CN108697787A - 猪生殖和呼吸综合征疫苗病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改良的活猪繁殖与呼吸综合征病毒。基于系统发生分组对病毒通过组织培养中的重复传代的改良进行遗传分析和选择。评估改良的活病毒对异源病毒提供保护性免疫的能力。改良的活病毒可用于疫苗，特别是用于可以治疗被多种异源病毒感染猪的疫苗。

Description

猪生殖和呼吸综合征疫苗病毒
本发明涉及改良的活猪繁殖与呼吸综合征病毒。改良的活病毒可用于疫苗中，特别是在提供针对异源病毒的保护的疫苗中。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，最初称为神秘猪病，首先在欧洲被描述，但现在已在全世界传播。PRRS导致育种年龄母猪的晚期流产、死产和不育，以及幼儿和生长/肥育猪的呼吸道疾病，生长性能下降，甚至死亡。仅在美国，PRRS每年造成超过6亿美元的经济损失。
成年猪动物中PRRS病毒感染的症状包括但不限于食欲减退、嗜睡、发烧和行为改变，例如失去平衡，盘旋和向一侧跌倒。怀孕的母猪可能过早分娩，中止胎儿，或生产木乃伊或死产仔猪，并且高达10％的怀孕母猪可能死于PRRS病毒感染。受感染的仔猪断奶前死亡率很高，通常很弱，并且眼睛周围可能有水肿。断奶保育猪或生长/肥育猪的PRRS病毒感染可以引起(但不限于)生长迟缓、呼吸窘迫、呼吸困难或呼吸急促、皮肤斑点发红和毛发粗糙。
PRRS病毒是包膜病毒，具有约15kb、线性、正链、单链RNA基因组，并且该病毒已被分类为动脉炎病毒科(Arteriviridae)。迄今为止，已在基因组中鉴定出至少九个开放读码框。PRRS病毒分为两种通用亚型。欧洲亚型，1型PRRS病毒，以Lelystad株为例，而2型北美PRRS病毒以株VR-2332为例。
这两种亚型在其基因组中可以具有低至约60％的序列同一性，并且甚至在亚型内，单个株在其基因组的同一性中可以变化高达约20％。这种可变性使得有效治疗和/或预防PRRS的疫苗的开发变得复杂。PRRS病毒的改良的活病毒(MLV)变体可以产生针对PRRS病毒攻击的免疫力，但是当攻击是用与MLV遗传上同源的PRRS病毒时，疫苗最有效。MLV疫苗对异源病毒的攻击效果较差。此外，MLV已显示出一些毒力逆转，使得疫苗病毒在接种疫苗的动物中引起疾病。含有灭活(即杀死的)PRRS病毒的疫苗具有更好的安全谱，但抗异源攻击的功效受到限制。
由于目前的PRRS疫苗没有显示出足够的安全性和有效性来减少PRRS病毒感染的经济影响，因此需要新的和改良的疫苗。优选地，那些疫苗将既安全又有效。如果疫苗包含减毒的MLV，那些减毒的MLV不应表现出毒力逆转，以便被认为在本领域中使用是安全的。例如，通过使PRRS株适应在组织培养细胞中的生长至少80代，或优选至少100代，MLV不应表现出毒力逆转。为了有效，疫苗病毒株应该能够在猪动物中引发针对一系列系统发生上不同的野生型PRRS株的保护性免疫。优选地，新的PRRS疫苗病毒株能够在猪动物中引发针对至少三种系统发生不同的野生型PRRS株的保护性免疫。
本发明提供了改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗病毒株，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12和SEQID NO：13的序列至少90％相同。优选地，改良的活株可具有共有互补DNA序列，其至少是与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13的序列95％相同。更优选地，所述改良的活株还可具有共有互补DNA序列，其与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同。作为普通技术人员将理解，由于PRRS病毒的高突变率，改良的活PRRS株可包含多个亚群，每个亚群具有同源但不相同的基因组。
本发明提供了改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株，其中PRRS病毒株是ND99-14株或SD 11-21株。PRRS病毒株应优选在组织培养细胞中传代至少80次，或更优选84次。最优选地，PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代100次。组织培养细胞中的这种传代可用于适当减毒改良的活PRRS病毒株。当将这些株施用于猪动物时，减毒的PRRS病毒株可能引起亚临床但不是临床疾病。传代至少80次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。最优选地，传代100次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。
本发明提供免疫原性组合物，其包含改良的活PRRS病毒株，其具有与选自SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列。优选地，改良的活株可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。更优选地，改良的活株也可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。作为普通技术人员将理解，由于PRRS病毒的高突变率，改良的活PRRS株可能包含多种亚群，每个亚群都具有同源但不相同的基因组。
本发明提供了包含改良的活PRRS病毒株的免疫原性组合物，其中所述PRRS病毒株是ND 99-14或SD 11-21。ND 99-14株或SD 11-21株可以在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。最优选地，ND 99-14株或SD 11-21株可以在组织培养细胞中传代100次。免疫原性组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。免疫原性组合物还可以包含来自不同病毒或来自细菌菌株或寄生虫的其他抗原。
本发明提供了包含改良的活PRRS病毒株的疫苗，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQID NO：13的序列至少90％相同。优选地，改良的活株可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。最优选地，改良的活株还可具有共有互补DNA序列，其与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同。疫苗可进一步包含佐剂。疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。疫苗可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或来自寄生虫的其他抗原。
本发明提供用于治疗或预防猪动物的猪繁殖与呼吸综合征的疫苗。由于PRRS是由PRRS病毒引起的，因此本发明提供了用于治疗PRRS病毒感染的疫苗。本发明还提供用于治疗猪动物的PRRS病毒感染引起的症状的疫苗。感染可以来自PRRS病毒的野生型毒力株。症状可以是，但不限于，食欲减退、嗜睡、发烧，行为改变(例如失去平衡，盘旋和向一侧跌倒)，过早分娩，流产，死产，水肿，生长停滞，咳嗽，呼吸窘迫，呼吸困难或呼吸急促，皮肤斑点发红，毛发粗糙，肺损伤，病毒脱落和死亡。本发明提供了用于猪动物治疗的疫苗。本发明还提供了用于猪动物中PRRS治疗的疫苗。优选地，疫苗包含改良的活PRRS株，其具有与选自SEQID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％，至少95％或至少98％相同的共有互补DNA序列。最优选地，疫苗包含改良的活PRRS株，其为ND 99-14或SD11-21。疫苗可进一步包含佐剂。疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂。疫苗可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或来自寄生虫的其他抗原。
本发明提供了一种疫苗，其包含用于治疗或预防猪动物的猪繁殖与呼吸综合征的改良的活PRRS病毒株。本发明还提供了包含改良的活PRRS病毒株的疫苗，其用于治疗或预防猪动物中由PRRS病毒感染引起的症状。症状可以是，但不限于，食欲减退、嗜睡、发烧，行为改变(例如失去平衡，盘旋和向一侧跌倒)，过早分娩，流产，死产，水肿，生长停滞，咳嗽，呼吸窘迫，呼吸困难或呼吸急促，皮肤斑点发红，毛发粗糙，肺损伤，病毒脱落和死亡。本发明提供了一种疫苗，其包含用于治疗猪动物的改良的活PRRS病毒株。本发明还提供了包含改良的活PRRS病毒株的疫苗，其用于治疗猪动物中的PRRS。感染可以来自与疫苗中的改良的活PRRS病毒异源的PRRS病毒的野生型毒力株。优选地，疫苗包含改良的活PRRS株，其具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13的序列至少90％，至少95％或至少98％相同的共有互补DNA序列。最优选地，疫苗包含改良的活PRRS株，其为ND 99-14或SD。11-21。疫苗可进一步包含佐剂。疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。疫苗可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或来自寄生虫的其他抗原。
本发明提供了在猪动物中治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征症状的方法，该方法包括向所述猪动物施用包含改良的活PRRS病毒株的免疫原性组合物。本发明还提供了治疗或预防猪动物中猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括向所述猪动物施用包含改良的活PRRS病毒株的免疫原性组合物。优选地，用于该方法的改良的活PRRS病毒株具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列。更优选地，用于该方法的改良的活PRRS病毒株与选自SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列具有至少95％相同的共有互补DNA序列。最优选地，用于该方法的改良的活PRRS病毒株具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。免疫原性组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂。免疫原性组合物可包含来自不同病毒或来自细菌或来自寄生虫的其他抗原。
本发明提供了在猪动物中治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括向所述猪动物施用包含改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株的免疫原性组合物，其中所述PRRS病毒株是ND 99-14或SD 11-21。用于该方法的ND 99-14株或SD 11-21株可以在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。最优选地，用于该方法的ND 99-14株或SD 11-21株在组织培养细胞中传代100次。免疫原性组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂。免疫原性组合物可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或来自寄生虫的其他抗原。
本发明提供了在猪动物中治疗或预防由PRRS病毒感染引起的症状的方法，包括向所述猪动物施用包含改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株的免疫原性组合物，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列优选与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同。更优选地，用于该方法的改良的活株还可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。最优选地，用于该方法的改良的活株也可具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。免疫原性组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。免疫原性组合物还可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或寄生虫的其他抗原。
本发明提供了在猪动物中治疗或治疗由PRRS病毒感染引起的症状的方法，包括向所述猪动物施用包含改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株的免疫原性组合物，其中所述PRRS病毒株是ND 99-14或SD 11-21。用于该方法的ND 99-14株或SD 11-21株可以在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。最优选地，用于该方法的ND 99-14株或SD11-21株可以在组织培养细胞中传代100次。免疫原性组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。免疫原性组合物还可包含来自不同病毒或来自细菌菌株或寄生虫的其他抗原。PRRS病毒感染可以是与免疫原性组合物中的改良的活PRRS病毒株异源的毒力PRRS病毒的感染。如果每种病毒株的基因组共有序列作图到不同的系统发生组，则认为两种PRRS病毒株是异源的。如果每种病毒株的互补DNA共有序列作图到不同的系统发生组，则认为两种PRRS病毒株是异源的。
本发明提供了改良的活PRRS病毒株在制备用于治疗或预防PRRS症状的药物中的用途，其中所述改良的活PRRS病毒包含与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列。优选地，改良的活株也可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。更优选地，改良的活株还可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。
本发明提供了包含ND 99-14株或SD 11-21株的改良的活PRRS病毒株在制备用于治疗或预防PRRS症状的药物中的用途。改良的活PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。此外，PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代100次。组织培养细胞中的这种传代可用于适当减毒改良的活PRRS病毒株。当将这些菌株施用于猪动物时，减毒的PRRS病毒株可能引起亚临床但不是临床疾病。传代至少80次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。传代100次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。
本发明提供了包含改良的活PRRS病毒株的免疫原性组合物在制备用于治疗PRRS病毒感染的药物中的用途，其中所述改良的活PRRS病毒株包含与选自SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列。用于此类用途的改良的活株还可具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。用于此类用途的改良的活株还可以具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。
本发明提供了免疫原性组合物在制备用于治疗PRRS病毒感染的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含改良的活PRRS病毒株，其包含ND 99-14株或SD 11-21株。PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。此外，PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代100次。组织培养细胞中的这种传代可用于适当减毒改良的活PRRS病毒株。当将这些菌株施用于猪动物时，减毒的PRRS病毒株可能引起亚临床但不是临床疾病。传代至少80次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。传代100次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。
本发明提供了包含改良的活PRRS病毒株的免疫原性组合物在制备用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的药物中的用途，其中所述改良的活PRRS病毒株包含与选自SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列。用于此类用途的改良的活株还可具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同的共有互补DNA序列。用于此类用途的改良的活株还可具有与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同的共有互补DNA序列。
本发明提供了免疫原性组合物在制备用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含改良的活PRRS病毒株，其包含ND 99-14株或SD 11-21株。PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代至少80次，或优选甚至84次。此外，PRRS病毒株应在组织培养细胞中传代100次。组织培养细胞中的这种传代可用于适当减毒改良的活PRRS病毒株。当将这些菌株施用于猪动物时，减毒的PRRS病毒株可能引起亚临床但不是临床疾病。传代至少80次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。传代100次的改良的活PRRS病毒株具有恢复野生型毒力的低概率。
图1、2型PRRSV ORF5核苷酸序列的系统发生分析。
图2、2型PRRSV nsp1核苷酸序列的系统发生分析。
图3、2型PRRSV nsp2OTU结构域核苷酸序列的系统发生分析。
图4、不同PRRSV田野分离物对IFN-α(IFN-α)表达刺激的变化。
图5、使用不同田野PRRSV分离物的DeISGylation测定。
如在以下讨论中所使用的，除非另有说明，否则术语单数形式(“一”或“一个”)应理解为包含一个或多个。
如本文所用，术语“病毒”可以指病毒种类，或者可互换地指可含有核酸、蛋白质和脂质膜的个体感染单位。个体感染单位也称为“病毒颗粒”或“病毒粒子”，后者的术语是同义词。
如本文所用，病毒“株”或“分离物(isolate)”病毒是指遗传同源病毒粒子的集合。如果这些病毒作图到相同的系统发生进化枝，那么两种病毒将被认为是“同源的”。如果这些病毒作图到不同的系统发生进化枝，则两种病毒将被视为“异源”。由于PRRS病毒具有高突变率，可以理解单个PRRS株包含具有相关但可变的遗传序列的各个病毒粒子。因此，株亚群存在于每个PRRS株内，并且PRRS株的遗传序列是共有序列，使得PRRS株的个体成员的遗传序列可能与该株的共有序列不同。“共有”序列是核酸序列，其中给定位置的每个核酸残基存在于PRRS病毒株或分离物中>50％的多核苷酸中。
“同一性百分比”可以通过计算核酸或蛋白质中相同位置的相同核苷酸或氨基酸的数量来确定。百分比同一性的计算包括确定两个或更多个序列之间的最佳比对。比对可以考虑每个待测序列中的插入和缺失(即“缺口”)，例如但不限于核酸的非编码区和多肽序列的截短或延伸。诸如基本局部比对搜索工具(BLAST)的计算机程序和算法可用于确定百分比同一性。BLAST是美国国家生物技术信息中心提供的众多资源之一。因为遗传密码是简并的，并且多于一个密码子可以编码给定的氨基酸，如果核酸编码相同的多肽，则认为核酸的编码区是相同的。因此，也可以基于核酸编码的多肽计算同一性百分比。可以基于全长共有基因组序列或基因组序列的一部分计算同一性百分比，例如但不限于单独的开放读码框(ORF)。
如本文所用，术语“改良的活病毒”适用于基因序列已从天然存在的野生型病毒的基因序列改变的任何单个病毒颗粒(即“病毒粒子”)或多种病毒颗粒。改变包括但不限于遗传突变，例如核苷酸的插入和缺失以及转换和易位(transversion)，其改变一个核苷酸为另一核苷酸。改变可以通过使野生型病毒适应组织培养系统中的复制，并继续在组织培养系统中传代病毒而实现，由此病毒积累遗传突变。改变也可以使用分子技术完成。减毒病毒构成改良的活病毒的子集。
如本文所用，术语“减毒的”或“减毒”是指减少或消除病毒引起或加剧临床疾病的能力。减毒病毒仍可在体外或体内感染宿主细胞，并且该感染可导致宿主生物体中的亚临床效应，但该感染不会导致一种或多种临床疾病症状。
相反，如本文所用，“灭活的”病毒是指不再在宿主细胞中复制的病毒。灭活病毒被认为是杀死的或死亡的病毒。灭活可以通过多种方法完成，包括但不限于病毒蛋白的化学改变，病毒粒子结构的化学或物理改变，或病毒核酸的化学或物理改变。
“抗原”是能够被生物体的免疫系统特异性检测的任何分子。通常，病毒抗原是由病毒基因组编码或衍生自病毒基因组产物的病毒蛋白。病毒抗原的存在可以通过宿主T淋巴细胞和宿主B淋巴细胞的表面抗原受体以及通过宿主细胞合成的抗体分子特异性地检测。
“免疫原性”是指抗原引发免疫反应的能力，所述免疫反应包括抗原特异性反应和非抗原特异性反应或先天免疫反应。“保护性免疫”是一种免疫反应，当免疫动物被攻击或暴露于病原性病毒株时，其可以减少或预防临床症状。如本领域技术人员所理解的，保护性免疫可随着时间或免疫动物的年龄增加而下降。本文所用的保护性免疫应从最近的免疫日期开始有效至少4个月，但优选至少6个月。单次剂量的疫苗可以引发保护性免疫。第二种或另外的剂量可用于增加或延长保护性免疫反应。例如，增加繁殖母猪的保护性免疫反应可导致仔猪中母系衍生抗体水平的增加。
与抗原相反，“佐剂”是免疫反应的非特异性刺激物。佐剂可通过结合并激活模式识别受体(PRR)来刺激先天免疫反应。这种PRR刺激剂可以是，例如，病毒或细菌核酸，来自细菌或寄生虫的脂质，或细菌蛋白质或毒素，或这些分子的任何人工构建的模拟物。佐剂还包括但不限于：聚集抗原以促进B淋巴细胞识别或吞噬细胞摄取的无机化合物，例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢钙或硫酸铵；油；和洗涤剂。佐剂也可以是免疫信号传导的宿主介质，例如但不限于细胞因子、淋巴因子、趋化因子、干扰素、过敏毒素、生长因子、分化因子和粘附分子。
如本文所用，“免疫原性组合物”是当施用于动物时引发免疫反应的组合物。免疫原性组合物包含至少一种抗原和至少一种药学上可接受的赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂的描述可见于例如“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”，Lloyd V.Allen编，Pharmaceutical Press，London，UK，第22版。抗原可以是活的或灭活的完整病毒、细菌或其他病原体。抗原也可以是从病毒、细菌或其他病原体中分离、纯化或部分纯化的抗原分子。抗原可以是多肽、多糖、核酸或脂质。
如本文所用，“疫苗”是免疫原性组合物，其在施用于动物时赋予对疾病症状的保护、抗性、预防或治疗，其中所述症状由病原生物，例如病毒引起。PRRS疫苗可以包括但不限于与药学上可接受的佐剂、赋形剂、稳定剂、增溶剂或稀释剂组合的活的或灭活的病毒抗原或完整的病毒粒子。
如本文所用，术语治疗以及其各种形式包括但不限于抑制、减缓、停止、减少、改善或逆转现有症状、病况、病症或疾病的进展或严重性。治疗可以治疗性地应用或给药。
如本文所用，术语预防以及其各种形式包括但不限于降低、减少或改善症状、病况、病症或疾病的风险，以及保护动物免于症状、病况、病症或疾病。预防可以预防性地应用或给药。
如本文所用，“施用给动物”包括但不限于皮肤、皮下、肌肉内、粘膜、粘膜下、经皮、口服或鼻内施用。施用可包括注射或局部给药。
以下实验实施例说明了改良的活PRRS病毒。以下实验实施例也说明了包含改良的活PRRS病毒的免疫原性组合物。以下实验实施例还说明了使用改良的活PRRS病毒来治疗猪动物的PRRS症状。应当理解，其他实施方式和用途对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且本发明不限于这些具体的说明性实施例或优选的实施方式。
实施例1
旨在开发针对PRRS的广泛保护的MLV疫苗。鉴定疫苗病毒的独特区域用于遗传标记和区分诊断测试开发。具体目标是：1)建立候选PRRS疫苗株；2)鉴定候选疫苗病毒中的独特标记区域并开发用于从野生型病毒感染的动物中区分接种动物的区分诊断试剂和测试；3)对候选疫苗的安全性和有效性进行体内评估，并评估伴随诊断测定的区分能力。
已经产生了9种候选疫苗病毒。这些候选病毒的详细表征如下。
最初通过在猪肺泡巨噬细胞中生长来分离病毒，所述猪肺泡巨噬细胞是从常规饲养的3至9周龄猪的肺获得的。切除肺并用pH7.2的磷酸盐缓冲盐水洗涤三次或四次。将细胞在4℃下以800×g离心10分钟。倾倒出上清液，并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞并重新沉淀两次。将细胞重悬于补充有10％经照射的胎牛血清和适当水平的抗生素的RPMI 1640培养基中。将巨噬细胞以106细胞/ml接种到24孔板中并使其贴附7小时。倾倒非贴壁细胞，并用10％胎牛血清和RPMI培养基重新填充孔。通过RT-PCR证实为PRRSV阳性的田野猪血清样品用于在巨噬细胞培养后72小时接种巨噬细胞。在接种后48小时，通过使用针对PRRSV核衣壳蛋白的单克隆抗体(mAb)的直接荧光抗体测试证实感染。
然后将每种病毒分离物噬斑纯化。汇合的细胞单层感染病毒，感染复数(MOI)为0.1。2小时后，除去细胞培养上清液并施加琼脂覆盖层。5天后在37℃下检测噬斑。挑选来自每种病毒分离物的至少10个单一噬斑并在培养的细胞中扩增。
通过用噬斑纯化的病毒以0.1的MOI感染细胞来进行病毒的后续传代。3天后，将培养上清液置于0.5M蔗糖垫上铺层，并以100,000×g离心14小时。用PBS洗涤病毒沉淀颗粒，并可以在-80℃储存。
为了确定每种病毒分离物的基因组序列，使用QiaAmp病毒RNA试剂盒(Qiagen)从蔗糖垫纯化的病毒中提取RNA。使用Purdue University Genomic Core Facility的下一代测序确定全长基因组序列。
使用CLUSTAL W多序列比对程序比对核苷酸序列。使用可从进化医学和信息中心(Tempe，AZ，USA)获得的Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA4)软件对得到的距离矩阵进行邻接距离分析。使用来自5000个重复的NJBOOT进行bootstrap选项以评估系统发生树的内部进化枝的稳健性。
已经评估了总共32种PRRSV田野分离物作为疫苗候选物的潜力。最初，已经对病毒的三个最高可变区(nsp1，nsp2和ORF5)进行了测序以进行系统发生分析。图1-3显示了基于nsp1，nsp2卵巢肿瘤(OTU)结构域或ORF5的序列通过邻接方法构建的系统发生树的结果。已经选择了代表系统发生树中每个聚簇的九个分离物(在框中突出显示)用于进一步表征。在所有三种系统发生树中，分离物ND99-14和ND99-17位于含有目前商业PRRSV疫苗株的进化枝的单独进化枝中。这两种病毒还具有刺激干扰素(IFN)-α产生的能力(参见图4)。分离物SD95-10和SD95-47分组在与VR2332和来源于VR2332的 PRRSMLV株相同的进化枝中。分离物12-7455和SD11-21代表了最近的田野株的进化枝。在nsp1和nsp2OTU结构域系统发生树中，SD04-89和SD98-163分组在具有中国高致病株JX143和来源于JA142株的 PRRSATP株的进化枝中。在ORF5和nsp2OTU结构域系统发生树中，MN05-68分组在具有JX143和INGELVAC PRRS ATP株的进化枝中。
疫苗开发的标准之一是候选病毒应具有刺激宿主免疫反应的能力。以前的研究表明，PRRSV抑制宿主细胞先天免疫反应，而nsp2是抑制干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISG)表达的先天拮抗剂之一。为了评估病毒株是否可以诱导干扰素α(IFN-α)，猪巨噬细胞或者以MOI为1的不同田野分离物感染，或者被模拟感染。在感染后24小时，如前所述(Lawson等人，Vaccine 28：5356-64(2010))，收获细胞培养上清液以使用荧光微球免疫测定法定量IFN-α表达。使用平均荧光强度值测定IFN-α的量，并将结果与来自模拟感染的对照细胞的平均值进行比较。
已经进行了体外deISGylation测定以选择具有弱的抑制ISG表达能力的病毒。如前所述进行deISGylation测定(Sun等人，J.Virology 86(7)：3839-50(2012))。简而言之，用表达缀合酶E1/E2/E3、FLAG标记的ISG15和PRRSV PLP2(aa386-578)的质粒DNA共转染HeLa细胞。包括空载体质粒作为对照。在转染后6小时，用1,000U/ml的IFN-α刺激细胞。刺激后24小时收获细胞并通过免疫印迹分析。用抗FLAG抗体探测膜以检测游离和缀合形式的ISG15的表达。使用nsp2特异性单克隆抗体检测PRRSV PLP2的表达。如图5所示，分离物SD95-10和SD11-21对细胞蛋白的ISG化影响较小，表明这两种分离物会具有用于未来疫苗开发的潜力。进一步测试了病毒刺激IFN-α表达的能力。之前记录的SD04-30和MO04-25能够增强IFN-α的产生。使用这两种分离物作为对照，在PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞中测量IFN-α表达水平。正如预期，SD04-30和MO04-25刺激了显著量的IFN-α表达(图4)。相反，分离物SD95-21、ND99-17、SD06-21和SD92-18刺激与SD04-30和MO04-25相容的IFN-α水平。分离物MN91-45、ND99-14和NE06-05显示IFN-α表达的弱刺激。
基于免疫测定结果和系统发生分析，最初选择9种2型分离物在培养的非猪细胞中连续传代80代。除了这9种2型病毒外，SD03-15(1型株)，SD02-11(1型株)和SD02-10(1型和2型病毒的混合物)也包括在进一步的分析中。在细胞培养中选择总共9个第80代(P80)病毒用于噬斑纯化两次，并且将第82代(P82)病毒通过蔗糖垫进一步纯化并作为病毒原种储存。在每种候选疫苗病毒传代期间测定病毒滴度，其范围在4.5-7log的荧光聚焦单位(FFU)/ml之间。从进一步研究中排除滴度低于5log FFU/ml的病毒分离物。最初在2013年2月11日确定了11种候选病毒分离物的全长基因组序列，并且于2013年12月22日对通过噬斑纯化和蔗糖垫纯化的9种候选疫苗病毒(P83)的最终产物再次测序并记录。
第83代(P83)的9个PRRS病毒分离物的cDNA共有序列保藏在GenBank基因序列数据库中，该数据库是所有可公开获得的核酸序列的注释集合。GenBank数据库由国家生物技术信息中心(NCBI)维护，该中心是美国国立卫生研究院(NIH)的一部分。GenBank是国际核苷酸序列数据库协作的一部分。
在P83处PRRS株SD 95-10的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131565(SEQ.ID.NO:1)。命名为SEQ.ID.NO：1的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 95-47的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131564(SEQ.ID.NO:2)。命名为SEQ.ID.NO：2的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 95-163的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131563(SEQ.ID.NO:3)。命名为SEQ.ID.NO：3的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株ND 99-14的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131562(SEQ.ID.NO:4)。命名为SEQ.ID.NO：4的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 02-10的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131561(SEQ.ID.NO:5)。命名为SEQ.ID.NO：5的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD03-15的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131560(SEQ.ID.NO:6)。命名为SEQ.ID.NO：6的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 04-89的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131559(SEQ.ID.NO:7)。命名为SEQ.ID.NO：7的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 05-68的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131558(SEQ.ID.NO:8)。命名为SEQ.ID.NO：8的cDNA共有序列是：
在P83处PRRS株SD 11-21的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131557(SEQ.ID.NO:9)。命名为SEQ.ID.NO：9的cDNA共有序列是：
本领域技术人员将认识到，每种基因组共有序列的多腺苷尾部的长度可以与上面报道的序列不同。
实施例2
本研究的目的是评估实验性PRRSV疫苗在用毒力PRRS病毒进行异源攻击后生长猪中的效力。测试疫苗的效力是基于与未接种疫苗的对照相比，疫苗减少肺病变和病毒血症的有效性。该研究的设计在表1中给出。
表1.研究设计。
1荧光灶单元(FFU)。
2接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)的安慰剂对照动物。
3 IM＝肌内注射。
攻击前阶段是从到达研究地点的那天(第-1天)到攻击当天(第35天)。在第0、14、28和35天收集用于使用荧光灶中和(FFN)测试的PRRSV血清抗体测定的血液样品。在第0天和第35天收集用于测定PRRSV病毒血症的血液样品。在第0天和第35天收集鼻拭子以评估病毒载量。第0天和第35天在攻击之前进行体重测量(lbs)。
在第35天，使用3mL非鲁尔锁定注射器鼻内递送2mL剂量，每个鼻孔约1mL。攻击后阶段是从第35天到第49天。在第35-49天对所有猪逐个进行抑郁、身体状况和呼吸窘迫的评估，并对每个临床体征进行评分。在第42天和第49天收集用于PRRSV血清抗体测定(FFN)的血液样品。在第38、42、45和49天收集用于测定PRRSV病毒血症的血液样品。在第38、42、45和49天收集鼻拭子以评估病毒载量。在第49天尸检时获得体重测量。在第49天，按照现场标准操作程序对动物进行人道安乐死，并且由对治疗不知情的研究调查员对肺进行评分。通过视觉和触诊检查七个肺叶中的每一个的归因于PRRSV的总体特征性病变。将每个肺叶中的病变/巩固的量评分为实际在叶的0和100％之间。将每个叶的得分输入加权公式中以计算具有病变的肺的百分比。
对于该研究，使用了大约3周龄的96只断奶的杂交小母猪和阉猪，其对PRRSV是血清阴性并且被评估为健康状况良好。到达研究地点后，将选定的研究动物随机分配到处理组(T01-T09)和研究围栏。到达后，所有符合以下入选标准的候选动物都包括在研究中，排除那些不符合标准的动物：1)在第0天通过血清中和试验(FFN)对PRRSV是血清反应阴性的；2)基于在第O天进行的体检，临床评估为健康状况良好的动物。
到达研究地点后，处理组将猪圈养在五个BSL-2环境控制污染室内。每个收容室包含五个围栏，每个围栏可容纳五头猪。在每个接种室内，两个处理组由塑料薄膜屏障隔开，并且组不共享相同的空域。在将房间内的接种组分开的两个区域之间严格保持生物安全。这些猪随意喂养适合生产的标准猪种植者配给(NRC，2012)。猪随意获得干净的饮用水。
从到达研究地点到攻击前一天(第-1天到第34天)每天进行一次总体健康观察。在第35-49天对所有猪进行抑郁、身体状况和呼吸窘迫的评估，并对评分系统中定义的每个临床体征进行评分。
将在第35天之前发生临床显著并发疾病的动物从研究中移出。在排除之前从猪收集的任何数据都不包括在数据分析中。在第35天进行攻击后，如果可能的话，对死亡或濒死时处死的猪进行尸体剖检以确定死因。由于同一围栏中死亡归因于猪链球菌和确认的疾病(T08)，按需要将抗生素(Zoetis Animal Health)施用于个体研究动物和第30天的所有动物。
所有候选PRRSV株在MARC-145细胞上传代83次。确定了八(8)种疫苗中每种疫苗的滴度，如表I所示。按照USDA 9C.F.R.要求的无菌试验在内布拉斯林肯市的BenchmarkBioLabs成功完成。疫苗包含在药学上可接受的赋形剂，即生理盐水中的PRRSV。
在即将使用之前，将三个1mL PRRSV NADC-20攻击株的原液小瓶在室温下解冻，并将3mL的原液加入到在无菌容器中297mL含有Earle盐和来自Mediatech，Inc的L-谷氨酰胺(MEM)的最小必需培养基中。将接种物(由病毒原液和培养基组成)手动混合并在给予动物期间保留在湿冰上。在攻击之前，将五(5)mL攻击接种物直接等分到无菌容器中以提交给诊断实验室用于滴度测定。滴度结果为102.75TCID50/mL。
动物是实验单位。使用α＝0.05的双侧测试评估组之间的差异。
根据以下公式计算具有病变的总肺的百分比：
有病变的总肺的百分比＝{(0.10x左心尖)+(0.10x左心脏)+(0.25x左膈)+(0.10x右心尖)+(0.10x右心脏)+(0.25x右膈)+(0.10x中间)}。
通过计算每个安慰剂/疫苗接种对的缓解分数和相关的95％置信区间(MF；CI；软件中的FREQ程序，SAS Institute，Cary NC)来评估疫苗接种对总肺病变百分比的影响。此外，在进一步分析之前，使用反正弦平方根转换具有病变的总肺的百分比。通过混合线性模型分析转换的数据，该模型包括固定的治疗效果(软件中的MIXED程序)作为唯一因子。如果治疗效果具有统计学意义，则使用线性对比和未调整的α＝0.05进行安慰剂组和接种组之间的成对比较。如果接种疫苗的猪与对照组相比显示肺病变评分显著降低，则疫苗符合测试结果。
在正态分布的假设下，使用适于重复测量的方法来评估疫苗接种对病毒血症值的影响(软件，SAS Institute，Cary NC中的MIXED程序)。在分析之前转换数据以稳定残留物。统计模型包括治疗、时间以及治疗与时间相互作用作为固定效应。如果治疗与时间相互作用是显著的，则评估疫苗在该时间治疗中的效应。在一段时间内，对接种疫苗的动物和未接种疫苗的动物进行了比较。如果相互作用不显著，则评估治疗的主要效应。在接种疫苗的和未接种疫苗的动物之间进行比较。适当地给出最小二乘平均值、标准误差、平均值的95％置信区间和范围。
在正态/二项式分布假设下，使用适合重复测量连续或二项式数据的方法来评估疫苗接种对血清抗体和鼻拭子值的影响(软件，SAS Institute，Cary NC中的MIXED或GLIMMIX程序)。在分析之前转换数据以稳定残值。统计模型包括治疗、时间以及治疗与时间相互作用作为固定效应。如果治疗与时间相互作用是显著的，则评估在时间治疗内的效应。在一段时间内，对接种疫苗的动物和未接种疫苗的动物进行了比较。如果相互作用不显著，则评估治疗的主要效应。在接种疫苗的和未接种疫苗的动物之间进行比较。适当地给出最小二乘平均值、标准误差、平均值的95％置信区间和范围。
使用适于重复测量的ANCOVA(MIXED程序)统计分析体重(第35天和第49天)、抑郁评分、呼吸评分和身体状况评分(第35-49天)。适当时，将第0天的值作为协变量包括在内。处理组、时间以及组与时间相互作用被包括在模型中作为固定效应。如果相互作用项是显著的，则在时间组内，通过使用未调整的α＝0.05将每个接种组与对照组进行比较来评估效果。如果相互作用不显著，则评估组的主要效应，并且如果显著，则通过使用未调整的α＝0.05将每个接种组与对照比较来评估组效应。由于研究期间只有一例死亡，因此没有评估死亡率。
对照组中肺受累的平均百分比为37.9％(表2)，这与使用2型菌株NADC-20，该PRRSV攻击模型的预期病理学一致(范围为30％至50％，L.Kesl of VeterinaryResources，Inc.，personal communication)。结论是PRRS病毒攻击足以评估疫苗株候选物。
平均肺病变评分显示在表2中。除含有PRRSV EU样(即1型PRRSV)株SD 03-15的疫苗外，与对照组相比，所有实验疫苗均减少(P<0.05)肺病变。值得注意的是，株SD 95-10，SD11-21和ND 99-14诱导了高度保护，导致肺受累非常低(分别为2.7％，1.0％和1.6％)。株SD95-47和MN 05-68也表现良好，而株SD 04-89和SD 02-10是可接受的。表3示出了每种疫苗与对照组相比的缓解分数。这些结果表明免疫接种减毒PRRSV株SD 95-10(T04)，SD 11-21(T05)和ND 99-14(T08)的猪与对照组中的猪相比，具有至少90％的具有较小的肺病变的严重程度的概率。
表2.平均肺病变评分。
处理组 疫苗 估计1 标准误 平均值2
T01 无(仅PBS) 0.6633 0.05594 37.91％
T02 株SD 04-89 0.3861* 0.07075 14.14％
T03 株SD 03-15 0.4885 0.07075 22.02％
T04 株SD 95-10 0.1662* 0.07075 2.74％
T05 株SD 11-21 0.0988* 0.07075 0.97％
T06 株SD 02-10 0.3642* 0.07075 12.69％
T07 株SD 95-47 0.2073* 0.07075 4.24％
T08 株ND 99-14 0.1252* 0.07458 1.56％
T09 株MN 05-68 0.2316* 0.07075 5.27％
1未转换的平均值。
2反向转换的平均值。
*与T01相比，在P<0.05时显著不同。
表3.肺病变评分。
处理组比较 缓解分数1 95％置信区间
对照(T01)对SD 04-89(T02) 0.5875 0.2266,0.9484
对照(T01)对SD 03-15(T03) 0.3125 -0.1838,0.8088
对照(T01)对SD 95-10(T04) 0.9000 0.7077,1.0000
对照(T01)对SD 11-21(T05) 0.9688 0.9017,1.0000
对照(T01)对SD 02-10(T06) 0.7000 0.3092,1.0000
对照(T01)对SD 95-47(T07) 0.8000 0.5290,1.0000
对照(T01)对ND 99-14(T08) 0.9028 0.7152,1.0000
对照(T01)对MN 05-68(T09) 0.7875 0.4986,1.0000
1缓解分数意味着接种者(T02-T09)的肺病变比非接种者(T01)的肺病变的严重程度较小的概率相对增加。
通过qtRT-PCR从鼻分泌物中列举的PRRSV的几何平均值示于表4中，作为病毒脱落的指示。除了用株SD 02-10接种的猪外，在第35天在所有接种组的鼻拭子中检测到疫苗病毒。与对照组猪相比，用株SD 03-15、SD 95-10和SD 95-47接种的猪具有统计学上更大的(P<0.05)基因组拷贝/mL，平均值分别为277、337和7基因组拷贝/mL。在第35天攻击后，所有组在第38、42、45和49天(攻击后分别3天，7天，10天和14天(DPC))脱落一些病毒。用株SD 95-10，SD 95-47和ND 99-14接种的猪在攻击后的所有时间点具有比对照更低的(P<0.05)脱落水平。通过10和14DPC，除了株SD 04-89和SD 03-15之外，与对照相比，所有疫苗株诱导脱落减少(P<0.05)。
表4.鼻拭子中PRRSV基因组拷贝/mL的几何平均值。
*在天vsT01内，P<0.05时显著不同。
表5中示出了通过qtRT-PCR(基因组拷贝/mL)从血清中列举的PRRSV的几何平均值。所有接种疫苗的组在第35天都有一些可测量的病毒血症可归因于疫苗接种，尽管接种SD 04-89和SD 11-21的组中的水平与对照组相比没有统计学差异(P>0.05)，所述对照组为阴性。在第35天攻击时，所有组均在3、7、10和14DPC处是病毒血症的。用株SD 95-10和ND99-14接种的猪在攻击后的所有时间点，具有比对照组低的病毒血症水平(p<0.05)。通过10和14DPC，与对照相比，所有疫苗株诱导病毒血症减少(P<0.05)，株SD 04-89和SD 03-15除外。
表5.血清中PRRSV基因组拷贝/mL的几何平均值。
*在天vsT01内，P<0.05时显著不同。
通过测量几何平均荧光灶中和(FFN)滴度来确定血清转化，如表6中所示。对照动物至第35天(攻击当天)保持血清阴性，到第42天(7DPC)开始血清转化并到第49天(14DPC)完成血清转化。所有接种组在接种疫苗后第14天进行血清转化，但SD 03-15除外。所有接种组中的几何平均滴度在第28、35和42天超过(P<0.05)对照之一，并且与第49天的对照之一相似或更小。接种组中的峰值FFN滴度反应在第35和42天发生。株SD 95-10，SD 11-21，SD95-47和ND 99-14似乎引起最稳健的血清学反应。
表6.荧光灶中和(FFN)滴度的几何平均值。
*在天vs T01内，P<0.05时显著不同。
表7中包括最小二乘方平均体重。第0天体重用作分析中的协变量。在攻击当天(第35天)，用株SD 03-15，SD 95-10，ND 99-14和MN 05-68接种的四组分别具有比对照低的平均体重(P<0.05)。所有其他组具有与对照组之一相似的平均体重(P>0.05)。在尸检当天(第49天)，在14DPC，用株SD 11-2 1，SD 95-47和ND 99-14接种的三组的平均体重超过(P<0.05)对照之一。所有其他组的体重与对照之一的体重相似(P>0.05)。
表7.最小二乘平均体重(lbs)。
*在天vsT01内，P<0.05时显著不同。
收集每只动物的总临床评分(呼吸+抑郁+身体状况)的平均值，并对每组求平均。在攻击后长达7天的任何组中临床体征均不明显。在第42天和第43天，一些疫苗组的临床体征明显，但其平均评分与对照之一没有差异(P<0.05)。从第44天到第49天，除了在第44天用株SD 04-89和SD 02-10接种的组之外，所有疫苗组具有比对照更低的(P<0.05)总和的得分。
总之，已经在病毒攻击模型中成功评估了8种减毒PRRSV疫苗株。除EU样株SD 03-15外，所有株均引发一些针对毒力NADC-20 2型PRRSV攻击的保护作用。四种株，SD 11-21，SD 95-10，SD 95-47和ND 99-14，赋予最大的保护作用，如肺病变和病毒血症的更高减少所证明。
实施例3
本研究的目的是评估四种实验性PRRSV疫苗在用两种不同的毒力PRRSV 2型株攻击后在生长猪中的交叉保护效力。通过肺病变和病毒血症的程度评估功效。该研究在Veterinary Resources,Inc.(VRI),Cambridge,Iowa的BSL-2设施中进行。研究设计在表8中示出。
表8.研究设计。
1荧光灶单元(FFU)。
2接受磷酸缓冲盐水(PBS)的安慰剂对照动物。
进行健康观察或收集样本的研究人员对治疗身份以及将猪在处理组的分配不知情。通过病毒中和试验(FFN)对PRSSV为血清阴性并且被评估为健康良好的100只大约3周龄的杂交小母猪和阉猪用于该研究。猪来源自威斯康星州伯灵顿的Wilson Prairie ViewFarms。在第-1天，将猪分配到治疗和围栏中并在三个BSL-2收容室内的围栏内进行治疗。在每个室内，四个接种组通过空围栏或通道和实体围栏隔板分开，以防止任何直接接触和废物污染到其他围栏中。猪随意喂养标准商业药物(抗生素)起始饮食(NRC，2012)。猪随意获得干净的饮用水。
从到达研究地点到攻击前一天(第-3天到第34天)每天进行一次总体健康观察。在第35-49天对所有猪进行抑郁、身体状况和呼吸窘迫的个体评估，并对每个临床体征进行评分。
在断奶和运送到VRI之前，每只猪用单剂量的VITAL E-500(维生素E)，单剂量的抗生素(头孢噻肟晶体，Zoetis Animal Health)治疗，并接种INGELVAC疫苗(Boehringer Ingelheim Vetmedica)。此外，所有猪在第13天或第14天给予单剂量的抗生素。
从研究中除去任何表现出临床疾病或受伤体征的猪。将相关样品提交给爱荷华州立大学兽医诊断实验室(VDL)进行诊断评估。记录从攻击后研究中移除的动物的日期、原因和处置。在从研究中移除的猪上收集的数据被排除在统计分析之外。
所有候选PRRSV株在MARC-145细胞上传代83次。测定四(4)种疫苗中每种疫苗的滴度。按照USDA 9CFR要求的无菌测试在Benchmark BioLabs,Lincoln,Nebraska成功完成。如实施例2中那样制备疫苗。
参加研究的100只猪中的每一只在第0天接种疫苗。在颈部右侧以0.5mL肌内剂量给予猪指定的治疗。在注射后一小时内，研究调查员检查每只猪的任何不良事件。
接种后阶段是从第1天到第35天。在第-1、14、28和35天收集用于使用荧光灶中和(FFN)测试的PRRSV血清抗体测定的血液样品。对于FFN测定，两倍稀释的血清(1：4至1：512)各自与等体积的含有100个灶形成单位(FFU)的测试PRRSV株(MN-184)的培养基混合。将混合物在37℃下孵育1小时，然后加入到96孔组织培养板中的MARC-145细胞的汇合培养物中。约1天后，将板固定在80％(v/v)丙酮水中，通过用异硫氰酸荧光素偶联(FITC)抗-N蛋白单克隆抗体SDOW17孵育来检测感染细胞(灶)。血清中和FFN滴度表示为最高稀释度的倒数，其与血清对照相比使灶形成减少约90％。在第-1、14和35天收集用于测定PRRSV病毒血症的血液样品。在第-1、14和35天收集用于评估病毒脱落的鼻拭子。在第-1天和在第35天进行攻击之前使用经过认证的重量校准的刻度来测量体重(1b)。
MN-184PRRSV攻击株(从爱荷华州立大学VDL获得)于2001年从明尼苏达州南部遭受严重生殖疾病和母猪死亡的猪群中分离出来。KS-11PRRSV攻击株(从堪萨斯州立大学VDL获得)于2011年从堪萨斯州东北部遭受严重生殖疾病的猪群中分离出来。在第35天，通过在攻击前立即解冻冷冻的等份MN-184和KS-11来制备攻击材料。攻击材料是即用形式，不需要稀释。将每种接种物(MN-184和KS-11)的样品提交给ISUVDL用于滴度测定。测定MN-184和KS-11株的第0天滴度分别为4.2×105和6.7×103TCID50/ml。使用3mL非鲁尔锁定注射器鼻内递送2mL剂量，每个鼻孔约1mL。
攻击后阶段是从第35天到第49天。在第35-49天对所有猪进行抑郁、身体状况和呼吸窘迫的逐个评估，并对每个临床体征进行评分。使用校准的温度计在同一时间段内记录直肠温度(°F)。在第42天和第49天收集用于PRRSV中和抗体测定(FFN)的血液样品。在第38、42、45和49天收集用于测定PRRSV病毒血症的血液样品。在第38、42、45和49天收集用于评估病毒脱落的鼻拭子。在第49天的尸检时使用经认证的重量校准的刻度获得体重测量值(lb)。在第49天，对动物进行人道安乐死，并且切除肺并由对治疗不知情的研究调查员进行评分。通过视觉和触诊检查七个肺叶中的每一个中归因于PRRSV的总体特征性病变。将每个肺叶中的病变/巩固量评分为叶的0-100％之间的实际值。将每个叶的得分输入加权公式中以计算具有病变的肺的百分比。
根据实施例2中给出的配方和程序计算具有病变的总肺的百分比。
使用适于重复测量的方法(MIXED程序)统计分析直肠温度、抑郁评分、呼吸评分和身体状况评分(第35天至第49天)。每只动物在一天内将临床评分求和。对各个评分，如上所述来统计分析经求和的评分。
测定以下时期的平均日增重(ADWG)：第-1天至第35天；第-1天至第49天；以及第35天至第49天。使用ANOVA(MIXED程序)分析每个时期的平均日增重(ADWG)。治疗作为固定效应包括在模型中，并且包括阻断作为随机效应。如果治疗的主要效果显著，则通过使用未调整的α＝0.05将每个接种组与对照比较来评估治疗效果。
一头猪(T09)在第28天因疑似猪链球菌感染而死亡。由于与支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)相关的支气管肺炎，从研究中除去两只猪，一只来自T03，另一只来自T09。没有任何不良事件归因于疫苗。
用MN-184攻击的对照组中肺病变的平均百分比为52.4％，这与该PRRSV攻击株的预期病理学一致。用KS-11攻击的对照组肺病变的平均百分比为22.5％。该PRRSV株以前未用作攻击材料，因此预期的肺病理学程度未知。该研究中达到的水平被认为足以评估疫苗候选物。
为了预防与PRRSV相关的疾病，攻击后肺病变和病毒血症是主要的结果变量。如果接种组的平均肺病变评分和病毒血症水平显著低于对照组(P<0.05)，则该疫苗被认为是有效的。
平均肺病变评分(反向转换平均值)显示在表9中。当用MN-184攻击时，与未接种疫苗的对照猪相比，所有接种疫苗的猪具有显著更少(P<0.05)的肺病变。与未接种疫苗的对照猪相比，用KS-11株攻击并接种SD 95-10，SD 11-21和ND 99-14株的猪具有显著更少(P<0.05)的肺病变。用MN 05-68株接种并用KS-11株攻击的猪具有与未接种疫苗的对照猪相似的(P>0.05)肺病变。
通过从未转换的数据计算缓解分数和相关的95％置信区间来评估疫苗接种对肺病变评分的影响。如表10所示，缓解分数范围为-0.06至0.98。对于用MN 05-68株接种并用KS-11株攻击的猪，95％置信区间包括0，表明接种对肺病变评分没有影响。所有其他疫苗，无论攻击株如何，均表明接种疫苗对减少肺病变评分的作用。
表9.平均肺评分-肺受累的百分比。
处理组 疫苗株 攻击株 估计1 标准误 平均值2
T01 对照 MN-184 0.8090 0.1026 52.4％
T02 SD 95-10 MN-184 0.2551* 0.1026 6.4％
T03 SD 11-21 MN-184 0.2478* 0.1043 6.0％
T04 ND 99-14 MN-184 0.1575* 0.1026 2.5％
T05 MN 05-68 MN-184 0.3039* 0.1026 8.9％
T06 对照 KS-11 0.4937 0.08280 22.5％
T07 SD 95-10 KS-11 0.1142* 0.08280 1.3％
T08 SD 11-21 KS-11 0.1651* 0.08280 2.7％
T09 ND 99-14 KS-11 0.0873* 0.09257 0.8％
T10 MN 05-68 KS-11 0.4936 0.08280 22.5％
1未转换的平均值
2反向转换的平均值
*在攻击株vs对照内，P<0.05时显著不同。
表10.肺病变评分
1缓解分数意味着接种疫苗的肺病变(T02-T05，T07-T10)比非接种疫苗的肺病变(T01，T06)的严重程度小的概率的相对增加。
鼻拭子脱落数据的分析结果在表11中总结。与攻击对照相比，接种组的治疗与时间相互作用高度显著(P<0.0001)。在第14天在所有疫苗组中检测到疫苗病毒脱落。到第35天，只有在MN-184攻击室中接种MN 05-68株的猪以比对照猪更高的水平(P<0.05)脱落疫苗病毒。
在用MN-184株攻击后，在每个攻击后时间点(第38,42,45和49天)，与对照猪相比，接种ND 99-14株的猪减少了(P<0.05)脱落。与对照猪相比，接种SD 95-10和MN 05-68株的猪在第42、45和49天显示出显著减少的(P<0.05)脱落。与对照猪相比，接种SD 11-21株的猪在第38天具有较高的脱落，但在第42、45和49天具有较低的脱落(P<0.05)。
在用KS-11株攻击后，与对照猪相比，接种SD 95-10和ND 99-14株的猪在第38、42和45天具有减少的(P<0.05)鼻脱落。与对照猪相比，接种SD 11-21株的猪在第38、42和49天显示出明显减少的鼻脱落。与对照猪相比，用MN 05-68株接种的猪在第38天具有减少的(P<0.05)脱落，但两个处理组在第42、45和49天没有差异(P>0.05)。
表11.鼻拭子中PRRSV基因组拷贝/mL的几何平均值。
*在攻击株vs对照内，在P<0.05时显著不同。
对病毒血症的分析结果在表12中总结。与攻击对照相比，接种组的治疗与时间相互作用是高度显著的(P<0.0001)。正如所预期的，由于存在疫苗病毒，所有接种组在接种后第14天和第35天与其各自的对照组相比具有更高的(P<0.05)病毒血症水平。
表12.血清中PRRSV基因组拷贝/mL的几何平均值。
*在攻击株vs对照中，在P<0.05时显著不同。
在用MN-184株攻击后，所有接种组在攻击后的每个时间点(第38、42、45和49天)与对照组相比具有更低的(P<0.05)病毒血症水平。在用KS-11株攻击后，接种SD 95-10和ND99-14株的猪在攻击后的每个时间点(第38、42、45和49天)具有较低的(P<0.05)病毒血症水平。与对照猪相比，用MN 05-68株接种的猪在第38、42和49天具有较低的(P<0.05)病毒血症水平，并且与对照猪相比，接种SD 11-21株的猪在第38天和第49天具有减少的(P<0.05)病毒血症水平。
血清学分析的结果在表13中总结。与攻击对照相比，接种组的治疗与时间相互作用是高度显著的(P<0.0001)。在接种疫苗之前的第-1天，所有猪均为血清反应阴性。在接种SD 95-10和ND 99-14株的猪中检测到病毒中和抗体，无论攻击株如何，从第28天开始并在整个研究期间保持存在。在第28、35、42和49天，与对照猪相比，接种SD 95-10和ND 99-14株的猪的病毒中和抗体更高(P<0.05)。
表13.荧光灶中和(FFN)滴度的几何平均值。
*在攻击株vs对照中，在P<0.05时显著不同。
在用MN-184株攻击后，接种SD 11-21株的猪直到第42天没有出现病毒中和抗体，并且到第49天仍然如此。病毒中和抗体在两个时间点都比对照猪高(P<0.05)。用MN 05-68株接种的猪直到第49天才具有可检测的病毒中和抗体水平，然而，水平比对照组中的猪更高(P<0.05)。
在用KS-11株攻击后，接种SD 11-21和MN 05-68株的猪直到第49天才具有可检测的病毒中和抗体水平，但两种疫苗株的水平均比对照猪更高(P<0.05)。
在整个研究期间，在任一对照组中均未检测到病毒中和抗体。这并不出乎意料，因为直到暴露后28-35天通常才会检测到病毒中和抗体。
如上所述进行直肠温度和总体临床评分(呼吸+抑郁+身体状况)的分析。对于两个攻击组，观察到高度显著的治疗与时间相互作用(P<0.0005)。
用MN-184株攻击后，接种SD 95-10，ND 99-14和MN 05-68株的猪在攻击后6天(第41天)左右开始与对照猪相比具有始终较低的(P<0.05)体温和临床评分。接种SD 11-21株的猪在攻击后第8天(第43天)左右开始与对照猪相比具有始终较低(P<0.05)的体温和较少(P<0.05)的临床体征。在接种SD 95-10，ND 99-14和MN 05-68株的猪中，早在攻击后两天就注意到体温显著降低(P<0.05)。
在用KS-11株攻击后，与对照猪相比，用四种疫苗株中的任一种接种的猪在攻击后第9天(第44天)开始具有显著降低(P<0.05)的临床评分，并且持续具有较少(P<0.05)临床体征直到研究完成。在攻击后约6天开始，SD 95-10，SD 11-21和ND 99-14组的体温降低(P<0.05)。与对照猪相比，用MN 05-68株接种的猪在第37天和第46天仅具有较低的(P<0.05)体温。
体重增加数据的分析在表14中显示，给出了按周期计算的体重增加的最小二乘平均值。在第35-49天的攻击后期间，有对于体重增加存在疫苗效应。这导致从第-1天到第49天的整个治疗期的疫苗效应。在攻击前期(第-1天至第35天)期间各组之间没有体重增加差异(P>0.05)。在攻击后期(第35-49天)期间，与对照猪相比，所有接种组，无论疫苗株如何，对于MN-184和KS-11攻击都具有改善的(P<0.05)ADWG。在MN-184攻击室中，与对照猪相比，接种SD 95-10，ND 99-14和MN 05-68株改善了(P<0.05)总体ADWG(第-1天至第49天)。与对照猪相比，接种SD11-21并用MN-184攻击的猪的总体ADWG没有差异(P>0.05)。在KS-11攻击室中，与对照猪相比，所有株的疫苗接种改善(P<0.05)总体ADWG(第-1天至第49天)。
表14.最小二乘平均体重增加(lb)。
*在攻击株vs对照中，在P<0.05时显著不同。
总之，所有接种疫苗的组都是病毒血症，并在疫苗接种后14和35天脱落疫苗病毒。
在用MN-184株攻击后，所有疫苗在攻击后期间减少(P<0.05)肺病变、病毒血症、鼻脱落、临床体征和直肠温度。此外，所有疫苗在攻击后期间改善(P<0.05)ADWG。
在用KS-11株攻击后，接种SD 95-10，SD 11-21和ND 99-14株的猪在攻击后期间具有减少的(P<0.05)肺病变、病毒血症、鼻脱落、临床体征和直肠温度。此外，所有疫苗株在攻击后期间显著改善(P<0.05)ADWG。
四种疫苗株中的三种在两种PRRSV株的攻击后都能有效减少肺病变和病毒血症。SD 95-10，SD 11-21和ND 99-14株对两种攻击株均有效。MN 05-68株仅在MN-184攻击时有效减少肺病变，并且没有减少用KS-11株攻击的猪的肺病变。
实施例4
该研究的目的是制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株ND 99-14的主种子病毒(MSV)。该种子将用于PRRSV疫苗开发。
PRRSV ND 99-14株通过在MARC-145细胞中传代83次(P83)进行改良，包括两轮噬斑纯化和一轮蔗糖梯度纯化，然后如实施例1所述进行初始表征和测序。通过在补充5％胎牛血清(FBS；Sigma Aldrich)和50μg庆大霉素/mL(Life Technologies)的生长培养基 I(Life Technologies)中在MARC-145细胞中传代12次(P95)进一步减毒ND 99-14株，并且在补充有不含庆大霉素的2％FBS的相同生长培养基中进行另外5次传代。PRRSV ND 99-14的第100代(P100)已被用作Pre-Master种子病毒(Pre-MSV)。
以下程序用于确定PRRSV MSV ND 99-14的滴度。在100μL生长培养基(补充有5％FBS和50μg/mL庆大霉素的OPTI-MEM培养基)中，将MARC-145细胞以0.75-1.5×104个细胞的密度接种到96孔板中。将细胞在37±2℃和5±1％CO2培养箱中孵育48-72小时，直至细胞超过95％汇合。在滴定当天，将所有培养基从96孔板中取出并用100μL新鲜生长培养基替换。
用稀释剂( I培养基，50μg/mL庆大霉素)制备10倍系列稀释的MSV，并和仅由稀释剂组成的阴性对照一起转移到如上制备的平板上的相应孔中。将滴定板在37±2℃下用5±1％CO2培养箱孵育4天。在孵育期结束时，使用倒置显微镜观察每个板在每个样品孔中是否存在病毒诱导的细胞病变效应(CPE)。使用Reed-Muench方法计算50％组织培养感染剂量(TCID50)，并将滴度记录为log10TCID50/mL。PRRSV MSV ND 99-14的平均滴度为3.50log10TCID50/mL。在MSV制备过程中，滴度没有明显差异。
PRRS ND 99-14MLV株被称为“主种子病毒(MSV)”，并且本发明的培养物已经被保藏在以下条件下，这个条件确保这些培养物在本申请未决期间可以提供给由Commissionerof Patents and Trademarks根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所确定的人员，这些保藏物在提交有本申请等同发现或其派生申请的国家可以获得。然而应该理解的是，可以得到保藏物并不等于被准许可以在损害由政府行为所授予的专利权的情形下实施本发明。本发明的培养物保藏将根据《微生物保藏布达佩斯条约》的规定进行保藏并对公众公开，即，将根据需要对其进行足够的照顾储存以使其在最近一次要求完成样品保藏之后的至少5年内、以及在任何情形中，在保藏日期之后的至少30年间或者在任何可能公开该保藏培养物的专利的有效期限之内保持其存活并不受污染。当保藏处在被要求时因为保藏条件的原因无法提供培养物时，保藏者认可替换保藏物的责任。任何针对本发明培养物保藏对公众可获得的限制在对它们进行公开的专利被授权之后即永久性地被消除。PRRSV MSV ND 99-14的保藏物已根据布达佩斯条约的条款于2015年12月2日进入位于10801University Blvd.,Manassas,Va.,20110-2209,USA的Patent Depository of the American Type CultureLaboratory的永久保藏，然后由储存库分配登录号ATCC PTA-122675。
实施例5
该研究的目的是使用下一代测序来建立遗传同一性，获得共有序列，并评估PRRSV株ND 99-14第84代和第100代制备物中存在的基因组变体(亚群)，两者均在实施例4中描述。
使用大规模平行测序(MP-Sep)系统进行序列表征是包括若干步骤的标准程序，包括：从病毒制备物中提取核酸，cDNA文库合成和定量，克隆扩增和通过PCR富集DNA文库以及由Roche/454下一代测序平台对文库测序。通过合成测序用于同时确定cDNA文库中片段的核苷酸顺序。通过将每个数据集绘制到参考序列，使用所得片段的生物信息学分析进行基因组鉴定和表征。在BioReliance进行的该分析中使用的参考序列由实施例1(SEQ ID NO：4)中公开的全长序列PRRSV ND 99-14第83代(P83)组成。
PRRSV ND 99-14基因组的测序导致P84和P100样品的完整基因组覆盖。P84和P100的完整共有基因组可分别见于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。cDNA共有序列也已经保藏在GenBank中。在P84的PRRS株ND 99-14的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131567(SEQ.ID.NO:10)。命名为SEQ.ID.NO：10的cDNA共有序列是：
在P100的PRRS株ND 99-14的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131569(SEQ.ID.NO:11)。命名为SEQ.ID.NO：11的cDNA共有序列是：
本领域技术人员会认识到，每种基因组共有序列的多腺苷尾部的长度可以与上述报道的序列不同。
还进行变体鉴定以确定两次传代的病毒群体中核苷酸变化的数量和频率。表15示出了与参考序列相比在P84和P100中发现的7个核苷酸变化。总体而言，变体位置在传代之间是一致的，除了P84中的2个核苷酸变化，其在P100中不存在。此外，每个变体的频率在传代之间是相似的，并且在相对低的频率下检测到，表明在ND 99-14的P84和P100中都发现了类似的亚群。
表15.PRRSV ND 99-14序列变体。
ND＝未检测
实施例6
该研究的目的是制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株SD 11-21的主种子病毒(MSV)。该种子将用于PRRSV疫苗开发。
PRRSV SD 11-21株通过在MARC-145细胞中传代83次(P83)进行改良，包括两轮噬斑纯化和一轮蔗糖梯度纯化，然后如实施例1所述进行初始表征和测序。通过在补充5％胎牛血清(FBS；Sigma Aldrich)和50μg庆大霉素/mL(Life Technologies)的生长培养基 I(Life Technologies)中在MARC-145细胞中传代12次(P95)进一步减毒SD 11-21株，并且在补充有不含庆大霉素的2％FBS的相同生长培养基中进行另外5次传代。PRRSV SD 11-21的第100代(P100)已被用于制备Pre-Master种子病毒(Pre-MSV)。
以下程序用于确定PRRSV MSV SD 11-21的滴度。在100μL生长培养基(补充有5％FBS和50μg/mL庆大霉素的OPTI-MEM培养基)中，将MARC-145细胞以0.75-1.5×104个细胞的密度接种到96孔板中。将细胞在37±2℃和5±1％CO2培养箱中孵育48-72小时，直至细胞超过95％汇合。在滴定当天，将所有培养基从96孔板中取出并用100μL新鲜生长培养基替换。
用稀释剂( I培养基，50μg/mL庆大霉素)制备10倍系列稀释的MSV，并和仅由稀释剂组成的阴性对照一起转移到如上制备的平板上的相应孔中。将滴定板在37±2℃下用5±1％CO2培养箱孵育4天。在孵育期结束时，使用倒置显微镜观察每个板在每个样品孔中是否存在病毒诱导的细胞病变效应(CPE)。使用Reed-Muench方法计算50％组织培养感染剂量(TCID50)，并将滴度记录为log10TCID50/mL。PRRSV MSV SD 11-21的平均滴度为3.25log10TCID50/mL。在MSV制备过程中，滴度没有明显差异。
PRRS SD 11-21MLV株被称为“主种子病毒(MSV)”，并且本发明的培养物已经被保藏在以下条件下，这个条件确保这些培养物在本申请未决期间可以提供给由Commissionerof Patents and Trademarks根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所确定的人员，这些保藏物在提交有本申请等同发现或其派生申请的国家可以获得。然而应该理解的是，可以得到保藏物并不等于被准许可以在损害由政府行为所授予的专利权的情形下实施本发明。本发明的培养物保藏将根据《微生物保藏布达佩斯条约》的规定进行保藏并对公众公开，即，将根据需要对其进行足够的照顾储存以使其在最近一次要求完成样品保藏之后的至少5年内、以及在任何情形中，在保藏日期之后的至少30年间或者在任何可能公开该保藏培养物的专利的有效期限之内保持其存活并不受污染。当保藏处在被要求时因为保藏条件的原因无法提供培养物时，保藏者认可替换保藏物的责任。任何针对本发明培养物保藏对公众可获得的限制在对它们进行公开的专利被授权之后即永久性地被消除。PRRSV MSV SD 11-21的保藏物已根据布达佩斯条约的条款于2015年12月2日进入位于10801University Blvd.,Manassas,Va.,20110-2209,USA的Patent Depository of the American Type CultureLaboratory的永久保藏，然后由储存库分配登录号ATCC PTA-122674。
实施例7
该研究的目的是使用下一代测序来建立遗传同一性，获得共有序列，并评估PRRSV株SD 11-21第84代和第100代制备物中存在的基因组变体(亚群)，两者均在实施例6中描述。
使用大规模平行测序(MP-Sep)系统进行序列表征是包括若干步骤的标准程序，包括：从病毒制备物中提取核酸，cDNA文库合成和定量，克隆扩增和通过PCR富集DNA文库以及由Roche/454下一代测序平台对文库测序。通过合成测序用于同时确定cDNA文库中片段的核苷酸顺序。通过将每个数据集绘制到参考序列，使用所得片段的生物信息学分析进行基因组鉴定和表征。在BioReliance进行的该分析中使用的参考序列由实施例1(SEQ ID NO：9)中公开的全长序列PRRSV SD 11-21第83代(P83)组成。
PRRSV SD 11-21基因组的测序导致P84和P100样品的完整基因组覆盖。P84和P100的完整共有基因组可分别见于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。cDNA共有序列也已经保藏在GenBank中。在P84的PRRS株SD 11-21的cDNA共有序列被指定为GenBank登录号KU131566(SEQ.ID.NO:12)。命名为SEQ.ID.NO：12的cDNA共有序列是：
在P100的PRRS株SD11-21的cDNA共有序列已被指定为GenBank登录号KU131568(SEQ.ID.NO:13)。命名为SEQ.ID.NO：13的cDNA共有序列是：
本领域技术人员会认识到，每种基因组共有序列的多腺苷尾部的长度可以与上述报道的序列不同。
还进行变体鉴定以确定两次传代的病毒群体中核苷酸变化的数量和频率。表16示出了与参考序列相比在P84和P100中发现的11个核苷酸变化。11个变化位置中的6个在传代之间是一致的，除了P100中的5个核苷酸变化，其在P84中不存在。这些变化表明，在病毒从84到100的传代过程中，出现了稍少于一半的亚群变体。
表16.PRRSV SD 11-21序列变体。
ND＝未检测
实施例8
本研究的目的是评估实验改良的活PRRSV疫苗在疫苗接种-攻击研究中的剂量反应和免疫起效(OOI)。评估疫苗减少肺病变、肺和血液中的病毒载量以及临床体征的能力。该研究使用与实施例2和3中所述类似的程序和条件在Veterinary Resources,Inc.,Cambridge,Iowa的BSL-2设施中进行。实验室测定在Iowa State University VeterinaryDiagnostic Laboratory,Ames,Iowa进行，如实施例2和3中所述。将八十(80)只临床健康，PRRSV血清阴性的14或15日龄断奶仔猪纳入研究。将猪随机分配到四个处理组之一(n＝20/组)。处理组包括安慰剂匹配的对照组和三个PRRSV疫苗剂量组(2.7，4.1或5.1log10TCID50/mL)。
在第0天，猪在颈部右侧肌内接受其各自的疫苗或安慰剂(1.0mL)。疫苗配制成包括SD 11-21PRRSV株，稳定剂和防腐剂(庆大霉素)。 I Reduced SerumMedium用作混合稀释剂。使用主种子病毒(MSV)以最高传代水平(MCS+5)制备旨在生产以最高传代水平(MSV+20)在主细胞原液(MCS)上生长的疫苗。通过感染MARC-145细胞测定每种疫苗的中值组织培养感染剂量(TCID50)。接种疫苗后未观察到局部或全身不良反应。与安慰剂对照组相比，在所有疫苗组中接种后第2天观察到直肠温度的短暂升高，但仍保持在正常生理范围内，并且此后未观察到。
在接种后第28天，所有猪用4mL(1mL/鼻孔和2mL IM)PRRSV株NADC-20(第3代)以3.98×104TCID50/mL攻击。安慰剂组肺病变受累的平均百分比为54％。该研究中达到的水平被认为足以评估疫苗候选物。
肺病变评分的统计分析结果在表17和18中总结。治疗的主要影响是统计学显著的(P<0.0001)。所有剂量组中接种疫苗的猪具有比对照组显著低(P<0.05)的肺病变评分(表17)。线性和二次对比没有统计学意义。表18中提供了缓解分数。与组T01(安慰剂)相比，组T02(2.7log)，T03(4.1log)和T04(5.1log)的缓解分数是显著的。用T02，T03和T04的疫苗接种将概率分别增加了0.9200、0.9450和0.9789，使得接种动物具有比未接种的对照动物少的肺病变。
表17.平均肺病变评分1
处理组 估计2 标准误 平均值3
T01:安慰剂 0.8288 0.04258 54.33
T02:2.7log10TCID50/mL 0.1804 0.04183 3.22*
T03:4.1log10TCID50/mL 0.1650 0.04243 2.70*
T04:5.1log10TCID50/mL 0.1662 0.04308 2.74*
1反正弦转换的肺受累百分比。
2未转换的平均值。
3反向转换的平均值。
*T01vsT02，T03或T04，在P<0.05时显著不同。
表18.缓解分数-肺病变评分
组比较 缓解分数 95％置信区间
安慰剂对2.7log10TCID50/mL 0.9200 0.7834,1.0000
安慰剂对4.1log10TCID50/mL 0.9450 0.8461,1.0000
安慰剂对5.1log10TCID50/mL 0.9789 0.9347,1.0000
在第42天，从切除的肺中无菌获得BAL流体。将等分试样的BAL流体提交给ISUVDL，用于PRRSV核酸存在的qRT-PCR分析。结果在表19中总结。与对照猪相比，所有三个剂量组中的接种疫苗的猪在肺中具有显著更低的(P<0.05)病毒载量。治疗的主要效应是显著的(P<0.0001)。
表19.BAL流体中PRRSV基因组拷贝/mL的几何平均值
*T01vsT02，T03或T04，在P<0.05时显著不同。
1未转换的平均值。
2反向转换的平均值。
在第-1、28(攻击前)和42天分别从所有研究动物收集用于测定PRRSV抗体水平和PRRSV病毒血症的血液样品。分别通过ELISA和qRT-PCR方法测定血清学和病毒血症。通过ELISA抗体滴度测定，所有猪在第-1天均为血清反应阴性。在第28天和第42天，所有接种组中的ELISA值显著高于安慰剂组中的值(P<0.05)。
第-1天没有猪对病毒血症呈阳性反应。在攻击时(第28天)，安慰剂对照组中的所有猪均为阴性，而T02，T03和T04组中95％，75％和89％的猪由于存在疫苗病毒而为阳性。在第42天，所有组中的所有猪均在攻击后为阳性，但接种组(T02，T03和T04)中的值显著低于安慰剂对照组(T01)中的值(P<0.05)。
在攻击当天(第28天)和尸检日(第42天)以磅为单位逐个称重所有研究动物并记录它们的重量。测定以下时期的平均日增重(ADWG)：疫苗接种前一天至攻击当天(第-1天至第28天)；接种前一天至尸检日(第-1天至第42天)；和攻击日至尸检日(第28天至第42天)。在攻击前(第-1天至第28天)，治疗的主要效应不显著(P＝0.2304)。在攻击期期间(第28天至第42天)和整个42天研究期间，治疗的主要效应是显著的(P<0.0001)。对于这两个时期中的每一个，接种组中的猪比安慰剂对照组中的猪增加更多的重量(P<0.05)。
在攻击后(第28-42天)每天评估所有动物的抑郁、身体状况和呼吸窘迫，持续14天，并对每个临床体征评分。随时间总结抑郁评分、呼吸评分和身体状况评分。也在一天内总计每只动物的临床评分。在第8天，T02和T04中的值显著低于安慰剂对照组(T01)中的值(P<0.05)。在第9天，T02中的值显著低于T01中的值(P<0.05)。在第10-14天，所有接种组(T02，T03和T04)的值显著低于T01中的值(P<0.05)。剂量对临床体征没有效应。
总之，所有剂量水平的疫苗都能有效减少(P<0.05)肺病变、肺病毒载量、病毒血症和临床体征。未观察到任何剂量水平的疫苗局部或全身不良反应。与对照动物相比，疫苗功效的衍生益处是平均每日体重增加的显著改善(P<0.05)。因此，在早至14-15天龄时接种疫苗的猪可实现28天的免疫起效(OOI)。
总之，表20列出了各种PRRS病毒疫苗株和对其共有基因组cDNA序列的参考。
表20.PRRS病毒疫苗株。
实施例9
本研究的目的是证明猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗的主种子病毒(MSV)SD 11-21X+1缺乏回复毒力，这种疫苗是猪中的改良的活病毒。
通过RT-qPCR总共八十(80)个临床健康，14-15天断奶的猪，对PRRSV是血清阴性和对PRRSV是阴性的，入组四个单独的反向传代(backpassages)。每个反向传代包含20头猪，对照组中有10头猪并且研究兽医产品(IVP)组中有10头猪。将猪随机分配到D-2或D-1的处理组。在反向传代1(BP)中，IVP由SD 11-21MSV X+1组成。在BP 2-4中，IVP由分离自前一次反向传代中的猪的支气管肺泡灌洗(BAL)液的PRRSV组成。对照产品是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。如果动物表现出典型的PRRSV感染的发热和临床体征；根据诊断报告，动物死亡或由于PRRSV被移除；或者具有由于PRRSV引起的严重的肺病变，则认为它受到PRRSV的临床影响。
PRRSV SD 11-21MSV的滴度为3.3log10TCID50(796-70-23Sep14)。产生MSV X+1以达到典型疫苗剂量的滴度水平，包括过量。为了产生X+1，汇合的MARC-145细胞用PRRSV主种子病毒(MSV)SD 11-21(796-70-23Sep14)感染，并且当观察到超过95％细胞病变效应(CPE)时收获PRRSV SD 11-21X+1。
在第0天，IVP组的猪鼻内给予1.0ml的IVP(IN；0.5ml/nare)。每天观察猪的临床体征(抑郁、呼吸和身体状况)和发热，在BP 1-3中观察14天，在BP 4中观察21天。在BP 1-3中的D14和BP 4中的D21天对猪进行安乐死。切除肺，并评估是否存在严重的肺病变。收集支气管肺泡灌洗(BAL)液并通过RT-qPCR分析PRRSV并进行病毒分离。(表21)。使用EZ-PRRSV MPX4.0RT-PCR试剂盒(Tetracore)进行RT-qPCR。通过RT-qPCR将PRRSV阳性的BAL液用蔗糖垫浓缩并合并。通过RT-qPCR测试合并的材料的PRRSV，并且在施用于下一组动物之前通过细胞病变效应(CPE)测定滴度。在反向传代后无法在动物中分离病毒，则认为MSV稳定并且没有逆转为毒力。将存在于通过RT-qPCR测试为阳性的最后反向传代的合并的BAL液中的PRRSV在表型和基因型上与原始MSV X+1中的PRRSV进行比较。使用PRRSV特异性抗体通过IFA测试进行表型比较，并通过比较ORF5基因的基因组测序进行基因型比较。
MSV X+1的病毒滴度为8.2log10TCID50/ml。通过用10倍连续稀释的病毒感染MARC-145细胞并将感染的细胞孵育4天来测定每种病毒的中值组织培养感染剂量(TCID50)。在孵育期结束时，检查每种感染是否存在病毒诱导的细胞病变效应(CPE)并评分为阳性或阴性。然后将收集的数据用于使用用于计算TCID50的Reed-Muench方法来计算的病毒滴度，并报告为log10TCID50/ml。MSV X+1的效力超过了产品的预期靶向释放剂量。在BP 2和3中给予的物质的病毒滴度分别为2.1和2.6log10TCID50/ml。BP 4中给予的物质对CPE是阴性的。在四个反向传代中的任何一个中施用IVP的猪没有对于临床上受PRRSV影响的猪的病例定义是阳性的。此外，当比较ORF5基因时，来自最后正向传代的合并BAL液的病毒显示出与MSV X+1表型相似并且与MSV X+1的基因型匹配。
该研究表明缺乏逆转毒力，并证实了给予14-15天龄猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，改良的活病毒的主种子病毒SD 11-21X+1的遗传稳定性。
表21.通过反向传代的BAL液病毒分离结果
NA-不适用；所有单独的BAL液都通过PCR和免疫荧光进行，因此没有产生池。
实施例10
本研究的目的是评估从接种疫苗到哨兵动物的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD 11-21主种子病毒(MSV)的脱落和传播。通过RT-qPCR招募二十(20)只临床健康，14日龄断奶的猪，对PRRSV呈血清阴性并且对PRRSV呈阴性。在D-1天，对猪进行身体检查，并随机分配到哨兵/对照组或PRRSV SD 11-21MSV X+1处理组。如实施例9中那样产生PRRSV SD 11-21MSV X+1。将猪饲养在具有4只猪/围栏的围栏中，每只猪含有两只猪/处理组。
在D0天，MSV X+1处理组的猪在颈部右侧肌肉内(IM)接种1.0ml，而未对哨兵猪进行治疗。在D-1，D3，D5，D7，D10，D14，D17和D21天收集鼻拭子和血清样品，并通过RT-qPCR测试PRRSV。在D21天，对猪进行人道安乐死并切除肺。无菌收集支气管肺泡灌洗(BAL)液并通过RT-qPCR测试PRRSV。另外，从肺、脾、扁桃体、胸腺和右和左气管支气管淋巴结收集组织样品，并通过RT-qPCR测试PRRSV。如果组织样品通过RT-qPCR测试PRRSV阳性，则使用ORF5区域通过基因组测序对样品进行同一性测试，并与MSV X+1的ORF5区域进行比较。在D-1和D21天收集体重。
在21天研究期间，十分之九的接种猪(90％)至少有一个鼻拭子PRRSV阳性。在21天的研究期结束时，一些猪(4/9)仍在脱落疫苗。所有接种疫苗的猪都是D3-D21的病毒血的。此外，来自接种猪的所有BAL液和组织样品在D21天通过RT-qPCR对PRRSV呈阳性。从组织样品中分离的RNA的核苷酸序列显示与MSV X+1具有99.67-100％的相似性，表明存在于源自疫苗病毒的猪中的唯一病毒。十分之一的哨兵猪(10％)被认为是疫苗病毒阳性。在21天的采样期间，单个鼻拭子呈阳性。没有血清样品，BAL液样品或取样的组织，在任何哨兵猪中通过RT-qPCR检测为PRRSV阳性。
施用后MSV X+1从接种疫苗的动物中脱落至少21天。从接种疫苗到哨兵动物的MSVX+1的传播是有限的，因为在单个阳性鼻拭子外的任何哨兵动物中未检测到疫苗病毒。
实施例11
本研究的目的是评估含有2型PRRSV株(SD 11-21)的实验性改良的活PRRSV疫苗在4.45log10TCID50/mL时在给予对PRRSV血清反应阴性的14日龄仔猪，随后受到当代毒力2型PRRSV株(NC-174)的攻击的效力。NC-174PRRS病毒是从北卡罗来纳州哈雷尔斯的养猪场经历呼吸道症状的9周龄猪的血清样品中分离出来的。来自农场的详细症状观察是厌食、嗜睡、呼吸过度、呼吸困难、15％发病率和5％死亡率。评估疫苗减少肺病变，肺和血液中的病毒载量以及临床体征的能力。
将40只临床健康的，PRRSV血清阴性的14日龄断奶仔猪纳入研究。通过降低体重对猪进行分级，并随机分配到两个处理组之一(n＝20/组)。处理组包括实验疫苗和安慰剂匹配的对照组。通过处理组饲养猪以直至攻击时间都防止由于疫苗病毒脱落而暴露。在攻击时，将猪混合在一起使得在围栏中有来自每个处理组的两头猪。
在第0天，猪在颈部右侧肌内接受疫苗或安慰剂(1.0mL)。在第-1、28、35和42天收集血样，并通过ELISA测试血清PRRSV抗体水平和通过定量PCR(qRT-PCR)检测病毒载量。在第28天，用1.3×106TCID50/mL的4mL(1mL/鼻孔和2mL IM)PRRSV株NC-174(谱系1，第3代)攻击所有猪。从第28天至第42天每天记录代表呼吸窘迫、抑郁和身体状况的临床评分。在第-1、28和42天对猪进行称重以评估体重增加。在第42天对猪实施安乐死，切除肺，并测定肺病变的程度。在第42天收集支气管肺泡灌洗(BAL)液并通过qRT-PCR测试PRRSV。
接种疫苗后未观察到局部或全身不良反应。实验性疫苗可有效降低(P<0.05)肺病变百分比(对照组为45.9％vs接种组为4.0％)，肺病毒载量(降低95％)，病毒血症(攻击后14天)和临床体征。肺病变数据的缓解分数评估表明，疫苗接种使接种动物比未接种疫苗的对照动物具有更少肺病变的概率增加0.9368。
在14天攻击期间，与对照动物(0.43vs0.25kg/天)相比，疫苗效力的衍生益处是平均每日体重增加的显著改善(P<0.05)。
总之，对于幼稚的14日龄猪，施用含有株SD 11-21作为单一1.0mL剂量的实验性PRRSV疫苗对于用当代PRRSV田野菌株NC-174攻击是安全有效的。
实施例12
本研究的目的是确认含有2型PRRSV毒株(SD 11-21)的实验改良的活PRRSV疫苗向PRRSV血清阴性的14日龄仔猪以4.45log10TCID50/mL施用随后用毒性2型PRRSV株(NADC-20)攻击时的免疫持续时间至少为26周(182天)。评估疫苗的减少肺病变，肺和血液中的病毒载量以及临床体征的能力。将64只临床健康的，PRRSV血清阴性的14日龄断奶仔猪纳入研究。猪被垫料阻塞并随机分配到两个处理组之一(n＝32/组)。处理组包括实验疫苗(T02)和安慰剂匹配的对照组(T01)。通过处理组饲养猪以直至攻击时间都防止由于疫苗病毒脱落而暴露。在攻击时，将猪混合在一起使得在围栏中有来自每个处理组的两头猪。
在第0天，猪在颈部右侧肌内接受疫苗或安慰剂(1.0mL)。在第-1、28、112、168、181、189和196天收集血液样本，并通过ELISA测试血清PRRSV抗体水平和通过定量PCR(qRT-PCR)测试病毒载量。在第182天，用10mL(4mL/鼻孔和2mL IM)的PRRSV株NADC-20以106.7TCID50/mL攻击所有猪。从第182天至第196天每天记录代表呼吸窘迫、抑郁和身体状况的临床评分。在第196天(攻击后14天)对猪进行安乐死，切除肺，并测定肺病变程度。收集支气管肺泡灌洗(BAL)液并通过qRT-PCR测试PRRSV。
该实验疫苗可有效减少(P<0.05)肺病变百分比(对照组为12.3％，接种组为1.1％)。肺病变数据的缓解分数评估表明，疫苗接种使接种疫苗的动物比未接种疫苗的对照动物具有更少的肺病变的概率增加0.6566。
该研究的结果证实，对于幼稚的14日龄猪，施用含有株SD 11-21作为单一1.0mL剂量的实验性PRRSV疫苗对于26周后给予的毒力PRRSV攻击是有效的。

Claims (19)

1.一种改良的活猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQID NO：13的序列至少90％相同。
2.权利要求1所述的改良的活PRRS病毒株，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同。
3.权利要求1或2所述的改良的活PRRS病毒株，其中所述PRRS株的共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13的序列至少98％相同。
4.权利要求1-3中任一项所述的改良的活PRRS病毒株，其中所述PRRS株是ND 99-14或SD 11-21。
5.权利要求1-4任一项所述的PRRS株，其中所述PRRS病毒株在组织培养细胞中传代至少80次。
6.权利要求1-4任一项所述的PRRS株，其中所述PRRS病毒株在组织培养细胞中传代100次。
7.一种免疫原性组合物，包含改良的活PRRS病毒株，其具有与选自SEQ ID NO：4，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少90％相同的共有互补DNA序列；和
药学上可接受的赋形剂，稳定剂，增溶剂或稀释剂。
8.权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少95％相同。
9.权利要求7或权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述共有互补DNA序列与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列至少98％相同。
10.权利要求7-9的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述改良的活PRRS病毒株是ND99-14或SD 11-21。
11.权利要求7-10的任一项所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。
12.疫苗，其包含改良的活PRRS病毒株，其中所述PRRS病毒株是ND99-14或SD 11-21。
13.一种在猪动物中治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征症状的方法，包括向所述猪动物施用权利要求7-12中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗。
14.一种在猪动物中治疗或预防又PRRS病毒感染引起的症状的方法，包括向所述猪动物施用权利要求7-12中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗。
15.权利要求14的方法，其中PRRS病毒感染由与免疫原性组合物或疫苗中的改良的活PRRS病毒株异源的毒力PRRS病毒引起。
16.权利要求1-6中任一项的改良的活PRRS病毒株在制备用于治疗PRRS的药物中的用途。
17.权利要求7-12中任一项的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗PRRS的药物中的用途。
18.一种疫苗，包含权利要求1-6中任一项的改良的活PRRS病毒株，用于在猪动物中治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征的症状。
19.一种疫苗，胞苷改良的活PRRS病毒株，用于在猪动物中治疗或预防由PRRS病毒感染引起的症状。
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