CN103695465A

CN103695465A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用

Info

Publication number: CN103695465A
Application number: CN201310682463.6A
Authority: CN
Inventors: 翁长江; 蔡雪辉; 李江南; 王承宝; 刘永刚; 黄丽; 石文达
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用，公开了一种重组载体，其是通过反向遗传操作技术构建的我国猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH1R的感染性克隆，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还公开了一种人工克隆弱毒疫苗株，该疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的传染性疾病，该病以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄猪的呼吸道症状和高死亡率为主要特征。PRRS首先于1987年在美国发现，并于1991年在荷兰首先分离并鉴定了病原，并命名为Lelystad virus(LV)，1992年美国也分离到了PRRS病原，命名为VR-2332。我国郭宝清等在1996年从4头流产胎儿中分离到PRRSV，此后该病毒一直在我国流行，给我国养猪业造成重大经济损失。

PRRSV归属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是一种有囊膜、不分节段、单股、正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，含有11个开放阅读框，在5’端有帽子结构，在3’端有poly(A)尾，根据遗传演化分析和血清学差异可以将PRRSV分为两个血清型，分别为以LV株为代表的欧洲型和以VR-2332为代表的美洲型。自从1987年PRRSV被发现以来，人们围绕PRRSV病原生物学特性、免疫学特性、致病机制和疫苗等进行了不懈的探索，取得了一些较好的进展，但由于PRRSV易发生变异、能够造成持续性感染和免疫抑制，而且具有抗体依赖性增强作用(ADE)等特征成为目前控制PRRS的主要障碍。

目前对PRRSV的控制手段主要依靠疫苗免疫，疫苗免疫可以有效降低该病的传播。PRRS灭活疫苗具有安全、便于储存等优点，其缺点是抗原性减弱、免疫效率低、使用剂量大等，对异源毒株免疫效果不理想；弱毒疫苗免疫效果好，免疫持续时间长，但其安全性仍然令人担忧，给我国防控猪繁殖与呼吸综合征带来很大的困难。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用，提供了一种重组载体，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还提供了一种人工克隆疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列，该全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，且该全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性酶切位点。

优选的，所述载体为pBAC载体，该载体内部经过了改造，改造后的载体具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

优选的，所述全长基因cDNA序列的5’端加设有转录启动子，其转录启动子为CMV启动子。

优选的，所述全长基因cDNA序列内部引入标记性的限制性酶切位点，其限制性酶切位点为SmaI。

在本发明的另一方面，提供了一种人工克隆弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤：将所述的重组载体和转染试剂混合后，转染病毒复制许可的宿主细胞，救获感染性的人工克隆弱毒疫苗株。

在本发明的另一方面，还提供了一种人工克隆弱毒疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。

优选的，所述人工克隆弱毒疫苗株具有SEQ ID NO.1所示的全长基因序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了人工克隆疫苗毒株在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供了一种重组载体，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的全长基因cDNA序列。本发明还提供了一种人工克隆疫苗株，所述人工克隆弱毒疫苗株是猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R的克隆毒株，在其结构蛋白基因序列中引入标记性的限制性的内切酶位点。通过对感染性克隆的基因工程改造，可以研究出更好的疫苗，有利于猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制。

附图说明

图1是本发明实施例1的PRRSV疫苗株CH1R基因组cDNA连接策略示意图；

图2是本发明实施例2克隆毒株rCH1R感染Marc-145细胞后的细胞病变图；

其中A为正常Marc-145细胞，B为克隆毒感染Marc-145细胞48h的CPE；

图3是本发明实施例2利用针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体的间接免疫荧光实验检测拯救毒株的结果图；其中A正常Marc-145细胞对照，B克隆毒感染Marc-145细胞；

图4是本发明实施例2中RT-PCR扩增了含基因组标记物的片段的酶切结果图；

图5是本发明实施例2中人工克隆毒株rCH1R与亲本毒株CH1R生长曲线比较图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1：猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株CH-1R基因组全长cDNA序列克隆的构建

1.材料与方法

1.1病毒、载体与主要试剂

PRRSV弱毒疫苗株CH1R，其微生物保藏号：CGMCC NO.1883；克隆载体pBeloBAC11由本研究所保存；病毒RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购和大提试剂盒自于QIAGEN公司；反转录试剂盒SuperScriptIII First-Strand Synthesis System购自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase购自于NEB公司；pZeroBack载体试剂盒购自于天根公司；所有的限制性内切酶和T4DNA连接酶均购自于NEB公司。

1.2引物

根据PRRSV CH1R株(GenBank登录号：EU807840)全基因组序列，用Oligo6.0软件设计了6对涵盖全基因组大部分序列的引物(由英俊生物工程有限公司合成，序列见表1)。合成了1对用于对病毒核蛋白基因进行突变的引物，产生一个SmaI酶切位点作为将来鉴定拯救病毒的基因组标记(genomic marker)；合成1对扩增N蛋白的引物用于遗传标记的鉴定(由英俊生物工程有限公司合成，序列见表1)。

表1.PRRSV疫苗株CH1R全基因组cDNA片段扩增及鉴定引物

注：表1中，U代表PCR上游引物；L代表下游引物。

1.3PRRSV疫苗株CH1R全长cDNA克隆的构建

1.3.1PRRSV疫苗株CH1R基因组片段的扩增及测序

按照病毒RNA提取试剂盒的说明书PRRSV疫苗株CH1R的基因组RNA，参照反转录试剂盒说明书，以每个片段的下游引物(表1)为反转录引物，合成cDNA第一链。PCR扩增按照高保真DNA聚合酶的说明书进行，按常规PCR条件扩增，退火温度和延伸时间以每对引物的Tm值及扩增片段的长度作出相应的调整。扩增的片段经纯化后，连接到pZeroBack载体中(分别命名为pZeroBack-A，pZeroBack-B，pZeroBack-DE，pZeroBack-F，pZeroBack-G)送英俊生物工程有限公司测序，测序没有突变的克隆保存备用。

1.3.2通过碱基点突变产生基因组标记

以pZeroBack-G为模板，以PRRSV-13331/15280-U/L和N120-AtoC-U/L为引物，采用融合PCR的方法，定点突变产生Sma I位点，扩增的片段经纯化后，连接到pZeroBack载体中(pZeroBack-G-Sma I)送英俊生物工程有限公司测序，测序正确的克隆保存备用。

1.3.3PRRSV疫苗株CH1R基因组片段的制备

参照图1所示，用相应的酶切位点，从载体pZeroBack-A，pZeroBack-B，pZeroBack-DE，pZeroBack-F和pZeroBack-G-Sma I载体中切出相应的片段保存备用。

1.3.4pBAC载体的改造

人工合成一段序列，依次包括Sfi I酶切位点、CMV启动子、PRRSV CH1R株5’端197个碱基、多克隆位点(BciVI，FseI，Nhe I，Asc I，and Nsi I)、PRRSV CH1R株3’端277个碱基和RsrII位点。用人工合成的序列替换原来pBeloBAC11中Sfi I至RsrII的序列，改造好的载体通过测序验证，命名为pBAC，改造后的载体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

1.3.5全长cDNA拼接

根据反向遗传操作技术相关的报道(Meulenberg et al.，1998；Fang et al.，2006；Zhang et al.，2011；St-Jean et al.，2006)，设计PRRSV疫苗株CH1R全长基因组cDNA连接的策略(图1)。将1.3.3中得到的片段按照图1所示的酶切位点分别进行酶切，通过图示1所示的流程图将各个片段通过图中所标注的酶切位点逐一连接，最终获得含有CH1R基因组全长cDNA质粒。

2.结果

2.1PRRSV疫苗株CH1R基因组片段的制备结果

利用表1中设计的6对特异性引物，经RT-PCR扩增获得了PRRSV CH1R的全基因组6个片段，与预期大小相符。得到的片段连接到pZeroBack载体中，并送英俊生物工程有限公司测序。挑去测序正确的克隆分别命名为：pZeroBack-A，pZeroBack-B，pZeroBack-C，pZeroBack-DE，pZeroBack-F，pZeroBack-G。

以pZeroBack-G为模板，采用融合PCR的方法，定点突变产生Sma I位点，连接到pZeroBack载体中送英俊生物工程有限公司测序，测序正确的克隆命名为pZeroBack-G-SmaI。

参照图1所示，用相应的酶切位点，从载体pZeroBack-A，pZeroBack-B，pZeroBack-DE，pZeroBack-F和pZeroBack-G-Sma I载体中切出相应的片段，片段大小分别为：2708、1600、3209、4383、1431、1754bp。

2.2全长cDNA的构建结果

将经RT-PCR扩增获得的PRRSV CH1R的6个片段分别连接到载体pBAC中，按照图1所示的策略再将各个片段逐一连接起来。构建成含全长cDNA的质粒pBAC-CH1R。获得的基因组全长23545bp。

实施例2：猪繁殖与呼吸综合征病毒的拯救和鉴定

1.材料与方法

1.1病毒、细胞与主要试剂

PRRSV弱毒疫苗株CH1R由本实验室传代致弱并保存，其微生物保藏号：CGMCC NO.1883；Marc-145细胞由中国农科科学院哈尔滨兽医研究所保存；DNA转染试剂X-tremeGENE HP购自Roche公司；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBICO公司；抗PRRSVN蛋白单克隆抗体由中国农科科学院哈尔滨兽医研究所李曦副研究员提供；FITC标记羊抗鼠荧光二抗购自于Sigma公司。

1.2感染性克隆质粒的转染

6孔板中培养Marc-145细胞单层，当细胞密度达到约80％时，进行转染；取2μg质粒pBAC-CH1R与3μL转染试剂，按照转染试剂X-tremeGENE HP的说明书进行。同时做未转染的对照孔。

1.3拯救病毒的鉴定

1.3.1观察细胞病变和拯救病毒的传代

感染性克隆质粒pBAC-CH1R转染Marc-145细胞后，48h和72h观察细胞病变；同时取细胞培养上清，在Marc-145细胞上连续传代，并观察每一代的细胞病变。

1.3.2RT-PCR检测基因组标记(genomic marker)

提取第5代(F5)拯救毒株rCH1R和亲本毒株CH1R感染细胞的RNA，反转录后，用引物N-U/L病毒N基因的片段，利用SmaI进行酶切鉴定，同时进行测序。

1.3.3间接免疫荧光鉴定

将第5代(F5)病毒接种Marc-145细胞，感染48h后用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，用0.3％Triton X-100处理细胞15min，10％的FBS血清封闭30min，加入抗PRRSVN蛋白单抗(1：200)，室温孵育2h，用PBS洗3次，在加入FITC标记的羊抗鼠二抗(1：200)，用PBS洗3次，荧光显微镜观察并记录实验结果。

1.4拯救病毒生物学分析

在12孔板中培养Marc-145细胞，当细胞密度达到90％左右时，将亲本病毒和拯救病毒以0.01TCID₅₀的滴度感染细胞，孵育2h后，用无血清的DMEM培养基轻轻地清洗细胞2次，然后向每孔中加入1ml2％FBS的DMEM培养基，分别在12h、24h、48h、60h、72h、84h和96h收集细胞上清，冻融3次后取上清测定TCID₅₀，最后绘制PRRSV SDA2拯救病毒和亲本病毒的生长曲线。

病毒滴度(TCID₅₀)测定：将Marc-145细胞接种96孔板，将病毒上清做10倍梯度稀释8个梯度(10^-1-10^-8)，将稀释好的病毒液加入到板中，每孔加入100μl，每个梯度设12个重复，37℃和5％CO2的条件下孵育2h后弃去培养液，每孔加入100μl2％FBS的DMEM培养基继续培养。每天观察细胞病变情况，连续观察7天。记录结果，根据Reed-Muench方法计算TCID₅₀。

2.结果

将感染性克隆质粒pBAC-CH1R转染Marc-145细胞，48h后开始出现细胞病变，72h后出现典型的细胞病变(图2)。同时收集病毒上清，在Marc-145细胞上连续传代，接种后48h产生典型的细胞病变。取F5代病毒接种Marc-145细胞，48h后间接免疫荧光实验中出现了抗PRRSV N蛋白的特异性荧光(图3)，表明拯救的病毒确定为PRRSV。利用RT-PCR扩增了含基因组标记的片段，酶切结果(图4)显示分子标记稳定存在。拯救病毒rCH1R和亲本毒株CH1R的生长曲线分析表明二者之间的生长特性基本一致(图5)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。