toksyny tezcowej (TetC) i bialka antygenowego polaczonych regionem zawiasowym, przy czym konstrukcja ta obejmuje sekwencje DNA kodujaca bialko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a -Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tezcowej, Het oznacza heterologiczne bialko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbe nie wiek- sza niz 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. PL PL PL
Description
Znane jest przygotowywanie konstrukcji DNA kodujących dwa lub więcej białek heterologicznych mające na celu ekspresję białek w odpowiednim gospodarzu w postaci pojedynczego białka fuzyjnego. Jednakże, często stwierdzano, że poddawanie w ten sposób fuzji dwóch białek ze sobą - prowadzi do niewłaściwie ufałdowanego białka chimerycznego, które nie zachowuje już właściwości pojedynczych składników. Na przykład, podjednostki B enterotoksyn Vibrio cholerae (CT-B) i E. coli (LT-B) są silnymi immunogenami śluzówkowymi, ale fuzje genetyczne z tymi podjednostkami i podjednostkami mogą zmieniać strukturę i właściwości nośników i skutkiem tego ich immunogenność (patrz M. Sandkvist i in. J. Bacteriol. 169, str. 4570-6, 1987, Clemens i in., 1990 i M. Lipscombe i in. Mol. Microbiol. 5, str. 1385, 1990). Co
186 847 więcej, wiele poddawanych ekspresji w bakteriach białek heterologicznych nie jest wytwarzanych w postaciach rozpuszczalnych właściwie ufałdowanych lub aktywnych i wykazuje tendencję do akumulacji w postaci nierozpuszczalnych agregatów (patrz C. Schein i in. Bio/Technology 6, str. 291-4,1988 i R. Halenbeck i in. Bio/Technology 7, str. 710-5, 1989).
W naszym wcześniejszym nieopublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer PCT/GB93/01617 ujawniono, że przez dostarczenie sekwencji DNA kodującej fragment C toksyny tężcowej (TetC) połączonej „regionem zawiasowym” z drugą sekwencją kodującą antygen, ekspresja sekwencji w komórkach bakteryjnych jest wzmacniana w stosunku do konstrukcji, w których fragment C jest nieobecny. Na przykład, poziom ekspresji pełnej długości białka S-transferazy glutationowej P28 S. mansoni, przy ekspresji w postaci białka fuzyjnego z TetC z promotora nirB była wyższa niż gdy białko P28 ulegało ekspresji samo z promotora nirB. Fuzja TetC z białkiem P28 S. mansoni była rozpuszczalna i ulegała ekspresji zarówno w E. coli, jak i S. typhimurium. Ponadto, białko fuzyjne TetC-P28 można było oczyszczać na zasadzie powinowactwa na matriks glutation-agaroza, co sugeruje, że P28 uległo właściwemu ufałdowaniu do przybrania konformacji wciąż zdolnej do wiązania z jego naturalnym substratem. Uprzednio uważano, że region zawiasowy, którym zazwyczaj jest sekwencja kodująca zazwyczaj jest sekwencja kodująca wysoki udział aminokwasów proliny i/lub glicyny, ma zasadnicze znaczenie dla sprzyjania niezależnemu ufałdowaniu zarówno TetC, jak i połączonego z nim białka antygenowego. Jednakże obecnie ujawniono, nieoczekiwanie w świetle uprzednich powyżej opisanych badań nad CT-B i LT-B, że gdy pomija się region zawiasowy pomiędzy TetC i drugim antygenem, takim jak P28, białka tworzące fuzję wykazują właściwe ufałdowanie, jak udowodniono przez oczyszczanie na zasadzie powinowactwa na matrycy glutation-agaroza.
A zatem, w pierwszym aspekcie, wynalazek dostarcza konstrukcję DNA obejmującą fragment C toksyny tężcowej (Tet-C) i białka antygenowe połączone regionem zawiasowym, charakteryzującą się tym, że konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC jest fragmentem toksyny tężcowej, Het jest białkiem heterologicznym, Z jest aminokwasem, a a jest liczbą nie większą niż 4, z zastrzeżeniem, że (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
W jednym rozwiązaniu (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
W innym rozwiązaniu a jest równe zero.
Zazwyczaj grupa (Z)a nie będzie zawierać jednocześnie glicyny i proliny, a generalnie w ogóle nie będzie zawierać ani glicyny, ani proliny.
Korzystnie konstrukcja DNA według wynalazku zawiera heterologiczne białko Het, które jest sekwencją antygenową pochodzącą z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
Bardziej korzystnie w konstrukcji DNA białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
W drugim aspekcie, wynalazek dostarcza zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, obejmujący konstrukcję DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego, charakteryzujący się tym, że obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
Korzystnie wektor ekspresyjny jest odpowiedni do stosowania w bakterii.
Korzystnie w wektorze ekspresyjnym (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których zawarta w tym wektorze sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
Korzystnie w wektorze ekspresyjnym a jest równe zero.
Również korzystnie (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny..
Korzystny wektor ekspresyjny zawiera heterologiczne białko Het z sekwencją antygenową pochodzącą z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
Najkorzystniej wektor ekspresyjny według wynalazku obejmuje białko heterologiczne Het, które jest antygenem S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
186 847
W innym aspekcie wynalazek dostarcza gospodarza, nie człowieka, który posiada zintegrowaną z chromosomalnym DNA konstrukcję DNA kodująca fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączone regionem zawiasowym, charakteryzujący się tym, że zintegrowana w nim konstrukcja obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
Korzystnym gospodarzem, według wynalazku jest bakteria.
Gospodarz w korzystnej odmianie wynalazku charakteryzuje się tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
Również korzystnie a może oznaczać zero a także (Z)a może być wolny od glicyny i/lub proliny.
W innym konkretnym wykonaniu gospodarz charakteryzuje się tym, że heterologicznym białkiem Het w konstrukcie DNA jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
Gospodarz według wynalazku może zawierać konstrukt, w którym białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne kodowane przez konstrukcję DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączone regionem zawiasowym, charakteryzuje się tym, że konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro. .
Korzystnie białko fuzyjne w swojej części (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
Korzystnie w białku fuzyjnym według wynalazku a jest równe zero.
W innym korzystnym wykonaniu (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny.
Heterologicznym białkiem Het może być korzystnie sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta, a bardziej korzystnie białkiem heterologicznym Het jest antygen Ś-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowywania bakterii, metodą transformowania bakterii konstrukcją DNA polegający na tym, że bakterię transformuje się konstrukcją DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączonych regionem zawiasowym, przy czym konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
W korzystnej odmianie sposobu według wynalazku (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną. Również korzystnie a jest równe zero, a (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny. Także korzystnie, heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta, ewentualnie także korzystnie białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
Bakterią w sposobie według wynalazku może być bakteria atenuowana.
Konstrukcja DNA występuje w gospodarzu w postaci zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego, takiego jak plazmid, albo występuje jako część chromosomu gospodarza, albo w obydwu postaciach.
Białko fuzyjne o postaci TetC-(Z)a-Het jak zdefiniowano powyżej, może być w postaci zasadniczo czystej, przy czym białko to może ulegać ekspresji dzięki zdolnemu do replikacji wektorowi ekspresyjnemu, jak zdefiniowano powyżej.
186 847
Heterologicznym białkiem „Het” może być na przykład heterologiczna sekwencja antygenowa, np. sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
Przykładami wirusowych sekwencji antygenowych są sekwencje pochodzące z ludzkiego wirusa niewydolności immunologicznej (HIV), takiego jak HIV-1 lub HIV-2, miejsce wiązania receptora CD4 z HIV, na przykład z HIV-1 lub -2, wirusa zapalenia wątroby A, B lub C, ludzkiego rhinowirusa, takiego jak typu 2 lub typu 14, wirusa opryszczki, poliowirusa typu 2 lub 3, wirusa pryszczycy (FMDV), wirusa wścieklizny, rotawirusa, wirusa grypy, wirusa Coxsackie, wirusa brodawczaka ludzkiego, jego białka E7 i fragmentów obejmujących białko E7 lub jego epitopy, oraz małpiego wirusa niewydolności immunologicznej (SIV).
Przykładami epitopów pochodzących z bakterii są te pochodzące z Bordetella pertussis (np. antygeny białka P69 i włókienkowej hemaglutyniny (FHA)), Vibrio cholerae, Bacillus anthracis oraz antygeny E. coli, takie jak podjednostka B termolabilnej E. coli, antygeny E. coli K88 i antygeny enterotoksygennej E. coli. Inne przykłady antygenów obejmują antygen powierzchniowy CD4, antygeny S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni (antygeny P28) oraz antygeny przywr, mykoplazm, obleńców, tasiemców; Chlamydia trachomatis i pasożytów wywołujących malarię, np. pasożytów z rodzaju Plasmodium lub Babesia, na przykład Plasmodium falciparum, oraz peptydy kodujące immunogenne epitopy wymienionych powyżej antygenów.
Konkretne antygeny obejmują pełnej długości P28 Schistosoma mansoni i oligomery (np. 2-, 4- i 8-mery) immunogennego peptydu o aminokwasach 115-131 P28 (który zawiera epitop zarówno komórek B, jak i T) oraz białko E7 wirusa brodawczaka ludzkiego, antygeny wirusa opryszczki, antygeny wirusa pryszczycy i antygeny małpiego wirusa niewydolności immunologicznej .
Konstrukcje DNA według niniejszego wynalazku mogą zawierać promotor, którego aktywność jest indukowana w odpowiedzi na zmianę otaczającego środowiska. Przykładem takiej sekwencji promotorowej jest sekwencja, która posiada aktywność indukowaną przez warunki beztlenowe. Konkretnym przykładem takiej sekwencji promotorowej jest promotor nirB, który opisano na przykład w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer PCT/GB92/00387. Promotor nirB wyizolowano z E. coli, gdzie kieruje on ekspresją operonu obejmującego gen reduktazy azotynowej nirB (Jayaraman i in., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987) oraz nirD, nirC, cysG (Peakman i in., Eur. J. Biochem. 191, 315323, 1990). Jest on regulowany zarówno przez azotyny, jak i zmiany prężności tlenu w środowisku, stając się aktywnym w nieobecności tlenu (Cole, Biochem. Biophys Acta 162. 356-368, 1968). W odpowiedź na anaerobiozę zaangażowane jest białko FNR, działające jako aktywator transkrypcji, na drodze mechanizmu wspólnego dla wielu genów oddychania beztlenowego. Część promotora, która odpowiada jedynie na anaerobiozę wyizolowano przez analizę delecyjną i mutacyjną i, przez porównanie z innymi promotorami regulowanymi warunkami beztlenowymi, zidentyfikowano sekwencję wspólną miejsca wiązania FNR (Bell i in., Nuci. Acids Res. 17, 3865-3874, 1989; Jayaraman i in., Nuci. Acids Res. 17, 135-145, 1989). Wykazano także, że odległość pomiędzy przypuszczalnym miejscem wiązania FNR a regionem homologii -10 ma znaczenie krytyczne (Bell i in., Molec. Microbiol. 4, 1753-1763, 1990). Dlatego też, korzystne jest stosowanie tylko tej części promotora nirB, która odpowiada jedynie na anaerobiozę. W znaczeniu tu stosowanym, odwołanie się do promotora nirB odnosi się do samego promotora lub jego części bądź pochodnej, która jest zdolna do kierowania ekspresją sekwencji kodującej w warunkach beztlenowych. Preferowana sekwencja, zawierająca promotor nirB jest następująca:
AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAG GCG GTAGGGCC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1)
W najbardziej korzystnym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę DNA obejmującą promotor nirB połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją DNA kodującą zdefiniowane uprzednio białko fuzyjne.
W innym korzystnym aspekcie wynalazku, dostarcza się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, odpowiedni do stosowania w bakteriach, zawierający sekwencję promotora nirB
186 847 połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencją DNA kodującą zdefiniowane uprzednio białko fuzyjne.
Cząsteczkę lub konstrukcję DNA można włączyć w chromosom bakteryjny, np. metodami znanymi per se, a zatem w dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza bakterię posiadającą w swoim chromosomie zdefrnowaną uprzednio sekwencję lub konstrukcję DNA.
Można uzyskać stabilną ekspresję białka fuzyjnego in vivo. Białko fuzyjne może ulegać ekspresji w atenuowanej bakterii, której można zatem używać jako szczepionki.
Atenuowaną bakterię można wybrać z rodzajów Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, i Yersinia. Alternatywnie, atenuowaną bakterią może być atenuowany szczep enterotoksygennej Escherichia coli. W szczególności, można wymienić następujące gatunki: S. typhi - przyczyna duru brzusznego u ludzi; S. typhimurium - przyczyna salmonellozy u kilku gatunków zwierząt; S. enteritidis przyczyna zatruć pokarmowych u ludzi; S. choleraesuis przyczyna salmonellozy u świń; Bordetella pertusis przyczyna kokluszu; Haemophilus influenzae - przyczyna zapalenia opon; Neisseria gonorrhoea - przyczyna rzeżączki i Yersinia - przyczyna zatruć pokarmowych.
Przykłady atenuowanych bakterii ujawniono na przykład w europejskich zgłoszeniach patentowych o numerach 0322237 i 0400958, których ujawnienia włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.
Atenuowaną bakterię zawierającą konstrukcję DNA według wynalazku, obecną albo w chromosomie bakteryjnym, albo w postaci plazmidu, bądź w obydwu postaciach, można stosować jako szczepionkę. Ulegające ekspresji w bakteriach białka fuzyjne również można stosować w przygotowywaniu szczepionek. Na przykład, stwierdzono, że oczyszczone białko fuzyjne TetC-P28, w którym białko TetC połączone jest swoim C-końcem z białkiem P28 bez wtrąconego regionu zawiasowego, jest immunogenne samo w sobie. Dlatego też, w dalszym aspekcie, wynalazek pozwala na utworzenie kompozycji szczepionki zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik oraz, jako składnik aktywny, zdefiniowaną uprzednio atenuowaną bakterię lub białko fuzyjne.
Szczepionka może zawierać jeden lub więcej odpowiednich adiuwantów.
Szczepionka może występować w postaci liofilizowanej, na przykład w kapsułkach do doustnego podawania pacjentom. Takie kapsułki można zaopatrzyć w powłokę dojelitową zawierającą, na przykład, Eudragit „S”, Eudragit „L”, octan celulozy, octanoftalan celulozy lub hydroksypropylometylocelulozę. Kapsułki te można stosować jako takie, lub alternatywnie, materiał liofilizowany można rekonstytuować przed podaniem, np. jako zawiesinę. Korzystne jest prowadzenie rekonstytucji w buforze o pH odpowiednim do zapewnienia przeżycia organizmów. W celu ochrony atenuowanych bakterii i szczepionki przed działaniem kwasu żołądkowego, korzystnie przed każdym podaniem szczepionki podaje się preparat dwuwęglanu sodowego. Alternatywnie, szczepionkę można przygotować do podawania pozajelitowego, podawania donosowego lub podawania dosutkowego.
Atenuowaną bakterię zawierającą konstrukcję DNA bądź białko fuzyjne według wynalazku można stosować do profilaktycznego leczenia gospodarza, szczególnie gospodarza będącego człowiekiem, ale również gospodarza zwierzęcego. Dlatego też, infekcji powodowanej przez mikroorganizm, zwłaszcza patogen, można zapobiegać przez podawanie skutecznej dawki atenuowanego gospodarza - bakterii według wynalazku. Następnie w bakterii zachodzi ekspresja białka fuzyjnego, które jest zdolne do wywołania przeciwciała skierowanego przeciw mikroorganizmowi. Zastosowane dawkowanie zależeć będzie od różnych czynników, włącznie z wielkością i wagą gospodarza, typem postaci szczepionki i charakterem białka fuzyjnego.
Atenuowaną bakterię według niniejszego wynalazku można przygotować przez transformację atenuowanej bakterii zdefiniowaną uprzednio konstrukcją DNA. Można wykorzystać każdą odpowiednią technikę transformacji, taką jak elektroporacja. W ten sposób można otrzymać atenuowaną bakterię zdolną do ekspresji białka lub białek heterologicznych dla bakterii. Hodowlę atenuowanych bakterii można prowadzić w warunkach aerobowych. W ten sposób przygotowuje się dostateczną ilość bakterii do nadania jej postaci szczepionki, z zachodzącą minimalną ekspresją białka fuzyjnego.
186 847
Konstrukcją DNA może być zdolny do replikacji wektor ekspresyjny składający się z promotora nirB połączonego w sposób umożliwiający działanie z sekwencją. DNA kodującą białko fuzyjne. Promotor nirB można wstawić do wektora ekspresyjnego, który zawiera już gen kodujący jedno z białek heterologicznych (np. fragment C toksyny tężcowej) w miejsce istniejącego promotora kontrolującego ekspresję białka. Następnie można wstawić gen kodujący inne białko heterologiczne (np. sekwencję antygenową). Wektor ekspresyjny powinien, oczywiście, być kompatybilny z atenuowaną bakterią, do której wektor ma być wprowadzony.
Wektor ekspresyjny dostarcza się z odpowiednimi elementami kontroli transkrypcyjnej i translacyjnej, obejmującymi, poza promotorem nirB, miejsce terminacji transkrypcji i kodony początku i końca translacji. Dostarcza się także odpowiednie miejsce wiązania rybosomów·. Wektor zazwyczaj zawiera miejsce początku replikacji i, jeśli jest to pożądane, gen markera selekcyjnego, taki jak gen oporności na antybiotyk. Wektor może być plazmidem.
Wynalazek został zilustrowany poniższymi przykładami i rysunkami, w których:
Figura Ijest schematyczną ilustracją konstruowania plazmidu pTECHl;
Figura 2 ilustruje schematycznie przygotowywanie plazmidu pTECHl-28 z materiału wyjściowego plazmidów pTECHl i pUC19-P28;
Figura 3 ilustruje schematycznie przygotowywanie plazmidu pTECH3-28 z materiału wyjściowego plazmidów pTECHl-28 i pTETnirló;
Figury 4 i 5 są biotami typu western otrzymanymi z komórek bakteryjnych zawierających konstrukcję pTECH3-28; i
Figura 6 ilustruje oczyszczanie przez powinowactwo do glutationu fuzji TetC, jak określono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS i barwienie Coomassie Blue.
Zgodnie z wynalazkiem, skonstruowano wektor dla umożliwienia genetycznych fuzji końca C w wysokim stopniu immunogennego fragmentu C toksyny tężcowej, bez stosowania heterologicznej domeny zawiasowej.
Skonstruowano fuzję z genem kodującym ochronną S-transferazę glutationową o masie cząsteczkowej 28 kDa ze Schistosoma mansoni. Zrekombinowanym wektorem stransformowano Salmononella typhimurium (SL338; rm+) .
Otrzymane białko chimeryczne ulegało stabilnej ekspresji w postaci rozpuszczalnej w Salmonella, jak określono przez blotting typu western z antysurowicami skierowanymi przeciw fragmentowi C i S'-transferazie glutationowej. Ponadto stwierdzono, że składnik P28 białka fuzyjnego zachowuje zdolność do wiązania glutationu.
Konstruowanie wektora i właściwości ulegającego z niego ekspresji białka fuzyjnego opisano bardziej szczegółowo poniżej w przykładach wykonania wynalazku.
Przykład 1- (przytdad odniesienia)
Przygotowywanie pTECHl
Przygotowywanie pTECHl, plazmidu obejmującego promotor nirB i gen TetC oraz sekwencję DNA kodującą region zawiasowy i zawierającą miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne dla umożliwienia wstawienia genu kodującego drugie lub obce białko, zilustrowano na figurze l. Plazmid ekspresyjny pTETnirl5, materiał wyjściowy przedstawiony na figurze l, skonstruowano z pTETtacll5 (Makoff i in., Nucl. Acids Res. l7, l0l9ll0202, l989) przez zastąpienie regionu EcoRI-Apal (l354 bp) zawierającego gen lacI i promotor tac następującą parą oligonukleotydów li 2:
Oligonukleotyd l 5' -AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2)
Oligonukleotyd 2 3'-GTCCATTTAAACTACATGTAGTTTACCATGGGGAACGACTTAGCAATTCCATCCGCCATC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3)
Oligonukleotydy zsyntetyzowano stosując Pharmacia Gene Assembler i sekwencję otrzymanych plazmidów potwierdzono przez sekwencj onowanie (Makoff i in., Bio/Technology 7, l043l046, l989^.
Plazmid pTETnirl5 zastosowano następnie do skonstruowania plazmidu pTECHl obejmującego region poliłącznika odpowiedni jako miejsce do wstawiania heterologicznego DNA do kierowania ekspresją białka fuzyjnego fragmentu C. Jednakże, przy końcu 3'genu
186 847
TetC brak jest naturalnie występujących dogodnych miejsc restrykcyjnych. Dlatego też, przy końcu 3' regionu kodującego TetC wprowadzono docelowe miejsca, poprzedzane przez region zawiasowy, poprzez startery o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 zawierającymi jednocześnie sekwencje adaptorowe (tablica 1) stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) [K. Mullis i in., Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol. 51, 263-273 1986]. Odpowiednio, pTETnir15 zastosowano jako matrycę w reakcji PCR z użyciem starterów odpowiadających regionom pokrywającym miejsca Sacll i BamHI. Antysensowny starter połączono w tej amplifikacji z 38 zasadami 5'-końcowej sekwencji adapterowej. Antysensowny starter tak zaprojektowano, że do produktu PCR włączono sekwencję kodującą nowe miejsca Xbal, Spel i BamHI. Ponadto, wprowadzono sekwencje DNA kodujące dodatkowe aminokwasy, włącznie z proliną (regiony zawiasowe), i sygnał kodonu końca translacji w jednej ramce z otwartą ramką odczytu fragmentu C).
Produkt PCR oczyszczono w żelu i strawiono Sacll i BamHI oraz sklonowano w pozostałych 2,8 kb wektora pTETnir15, który uprzednio strawiono SacII i BamHI. Otrzymany plazmid oczyszczony ze stransformowanych kolonii i nazwany pTECHl przedstawiono na figurze 1. Sekwencje heterologiczne, takie jak sekwencja kodująca S-transferazę glutationową P28 Schistosoma mansoni (P28) sklonowoano w miejscach Xbal, Spel i BamHI zgodnie ze znanymi metodami.
Sekwencję DNA plazmidu pTECH1 przedstawiono w liście sekwencji jako sekwencję 0 numerze identyfikacyjnym: 6.
TABLICA 1
SEKWENCJE DNAOLIGONUKLEOTYDÓW WYKORZYSTANYCH W KONSTRUOWANIU WEKTORÓW TETC-REGION ZAWIASOWY
A. Starter 1. Sensowny starter PCR (21 mer). (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4)
SacII
5'AAA GAC TCC GCG GGC GAA GTT -3'
SEKWENCJA FRAGMENTU C TOKSYNY TĘŻCOWEJ
B. Starter 2. Antysensowny starter PCR (64-mer) (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5)
BamHI STOP Spel
5'- CTAT GGA TCC TTA ACT AGT GAT TCT AGA GGG CCC CGG CCC
GTC GTT GGT CCA ACC TTC ATC GGT -3'
KONIEC 3' SEKWENCJI FRAGMENTU C TOKSYNY TĘŻCOWEJ
Przykład 2 (przykład odniesienia)
Konstruowanie pTECH1-P28
Kasetkę ekspresyjną genu P28 utworzono przez reakcję PCR z zastosowaniem DNA pUC19-P28 (dzięki uprzejmości dr R. Pierce, Pasteur Institute, Lille) jako matrycy. Zaprojektowano startery oligonukleotydowe do amplifikacji pełnej długości genu P@8, zaczynającego się kodonem start i zakończonego kodonem stop. Ponadto, startery sensowny i antysensowny połączono z miejscami restrykcyjnymi odpowiednio Xbal i BamHI. Startery przedstawiono w liście sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 7 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 8.
Produkt oczyszczono w żelu i strawiono Xbal i BamHI, a następnie sklonowano w pTECH1, który strawiono uprzednio tymi enzymami, a następnie oczyszczono w żelu. Sekwencję DNA pTECH1-P28 przedstawiono w liście sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 9.
Ekspresja białka fuzyjnego TetC-region zawiasowy-P28
Poszczególne szczepy bakteryjne, a mianowicie szczepy SL 5338 S. typhimirium (A. Brown 1 in., J. Infect. Dis. 155, 86-92, 1987) i SL3261 E. coli (TG2) stransformowano pTECH1-P28 przez elektroporację. Szczepy SL3261 zawierające plazmid pTECH1-P28 zdeponowano w National Collection of Type Cultures, 61 Coindale Avenue, Londyn, NW9 5HT, Wielka Brytania, pod numerem dostępu NCTC 12 833. Szczep SL3261 zawierający plazmid pTECH1
186 847 zdeponowano pod numerem dostępu NCTC 12831. Tożsamość rekombinantów zweryfikowano przez mapowanie restrykcyjne plazmidowego DNA zawartego w komórkach. Następnie oceniano dalszą ekspresję białka fuzyjnego przez elektroforezę w żelu paliakryloamidowym z SDS i blotting typu western komórek bakteryjnych zawierających konstrukcję. Stwierdzono, że białko fuzyjne pozostaje rozpuszczalne, reaguje krzyżowo z antysurowicami skierowanymi zarówno przeciw TetC, jak i P28, i ma również oczekiwaną masę cząsteczkową dla fuzji pełnej długości, 80 kDal.
Białko fuzyjne ulegało stabilnej ekspresji w E. coli (TG2) i S. typhimurium (SL5338, SL3261), jak stwierdzono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS i blotting typu western. Interesujące było, że na biotach typu western widoczny jest prążek odpowiadający masie cząsteczkowej 50 kDal, który migruje razem z białkiem zawierającym tylko TetCregion zawiasowy i reaguje krzyżowo wyłącznie z surowicą skierowaną przeciw TetC. Ponieważ wyboru kodonów w regionie zawiasowym dokonano tak, aby były nie w pełni optymalne, rzadkie kodony mogą powodować przerwy podczas translacji, co może od czasu do czasu prowadzić do przedwczesnej terminacji translacji, odpowiadając zatem za ten prążek. Oczyszczanie fuzji TetC-P28 na zasadzie powinowactwa.
Glutation jest naturalnym substratem P28, S-transferazy glutationowej. Uważa się, że reszty aminokwasowe zaangażowane w wiązaniu glutationu są przestrzennie oddzielone w strukturze pierwszorzędowej polipeptydu i stykają się tworząc kieszeń wiążącą glutation w strukturze trzeciorzędowej (P. Reinemer i in. EMBO J. 8, 1997-2005, 1991). W celu sprawdzenia, czy składnik fuzji uległ właściwemu ufałdowaniu do przybrania konformacji zdolnej do wiązania glutationu, testowano jej zdolność do oczyszczania na zasadzie powinowactwa na matriks glutation-agaroza. Otrzymane wyniki (nie przedstawione) wykazały, że TetC-P28 może rzeczywiście wiązać się z matriks i wiązanie jest odwracalne, jako że fuzję można współzawodniczo wyeluować wolnym glutationem.
Przykład 3. Konstruow<uuepTECH3-P28
Plazmid pTECH1-P28 kieruje ekspresją białka P28 S.mansoni w postaci C-końcowej fuzji z fragmentem C toksyny tężcowej, rozdzielonych heterologiczną domeną zawiasową Espresja białka fuzyjnego pozostaje pod kontrolą promotora nirB. Wektor pTECH3-P28 częściowo skonstruowano z plazmidu pTETnir15 przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z zastosowaniem wykazującej dużą dokładność termostabilnej polimerazy DNA z Pyrococcus fusorius, która posiada towarzyszącą aktywność 3'5'-egzonukleazową odpowiedzialną za korekcję błędów replikacji. Kolejność etapów podsumowano na figurze 5. W celu utworzenia kasetki zastępczej TetC bez regionu zawiasowego, odcinek DNA od unikalnego w genie TetC miejsca Sacll do końcowego kodonu zamplifikowano przez reakcję PCR z zastosowaniem pTETni:r15 jako matrycy DNA. Startery zastosowane w amplifikacji przez PCR przedstawiono w liście sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 10 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 11. W tej reakcji amplifikacji starter antysensowny połączono z sekwencją rozpoznawaną przez Xbal.
Reakcję amplifikacji przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (Stratagene, La Jolla, CA, Stany Zjednoczone Ameryki). Produkt oczyszczono w żelu, strawiono Sacll i Xbal, a następnie sklonowano w pozostałej części wektora pTECH1-P28, który uprzednio strawiono odpowiednimi enzymami Sacll i Xbal. Otrzymany wektor nazwano pTECH3-P28. Sekwencję pTECH3-P28 przedstawiono w liście sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 12.
Przykład4
Transformacja S. typhimurium SL5338 (galE r m+) pTECH3-28 i analiza transformantów
S. typhimurium SL5338 (galE r'm+) hodowano albo w bulionie L, albo YT i na agarze L z ampicyliną (50 g/ml), jeśli było to pożądane, i transformowano ją plazmidem pTECH3-P28. Protokół transformacji był oparty na metodzie opisanej przez MacLachlana i Sandersona (MacLachlan PR i Sanderson KE, 1985. Transformation of Salmonella typhimurium with plasmid DNA: differences between rough and smooth strains. J. Bacteriology 161, 442-445).
ml całonocnej hodowli S. typhimurium SL5338 (r'm+; Brown, A, Hormaeche CE, Demarco de Hormaeche R, Dougan G, Winther M, Maskell D, i Strocker BAD, 1987. J. Infect.
186 847
Dis. 155, 86-92) stosowano do inokulacji 100 ml bulionu LB i wytrząsano w temperaturze 37°C do osięgnięcia OD50 hodowli równej 0,2. Komórki zbierano przez odwirowanie przy 3000 x g i ponownie zawieszano w 0,5 objętości 0,1 M MgCh chłodzonego lodem. Komórki ponownie osadzano i zawieszano w 0,5 objętości chłodzonego lodem CaCl2. Ten etap powtarzano jeszcze raz i komórki zawieszano w 1 ml 0,1 M CaCl2, do którego dodawano 50 pl TES 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 8,0. Komórki inkubowano chłodząc lodem w ciągu 45 do 90 minut. Do 150 μΐ komórek dodawano 100 ng plazmidowego DNA w objętości 1-2 μΐ. Mieszaninę inkubowano chłodząc lodem w ciągu 30 minut przed szokiem cieplnym w temperaturze 42°C w ciągu 2 minut i natychmiastową ponowną inkubacją w lodzie w ciągu 1 minuty. Do mieszaniny transformantów dodawano 2 ml bulionu LB i inkubowano w ciągu 1,5 godziny dla umożliwienia ekspresji genu oporności na ampicylinę, Blaktamazy. Po inkubacji 20 μΐ i 200 pl komórek rozprowadzono na płytkach z agarem lB zawierającym 50 pl/ml ampicyliny. Płytki suszono i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C.
Tożsamość rekombinantów weryfikowano przez mapowanie restrykcyjne plazmidowego DNA i przez blotting typu western z antysurowicami skierowanymi przeciw TetC i P28.
Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS i blotting typu western
Ekspresję fuzji TetC testowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS i blotting typu western. Komórki bakteryjne S. typhimurium SL5338 (galE fm+) zawierające plazmid pTECH3-P28, poddawane selekcji antybiotykiem, w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego, zbierano przez odwirowanie i białka frakcjonowano przez elektroforezę w 10% żelu poliakryloamidowym z SDS. Białka przenoszono na membranę nitrocelulozową przez elektroblotting i poddawano reakcji z poliklonalną surowicą króliczą skierowaną przeciw albo TetC, albo białku p28 pełnej długości. Następnie bioty poddawano reakcji z surowicą kozią skierowaną przeciw króliczym Ig skonniugowaną z peroksydazą z chrzanu (Dako, High Wycombe, Bucks, Wielka Brytania) i wywoływano stosując 4-chloro-1-naftol. Wyniki doświadczeń blottingu typu western przedstawiono na figurach 4 i 5; figura 4 ilustruje wyniki reakcji z króliczą surowicą poliklonalną skierowaną przeciw TetC, a figura 5 ilustruje wyniki reakcji z króliczą surowicą poliklonalną skierowaną przeciw P28. W każdym przypadku ścieżki 1, 2 i 3 są niezależnymi klonami SL5338 (pTECH3-P28), ścieżki 4, 5 i 6 są SL5338 (pTECH1P23), a ścieżka 7 jest SL5338 (pTETnir15). Wskazano markery masy cząsteczkowej. Na podstawie wyników widać, że białko fuzyjne pozostaje rozpuszczalne, reaguje z antysurowicami skierowanymi przeciw zarówno TetC, jak i P28, i ma również masę cząsteczkową, 80 kDal, oczekiwaną dla fuzji pełnej długości (figura 4). Ponadto, białko fuzyjne okazało się ulegać stabilnej ekspresji.
Oczyszczanie przez powinowactwo do glutationu-agarozy
Glutation jest naturalnym substratem P28, S-transferazy glutationowej. Uważa się, że reszty aminokwasowe biorące udział w wiązaniu glutationu są przestrzennie oddzielone w strukturze pierwszorzędowej polipeptydu, a stykając się tworzą kieszeń wiążącą glutation w strukturze trzeciorzędowej. W celu sprawdzenia, czy składnik P28 fuzji ulegał właściwemu ufałdowaniu do przyjęcia konformacji zdolnej do wiązania glutationu, testowaliśmy jej zdolność do ulegania oczyszczaniu na matriks glutation-agaroza.
Komórki bakteryjne zawierające pTECH3-P28 i zdolne do ekspresji pełnej długości fuzji genowej TetC z P28 hodowano do fazy wzrostu logarytmicznego, schładzano na lodzie i zbierano przez odwirowanie przy 2500 x g w ciągu 15 minut w temperaturze 45°C. Komórki ponownie zawieszano w 1/15-tej objętości początkowej schłodzonej lodem soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS) i lizowano przez sonikację w MSE Soniprep 150 (Gallenkamp, Leicester, Wielka Brytania). Nierozpuszczalny materiał usuwano przez odwirowanie i do supematantu dodawano 1/6 objętości 50% zawiesinę uprzednio spęczniałych perełek glutation-agaroza (Sigma, Poole, Dorset, Wielka Brytania). Po ostrożnym mieszaniu w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny perełki zbierano przez odwirowanie przy 1000 x g w ciągu 10 sekund. Supematant odrzucano, a perełki ponownie zawieszano w 20 objętościach zimnego PBS-0,5% Tritonu X100 i perełki ponownie zbierano przez odwirowanie. Etap przemywania powtarzano trzy razy więcej. Białko fuzyjne eluowano przez dodanie 1 objętości
186 847 buforu do próbek do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS. Dla celów porównawczych podobną procedurę przeprowadzono z komórkami bakteryjnymi zawierającymi plazmid PTECH1-P28 z którego zachodzi ekspresja białka fuzyjnego TetC-region zawiasowy-P28. Ekstrakty z klonów zawierających każdy z plazmidów porównano stosując elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS i wyniki przedstawiono na figurze 6. Na figurze 6 ścieżki 1, 2 i 3 są klonami SL5338 (pTECH1-P28), podczas gdy ścieżki 4, 5 i 6 są niezależnymi klonami SL 5338 (pTECH3-P28).
Wyniki sugerują, że białko fuzyjne TetC-P28 może wiązać się z matriks bez względu na nieobecność heterologicznej domeny zawiasowej (dane nie przedstawione). Możliwe jest, że sekwencja peptydowa obecna w C-końcu TetC może w rzeczywistości nadawać giętkość temu konkretnemu regionowi.
Claims (33)
1. Konstrukcja DNA kodująca fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączone regionem zawiasowym, znamienna tym, że konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Ź)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
2. Konstrukcja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
3. Konstrukcja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że a jest równe zero.
4. Konstrukcja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny.
5. Konstrukcja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
6. Konstrukcja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
7. Wektor ekspresyjny zdolny do replikacji, obejmujący konstrukcję DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego, znamienny tym, że obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
8. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że jest odpowiedni do stosowania w bakterii.
9. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których zawarta w tym wektorze sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
10. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że a jest równe zero.
11. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny.
12. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
13. Wektor ekspresyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
14. Gospodarz, nie człowiek, posiadający zintegrowaną z chromosomalnym DNA konstrukcję DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączone regionem zawiasowym, znamienny tym, że zintegrowana w nim konstrukcja obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
15. Gospodarz według zastrz. 14, znamienny tym, że stanowi go bakteria.
16. Gospodarz według zastrz. 15, znamienny tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
17. Gospodarz według zastrz. 14, znamienny tym, że a jest równe zero.
18. Gospodarz według zastrz. 14, znamienny tym, że (Z)ajest wolny od glicyny i/lub proliny.
19. Gospodarz według zastrz. 14, znamienny tym, że heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
186 847
20. Gospodarz według zastrz. 14, znamienny tym, że białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
21. Białko fuzyjne kodowane przez konstrukcję DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączone regionem zawiasowym, znamienne tym, że konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
22. Białko fuzyjne według zastrz. 20, znamienne tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów, dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną
23. Białko fuzyjne według zastrz. 20, znamienne tym, że a jest równe zero.
24. Białko fuzyjne według zastrz. 20, znamienne tym, że (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny.
25. Białko fuzyjne według zastrz. 20, znamienne tym, że heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
26. Białko fuzyjne według zastrz. 20, znamienne tym, że białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
27. Sposób przygotowywania bakterii, polegający na transformowaniu bakterii konstrukcją DNA, znamienny tym, że bakterię transformuje się konstrukcją DNA kodującą fragment C toksyny tężcowej (TetC) i białka antygenowego połączonych regionem zawiasowym, przy czym konstrukcja ta obejmuje sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne o wzorze TetC-(Z)a-Het, gdzie TetC oznacza fragment toksyny tężcowej, Het oznacza heterologiczne białko antygenowe, Z oznacza aminokwas, a oznacza liczbę nie większą niż 4, a (Z)a nie obejmuje sekwencji Gly-Pro.
28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że (Z)a jest łańcuchem dwóch lub trzech aminokwasów; dla których sekwencja DNA definiuje miejsce rozszczepiane przez endonukleazę restrykcyjną.
29. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że a jest równe zero.
30. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że (Z)a jest wolny od glicyny i/lub proliny.
31. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że heterologicznym białkiem Het jest sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.
32. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że białkiem heterologicznym Het jest antygen S-transferazy glutationowej P28 Schistosoma mansoni.
33. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że bakterię stanowi bakteria atenuowana.
Wynalazek ten dotyczy konstrukcji DNA, wektorów ekspresyjnych zdolnych do replikacji zawierających te konstrukcje DNA, gospodarzy zawierających konstrukcje DNA i białka fuzyjnego oraz sposobu przygotowywania bakterii. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy nowych konstrukcji DNA, kodujących fragment C toksyny tężcowej i białek fuzyjnych zawierających fragment C toksyny tężcowej.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/GB1993/001617 WO1994003615A1 (en) | 1992-07-31 | 1993-07-30 | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
| GB9401787A GB9401787D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Vaccine compositions |
| PCT/GB1994/001647 WO1995004151A2 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Vaccine compositions containing recombinant tetc-fusion proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL313979A1 PL313979A1 (en) | 1996-08-05 |
| PL186847B1 true PL186847B1 (pl) | 2004-03-31 |
Family
ID=10749593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94313979A PL186847B1 (pl) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Konstrukcja DNA, wektor ekspresyjny, gospodarz, białko fuzyjne i sposób przygotowania bakterii |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6488926B1 (pl) |
| KR (1) | KR100338894B1 (pl) |
| CZ (1) | CZ24196A3 (pl) |
| GB (1) | GB9401787D0 (pl) |
| HU (1) | HUT74495A (pl) |
| PL (1) | PL186847B1 (pl) |
| SK (1) | SK9996A3 (pl) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214787B1 (en) * | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
| GB0205376D0 (en) * | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Royal Holloway University Of L | Spore germination |
| US20090110702A1 (en) | 2002-07-12 | 2009-04-30 | The Johns Hopkins University | Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors |
| AU2003259109A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-02-02 | The Johns Hopkins University | Mesothelin vaccines and model systems |
| US9200036B2 (en) | 2002-07-12 | 2015-12-01 | The Johns Hopkins University | Mesothelin vaccines and model systems |
| US7521059B2 (en) * | 2004-06-14 | 2009-04-21 | Fenwick Bradley W | Kennel cough vaccine |
| US20090285771A1 (en) * | 2004-10-04 | 2009-11-19 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules |
| AU2006247188A1 (en) | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Methods and compositions for immunizing against chlamydia infection |
| WO2007067597A2 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-14 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of binding partners |
| US20090304684A1 (en) * | 2005-12-05 | 2009-12-10 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of antibodies |
| EP2010205A2 (en) | 2006-03-16 | 2009-01-07 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs |
| US20090092660A1 (en) * | 2006-08-09 | 2009-04-09 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of particles |
| WO2010065613A2 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | The Johns Hopkins University | Annexina2 as immunological target |
| US11246915B2 (en) | 2010-09-15 | 2022-02-15 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
| SI3139965T1 (sl) | 2014-05-07 | 2022-01-31 | Applied Molecular Transport Inc. | Fuzijske molekule, izpeljane iz toksina cholix, za peroralno dostavljanje biološko aktivnega tovora |
| EP3844169A4 (en) | 2019-08-16 | 2021-12-15 | Applied Molecular Transport Inc. | COMPOSITIONS, FORMULATIONS AND PRODUCTION AND PURIFICATION OF INTERLEUKINS |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516442D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Wellcome Found | Cloned antigen |
| AU634153B2 (en) | 1988-02-01 | 1993-02-18 | Wyeth Holdings Corporation | T-cell epitope as carriers molecule for conjugate vaccines |
| GB8914122D0 (en) * | 1989-06-20 | 1989-08-09 | Wellcome Found | Polypeptide expression |
| CA2031468A1 (en) | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| FR2656626B1 (fr) | 1989-12-29 | 1994-08-12 | Pasteur Institut | Fragment peptidique comprenant une sequence issue de la proteine 28 kda de schistosoma mansoni et compositions vaccinantes et/ou therapeutiques comprenant ledit fragment. |
| US5498538A (en) * | 1990-02-15 | 1996-03-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Totally synthetic affinity reagents |
| CA2099841C (en) | 1991-03-05 | 2003-02-25 | Ian G. Charles | Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria |
| SE468050C (sv) * | 1991-03-15 | 1998-04-27 | Pharmacia & Upjohn Ab | Rekombinant derivat av human faktor VIII |
| AU2699192A (en) | 1991-10-16 | 1993-05-21 | University Of Saskatchewan | Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras |
| CA2141427C (en) | 1992-07-31 | 2008-07-22 | Mohammed Anjam Khan | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
-
1994
- 1994-01-31 GB GB9401787A patent/GB9401787D0/en active Pending
- 1994-07-29 KR KR1019960700478A patent/KR100338894B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 HU HU9600207A patent/HUT74495A/hu unknown
- 1994-07-29 CZ CZ96241A patent/CZ24196A3/cs unknown
- 1994-07-29 PL PL94313979A patent/PL186847B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 US US08/586,740 patent/US6488926B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 SK SK99-96A patent/SK9996A3/sk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL313979A1 (en) | 1996-08-05 |
| SK9996A3 (en) | 1996-09-04 |
| GB9401787D0 (en) | 1994-03-23 |
| HU9600207D0 (en) | 1996-04-29 |
| KR100338894B1 (ko) | 2002-11-13 |
| CZ24196A3 (en) | 1996-06-12 |
| HUT74495A (en) | 1997-01-28 |
| US6488926B1 (en) | 2002-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0712442B1 (en) | Vaccine compositions | |
| CA2141427C (en) | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria | |
| JP3267333B2 (ja) | 融合タンパク質 | |
| US6040427A (en) | Vaccine | |
| JP5566684B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン | |
| Khan et al. | Construction, expression, and immunogenicity of the Schistosoma mansoni P28 glutathione S-transferase as a genetic fusion to tetanus toxin fragment C in a live Aro attenuated vaccine strain of Salmonella. | |
| PL186847B1 (pl) | Konstrukcja DNA, wektor ekspresyjny, gospodarz, białko fuzyjne i sposób przygotowania bakterii | |
| Khan et al. | Construction, expression, and immunogenicity of multiple tandem copies of the Schistosoma mansoni peptide 115-131 of the P28 glutathione S-transferase expressed as C-terminal fusions to tetanus toxin fragment C in a live aro-attenuated vaccine strain of Salmonella. | |
| CA2323634A1 (en) | Lactobacilli harboring aggregation and mucin binding genes as vaccine delivery vehicles | |
| WO1995003413A1 (en) | High level expression, purification and refolding of the neisseria meningitidis outer membrane group b porin proteins | |
| HU219267B (en) | Dna fragments coding for neisseria meningitidis transferrin receptor subunits and method for their preparation | |
| AU693175B2 (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A | |
| LeClerc et al. | Induction of virus-neutralizing antibodies by bacteria expressing the C3 poliovirus epitope in the periplasm. The route of immunization influences the isotypic distribution and the biologic activity of the antipoliovirus antibodies. | |
| NZ258684A (en) | Vaccine against group b streptococcus comprising a group b streptococcus polysaccharide conjugated to a functional derivative of group b streptococcus c protein alpha antigen | |
| HUT64596A (en) | Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie | |
| Dertzbaugh et al. | Plasmid vectors for constructing translational fusions to the B subunit of cholera toxin | |
| JP7334176B2 (ja) | 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現 | |
| CA1340577C (en) | Recombinant systems for expressions of cholera b-subunit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides | |
| US5942418A (en) | Expression of gene products from genetically manipulated strains of Bordetella | |
| Chen et al. | A nontoxic Pseudomonas exotoxin A induces active immunity and passive protective antibody against Pseudomonas exotoxin A intoxication | |
| AU644828B2 (en) | Novel vaccine | |
| EP0742829B1 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
| US6033877A (en) | Peptide expression and delivery system | |
| NZ530979A (en) | Recombinant haemophilus influenzae adhesin proteins | |
| Cho et al. | Active Immunity and Passive Protective Antibody against Pseudomonas Exotoxin A Intoxication |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080729 |