CZ24196A3 - Vaccine preparations - Google Patents
Vaccine preparations Download PDFInfo
- Publication number
- CZ24196A3 CZ24196A3 CZ96241A CZ24196A CZ24196A3 CZ 24196 A3 CZ24196 A3 CZ 24196A3 CZ 96241 A CZ96241 A CZ 96241A CZ 24196 A CZ24196 A CZ 24196A CZ 24196 A3 CZ24196 A3 CZ 24196A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- tetc
- protein
- sequence
- seq
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical group OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 36
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 abstract description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 102100023541 Glutathione S-transferase omega-1 Human genes 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 13
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 10
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 101710101517 Gluconate operon transcriptional repressor Proteins 0.000 description 6
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 6
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 102100029173 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Human genes 0.000 description 2
- 101710100756 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 101100404147 Bacillus subtilis (strain 168) nasE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 229920003136 Eudragit® L polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003137 Eudragit® S polymer Polymers 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 101150105804 cysG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 glycine amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150100899 nirC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150045642 nirD gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
(57) Je popsán konstrukt DNA, zahrnující sekvenci DNA kódující fúzní protein vzorce TetC-(Z)a-Het, kde TetC je C fragment tetanového toxinu nebo protein zahrnující jeho epitopy, Het je heterologní protein, Z je aminokyselina a a je nula nebo kladné celé číslo, s podmínkou, že (Z)a nezahrnuje sekvenci Gly-Pro, dále replikovatelné expresní vektory, zahrnující tyto konstrukty, bakterie transformované těmito konstrukty, fúzní proteiny jako takové a vakcinové přípravky tvořené z těchto fúzních proteinů nebo oslabených bakterií exprimujících tyto fúzní proteiny.
Vakcinové přípravky
Oblast techniky
TJ ;n<
| Γ | — | |||||
| < | T | |||||
| r— | TV | NJ | ||||
| > | ·Π> | O | ||||
| co —( | 2 -τ' | C· | cn | σ | .*«** | rx |
| co | >> | o (rx | — | v—. | ||
| O | □ | -- | ||||
| -1 | fT> | co | o | rc | ||
| < | TC | cn | ||||
| —Λ | O | ZP |
Vynález se týká konstruktů DNA, replikovatelných expresních vektorů obsahujících tyto konstrukty, bakterií obsahujících tyto konstrukty a vakcín obsahujících tyto bakterie nebo fúzní proteiny exprimované z nich. Konkrétně se vynález týká nových konstruktů DNA, kódujících C-fragment tetanového toxinu, a fúzních proteinů, obsahujících Cfragment tetanového toxinu.
Dosavadní stav techniky
Je známo připravovat DNA konstrukty kódující dva nebo více heterolognícn proteinů za účelem exprese proteinů ve vhodném hostiteli ve formě jediného fúzního proteinu. Často se však zjišťuje, že vzájemné fúzování dvou proteinů tímto způsobem vede k nesprávně svinutému chimernímu proteinu, který již nemá vlastnosti jednotlivých složek. Například Bpodjednotky enterotoxinů Víbrío cholerae (CT-B) a E. coli (LT-B) jsou účinnými mukosálními imunogeny, ale genetické fúze k těmto podjednotkám mohou změnit strukturu a vlastnosti nosičů, a tudíž jejich imunogenitu (viz M. Sandkvist ad., J. Bacteriol. 169, str. 4570-6, 1987, Clements a d., 1990 a M. Lipscombe a d., Mol. Microbiol. 5, str. 1385, 1990. Navíc mnohé heterologní proteiny exprimované v bakteriích nejsou produkovány v rozpustných správně svinutých nebo aktivních formách a mají tendenci se hromadit jako nerozpustné agregáty (viz C. Schein a d., Bio/Technology 6, str. 291-4, 1988, a R. Halenbeck a d., Bio/Technology 7, str. 710-5, 1989.
------- V naší dřívější nezveřejněné mezinárodnípatentovépřihlášce č. PCT/GB93/01617 je uvedeno, že pomocí sekvence DNA, kódující C-fragment tetanového toxinu (TetC), napojené přes „pantovou oblast na druhou sekvenci kódující antigen, se dosáhne zvýšení exprese sekvence v bakteriálních buňkách oproti konstruktům, kde C-fragment chybí. Například úroveň exprese plné délky proteinu glutathion S-transferasy P28 S. mansoni, exprimovaného jako fúze k TetC z promotoru nirB, byla vyšší než byl-li protein P28 exprimován samotný z promotoru nirB. Fúze TetC k úplnému proteinu P28 S. mansoni byla rozpustná á bylá exprimována jak v E.'~ coli, tak v S. typhimurium. Kromě toho bylo možno fúzní protein TetC-P28 afinitně čistit glutathion agarózovou matricí, z čehož vyplývá, že P28 se svinul správně, aby mohl zaujmout konformaci, ještě schopnou vazby na jeho přirozený substrát. Dříve se uvažovalo, že pro podporu nezávislého svinování jak TetC, tak antigenního proteinu, k němu fúzovaného, je nezbytná pantová oblast, která má typicky sekvenci, kódující vysoký podíl aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Nyní však bylo překvapivě s ohledem na výše uvedené studie na CT-B a LT-B zjištěno, že je-li mezi TetC a druhým antigenem, jako je P28, vynechána pantová oblast, vykazují proteiny tvořící fúzi správné svinování, což dokazuje afinitní čištění na glutathion agarózové matrici.
Podstata vynálezu
V prvním aspektu je tedy předmětem vynálezu konstrukt DNA, zahrnující sekvenci DNA kódující fúzní protein vzorce TetC-(Z)a-Het, kde TetC je C-fragment tetanového toxinu nebo protein zahrnující jeho epitopy, Het je heterologní protein, Z je aminokyselina a a je nula nebo kladné celé číslo, s podmínkou, že (Z)a nezahrnuje sekvenci Gly-Pro.
----------------Typicky (Z) a představuje řetězec O až 15 aminokyselin, například 0 až 10, přednostně méně než 6 a zvlášť výhodně méně než 4 aminokyselin.
V jednom provedení je (Z)a řetězec dvou nebo tří aminokyselin, pro něž sekvence DNA definuje místo štěpení restrikční endonukleasou.
V jiném provedení je a nula.
Skupina (Z)a běžně neobsahuje zároveň glycin a prolin, a obvykle neobsahuje glycin ani prolin vůbec.
V dalším provedenie (Z)a řetězec aminokyselin s podmínkou, že je-li a 6 nebo více, (Z)a neobsahuje glycin nebo prolin.
Skupina (Z)a může být řetězec aminokyselin v podstatě bez biologické účinnosti.
V druhém aspektu je předmětem vynálezu replikovatelný expresní vektor, například vhodný pro použití v bakteriích, obsahující výše definovaný konstrukt DNA.
V dalším aspektu je předmětem vynálezu hostitel (například bakterie), obsahující výše definovaný konstrukt DNA, přičemž konstrukt DNA je v hostiteli přítomen buď ve formě replikovatelného expresního vektoru, jako je plasmid, nebo je přítomen jako část hostitelského chromosomu nebo v obou formách.
V dalším aspektu je předmětem vynálezu fúzní protein výše definovaného vzorce TetC-(Z)a-Het, přednostně ve v podstatě čisté formě, přičemž uvedený fúzní protein je exprimovatelný výše definovaným replikovatelným expresním vektorem.
V dalším aspektu je předmětem vynálezu způsob přípravy bakterie (přednostně oslabené bakterie), zahrnující transformaci bakterie (například oslabené bakterie) výše definovaným konstruktem DNA.
Předmětem vynálezu----je - rovněž vakcinový přípravek, zahrnující oslabenou bakterii nebo výše definovaný fúzní protein a farmaceuticky přijatelný nosič.
Heterologním proteinem „Het může být například heterologní antigenní sekvence, například antigenní sekvence odvozená od viru, bakterie, plísně, kvasinky nebo parazita.
Příklady virálních antigenních sekvencí jsou sekvence odvozené od některého typu viru lidské imunodeficience (HIV), jako je HIV-1 nebo HIV-2, vazebného místa receptoru CD4 z HIV, například z HIV-1 nebo HIV-2, viru hepatitidy A, B nebo C, lidského rhinoviru, jako je typ 2 nebo typ 14, viru Herpes simplex, polioviru typu 2 nebo 3, viru slintavky a kulhavky (FMDV), viru vztekliny, rotaviru, viru chřipky, viru coxsackie, lidského papillomaviru (HPV), například papillomaviru typu 16, jeho proteinu E7 a fragmentů obsahujících protein E7 nebo jeho epitopy a viru opičí imunodeficience (SIV).
Příklady antigenů odvozených od bakterií tvoří antigeny odvozené od Bordetella pertussis (například protein P69 a antigeny vláknitého hemaglutininu (FHA)), Vibrio cholerae, Bacillus anthracis a antigeny E. coli, jako je B podjednotka tepelně labilního toxinu E. coli (LT-B), antigeny E. coli KQQ a antigeny enterotoxigenní E. coli. Další příklady antigenů zahrnují buněčný povrchový antigen CD4, antigeny P28 glutathion S-transferasy Schistosoma mansoni (antigeny P28) a antigeny motolice, mykoplasmy, škrkavek, tasemnice, Chlamydia trachomatis a parazitů malárie, například parazitů rodu Plasmodium nebo Babesia, například Plasmodium falciparum, a peptidy kódující imunogenní epitopy z výše uvedených antigenů.
Konkrétní antigeny zahrnují plnou délku P28 Schistosoma mansoni a oligomery (například 2-, 4- a 8-mery) imunogenního peptidu P28 aa 115-131 (který obsahuje epitop buňky B i T) a _ protein EX —lidského, -papiHomaviru, antigeny Herpes simplex, antigeny viru slintavky a kulhavky a antigeny viru opičí imunodeficience.
Konstrukty DNA podle vynálezu mohou obsahovat promotor, jehož aktivita je vyvolána jako odpověď na změnu okolního prostředí. Příkladem je taková promotorově sekvence, která má aktivitu, která je vyvolána anaerobními podmínkami. Konkrétním příkladem takové promotorové sekvence je promotor nirB, který byl popsán například v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB92/00387. Promotor nirB byl izolován z E. coli, kde řídí expresi' '‘operonu, který zahrnuje gen nitrát reduktasy nirB (Jayaraman ad., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987) a nirD, nirC, cysG (Peakman a d., Eur. J. Biochem. 191, 315323, 1990) . Je regulován jak nitritem, tak změnami tenze kyslíku v okolí a aktivuje se, je-li zbaven kyslíku (Cole, Biochem. Biophys. Acta 162, 356-368, 1968). Odpověď na anaerobiózu je zprostředkována proteinem FNR, fungujícím jako transkripční aktivátor v mechanismu společném mnoha anaerobním respiračním genům. Deleční a mutační analýzou byla izolována ta část promotoru, která odpovídá pouze na anaerobiózu a porovnáním s jinými anaerobicky regulovanými promotory bylo identifikováno konsensuální vazebné místo FNR (Bell a d., Nucl. Acids Res. 17, 3865-3874, 1989, Jayaraman a d., Nucl. Acids Res. 17, 135-145, 1989). Prokázalo se také, že vzdálenost mezi předpokládaným vazebným místem FNR a oblastí homologie -10 je kritická (Bell a d., Molec. Microbiol. 4, 1753-1763, 1990). Je tedy výhodné používat pouze tu část promotoru nirB, která odpovídá pouze na anaerobiózu. Odkazy na promotor nirB, jak jsou zde používány, se vztahují k samotnému promotoru nebo k jeho části nebo derivátu, který je schopen podporovat expresi kódující sekvence za anaerobních podmínek. Výhodná sekvence, obsahující promotor nirB, je
AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGG TAGGGCC (SEQ ID NO: 1)
Ve zvlášť výhodném aspektu je předmětem vynálezu molekula DNA zahrnující promotor nirB, operativně vázaný k sekvenci DNA kódující výše definovaný fúzní protein.
V jiném výhodném aspektu je předmětem vynálezu replikovatelný expresní vektor, vhodný pro použití v bakteriích, obsahující sekvenci promotoru nirB, operativně vázanou na sekvenci DNA kódující výše definovaný fúzní protein.
Molekula nebo konstrukt DNA může být integrován do bakteriálního chromosomu, například o sobě známými metodami, a v dalším aspektu je tedy předmětem vynálezu bakterie mající ve svém chromosomu výše definovanou sekvenci DNA nebo konstrukt.
Stabilní exprese fúzního proteinu je možno dosáhnout in vivo. Fúzní protein může být exprimován v oslabené bakterii, která tak může být použita jako vakcína.
Oslabená bakterie může být vybrána z rodů Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria a Yersinia. Alternativně může být oslabenou bakterií oslabený kmen enterotoxigenní Escherichia coli. Je možno uvést konkrétně tyto druhy: S. typhi - původce lidského tyfu, S. typhimurium původce salmonelózy u několika druhů živočichů, S. enteritidis - původce otravy jídlem u lidí, S. choleraesuis původce salmonelózy u prasat, Bordetella pertussis - původce černého kašle, Haemophilus influenzae - původce meningitidy,
Neisseria gonorrhoea - původce gonorrhoey, a Yersinia původce otravy jídlem.
Příklady oslabených bakterií jsou uvedeny například v EP-A-0322237 a EP-A-0400958, jejichž popisy jsou zde zahrnuty formou odkazu.
___ Jako vakcína může být____________použita oslabená—bakterie obsahující konstrukt DNA podle vynálezu, buď přítomný v bakteriálním chromosomu, nebo ve formě plasmidu, nebo v obou formách. Fúzní proteiny (přednostně ve v podstatě čisté formě), exprimované touto bakterií, mohou být také použity při přípravě vakcín. Například bylo zjištěno, že čištěný fúzní protein TetC-P28, v němž je protein TetC navázán svým C-koncem na protein P28 bez intervenující pantové oblasti, je sám o sobě imunogenní. V dalším aspektu je tedy předmětem vynálezu vakcinový přípravek zahrnující farmaceuticky přijatelný nosič .nebo jř^didlo a jako účinnou složku výše definovanou oslabenou bakterii nebo fúzní protein.
Vakcína může zahrnovat jednu nebo více vhodných přísad.
Vakcína je výhodně v lyofilizované formě, například ve formě kapslí, pro orální podávání pacientovi. Tyto kapsle mohou být opatřeny enterosolventním povlakem, zahrnujícím například Eudragit „S, Eudragit „L, acetát celulózy, acetát-ftalát celulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózu. Tyto kapsle mohou být používány jako takové nebo alternativně může být lyofilizovaný materiál před podáváním, například jako suspense, rekonstituován. Rekonstituce se výhodně provádí v pufru při vhodném pH, zajišťujícím životaschopnost organismů. K ochraně oslabené bakterie před žaludeční kyselostí se výhodně před každým podáním vakcíny podává preparát na bázi hydrogenuhličitanu sodného. Alternativně může být vakcína připravována pro parenterální aplikaci, intranasální aplikaci nebo intramamální aplikaci.
Oslabená bakterie obsahující konstrukt DNA nebo fúzní protein podle vynálezu mohou být použity při profylaktickém ošetření hostitele, popřípadě zvířecího infekci, způsobené zejména lidského hostitele, ale také hostitele. Je tedy možno předcházet mikroorganismem, zvláště patogenem, podáváním účinné dávky oslabené bakterie podle vynálezu.
Bakterie pak exprimuje fúzní protein, který je schopen vyvolávat tvorbu protilátek proti mikroorganismu. Použitá dávka bude záviset na různých faktorech včetně velikosti a hmotnosti hostitele, typu formulované vakcíny a charakteru fúzního proteinu.
Oslabená bakterie podle vynálezu může být připravována transformaci oslabené bakterie výše definovaným konstruktem DNA. Může být použita jakákoli vhodná technika transformace, jako je elektroporace. Tímto způsobem je možno získat oslabenou bakterii schopnou exprimovat protein nebo proteiny heterologní k bakterii. Kultura této oslabené bakterie může být pěstována za aerobních podmínek. Připraví se tak dostatečné množství' bakterie pro formulaci ve formě vakcíny s minimální probíhající expresí fúzního proteinu.
Konstrukt DNA může být replikovatelný expresní vektor, zahrnující promotor nirB, operativně vázaný k sekvenci DNA, kódující fúzní protein. Promotor nirB může být vložen do expresního vektoru, který již zahrnuje gen, kódující jeden z heterologních proteinů (například fragment C tetanového toxinu), namísto existujícího promotoru kontrolujícího expresi proteinu. Pak může být vložen gen, kódující druhý heterologní protein (například antigenní sekvenci). Expresní vektor by samozřejmě měl být kompatibilní s oslabenou bakterií, do níž se má vektor vkládat.
Expresní vektor je vybaven příslušnými kontrolními elementy pro transkripci a translaci, zahrnujícími vedle promotoru nirB terminační místo transkripce a startovací a terminační kodon translace. Je k dispozici také příslušné místo vazby ribosomů. Vektor typicky zahrnuje počátek replikace a podle potřeby gen selektovatelného signálního znaku, jako je gen rezistence k antibiotikům. Vektorem může být plasmid.
Vynález je blíže osvětlen v souvislosti s uvedenými příklady provedeni a připojenými výkresy, které jej však nijak neomezuj i.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 schematicky zobrazuje konstrukci plasmidú pTECHl.
Obr. 2 schematicky znázorňuje přípravu plasmidú pTECHl28 z výchozích materiálů pTECHl a PUC19-P28.
Obr. 3 schematicky znázorňuje přípravu plasmidú pTECH3P28 z výchozích materiálů plasmidú pTECHl-P28 a pTETnirl5.
Obr. 4a 5 představují westernové přenosy, získané z bakteriálních buněk-obsáifQj ících konstrukt pŤECH3-P28.
Obr. 6 znázorňuje glutathionové afinitní čištění fúzí TetC, stanovené pomocí SDS-PAGE a barvením Coomasie Blue.
Podle vynálezu byl zkonstruován vektor, umožňující genetické fúze k C-konci vysoce imunogenního C fragmentu tetanového toxinu bez použití heterologní pantové oblasti. Byla zkonstruována fúze s genem, kódujícím ochrannou glutathion S-transferasu 28 kDa ze Schistosoma mansoni. Rekombinační vektor byl transformován do Salmonella typhimurium (SL338, rm+) . Vzniklý chimerní protein byl v salmonele stabilně exprimován v rozpustné formě, jak potvrzuje westernový přenos s fragmentem C a antisérem glutathion S-transferasy. Dále bylo zjištěno, že komponenta P28 fúze si uchovává schopnost vázat glutathion.
Konstrukce vektoru a vlastnosti fúzního proteinu, exprimovaného z něho, jsou podrobněji popsány dále.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava pTECHl
Příprava pTECHl, plasmidu zahrnujícího promotor nirB a gen TetC, a sekvence DNA kódující pantovou oblast a obsahující místa restrikční endonukleasy k umožnění inserce genu kódujícího druhý nebo hostující protein, je znázorněna na obr. 1. Expresní plasmid pTETnirl5, výchozí materiál znázorněný na obr. 1, byl konstruován z pTETtacll5 (Makoff a d., Nucl. Acids Res. 17, 10191-10202, 1989) náhradou oblasti EcoRI-Apal (1354 bp), obsahující gen láci a promotor tac, tímto párem oligomerů 1 a 2:
01igo-l ’’
5' AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGC GGTAGGGCC-3' (SEQ ID NO: 2)
Oligo-2
3' -GTCCATTTAAACTACATGTAGTTTACCATGGGGAACGACTTAGCAATTCCATCCG CCATC-5' (SEQ ID NO: 3)
Oligonukleotidy byly syntetizovány na zařízení Pharmacia Gene Assembler a vzniklé plasmidy byly potvrzeny sekvenováním (Makoff a d., Bio/Technology 7, 1043-1046, 1989).
Plasmid pTETnirlS pak byl použit ke konstrukci plasmidu pTECHl, zahrnujícího polylinkerovou oblast, vhodnou jako místo pro vložení heterologní DNA, která bude řídit expresi fúzních proteinů s fragmentem C. pTETnirl5 je známý plasmid na bázi pAT153, který řídí expresi fragmentu C. Na 3'-konci genu TetC však nejsou přítomna žádná přirozeně se vyskytující vyhovující restrikční místa. Proto byla na 3'-konec kódující oblasti TetC zavedena cílová místa s předcházející pantovou oblastí pomocí primeru SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 5, zhotovených s „přidanými” adaptorovými sekvencemi (tabulka 1) s použitím reakce s polymerasou (PCR)[K. Mullis a d, Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol. 51, 263-273, 1986]. V PCR reakci s použitím primeru odpovídajících oblastem, pokrývajícím místa SacII a BamHI, byl přitom jako templát použit pTETnirl5. Pozitivní primer při této amplifikaci byl zhotoven s 38bázovou 5'-adaptorovou sekvencí. Pozitivní primer byl navržen tak, aby do PCR produktu byla začleněna sekvence kódující nová místa Xbal, Spěl a BamHI. Dále byly vloženy sekvence DNA, kódující další přidané aminokyseliny zahrnující prolin (pantové oblasti) a signál terminačního kodonu translace v rámci s otevřeným čtecím rámcem fragmentu C.
Produkt PCR byl gelově čištěn a digerován se SacII a BamHI a klonován do zbytkového 2,8 kb vektoru pTETnirl5, který byl předem digerciváa Sadí a BamHI: Vzniklý plasmid, čištěný z transformovaných kolonií a nazvaný pTECH 1, je znázorněn na obr. 1. Heterologní sekvence, jako je sekvence kódující glutathion S-transferasu P28 Schistosoma mansoni (P28), byly klonovány do míst Xbal, Spěl a BamHI v souladu se známými metodami.
Sekvence DNA plasmidu pTECHl je uvedena v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO; 6.
Tabulka 1
SEKVENCE DNA OLIGONUKLEOTIDŮ POUŽITÝCH PŘI KONSTRUKCI VEKTORŮ TETC-PANT
A) Primer 1. Negativní PCR (21mer). (SEQ ID NO: 4)
SacII
5'AAA GAC TCC GCG GGC GAA GTT -3'
FRAGMENT SEKVENCE TETANOVÉHO TOXINU C
B) Primer 2. Pozitivní primer PCR (64mer) (SEQ ID NO: 5) BamHI STOP Spěl Xbal PANTOVÁ OBLAST
5'- CTAT GGA TCC TTA ACT AGT GAT TCT AGA GGG CCC CGG CCC
GTC GTT GGT CCA ACC TTC ATC GGT -3'
3'-K0NEC SEKV. FRAGMENTU C TETANOVÉHO TOXINU
Příklad 2
Konstrukce pTECHl-P28
Expresní kazeta genu P28 byla vyrobena technikou PCR s použitím DNA pUC19-P28 (laskavý dar od Dr. R. Pierce, Pasteurův institut, Lilie) jako templátu. Oligonukleotidové primery byly navrženy tak, aby amplifikovaly plnou délku genu P28 počínaje startovacím kodonem a konče terminačním (stop) kodonem. Dále byl zhotoven negativní, resp. pozitivní primer s restrikčním místem pro Xbal, resp. BamHI. Primery jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8.
Produkt byl gelové čištěn a digerován s Xbal a BamHI a pak klonován do pTECHl, který byl předem digerován s těmito enzymy a pak gelové čištěn. Sekvence DNA pTECHl-P28 je uvedena v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 9.
Exprese fúzního proteinu TetC-pant-P28
Do pTECHl-P28 bylo elektroporací transformováno několik bakteriálních kmenů, totiž kmeny SL 5338 (A. Brown ad., J. Infect. Dis. 155, 86-92, 1987) a SL3261 S. typhimurium a E. coli (TG2). Kmeny SL3261 obsahující plasmid pTECHl-P28 jsou uloženy u Národní sbírky typových kultur (National Collection of Type Cultures) , 61 Colindale Avenue, Londýn, NW9 5HT, UK, pod přírůstkovým číslem NCTC 12833. Kmen SL3261 obsahující plasmid pTECHl, je uložen pod přírůstkovým číslem NCTC 12831. Identita rekombinantů byla potvrzena restrikčním mapováním plasmidové DNA, obsažené v buňkách. Další exprese fúzního proteinu TetC-P28 pak byla hodnocena pomocí SDS-PAGE a westernového přenosu bakteriálních buněk obsahujících konstrukt. Bylo zjištěno, že fúzní protein zůstává rozpustný, křížově reaguje jak s antisérem k TetC, tak P28, a v případě fúze o plné délce má očekávanou molekulovou hmotnost 80 kDal.
Fúzní protein byl, posuzováno pomocí SDS-PAGE a westernového přenosu, stabilně exprimován v E. coli (TG2) a
S. typhimurium (SL5.338-t-~. SL3261) . Zajímavé bylo, že ve westernovém přenosu je viditelný pás 50 kDal, který souběžně migruje s proteinem TetC-pant samotným a křížově reaguje výlučně se sérem anti-TetC. Jelikož kodonová selekce v pantové oblasti byla navržena jako suboptimální, mohou nečetné kodony způsobovat pauzy během translace, které mohou v některých případech vést k předčasné terminaci translace, která je tedy odpovědná za tento pás.
Afinitní čištění fúze TetC-P28
Glutathion je přirozeným substrátem pro P28, což je glutathion S-transferasa. Má se za to, že zbytky aminokyselin, účastnící se vazby glutathionu, jsou v primární struktuře polypeptidu prostorově odděleny a v terciární struktuře se spojují k vytvoření kapsy vážící glutathion (P. Reinemer a d., EMBO, J8, 1997-2005, 1991). Za účelem zjištění, zda se komponenta P28 fúze svinula správně, aby zaujmula konformaci schopnou vázat glutathion, byla testována její schopnost být afinitně čištěna na glutathion-agarózové matrici. Získané výsledky (neznázorněné) demonstrují, že TetC-P28 se skutečně může vázat k matrici a vazba je reversibilní, protože fúze může být kompetitivně eluována s volným glutathionem.
Příklad 3
Konstrukce pTECH3-P28
Plasmid pTECHl-P28 řídí expresi proteinu P28 S. mansoni jako C-terminální fúze k fragmentu C z tetanového toxinu, oddělené heterologní pantovou oblastí. Exprese fúzního proteinu je pod kontrolou promotoru nirB. Vektor pTECH3-P28 byl zčásti konstruován z plasmidu pTETnirl5 polymerasovou reakcí (PCR) s použitím vysoce věrné termostabilní polymerasy DNA z Pyrococcus fusorius, která má korekční aktivitu pro přidruženou 3'5' exonukleasu. Sled jednotlivých kroků je shrnut na obr. 5. Za účelem vytvoření substituční kazety TetC-bezpantové byl segment DNA od jediného místa Sacll v genu TetC k finálnímu kodonu amplifikován pomocí reakce PCR s použitím pTETnirl5 jako templátové DNA. Primery použité při amplifikaci PCR jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 11. Pozitivní primer při této amplifikaci byl zhotoven s rozpoznávací sekvencí Xbal.
Amplifikační reakce byla prováděna podle pokynů výrobce (Stratagene, La Jolla, CA, USA) . Produkt byl gelově čištěn, digerován se Sacll a Xbal a pak klonován do zbytkového vektoru pTECHl-P28, který byl předem digerován s jednotlivými enzymy Sacll a Xbal. Vzniklý vektor byl označen pTECH3-P28. Sekvence DNA pTECH3-P28 je uvedena v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 12.
Příklad 4
Transformace S. typhimurium SL5338 (galE rm*) s pTECH3P28 a analýza transformantů
Kultura S. typhimurium SL5338 (galE r'm*) byla pěstována buď v médiu L nebo YT a podle potřeby na L-agaru s ampicilinem (50 g/ml) a byla provedena transformace s plasmidem pTECH3-P28. Transformační protokol byl založen na metodě popsané MacLachlanem a Sandersonem (MacLachlan PR a Sanderson KE, 1985, Transformation of Salmonella typhimurium with plasmid DNA: difference between rough and smooth strains, J. Bacteriology 161, 442-445).
ml kultury S. typhimurium SL5338 (r'm+; Brown A,
Hormaeche CE, Demarco de Hormaeche R, Dougan G, Winther M, Maskell D a Stocker BAD, 1987, J. Infect. Dis. 155, 86-92), získané přes noc, byl použit k inokulaci 100 ml média LB a kultura byla třepána .při'‘<-37 °C do dosaženi' OB650 = 0, 2 . Buňky byly odebírány při 3000 x g a resuspendovány v 0,5 objemu ledově chladného 0,lM MgCl2. Pak byly buňky znovu peletovány a resuspendovány v 0,5 objemu ledově chladného CaCl2. Tento krok byl opakován ještě jednou a buňky byly resuspendovány v 1 ml 0, ÍM CaCl2, ke kterému bylo přidáno 50 μΐ TES (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 8,0). Buňky byly 45 až 90 min inkubovány na ledu. Ke 150 μΐ buněk bylo přidáno 100 ng plasmidové DNA v 1 až 2 μΐ. Směs byla inkubována 30 min na ledu, načež byl proveden tepelný šok při 42 °C po dobu 2 min a okamžitá reinkubace na ledu po dobu 1 min. K transformované směsi byly přidány 2 ml média LB a inkubováno 1,5 h k umožnění exprese genu rezistence k léčivu ampicilinu, B laktamasy. Po inkubaci bylo 20 μΐ a 200 μΐ buněk naneseno na agarové plotny LB, obsahující 50 μρ/πιΐ ampicilinu. Plotny byly vysušeny a inkubovány přes noc při 37 °C.
Identita rekombinantů byla potvrzena restrikčním mapováním plasmidové DNA a westernovým přenosem s antisérem zaměřeným proti TetC a P28.
SDS-PAGE a westernový přenos
Exprese fúzí TetC byla testována pomocí SDS-PAGE a westernového přenosu. Bakteriální buňky S. typhimurium SL5338 (galE rm*), obsahující plasmid pTECH3-P28 a rostoucí v mid16 log fázi s antibiotickou selekcí, byly získány odstředěním a proteiny byly frakcionovány pomocí 10% SDS-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu elektroblottingem a reagovaly buď s polyklonálním králičím antisérem zaměřeným proti TetC nebo proteinu P28 o plné délce. Bloty pak byly testovány s kozím anti-králičím lg, konjugovaným ke křenové peroxidase (Dako, High Wycombe, Bucks, UK), a vyvíjeny 4chlor-l-naftolem. Výsledky experimentů westernového přenosu jsou znázorněny na obr. 4 a 5; obr. 4 zobrazuje výsledky detekce králičím anti-TetC polyklonálním antisérem a obr. .5 zobrazuje výsledky detekce králičím anti-P28 polyklonálním antisérem. V obou případech pruhy 1, 2 a 3 představují nezávislé klony SL5338 (pTECH3-P28), pruhy 4, 5 a 6 jsou SL5338 (pTECHl-P28) a pruh 7 je SL5338 (pTETnirl5) . Jsou označeny hodnoty molekulové hmotnosti. Z výsledků je zřejmé, že fúzní protein zůstává rozpustný, reaguje jak s antisérem k TetC, tak P28 a má v případě fúze plné délky také očekávanou molekulovou hmotnost 80 kDal (obr. 4) . Kromě toho se fúzní protein jeví být stabilně exprimován.
Afinitní čištění na glutathion-agaróze
Glutathion je přirozeným substrátem pro P28, což je glutathion S-transferasa. Má se za to, že zbytky aminokyselin, účastnící se vazby glutathionu, jsou v primární struktuře polypeptidu prostorově odděleny a v terciární struktuře se spojují k vytvoření kapsy vážící glutathion. Za účelem zjištění, zda se komponenta P28 fúze svinula správně, aby zaujmula konformaci schopnou vázat glutathion, jsme testovali její schopnost být afinitně čištěna na glutathionagarózové matrici.
Bakteriální buňky, obsahující pTECH3-P28 a exprimující fúzi genu P28 plné délky s TetC, byly kultivovány do log fáze, vychlazeny na ledu a odebrány odstředěním při 2500 x g po dobu 15 min při 4 °C. Buňky byly resuspendovány v 1/15 původního objemu ledově chladného fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS) a lyžovány sonifikací v zařízení MSE Soniprep 150 (Gallenkamp, Leicester, UK) . Nerozpustný materiál byl odstředěn a k supernatantu byla přidána 1/6 objemu 50% suspense předem nabobtnaných glutathionagarózových perliček (Sigma, Poole, Dorset, UK). Po 1 h mírného míchání při teplotě místnosti byly perličky odstřeďovány 10 s při 1000 x g. Supernatant byl kanalizován a perličky byly resuspendovány ve 20 objemech chladného PBS s 0,5% Tritonu X100 a pak znovu odstředěny. Promývací stupeň byl opakován ještě třikrát. Fúzní protein byl, eluován přídavkem 1 objemu vzorkovacího pufru SDS-PAGE. Pro účely srovnání bylo podobně^postupováno u bakteriálních buněk obsahujících plasmid PTECH1-P28, z něhož je exprimován fúzní protein TetC-pant-P28. Extrakty z klonů obsahujících každý plasmid byly porovnávány s použitím SDS-PAGE a výsledky jsou znázorněny na obr. 6. Na obr. 6 pruhy 1, 2 a 3 jsou klony SL5338 (pTECHl-P28), zatímco pruhy 4, 5 a 6 jsou nezávislé klony SL5338 (pTECH3-P28) .
Z výsledků vyplývá, že fúzní protein TetC-P28 se skutečně může vázat na matrici a že vazba je reversibilní bez ohledu na nepřítomnost heterologní pantové oblasti (data neznázorněná). Je možné, že peptidická sekvence, přítomná na C-konci TetC, může vlastně této konkrétní oblasti dodávat flexibilitu.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
| (A) NÁZEV: MEDEVA HOLDINGS BV | |
| (B) | ULICE: CHURCHILL-LAAN 223 |
| (C) | MĚSTO: AMSTERDAM |
| (E) | ZEMĚ: NIZOZEMÍ |
| (F) | POŠTOVNÍ KÓD (ZIP): 1078 ED |
(ii) NÁZEV VYNÁLEZúftVAKCÍNY ' ' ' (iii) POČET SEKVENCÍ: 20 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, verze #1,25 (EPO) (vi) ÚDAJ O DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PCT/GB93/01617 (B) DATUM PODÁNÍ: 30.07.1993 (vi) ÚDAJ O DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: GB 9401787.8 (B) DATUM PODÁNÍ: 31.01.1994 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 68 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: 1..61 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
AATTCAGGTA AATTTGATGT ACATCAAATG GTACCCCTTG CTGAATCGTT 50 AAGGTAGGCG GTAGGGCC 68 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 68 párů bází | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | ŘETĚZEC: jednoduchý | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | TYP | MOLEKULY: DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: NE |
(iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
AATTCAGGTA AATTTGATGT ACATCAAATG GTACCCCTTG CTGAATCGTT 50 AAGGTAGGCG GTAGGGCC 68 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 60 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE ______________________ .
(iii) POZITIVNÍ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
GTCCATTTAA ACTACATGTA GTTTACCATG GGGAACGACT TAGCAATTCC 50 ATCCGCCATC 60 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 21-.párů bází | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | |
| (C) | ŘETĚZEC: jednoduchý | |
| (D) | TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | TYP | MOLEKULY: DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: NE |
(iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
AAAGACTCCG CGGGCGAAGT T 21 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) | DÉLKA: 64 | párů bází | |
| (B) | TYP: nukleová kyselina | ||
| (C) | ŘETĚZEC: | j ednoduchý | |
| (D) | TOPOLOGIE | : lineární | |
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE |
(iii) POZITIVNÍ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
CTATGGATCC TTAACTAGTG ATTCTAGAGG GCCGCGGCCC GTCGTTGGTC 50 CAACCTTCAT CGGT rz (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3754 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: kruhová (ii) TYP MOLEKULY:'DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE
22.
(iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
| TTCAGGTAAA | TTTGATGTAC | ATCAAATGGT | ACCCCTTGCT GAATCGTTAA GGTAGGCGGT | 60 |
| AGGGCCCAGA | TCTTAATCAT | CCACAGGAGA | CTTTCTGATG AAAAACCTTG ATTGTTGGGT | 120 |
| CGACAACGAA | GAAGACATCG | ATGTTATCCT | GAAAAAGTCT ACCATTCTGA^ACTTGGACAT | 180 |
| CAACAACGAT | ATTATCTCCG | ACATCTCTGG | TTTCAACTCC TCTGTTATCA CATATCCAGA | 240 |
| TGCTCAATTG | GTGCCGGGCA | TCAACGGCAA | AGCTATCCAC jCTGGTTAACA ACGAATCTTC | - 300 |
| TGAAGTTATC | GTGCACAAGG | CCATGGACAT | CGAATACAAC GACATGTTCA ACAACTTCAC | 360 |
| CGTTAGCTTC | TGGCTGCGCG | TTCCGAAAGT | TTCTGCTTCC CACCTGGAAC AGTACGGCAC | 420 |
| TAACGAGTAC | TCCATCATCA | GCTCTATGAA | GAAACACTCC CTGTCCATCG GCTCTGGTTG | 480 |
| GTCTGTTTCC | CTGAAGGGTA | ACAACCTGAT | CTGGACTCTG AAAGACTCCG CGGGCGAAGT | 540 |
| TCGTCAGATC | ACTTTCCGCG | x bUUvTvxn. | CAAGTTCAAC GCGTACCTGG CTAACAAATG | 600 |
| GGTTTTCATC | ACTATCACTA | ACGATCGTCT | GTCTTCTGCT AACCTGTACA TCAACGGCGT | 660 |
| TCTGATGGGC | TCCGCTGAAA | TCACTGGTCT | GGGCGCTATC CGTGAGGACA ACAACATCAC | 720 |
| TCTTAAGCTG | GACCGTTGCA | ACAACAACAA | CCAGTACGTA TCCATCGACA AGTTCCGTAT | 780 |
| CTTCTGCAAA | GCACTGAACC | CGAAAGAGAT | CGAAAAACTG TATACCAGCT ACCTGTCTAT | 340 |
| CACCTTCCTG | CGTGACTTCT | GGGGTAACCC | GCTGCGTTAC GACACCGAAT ATTACCTGAT | 900 |
| CCCGGTAGCT | TCTAGCTCTA | AAGACGTTCA | GCTGAAAAAC ATCACTGACT ACATGTACCT | 960 |
| GACCAACGCG | CCGTCCTACA | CTAACGGTAA | ACTGAACATC TACTACCGAC GTCTGTACAA | 1020 |
| CGGCCTGAAA | TTCATCATCA | AACGCTACAC | TCCGAACAAC GAAATCGATT CTTTCGTTAA | 1080 |
| ATCTGGTGAC | TTCATCAAAC | TGTACGTTTC | TTACAACAAC AACGAACACA TCGTTGGTTA | 1140 |
| CCCGAAAGAC | GGTAACGCTT | TCAACAACCT | GGACAGAATT CTGCGTGTTG GTTACAACGC | 1200 |
| TCCGGGTATC | CCGCTGTACA | AAAAAATGGA | AGCTGTTAAA CTGCGTGACC TGAAAACCTA | 1260 |
| CTCTGTTCAG | CTGAAACTGT | ACGACGACAA | AAACGCTTCT CTGGGTCTGG TTGGTACCCA | 1320 |
| CAACGGTCAG | ATCGGTAACG | ACCCGAACCG | TGACATCCTG ATCGCTTCTA ACTGGTACTT » | 1380 |
| CAACCACCTG | AAAGACAAAA | TCCTGGGTTG | CGACTGGTAC TTCGTTCCGA CCGATGAAGG | 1440 |
| TTGGACCAAC | GACGGGCCGG | GGCCCTCTAG | AATCACTAGT | 7AAGGA7CCG | CTAGCCCGCC | 1500 |
| TAATGAGCGG | GCTTTTTTTT | CTCGGGCAGC | GTTGGGTCCT | GGCCACGGG7 | GCGCA7GA7C | 1560 |
| GTGCTCCTGT | CGTTGAGGAC | CCGGCTAGGC | TGGCGGGGTT | GCCT7AC7GG | TTAGCAGAAT | 1620 |
| GAATCACCGA | TACGCGAGCG | AACGTGAAGC | GACTGCTGCT | GCAAAACGTC' | TGCGACCTGA | 1680 |
| GCAACAACAT | GAATGGTCTT | CGGTTTCCGT | GTTTCGTAAA | GTCTGGAAAC | GCGGAAGTCA | 1740 |
| GCGCTCTTCC | GCTTCCTCGC | TCACTGACTC | GCTGCGCTCG | GTCGTTCGGC | TGCGGCGAGC | 1800 |
| GGTATCAGCT | CACTCAAAGG | CGGTAATACG | GTTATCCACA | GAATCAGGGG | ATAACGCAGG | 1860 |
| AAAGAACATG | TGAGCAAAAG | GCCAGCAAAA | GGCCAGGAAC | .CG7AAAAAGG | CCGCGTTGCT | 1920 |
| GGCGTTTTTC | CATAGGCTCC | GCCCCCG7GÁ;--CGAGCATCAC | AAAAA7CGAČ | GČTCAAGTCA | 1980 | |
| GAGGTGGCGA | AACCCGACAG | GAC7A7AAAG | ATACCAGGCG | TTTCCCCCTG | GAAGCTCCCT | 2040 |
| CGTGCGCTCT | CCTGTTCCGA | X x | TACCGGATAC | CTGTCCGCCT | TTCTCCCTTC | 2100 |
| GGGAAGCGTG | r-f. r* Ui-VJk. i 1 | AATGCTCACG | CTGTAGGTAT | CTCAG7TCGG | TGTAGGTCGT | 2160 |
| TCGCTCCAAG | CTGGGCTGTG | TGCACGAACC | CCCCGTTCAG | CCCGACCGCT | GCGCCT7A7C | 2220 |
| CGGTAACTAT | CGTCTTGAGT | CCAACCCGGT | AAGACACGAC | 7TA7CGCCAC | X vVCzxvC/lÁsv | 2280 |
| CACTGGTAAC | AGGATTAGCA | GAGCGAGGTA | TGTAGGCGGT | GC7ACAGAG7 | TCTTGAAGTG | 2340 |
| GTGGCCTAAC | TACGGCTACA | CTAGAAGGAC | AGTA7TTGG7 | ATCTGCGCTC | TGCTGAAGCC | 2400 |
| AGTTACCTTC | GGAAAAAGAG | TTGGTAGCTC | TTGA7CCGGC | AAACAAACCA | CCGCTGGTAG | 2460 |
| CGGTGGTTTT | TTTGTT7GCA | AGCAGCAGAT | TACGCGCAGA | AAAAAAGGA7 | CTCAAGAAGA | 2520 |
| TCCTTTGATC | TTTTCTACGG | GGTCTGACGC | TCAGTGGAAC | GAAAACTCAC | GTTAAGGGAT | 2580 |
| TTTGGTCATG | AGATTATCAA | AAAGGATCTT | CACCTAGATC | CTTTTAAATT | AAAAATGAAG | 2640 |
| TTTTAAATCA | ATCTAAAGTA | TATATGAGTA | AACTTGGTCT | GACAG7TACC | AATGCTTAAT | 2700 |
| CAGTGAGGCA | CCTATCTCAG | CGATCTGTCT | ATTTCGTTCA | TCCATAGTTG | CCTGACTCCC | 2760 |
| CGTCGTGTAG | ATAACTACGA | TACGGGAGGG | CTTACCATCT | GGCCCCAGTG | CTGCAATGAT | 2820 |
| ACCGCGAGAC | CCACGCTCAC | CGGC7CCAGA | TTTATCAGCA | A7AAACCAGC | CAGCCGGAAG | 2880 |
| GGCCGAGCGC | AGAAGTGGTC | CTGCAACTTT | ATCCGCCTCC | ATCCAGTCTA | TTAATTGTTG | 2940 |
| CCGGGAAGCT | AGAGTAAGTA | GTTCGCCAGT | TAATAGTTTG | CGCAACG77G | TTGCCATTGC | 3000 |
| TGCAGGCATC | GTGGTGTCAC | GCTCGTCGTT | TGGTATGGCT | TCATTCAGCT | CCGGTTCCCA | 3060 |
2¼
ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG 3120
TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC 3180
ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA 3240
CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC 3300
AACACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG 3360
TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC 3420
CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC 3480
AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG.GCGACACGGA AATGTTGAAT 3540
ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTS-ftAGCATTTÁT CAGGGTTATT GTCTCATGAG 3600
CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC 3660
CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA CCTATAAAAA 3720
TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTCGTCTTCA AGAA 3754 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
TAGTCTAGAA TGGCTGGCGA GCATATCAAG 30 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
2Γ (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
TTAGGATCCT TAGAAGGGAG TTGCAGGCCT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4378 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dVojiCy (D) TOPOLOGIE: kruhová (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
| TTCAGGTAAA TTTGATGTAC ATCAAATGGT ACCCCTTGCT GAATCGTTAA GGTAGGCGGT | 60 | |||||
| START KODON | GENU TETO | |||||
| AGGGCCCAGA | TCTTAATCAT | CCACAGGAGA | CTTTCTGATG | AAAAACCTTG | ATTGTTGGGT | 120 |
| CGACAACGAA | GAAGACATCG | ATGTŤATCCT | GAAAAAGTCT | ACCATTCTGA | ACTTGGACAT | 180 |
| CAACAACGAT | ATTATCTCCG | ACATCTCTGG | TTTCAACTCC | TCTGTTATCA | CATATCCAGA | 24Ó |
| TGCTCAATTG | GTGCCGGGCA | TCAACGGCAA | AGCTATCCAC | CTGGTTAACA | ACGAATCTTC | 300 |
| TGAAGTTATC | GTGCACAAGG | CCATGGACAT | CGAATACAAC | GACATGTTCA | ACAACTTCAC | 360 |
| CGTTAGCTTC | TGGCTGCGCG | TTCCGAAAGT | TTCTGCTTCC | CACCTGGAAC | AGTACGGCAC | 420 |
| TAACGAGTAC | TCCATCATCA | GCTCTATGAA | GAAACACTCC | CTGTCCATCG | GCTCTGGTTG | 480 |
Sacll
GTCTGTTTCC CTGAAGGGTA ACAACCTGAT CTGGACTCTG AAAGACTCCG CGGGCGAAGT 540 TCGTCAGATC ACTTTCCGCG ACCTGCCGGA CAAGTTCAAC GCGTACCTGG CTAACAAATG 600 GGTTTTCATC ACTATCACTA ACGATCGTCT GTCTTCTGCT AACCTGTACA TCAACGGCGT 660 TCTGATGGGC TCCGCTGAAA TCACTGGTCT GGGCGCTATC CGTGAGGACA ACAACATCAC 720
2(,
TCTTAAGCTG GACCGTTGCA ACAACAACAA CCAGTACGTA TCCATCGACA AGTTCCGTAT 780
CTTCTGCAAA GCACTGAACC CGAAAGAGAT CGAAAAACTG TATACCAGCT ACCTGTCTAT 840
CACCTTCCTG CGTGACTTCT GGGGTAACCC GCTGCGTTAC GACACCGAAT ATTACCTGAT 900
CCCGGTAGCT TCTAGCTCTA AAGACGTTCA GCTGAAAAAC ATCACTGACT ACATGTACCT 960
GACCAACGCG CCGTCCTACA CTAACGGTAA ACTGAACATC TACTACCGAC GTCTGTACAA 1020
CGGCCTGAAA TTCATCATCA AACGCTACAC TCCGAACAAC GAAATCGATT CTTTCGTTAA 1080
ATCTGGTGAC TTCATCAAAC TGTACGTTTC TTACAACAAC AACGAACACA TCGTTGGTTA 1140
CCCGAAAGAC GGTAACGCTT TCAACAACCT GGACAGAATT-CTGCGTGTTG GTTACAACGC ' 1200 TCCGGGTATC CCGCTGTACA AAAÁ&ATG&A'-AGCTGTŤAAA CTGCGTGACC~TGAAAACCTA 1260 CTCTGTTCAG CTGAAACTGT ACGACGACAA AAACGCTTCT CTGGGTCTGG TTGGTACCCA 1320
CAACGGTCAG ATCGGTAACG ACCCGAACCG TGACATCCTG ATCGCTTCTA ACTGGTACTT 1380
CAACCACCTG AAAGACAAAA TCCTGGGTTG CGACTGGTAC TTCGTTCCGA CCGATGAAGG 1440
PANTOVÁ OBLAST Xbal START GENU P28 S. Mansoni TTGGACCAAC GACGGGCCGG GGCCCTCTAG AATGGCTGGC GAGCATATCA AGGTTATCTA 1500
TTTTGACGGA CGCGGACGTG CTGAATCGAT TCGGATGACT CTTGTGGCAG CTGGTGTAGA 1560
CTACGAAGAT GAGAGAATTA GTTTCCAAGA TTGGCCAAAA ATCAAACCAA C7ATTCCAGA 1620
CGGACGATTG CCTGCAGTGA AAGTCACTGA TGATCATGGG CACGTGAAAT GGATGTTAGA 1680
GAGTTTGGCT ATTGCACGGT ATATGGCGAA GAAACATCAT ATGATGGGTG AAACAGACGA 1740
GGAATACTAT AGTGTTGAAA AGTTGATTGG TCATGCTGAA GATGTAGAAC ATGAATATCA 1800
CAAAACTTTG ATGAAGCCAC AAGAAGAGAA AGAGAAGATA ACCAAAGAGA TATTGAACGG 1860
CAAAGTTCCA GTTCTTCTCA ATATGATCTG CGAATCTCTG AAAGGGTCGA CAGGAAAGCT 1920
GGCTGTTGGG GACAAAGTAA CTCTAGCTGA TTTAGTCCTG ATTGCTGTCA TTGATCATGT 1980
GACTGATCTG GATAAAGGAT TTCTAACTGG CAAGTATCCT GAGATCCATA AACATCGAGA 2040
AAATCTGTTA GCCAGTTCAC CGCGTTTGGC GAAATATTTA TCGAACAGGC CTGCAACTCC 2100
STOP BamHI
CTTCTAAGGA TCCGCTAGCC CGCCTAATGA GCGGGCTTTT TTTTCTCGGG CAGCGTTGGG 2160
TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG 2220
GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC 2280
2Í
| TGCTGCAAAA | CGTCTGCGAC | CTGAGCAACA | ACATGAATGG | TCTTCGGTTT | CCGTGTTTCG | 2340 |
| TAAAGTCTGG | AAACGCGGAA | GTCAGGGCTC | TTCCGCTTCC | TCGCTCACTG | AC7CGCTGCG | 2400 |
| CTCGGTCGTT | CGGCTGCGGC | GAGCGGTATC | AGCTCACTCA | AAGGCGGTAA | TACGGTTATC | 2460 |
| CACAGAATCA | GGGGATAACG | CAGGAAAGAA | CATGTGAGCA | AAAGGCCAGC | AAAAGGCCAG | 2520 |
| GAACCGTAAA | AAGGCCGCGT | TGCTGGCGTT | TTTCCATAGG | CTCCGCCCCC | CTGACGAGCA | 2580 |
| TCACAAAAAT | CGACGCTCAA | GTCAGAGGTG | GCGAAACCCG | ACAGGACTAT | AAAGATACCA | 2640 |
| GGCGTTTCCC | CCTGGAAGCT | CCCTCGTGCG | CTCTCCTGTT | CCGACCCTGC | CGGTTACCGG | 2700 |
| ATACCTGTCC | GCCTTTCTCC | CTTCGGGAAG | CGTGGCGCTT' | 'TCTCAATGCT | CACGCTGTAG | 2760 |
| GTATCTCAGT | TCGGTGTAGG | TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC | TGTGTGCACG | AACCCCCCGT | 2820 | |
| TCAGCCCGAC | CGCTGCGCCT | TATCCGGTAA | CTATCGTCTT | GAGTCCAACC | CGGTAAGACA | 2880 |
| CGACTTATCG | CCACTGGCAG | CAGCCACTGG | TAACAGGATT | AGCAGAGCGA | GGTATGTAGG | 2940 |
| CGGTGCTACA | GAGTTCTTGA | AGTGGTGGCC | TAACTACGGC | TACACTAC-AA | GGACAGTATT | 3000 |
| TGGTATCTGC | GCTCTGCTGA | AGCCAGTTAC | CTTCGGAAAA | AGAGTTGGTA | gctcttgatc | 3060 |
| CGGCAAACAA | ACCACCGCTG | GTAGCGGTGG | TTTTTTTGTT | TGCAAGCAGC | AGATTACGCG | 3120 |
| CAGAAAAAAA | GGATCTCAAG | AAGATCCTTT | GATCTTTTCT | ACGGGGTCTG | ACGCTCAGTG | 3180 |
| GAACGAAAAC | TCACGTTAAG | GGATTTTGGT | CATGAGATTA | TCAAAAAGGA | TCTTCACCTA | 3240 |
| GATCCTTTTA | AATTAAAAAT | GAAGTTTTAA | ATGAATCTAA | AGTATATATG | AGTAAACTTG | 3300 |
| GTCTGACAGT | TACCAATGCT | TAATCAGTGA | GGCACCTATC | TCAGCGATCT | GTCTATTTCG | 3360 |
| TTCATCCATA | GTTGCCTGAC | TCCCCGTCGT | GTAGATAACT | ACGATACGGG | AGGGCTTACC | 3420 |
| ATCTGGCCCC | AGTGCTGCAA | TGATACCGCG | AGACCCACGC | TCACCGGCTC | CAGATTTATC | 3480 |
| AGCAATAAAC | CAGCCAGCCG | GAAGGGCCGA | GCGCAGAAGT | GGTCCTGCAA | CTTTATCCGC | 3540 |
| CTCCATCCAG | TCTATTAATT | GTTGCCGGGA | AGCTAGAGTA | AGTAGTTCGC | CAGTTAATAG | 3600 |
| TTTGCGCAAC | GTTGTTGCCA | TTGCTGCAGG | CATCGTGGTG | TCACGCTCGT | CGTTTGGTAT | 3660 |
| GGCTTCATTC | AGCTCCGGTT | CCCAACGATC | AAGGCGAGTT | ACATGATCCC | CCATGTTGTG | 3720 |
| CAAAAAAGCG | GTTAGCTCCT | TCGGTCCTCC | GATCGTTGTC | AGAAGTAAGT | TGGCCGCAGT | 3780 |
| GTTATCACTC | ATGGTTATGG | CAGCACTGCA | TAATTCTCTT | ACTGTCATGC | CATCCGTAAG | 3840 |
| ATGCTTTTCT | GTGACTGGTG | AGTACTCAAC | CAAGTCATTC | TGAGAATAGT | GTATGCGGCG | 3900 |
2.8
ACCGAGTTGC TCTTGCCCGG CGTCAACACG GGATAATACC GCGCCACATA GCAGAACTTT
AAAAGTGCTC ATCATTGGAA AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA TCTTACCGCT
GTTGAGATCC AGTTCGATGT AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG CATCTTTTAC
TTTCACCAGC GTTTCTGGGT GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA AAAAGGGAAT
AAGGGCGACA CGGAAATGTT GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT ATTGAAGCAT
TTATCAGGGT TATTGTCTCA TGAGCGGATA CATATTTGAA TGTATTTAGA AAAATAAACA
AATAGGGGTT CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG AAACCATTAT
TATCATGACA TTAACCTATA AAAATAGGCG TATCACGAGG-CCCTTTCGTC TTCAAGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP£ nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
AAAGACTCCG CGGGCGAAGT T
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4.378 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: ANO
W (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:
TTATCTAGAG TCGTTGGTCC AACCTTCATC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4366 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: kruhová (ii) TYP MOLEKULY-.:. DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
| TTCAGGTAAA TTTGATGTAC ATCAAATGGT ACCCCTTGCT GAATCGTTAA GGTAGGCGGT | 60 | |
| START KODON GENU TETC | ||
| AGGGCCCAGA | TCTTAATCAT CCACAGGAGA CTTTCTGATG AAAAACCTTG ATTGTTGGGT | 120 |
| CGACAACGAA | GAAGACATCG ATGTTATCCT GAAAAAGTCT ACCATTCTGA ACTTGGACAT | 130 |
| CAACAACGAT | ATTATCTCCG ACATCTCTGG TTTCAACTCC TCTGTTATCA CATATCCAGA | 240 |
| TGCTCAATTG | GTGCCGGGCA TCAACGGCAA AGCTATCCAC CTGGTTAACA ACGAATCTTC | 300 |
| TGAAGTTATC | GTGCACAAGG CCATGGACAT CGAATACAAC GACATGTTCA ACAACTTCAC | 360 |
| CGTTAGCTTC | TGGCTGCGCG TTCCGAAAGT TTCTGCTTCC CACCTGGAAC AGTACGGCAC | 420 |
| TAACGAGTAC | TCCATCATCA GCTCTATGAA GAAACACTCC CTGTCCATCG GCTCTGGTTG | 480 |
| SacII | ||
| GTCTGTTTCC | CTGAAGGGTA ACAACCTGAT CTGGACTCTG AAAGACTCCG CGGGCGAAGT | 540 |
| TCGTCAGATC | ACTTTCCGCG ACCTGCCGGA CAAGTTCAAC GCGTACCTGG CTAACAAATG | 600 |
| GGTTTTCATC | ACTATCACTA ACGATCGTCT GTCTTCTGCT AACCTGTACA TCAACGGCGT | 660 |
| TCTGATGGGC | TCCGCTGAAA TCACTGGTCT GGGCGCTATC CGTGAGGACA ACAACATCAC | 720 |
| TCTTAAGCTG | GACCGTTGCA ACAACAACAA CCAGTACGTA TCCATCGACA AGTTCCGTAT | 780 |
| CTTCTGCAAA | GCACTGAACC CGAAAGAGAT CGAAAAACTG TATACCAGCT ACCTGTCTAT | 840 |
(7
Claims (8)
- PATENTOVÉ :-7O cdOOCo<o< 1b. ι1. Konstrukt DNA, zahrnující sekvenci DNA kódující fúzní protein vzorce TetC-(Z)a-Het, kde TetC je C fragment tetanového toxinu, Het je heterologní protein, Z je aminokyselina a a je 0 až 15, s podmínkou, že (Z)a nezahrnuje sekvenci Gly-Pro.
- 2. Konstrukt DNA podle nároku 1, kde (Z)a je řetězec o 0 až 10 aminokyselinách.
- 3. Konstrukt DNA podle nároku 2, kde (Z)a je řetězec o méně než 6 aminokyselinách.
- 4. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde (Z)a je řetězec o méně než 4 aminokyselinách.
- 5. Konstrukt DNA podle nároku 4, kde (Z)a je řetězec o dvou nebo třech aminokyselinách, pro něž sekvence DNA definuje místo štěpení restrikční endonukleasou.
- 6. Konstrukt DNA podle nároku 1, kde a je nula.
- 7. Konstrukt DNA podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde (Z)a je prostý glycinu a/nebo prolinu.
- 8. Konstrukt DNA podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde skupina (Z) a je řetězec aminokyselin v podstatě prostý biologické aktivity.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/GB1993/001617 WO1994003615A1 (en) | 1992-07-31 | 1993-07-30 | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
| GB9401787A GB9401787D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Vaccine compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ24196A3 true CZ24196A3 (en) | 1996-06-12 |
Family
ID=10749593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ96241A CZ24196A3 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Vaccine preparations |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6488926B1 (cs) |
| KR (1) | KR100338894B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ24196A3 (cs) |
| GB (1) | GB9401787D0 (cs) |
| HU (1) | HUT74495A (cs) |
| PL (1) | PL186847B1 (cs) |
| SK (1) | SK9996A3 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214787B1 (en) * | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
| GB0205376D0 (en) * | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Royal Holloway University Of L | Spore germination |
| US20050175625A1 (en) * | 2002-07-12 | 2005-08-11 | The Johns Hopkins University | Mesothelin vaccines and model systems |
| US20090110702A1 (en) | 2002-07-12 | 2009-04-30 | The Johns Hopkins University | Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors |
| US9200036B2 (en) | 2002-07-12 | 2015-12-01 | The Johns Hopkins University | Mesothelin vaccines and model systems |
| US7521059B2 (en) * | 2004-06-14 | 2009-04-21 | Fenwick Bradley W | Kennel cough vaccine |
| CA2583202A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-27 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules |
| AU2006247188A1 (en) | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Methods and compositions for immunizing against chlamydia infection |
| CA2631952A1 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-14 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of antibodies |
| US20070148131A1 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-28 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of binding partners |
| EP2010205A2 (en) | 2006-03-16 | 2009-01-07 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs |
| US20090092660A1 (en) * | 2006-08-09 | 2009-04-09 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of particles |
| EP2373338B1 (en) | 2008-12-03 | 2017-02-15 | The Johns Hopkins University | Annexina2 as immunological target |
| US11246915B2 (en) | 2010-09-15 | 2022-02-15 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
| BR112016025866A2 (pt) | 2014-05-07 | 2017-12-12 | Applied Molecular Transp Llc | composição farmacêutica, método para tratar uma doença anti-inflamatória em um indivíduo, método para tratar uma doença autoimune em um indivíduo, método para tratar um câncer em um indivíduo, uso de uma molécula de fusão que não ocorre naturalmente, método para tratar um distúrbio metabólico em um indivíduo, método para tratar uma doença hepática gordurosa em um indivíduo, método para tratar um distúrbio de deficiência de hormônio de crescimentoem um indivíduo, e, polinucleotídeo que codifica uma molécula de fusão |
| WO2021034727A1 (en) | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Applied Molecular Transport Inc. | Compositions, formulations, and interleukin production and purification |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516442D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Wellcome Found | Cloned antigen |
| EP0399001B1 (en) | 1988-02-01 | 1994-07-27 | Praxis Biologics, Inc. | T-cell epitope as carriers molecule for conjugate vaccines |
| GB8914122D0 (en) * | 1989-06-20 | 1989-08-09 | Wellcome Found | Polypeptide expression |
| CA2031468A1 (en) | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| FR2656626B1 (fr) | 1989-12-29 | 1994-08-12 | Pasteur Institut | Fragment peptidique comprenant une sequence issue de la proteine 28 kda de schistosoma mansoni et compositions vaccinantes et/ou therapeutiques comprenant ledit fragment. |
| US5498538A (en) * | 1990-02-15 | 1996-03-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Totally synthetic affinity reagents |
| PL170938B1 (pl) | 1991-03-05 | 1997-02-28 | Wellcome Found | Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella PL PL |
| SE468050C (sv) * | 1991-03-15 | 1998-04-27 | Pharmacia & Upjohn Ab | Rekombinant derivat av human faktor VIII |
| WO1993008290A1 (en) | 1991-10-16 | 1993-04-29 | University Of Saskatchewan | Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras |
| ES2127829T3 (es) | 1992-07-31 | 1999-05-01 | Medeva Holdings Bv | Expresion de proteinas recombinantes fusionadas en bacterias atenuadas. |
-
1994
- 1994-01-31 GB GB9401787A patent/GB9401787D0/en active Pending
- 1994-07-29 US US08/586,740 patent/US6488926B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 SK SK99-96A patent/SK9996A3/sk unknown
- 1994-07-29 KR KR1019960700478A patent/KR100338894B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 HU HU9600207A patent/HUT74495A/hu unknown
- 1994-07-29 PL PL94313979A patent/PL186847B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 CZ CZ96241A patent/CZ24196A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100338894B1 (ko) | 2002-11-13 |
| US6488926B1 (en) | 2002-12-03 |
| HUT74495A (en) | 1997-01-28 |
| SK9996A3 (en) | 1996-09-04 |
| HU9600207D0 (en) | 1996-04-29 |
| PL313979A1 (en) | 1996-08-05 |
| GB9401787D0 (en) | 1994-03-23 |
| PL186847B1 (pl) | 2004-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ24196A3 (en) | Vaccine preparations | |
| EP0712442A1 (en) | Vaccine compositions | |
| AU2018210554A1 (en) | Induction of protective immunity against antigens | |
| CA2328515C (en) | Continuous in-vitro evolution | |
| CN108715861B (zh) | 一种碱基编辑工具及其应用 | |
| CN101984061B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用 | |
| CN110891600B (zh) | 表达寨卡病毒蛋白的重组麻疹病毒及其应用 | |
| CN108395996B (zh) | 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途 | |
| CN101405389A (zh) | 新型蛋白质表达系统 | |
| CN107937428B (zh) | 一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法 | |
| CN113604505A (zh) | pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN113652405A (zh) | pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用 | |
| KR20230136172A (ko) | 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물 | |
| CN107661496A (zh) | 一种猪细小病毒免疫组合物及其制备方法与应用 | |
| RU2782267C2 (ru) | Индукция защитного иммунитета против антигенов | |
| CN113249407A (zh) | 一种用于同源重组的载体及其应用 | |
| CN100564531C (zh) | 猪n-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用 | |
| CN112725211A (zh) | 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途 | |
| CN114533862B (zh) | 一种鱼用dna疫苗及其制备方法与应用 | |
| KR101123640B1 (ko) | 전기 전도성을 지니게 하는 박테리오파아지의 제조 방법 및상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지 및 상기 박테리오파아지를 분자 인지 센서로 이용하는 방법 및 상기박테리오파아지를 이용한 분자 인지 센서 | |
| CN108929877A (zh) | 一种编码嵌合寨卡病毒的dna分子及其制备方法和用途 | |
| US20220307050A1 (en) | Non-viral transgenesis | |
| KR102468650B1 (ko) | T7 RNA 중합효소 및 mRNA 캡핑 효소를 유도 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도 | |
| KR102372647B1 (ko) | 멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 | |
| CN108096573A (zh) | 一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |