CN101984061B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人工克隆弱毒疫苗株，该疫苗株是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性内切酶位点。本发明还公开了一种重组载体，包含高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的全长基因cDNA序列，该全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，且该全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性内切酶位点。本发明的人工克隆弱毒疫苗株，不仅在免疫猪体后能对猪抵抗高致病性PRRSV提供完全的安全免疫保护，而且能有效区分猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪与猪繁殖与呼吸综合征自然感染猪，有利于高致病性PRRSV的预防和控制。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种具有感染性的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒人工克隆弱毒疫苗株及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状和高死亡率为主要特征的传染病，俗称“猪繁殖与呼吸综合征”，是OIE法定报告的七大猪病之一。从1996年首次发现以来，一直在我国流行，给我国养猪业造成巨大的经济损失。2006年，一种“猪高热综合征”在我国猪群传播迅速，发病率为50-100％，死亡率为20-100％，对各种年龄的猪均有发病死亡，后来证实此病是由一种变异的PRRSV引起的，此病毒被称为高致病性PRRSV。

PRRSV是不分节段、单股、正链有囊膜的RNA病毒，基因组全长大约15kb左右，整个基因组RNA具有感染性，含有9个开放阅读框(ORF)，在5’端有帽子结构，在3’端有poly(A)尾，根据遗传学演化分析和血清学差异可以将PRRSV分为两个血清型，分别是以LV株为代表的欧洲型和以VR-2332为代表的美洲型。而我国的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与早期流行的经典毒株CH-1a株相比其核苷酸同源性在94.9％-95.4％左右，最具特征的是在非结构蛋白NSP2基因区域存在不连续的30个氨基酸的缺失，同时在5’端与3’端非编码区各有一处核苷酸缺失。由于存在大量核苷酸变异以及碱基缺失等特征，在生物学特性上与以往经典毒株相比较，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒其细胞适应能力显著提高，抗原性增强，在猪体内增殖更快，病毒血症出现的时间更早，致病性和致死能力明显增强。目前高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情在我国仍然很严重，高致病性PRRSV毒株已经成为我国近年来流行的优势毒株，其毒力和致病性丝毫没有减弱的趋势。

尽管世界各养猪大国对PRRS都给予了足够的重视，从1987年PRRSV被发现以来，人们围绕PRRSV病原生物学特性、免疫学特性、致病机制和疫苗等进行了不懈的探索，在对病原基因组结构、病毒编码蛋白特性、与病毒相互作用的宿主细胞蛋白、抗病毒感染免疫等方面的研究中也取得了一些较好的进展，但是由于PRRSV易发生变异、能够造成持续感染和免疫抑制，而且具有抗体依赖性增强作用(ADE)等等特征都成为目前控制PRRS的主要障碍。再加上我国目前存在的PRRSV毒株呈现多样化并存的态势，也就是既存在基因组无缺失的经典毒株，又存在NSP2基因编码区核苷酸插入毒株，还存在NSP2基因编码区核苷酸不同数量缺失的变异毒株等等，使我国由PRRSV引起的疫情趋于复杂化，这样不仅加重了防控PRRS的难度，而且给PRRSV的研究也带来了新的挑战。

目前对该病的控制手段主要依靠疫苗免疫，疫苗免疫可以有效的降低该病的传播，其中PRRS灭活疫苗具有安全、便于储存和运输等优点，其缺点是在灭活疫苗的制备过程中容易造成病原体抗原性减弱，使疫苗的免疫效率降低，而且灭活疫苗的免疫剂量大，成本高，对异源毒株免疫效果不理想。弱活疫苗免疫效果好，免疫反应持续时间长，但其安全性仍然令人担忧，尤其是对于我国存在的高致病性猪繁殖与呼吸综合征目前尚无较好的疫苗应用于临床，给我国防控高致病性猪繁殖与呼吸综合征带来很大的困难。

发明内容

本发明要解决缺乏安全、高效的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗的技术问题，提供一种具有感染性的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的人工克隆弱毒疫苗株，该疫苗免疫猪体后21天就可以对猪抵抗高致病性PRRSV提供完全的免疫保护，且安全可靠。

此外，还需要提供一种上述人工克隆弱毒疫苗株的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的全长基因cDNA序列，该全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，且该全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性内切酶位点。

优选的，所述载体为pSK载体，该pSK载体内部XhoI至NotI的多克隆位点经过了改造(图1)，改造后的pSK载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述全长基因cDNA序列内部引入标记性的MluI限制性内切酶位点；所述转录启动子为SP6启动子。

优选的，所述全长基因cDNA序列的3’末端引入Swa I限制性酶切位点，可用于重组载体的线性化。

在本发明的另一方面，提供了一种人工克隆弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤：

将上述重组载体线性化，并将线性化的全长cDNA进行体外转录合成病毒RNA；

将体外转录产物和转染试剂混合后，共转染包装细胞，培养转染后的细胞，完成病毒的包装；

收获转染后的细胞，并将其接种病毒复制许可的宿主细胞，救获感染性的人工克隆弱毒疫苗株。

在本发明的另一方面，还提供了一种人工克隆弱毒疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性内切酶位点。

优选的，所述人工克隆弱毒疫苗株具有SEQ ID NO.2所示的全长基因序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述人工克隆弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述人工克隆弱毒疫苗株在制备区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征的人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测方法，包括以下步骤：

针对引入的标记性的限制性内切酶位点设计合成特异性引物，通过RT-PCR及进一步的限制性酶切，区分出人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征的人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测试剂盒，包含：针对引入的标记性的限制性内切酶位点设计的特异性引物、标记性的限制性内切酶。

本发明人工克隆弱毒疫苗株，不仅在免疫猪体后能对猪抵抗高致病性PRRSV提供完全的安全免疫保护，而且能有效区分猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪与猪繁殖与呼吸综合征自然感染猪，满足临床上对高致病性PRRSV疫苗免疫毒株与自然感染毒株的鉴别诊断，非常有利于高致病性PRRSV的预防和控制。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1多克隆位点经过改造的pG2SK载体MCS序列示意图；

图2是本发明实施例1的PRRSV疫苗株HuN4-F112基因组全长cDNA连接策略示意图；

图3是本发明实施例1中HuN4-F112株各片段RT-PCR扩增结果图；

图4是本发明实施例1全长cDNA克隆pSK-HuN4-Vac酶切鉴定结果图；

图5是本发明实施例2克隆毒cHuN4-Vac感染Marc-145细胞后的细胞病变图；

图6是本发明实施例2利用针对PRRSV N蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光实验检测救获克隆毒的结果图；

图7是本发明实施例2RT-PCR扩增了含基因组标记物的片段的酶切结果图；

图8是本发明实施例2人工克隆毒cHuN4-Vac与亲本毒HuN4-F112株生长曲线比较图；

图9是本发明实施例3人工克隆疫苗毒cHuN4-Vac免疫后ELISA检测抗体水平变化图；

图10是本发明实施例3利用RT-PCR结合MluI酶切鉴别诊断免疫猪与自然强毒感染猪的电泳图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

由于PRRS的灭活疫苗和减毒活疫苗均有缺点和不足，因此利用新的技术手段研制PRRS新型疫苗势在必行。本实验室几年前分离到一株高致病性PRRSV毒株HuN4，与经典的美洲型毒株VR-2332序列相比在Nsp2基因的第483位和535～563位氨基酸发生缺失，是一株典型的PRRSV强毒变异株。通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株HuN4-F112，由大量临床实验证实所获得的HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力，实验组动物可以抵抗致死性强毒攻击而不出现高致病PRRS的临床症状(专利号为200810097546.8的中国发明专利)。本发明正是在此基础上，利用反向遗传操作技术，采用分段克隆逐一拼接的策略构建了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112疫苗株基因组全长cDNA克隆pSK-HuN4-Vac，并在细胞上拯救出携带特征性分子修饰的、具有感染性的cHuN4-Vac人工克隆疫苗毒株，成功构建了高致病性PRRSV HuN4-F112疫苗株的感染性克隆，并通过研究证实该感染性克隆毒株可以作为疫苗毒应用于对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防制。

本发明所用的反向遗传操作技术，其主要策略是：将PRRSV基因组通过反转录得到病毒cDNA，然后克隆到合适的载体中，将PRRSV基因组全长cDNA置于强的转录启动子之下，如噬菌体T7、T3、SP6启动子。在体外应用RNA聚合酶转录系统合成PRRSV病毒基因组RNA，再用这些体外转录本转染宿主细胞(BHK-21或Marc-145)，在宿主细胞内包装生成具有感染性的PRRSV病毒粒子。

利用反向遗传操作技术，本发明成功构建了PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112全长基因的pSK-HuN4-Vac全基因cDNA克隆，并人工救获了高致病性PRRSV-F112弱毒疫苗株cHuN4-Vac，其内部基因骨架主要是来源于由我国高致病性PRRSV代表性毒株HuN4株在体外连续传代致弱获得的弱毒疫苗株HuN4-F112，通过定点突变等人工基因修饰技术在克隆病毒基因内部引入了具有独特特征的Mlu I酶切位点，该限制性酶切位点在自然流行毒株的基因组中不存在，是本发明人工构建的感染性克隆毒株特有的标志，而且本发明的构建既不影响病毒复制和免疫保护效果，又可以用来区分疫苗免疫和自然感染人工克隆疫苗株。

本发明的人工克隆弱毒疫苗株，主要通过以下步骤制得：

利用引入的酶切位点将包含HuN4-F112全长cDNA的质粒线性化；

以上述线性化的全长cDNA质粒作为模板，与体外转录试剂混合，在37℃下进行体外转录合成病毒RNA；

将上述转录后的产物和转染试剂的混合物共转染BHK21细胞，于37℃ CO2培养箱中培养病毒转染的细胞，完成病毒的包装；

经过48小时后收获病毒转染后的细胞，经反复动冻融后取上清，并将其接种病毒体外增殖许可的宿主细胞，救获经过体外人工改造的具有遗传标记(Mlu I酶切位点)的人工克隆疫苗毒株，命名为cHuN4-Vac。

本发明人工克隆弱毒疫苗株cHuN4-Vac具有高度的细胞适应特性，在细胞上接毒后48小时病毒复制滴度就可达到高峰，病毒滴度为10^6.6TCID₅₀，在连续20代的传代过程中，引入的突变标志仍然稳定存在。所获得的人工克隆弱毒疫苗株cHuN4-Vac具有良好的免疫原性，在免疫后第7天就可以检测到抗体，第14天抗体水平就达到最高峰，高水平抗体可以持续3-4周，疫苗免疫后对致死性高致病性PRRSV强毒的攻击能够提供完全保护，免疫猪攻毒后不发病，不死亡，不排毒，可达到与现有的商品化疫苗株同等的免疫保护效果。

针对引入的突变位点人工合成一对特异性引物建立RT-PCR检测方法，配合限制性内切酶Mlu I作为区分自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断方法，结果表明从疫苗免疫后第10天的血液中检测到的RT-PCR产物可以被Mlu I切成约为200bp和400bp左右的目的片段，而从人工感染野毒对照组血液中检测到的RT-PCR产物则不能被其切割。

实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株HuN4-F112基因组全长cDNA克隆的构建

1.材料与方法

1.1病毒、载体与试剂

PRRSV疫苗株F112由本实验室传代致弱并保存(童光志等2007；Tong GZ et al.，2007；Zhou YJ et al.，2008；Tian ZJ et al.，2009)，克隆载体pBulescriptII SK(+)购自Fermentas；RNeasy Plus Mini Kit试剂盒购自QIAGEN；胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司；SupersciptIII逆转录酶和pfx DNA聚合酶购自Invitrogen；RNase H，T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；DL-15000，DL-2000DNA Marker购自TakaRa；其它化学试剂均是进口或国产分析纯。

1.2引物

根据PRRSV HuN4株(GenBank登录号：EF635006)全基因组序列，用Olio 6.0软件设计了6对涵盖全基因组序列的引物(由上海英骏生物工程公司合成，序列见表1)，用无核酸酶的水配置成使用浓度。其中引物F16(sp6)引入pacI酶切位点和RNA聚合酶sp6启动子核心序列，下游引物R15313中还加入病毒原始序列中不存在的单酶切位点NotI(表1)，利用引物R14670和F14668将14680位的A突变成G产生一个MluI酶切位点作为将来鉴定拯救病毒的基因组标记(genomic marker)。

表1.PRRSV疫苗株HuN4-F112全基因组cDNA片段扩增引物

注：表1中，F代表PCR上游引物；R代表PCR下游引物；斜体部分代表插入的酶切位点；下划线代表sp6启动子。

1.3PRRSV疫苗株HuN4-F112全长cDNA克隆的构建

1.3.1PRRSV疫苗株HuN4-F112基因组片段的扩增

将PRRSV株HuN4-F112接种于Marc-145细胞，48h后待细胞病变致80％的细胞脱落时，收获病毒培养液。冻融3次后，差速离心纯化病毒粒子。按照RNA提取试剂盒RNeasy Plus MiniKit的操作说明提取总RNA。

参照SupersciptIII逆转录酶产品说明书，以每个片段下游引物(表1)为反转录引物，合成cDNA第一链。PCR扩增参照pfx DNA聚合酶产品说明进行。每个PCR体系50μL，包括10×pfx扩增缓冲液5μL；10mM dNTP混合物1.5μL；50mM MgSO41μL；上、下游引物各1.5μL(10μM)；cDNA 2μL；补充水至50μL。按常规PCR条件扩增，退火温度和延伸时间以每对引物的Tm值及其扩增片段的长度作出相应调整。

1.3.2pBluescript II SK(+)载体改造

根据对PRRSV HuN4株全基因组序列的酶切位点分析，将pBluescript II SK(+)的多克隆位点区(MCS)进行改造，以便用于后续的全长cDNA连接。合成图1中所标出的一段序列，用来替换原来pBluescript II SK(+)中XhoI至NotI的序列(见图1)。改造好的载体通过测序验证，命名为pG2SK。

1.3.3全长cDNA连接

根据反向遗传操作技术相关文献报道(Meulenberg etal.，1998；Nielsen et al.，2003；Truong et al.，2004；Choi YJ et al.，2006；Lee CH et al.，2005；Fang Y et al.，2006)，设计PRRSV疫苗株HuN4-F112基因组全长cDNA连接的策略(图2)。将1.3.1中扩增得到的各个PCR产物用胶回收试剂盒按操作说明进行纯化，按图2所示的酶切位点分别进行酶切，分别连入pG2SK载体，得到的重组质粒分别命名为pLA-pLF，通过图2所示流程图将各个片段通过图中所标注的酶切位点逐一连接，最终获得含HuN4-F112基因组全长cDNA的质粒。在全长cDNA构建过程中所有的重组质粒构建都是用T4DNA连接酶16℃过夜连接，然后连接产物42℃热激90s转化E.coli DH5α，挑取单克隆，摇菌并提取质粒DNA。

将重组质粒用CalI和AscI以及PacI和SwaI对构建的全长质粒进行双酶切鉴定。酶切体系(20)：10×L Buffer 2.0μL，限制性内切酶各0.5μL，重组质粒7.0μL，dH2O 10.0μL。将酶切后与预期大小相符泳带的重组质粒送至上海生工测序。

2.结果

2.1RT-PCR扩增结果

上述1.3.1利用设计的6对特异性引物，经RT-PCR扩增获得了PRRSV HuN4-F112全基因组的6个片段，分别为2381、4194、2914、2652、2836、705bp(图3)，与预期大小相符。在图3中，M：DL15000 marker；1：A片段扩增产物；2：B片段扩增产物；3：C片段扩增产物；4：D片段扩增产物；5：E片段扩增产物；6：F片段扩增产物。

2.2全长cDNA的构建

将经RT-PCR扩增获得的PRRSV HuN4-F112全基因组的6个片段分别连接到载体pG2SK，按照图2所示的策略再将各个片段逐一连接起来，构建成含全长cDNA的质粒pSK-HuN4-Vac。获得基因组全长cDNA克隆pSK-HuN4-Vac长度约18.2kb，用DNAStar中SeqBuilder软件分析pSK-HuN4-Vac全长质粒经酶切后各片段的大小。用限制性内切酶PacI和MluI以及在3末端PolyA尾引入的NotI进行酶切鉴定。鉴定结果(图4)说明成功构建了PRRSV HuN4-F112株全长cDNA克隆。在图4中，M：DL15000 marker；1：全长基因克隆质粒NotI酶切线性化结果；2：全长基因克隆质粒。

实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒的拯救及鉴定

1.方法

1.1RNA的体外合成与转染

利用3’末段Poly(A)尾引入的SwaI酶切位点将包含全长cDNA的质粒pSK-HuN4-Vac线性化，根据体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit操作说明合成病毒RNA，接种BHK21细胞，在细胞密度为70％～90％时根据DMRI-C转染试剂说明书进行转染。

1.2拯救病毒的鉴定

1.2.1RT-PCR检测基因组标记(genomic marker)

提取克隆毒cHuN4-Vac和亲本毒HuN4-F112感染细胞的RNA，反转录，利用引物JD1和JD2扩增包含MIulI的片段，利用MIulI进行酶切鉴定，同时连接pMD18-T载体测序。

1.2.2间接免疫荧光

将拯救的克隆毒cHuN4-Vac接种单层Macr-145细胞，感染后48h弃去培养液。用冰甲醇固定10min，加入稀释后的针对PRRSV核衣壳蛋白的单克隆抗体(Zhou YJ et al.，2005；ZhouYJ et al.，2006)，室温孵育1h，PBS洗涤5遍，再加入FITC标记羊抗鼠的二抗，室温孵育1h，PBS洗涤5遍，于荧光显微镜下观察结果。

1.3拯救病毒生物学分析

1.3.1病毒细胞TCID₅₀测定

参照文献用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定(殷震等，1997)。将待检样品用维持液作10倍系列稀释后，将连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的Marc-145单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(用维持液代替病毒液)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察感染细胞，记录出现细胞病变(CPE)的孔数，停止出现CPE时终止观察。根据结果按Reed-Muench法计算TCID₅₀(殷震等，1997)。

1.3.2病毒生长曲线的绘制

以低剂量(0.1MOI)病毒(亲本毒HuN4-F112和拯救的克隆毒cHuN4-Vac)感染Macr-145细胞，在感染后每隔12h收取200μL细胞上清液进行病毒滴度测定，收取的每个时间点病毒用半数感染量(TCID₅₀/mL)计算滴度，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒多步生长曲线。

2.结果

利用SwaI酶切位点将含HuN4-F112基因组cDNA的质粒pSK-HuN4-Vac线性化，体外转录合成病毒RNA。将体外转录的RNA转染BHK-21细胞，24h后，将上清接种Marc-145细胞，48小时后出现典型的细胞病变(图5)。将纯化后的稀释病毒分别接种单层Macr-145细胞，48h后间接免疫荧光试验中出现了抗PRRSV N蛋白的特异荧光(图6)，表明拯救病毒cHuN4-Vac确实为PRRSV。利用RT-PCR扩增了含基因组标记的片段，酶切结果(图7)均显示分子标记稳定存在，图7中，M：DL2000marker；1：亲本毒RT-PCR扩增产物；2：亲本毒RT-PCR扩增产物经MIul酶切后结果；3：克隆毒RT-PCR扩增产物经MIul酶切后结果；4：克隆毒RT-PCR扩增产物。拯救病毒cHuN4-Vac和亲本毒HuN4-F112的生长曲线分析表明二者之间的生长特性基本一致(图8)。

实施例3动物试验

1.动物试验方法：

15头40日龄PRRS病毒和抗体均为阴性，PRV、PCV2和CSFV阴性的健康仔猪，随机分成3组，分别为HuN4-F112疫苗对照组，人工克隆毒cHuN4-Vac疫苗组和空白对照组，每组5头，其中人工克隆毒疫苗组每头猪接种第10代克隆毒的剂量为10^5.0TCID₅₀，HuN4-F112疫苗对照组每头猪按疫苗使用说明书接种1头份，空白对照组接种DMEM。接种后28天，所有试验猪每头攻击HuN4-F5强毒3×10^4.0TCID₅₀，攻毒后每天观察临床表现、测温，分别在0、1、3、7、14、21、28天采血检测抗体水平，分离病毒并对其进行鉴别诊断检测，同时对试验猪进行病理组织学观察。

2.结果

2.1试验猪临床症状观察

接种后3个试验组的猪均正常，无发烧、厌食等临床症状。但是在攻毒后24小时对照组的猪就有4头体温达到41℃以上，最多累计8天，临床表现为厌食、咳嗽、呼吸困难、腹泻和后肢麻痹等症状，大部分猪体重表现为负增长，并有4头死亡。而HuN4-F112组和cHuN4-Vac组攻毒后所有猪体温无一头超过40.5℃，无任何临床表现，生长正常。

2.2抗体水平变化：利用IDEXX ELISA抗体检测试剂盒对3个实验组的猪免疫后的抗体进行检测，结果显示HuN4-F112组和cHuN4-Vac组免疫后第7天抗体开始阳转，14天全部阳转，且此后一直维持在较高水平(图9)。

2.3病毒分离：攻毒后7天，HuN4-F112组和cHuN4-Vac组即分离不到病毒，而对照组所有猪直至试验结束仍能分离到病毒。

2.4病理检查：病理切片观察发现HuN4-F112组和cHuN4-Vac组剖检除淋巴结普遍肿大增生外，无明显的病理变化，病理组织学检查免疫系统表现为增生性反应。对照组表现为全身性的病理损伤，病理组织学检查其免疫系统、呼吸系统、神经系统和消化系统都受到严重损害。

2.5鉴别诊断：对cHuN4-Vac组免疫后第7天以及对照组攻毒后第14天的血液进行RT-PCR检测，同时将其产物用MluI限制性内切酶进行酶切鉴定，结果显示：两个组的样品均可以特异性扩增获得PCR产物，而且cHuN4-Vac组免疫后第7天的产物可以被MluI酶切切割成大小约为200bp和400bp的目的片段，但是对照组攻毒后第14天的产物不可以被MluI切割(图10)，证明可以利用人工引入的标记来区分疫苗免疫与自然感染的毒株，进而达到鉴别诊断的目的。图10中，M：DL2000marker；1：自然强毒HuN4株感染后RT-PCR产物MluI酶切结果2：克隆毒对cHuN4-Vac免疫后RT-PCR产物MluI酶切结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2948

<212>DNA

<213>pG2SK载体序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(668)..(731)

<223>改造后的多克隆位点序列

<400>1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc    60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga    120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc    180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc    240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag    300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa    360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac    420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg    480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg    540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg    600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg    660

gccccccctc gagttaatta acaattggga tccatcgatg gcgcgccacg cgtatttaaa    720

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catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt    1200

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg    1260

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catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa  1920

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga  1980

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agtgccac                                                           2948

<210>2

<211>15323

<212>DNA

<213>感染性克隆毒cHuN4-Vac

<220>

<221>misc_feature

<222>(14676)..(14681)

<223>MluI限制性内切酶标记

<400>2

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tgctccctac ttgtaaagag atcaacatgg tcgctgtcgc ctctaacgtg ttgcgcagca  9960

ggtttatcat cggcccaccc ggtgctggga aaacacactg gcttcttcaa caagtccagg  10020

atggtgatgt catttacacg ccaactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg  10080

ggacgtgccg gttcaacgtt ccagcaggta caacgctgca attccctgcc ccctcccgta  10140

ccggcccatg ggttcgcatc ttggccggcg gttggtgtcc tggcaagaac tccttcctgg  10200

atgaagcggc gtattgcaat caccttgatg tcttgaggct tctcagtaaa acaactctca  10260

cttgcctagg ggacttcaaa caactccacc ctgtgggttt tgactcccat tgctatgtat  10320

ttgacatcat gcctcagacc caattaaaga ccatctggag gttcgggcag aatatctgtg  10380

atgccattca accagattac agggacaaac ttatgtccat ggtcaacacg acccgtgtga  10440

cctacgtgga aaaacctgtc aggtatgggc aagtcctcac cccctaccac agggaccgag  10500

aggacggcgc cattactatc gactccagtc aaggcgccac atttgatgtg gttacactgc  10560

atttacccac taaagattca ctcaacaggc aaagagctct tgttgctatc accagggcaa  10620

gacatgctat cttcgtgtat gacccacaca ggcaattgca gagcatgttt gatctccccg  10680

cgaaaggcac acccgtcaac cttgcagtgc accgtgacga acagctgatc gtattagaca  10740

gaaacaacag agaaatcacg gttgctcagg ctctaggcaa tggagataaa ttcagggcca  10800

cagataagcg cgttgtagat tctctccgcg ctatttgcgc agacctggaa gggtcgagct  10860

ccccgctccc caaggtcgcg cataacttgg gattctattt ctcacctgat ttgactcagt  10920

ttgctaaact cccggcagaa cttgcacccc actggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg  10980

aaaggtggcc agatcggctg gtagccagcc ttcgccctat ccataaatat agccgcgcgt  11040

gcattggtgc cggctatatg gtgggcccct cggtgttttt aggcacccct ggggttgtgt  11100

catactatct cacaaaattt gttagaggcg aggctcaaat gcttccggag acagtcttca  11160

gcactggccg aattgaggta gattgccgag agtatcttga tgatcgggag cgagaagttg  11220

ctgagtccct cccacatgcc ttcatcggcg atgtcaaagg taccaccgtt gggggatgtc  11280

atcacgttac ctccaaatac cttccgcgct tccttcccaa ggaatcagtt gcggtggtcg  11340

gggtttcgag ccccgggaaa gccgcgaaag cagtttgcac attgacggat gtgtacctcc  11400

cagaccttga agcgtacctc tacccagaga cccagtccag gtgctggaaa gtgatgttgg  11460

actttaagga ggttcgactg atggtatgga aagacaagac ggcctatttt caacttgaag  11520

gccgtcattt tacctggtat caacttgcaa gctacgcctc atacatccga gttcctgtta  11580

attctactgt gtacttggac ccctgcatgg gccctgctct ttgcaacaga agggttgtcg  11640

ggtccaccca ttggggagct gacctcgcag tcacccctta tgattacggt gccaaaatta  11700

ttctgtctag tgcataccat ggtgaaatgc ctccaggtta caaaattctg gcgtgcgcgg  11760

agttctcgct tgatgaccca gtaaggtaca aacacacctg gggatttgaa tcggatacag  11820

cgtatctgta cgagtttact ggaaatggtg aggactggga ggattacaat gatgcgtttc  11880

gggcgcgcca gaaagggaaa atttataaag ctaatgccat cagcatgagg tttcattttc  11940

ccccgggccc tgtcattgaa ccaactttag gcctgaattg aaatgaaatg gggtctatgc  12000

aaagcctctt taacaaaatt ggccaacttt ttgtggatgc tttcacggaa tttctggtgt  12060

ccattgttga tatcatcata tttttggcca ttttgtttgg cttcacaatc gccggttggc  12120

tggtggtctt ctgcatcaga ctggtttgct ccgcggtact ccgtgcgcgc tctaccgttc  12180

accctgagca attacagaag atcttatgag gcctttcttt ctcagtgtca ggtggacatt  12240

cccacctggg gcgtcaaaca ccctttgggg gtgctttggc accataaggt gtcaaccctg  12300

attgatgaaa tggtgtcgcg tcgaatgtac cgcgtcatgg ataaagcagg gcaggctgcc  12360

tggaaacagg tggtgagcga ggctacattg tctcgcatta gtggtttgga tgtggtggct  12420

cactttcaac atcttgccgc tattgaagcc gagacttgta aatatttggc ttcccggcta  12480

cccatgctgc acaacctgcg cttgacaggg gcaaatgtaa ccatagtgta taatagtact  12540

ttggatcagg tgtttgccat tttcccaacc cctggttccc ggccaaagct tcacgatttt  12600

cagcaatggc taatagctgt acattcctcc atattttcct ccgttgcagc ttcttgtact  12660

ctttttgttg tgctgtggtt gcgaattcca atgctacgtt ctgtttttgg tttccgctgg  12720

ttaggggcaa tttttctttt gaactcgtgg tgaattacac ggtatgcccg ctttgcccaa  12780

cccggcaggc agccgctgag atccttgagc ccggcaagtc tttttggtgc aggatagggc  12840

atgaccgatg tagtgagaac gatcatgacg aactagggtt catggttccg cctggcctct  12900

ccagcgaagg ccacttgacc agtgtttacg cctggttggc gttcctgtcc ttcagctaca  12960

cggcccagtt ccatcccgag atatttggga tagggaatgt gagtcaagtt tatgttgaca  13020

tcaagcacca attcatctgc gctgttcacg acggggataa cgccaccttg cctcgccatg  13080

acaatatttc agccgtattt cagacctact accaacacca ggtcgacggc ggcaattggt  13140

ttcacctgga atggctgcgt cctttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtttcgtggt  13200

ttctcaggcg ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaaaaccaa  13260

caccaccgca gcatcaaact tcgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga  13320

ctcgtcctct ccgacgattc gcaaaattcc tcagtgccgc acggcgatag ggacgcccgt  13380

gtacatcacc atcactgcca atgtcacaga tgaaaattat ctacattctt ctgatctcct  13440

catgctttct tcttgccttt tctatgcttc cgagatgagt gaaaagggat tcaaagtggt  13500

gtttggcaat gtgtcaggcg tcgtggctgt gtgcatcaac tttaccagct acgtccaaca  13560

cgtcaaggag tttacccaac gctccttagt ggtcgatcat gtgcgactgc ttcatttcat  13620

gacacctggg acaatgaggt gggcaaccgt tttagcctgt ctttttgcca tcctactggc  13680

aatttgaatg ttcaagtatg ttggggaagt gcttgaccgc gtgctgttgc tcgcgattgc  13740

tttttttgtg gtgtatcgtg ccgttctatc ttgctgtgct cgtcaacgcc agcaacgaca  13800

acagctctca tattcagttg atttataact taacgttatg tgagctgaat ggcacagatt  13860

ggctggcaca aaaatttgac tgggcagtgg agacttttgt catcttcccc gtgttgactc  13920

acattgtttc ctatggggca ctcaccacca gccatttcct tgacacagtt ggtctggcca  13980

ctgtgtccac cgccggatat tatcacgggc ggtatgtctt gagtagcatt tacgcagtct  14040

gtgctctggc tgcgctgatt tgctttgtca ttaggcttgc gaagaactgc atgtcctggc  14100

gctactcttg taccagatat accaacttcc ttctggacac taagggcaga ctctatcgtt  14160

ggcggtcgcc cgtcattgtg gagaaagggg gtaaggttga ggtcgaaggt cacctgatcg  14220

acctcaagag agttgtgctt gatggttccg cggcaacccc tttaaccaga gtttcagcgg  14280

aacgatgggg tcgtctctag acgacttctg caatgatagc acagctccac agaaggtgct  14340

tttggcgttt tccattacct acacgccagt gatgatatat gctctaaagg taagtcgcgg  14400

ccgactgcta gggcttctgc accttttgat ctttctgaat tgtgctttta ccttcgggta  14460

catgacattc gcgcactttg agagcacaaa tagggtcgcg ctcactatgg gagcagtagt  14520

tgcacttctt tggggagtgt actcagccat agaaacctgg aaattcatca cctccagatg  14580

ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat tctggcccct gcccaccacg tcgaaagtgc  14640

cgcgggcttt catccgattg cggcaaatga taaccacgcg tttgtcgtcc ggcgtcccgg  14700

ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc cgggttgaaa agcctcgtgt tgggtggcag  14760

aaaagctgtt aagcagggag tggtaaacct tgttaaatat gccaaataac aacggcaagc  14820

agcaaaagaa aaagaagggg aatggccagc cagtcaatca gctgtgccaa atgctgggta  14880

agatcatcgc ccaacaaaac cagtccagag gcaagggacc ggggaagaaa aataggaaga  14940

aaaacccgga gaagccccat ttccctctag cgactgaaga tgacgtcagg catcacttta  15000

cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt cgatccagac tgcattcaat cagggcgctg  15060

gaacttgtgc cctgtcagat tcagggagga taagttacac tgtggagttt agtttgccga  15120

cgcaacatac tgtgcgtctg atccgcgcca cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca  15180

ttctttggca cctcagtgtt agaattggga gaatgtgtgg tgaatggcac tgattgacac  15240

tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg ggggtaaagt ttaattggcg  15300

agaaccatgc ggccgtaatt aaa                            15323

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(44)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>pacI酶切位点

<220>

<221>promoter

<222>(10)..(26)

<223>sp6启动子

<400>3

ccgctcgaga tttaggtgac actataggat gacgtatagg tgtt     44

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>4

gtgatgaacc tcgtcacctt gtgcaggg                       28

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>5

ctttgggcaa ggactcggt     19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>6

gatcctgtgt gaacgccgac    20

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>7

cttctgcttc accgcgtgt    19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>8

aagaagattg gcggcaaac    19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>9

gcaggtgcct tgaagctgat                20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>10

ctcatgctga tggcattagc                20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>11

aggactggga ggattacaat                20

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>12

cggacgacaa acgcgtggtt at             22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>13

tgataaccac gcgtttgtcg tc                                     22

<210>14

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(52)

<223>引物

<400>14

tatagcggcc gctttttttt tttttttttt tttttttttt ttttaattac gg    52

Claims (7)

1.一种重组载体，其特征在于，包含：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的全长基因cDNA序列，该全长基因cDNA序列内部引入标记性的MluI限制性内切酶位点，该内部引入MluI限制性内切酶位点的弱毒疫苗株全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组载体的空载体为pSK载体，该pSK载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.2序列插入在空载体pSK的XhoI和NotI两个酶切位点之间，在该SEQ ID NO.2序列5’端还加设有转录启动子。

2.一种人工克隆弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建权利要求1所述的重组载体：以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112作为亲本毒，将其全长基因cDNA序列分别用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14六对引物扩增出六个基因片段，再将该六个基因片段通过酶切、连接，得内部引入标记性MluI限制性内切酶位点的HuN4-F112全长基因cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将SEQ ID NO.2序列插入空载体pSK的XhoI和NotI两个酶切位点之间，并在SEQ ID NO.2序列5’端加设转录启动子，得权利要求1所述的重组载体；

将上述重组载体线性化，并将线性化的全长cDNA进行体外转录合成病毒RNA；

将体外转录产物和转染试剂混合后，共转染包装细胞，培养转染后的细胞，完成病毒的包装；

收获转染后的细胞，并将其接种病毒复制许可的宿主细胞，救获感染性的人工克隆弱毒疫苗株。

3.一种人工克隆弱毒疫苗株，其特征在于，所述人工克隆弱毒疫苗株是亲本毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的克隆毒株，其具有SEQ ID NO.2所示的基因序列，在该基因序列中引入标记性的MluI限制性内切酶位点，该人工克隆弱毒疫苗株由权利要求2所述的制备方法获得。

4.权利要求3所述的人工克隆弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

5.权利要求3所述的人工克隆弱毒疫苗株在制备区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。

6.一种区分权利要求3所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征的人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对引入的位于SEQ ID NO.2序列14676-14681位的标记性MluI限制性内切酶位点设计合成特异性引物，通过RT-PCR及进一步的限制性酶切，区分出人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株。

7.一种区分权利要求3所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征的人工克隆弱毒疫苗株与自然感染毒株的检测试剂盒，其特征在于，包含：针对引入的位于SEQ ID NO.2序列14676-14681位的标记性MluI限制性内切酶位点设计的特异性引物、标记性的MluI限制性内切酶。

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