KR20180100231A - 돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 관한 것이다. 바이러스는 유전자 분석되고, 조직 배양에서의 반복 계대배양에 의한 변형에 대해 계통발생학적 그룹화를 기초로 하여 선택된다. 변형된, 생 바이러스는 이종 바이러스에 대한 보호 면역을 제공하는 능력에 대해 평가된다. 변형된, 생 바이러스는 백신, 특히 다중 이종 바이러스에 의한 돼지의 감염을 치료할 수 있는 백신에서 유용하다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 바이러스

본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 관한 것이다. 변형된, 생 바이러스는 백신, 특히 이종 바이러스에 대한 보호를 제공하는 백신에 유용하다.

원래 미확인 돼지 질환으로 불린 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)은 유럽에서 최초로 보고되었고 현재 전세계로 확산되었다. PRRS는 번식 적령기 암퇘지에서의 후기 유산, 사산, 및 불임, 및 사육 및 성장 중/마감 돼지에서의 호흡기 질환, 감소된 성장 성능, 및 심지어 사망을 유발한다. PRRS는 미국에서만 매년 6억 달러가 넘는 경제적 손실을 유발한다.

성체 돼지과 동물에서의 PRRS 바이러스 감염의 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 및 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것을 포함한다. 임신한 암퇘지는 새끼를 조산하거나, 태아를 유산하거나, 미이라화된 또는 사산된 새끼돼지를 분만할 수 있고, 최대 10%의 임신한 암퇘지가 PRRS 바이러스 감염으로 사망할 수 있다. 감염된 새끼돼지는 이유전 사망률이 높고, 종종 약하고, 눈 주위에 부종이 있을 수 있다. 이유된 사육 또는 성장 중/마감 돼지에서의 PRRS 바이러스 감염은, 제한 없이, 성장 장애, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 및 거친 털을 유발할 수 있다.

PRRS 바이러스는 대략 15 kb, 선형, 양성-가닥, 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 외피보유 바이러스이고, 상기 바이러스는 패밀리 아르테리비리다에(Arteriviridae)로 분류되어 있다. 지금까지 적어도 9개의 오픈 리딩 프레임이 게놈에서 확인되었다. PRRS 바이러스는 2개의 일반 하위유형으로 나뉜다. 유럽 하위유형, 유형 1 PRRS 바이러스는 렐리스타드(Lelystad) 균주로 예시되며, 유형 2 북아메리카 PRRS 바이러스는 균주 VR-2332로 예시된다.

2종의 하위유형은 그의 게놈에서 약 60%만큼 낮은 서열 동일성을 가질 수 있고, 심지어 하위유형 내에서도 개개의 균주는 그의 게놈의 동일성에서 최대 약 20% 다를 수 있다. 이러한 가변성은 PRRS를 효과적으로 치료하고/거나 예방하기 위한 백신의 개발을 복잡하게 하고 있다. PRRS 바이러스의 변형된, 생 바이러스 (MLV) 변이체는 PRRS 바이러스에 의한 챌린지에 대해 면역을 생성할 수 있지만, 백신은 챌린지가 MLV와 유전학적으로 상동인 PRRS 바이러스에 의한 경우에 가장 효과적이다. MLV 백신은 이종 바이러스에 의한 챌린지에 대해 덜 효과적이었다. 또한, MLV는 병독성으로의 일부 반전을 나타내어, 백신 바이러스가 백신접종된 동물에서 질환을 유발한다. 불활성화된 (즉 사멸된) PRRS 바이러스를 함유하는 백신은 보다 우수한 안전성 프로파일을 갖지만, 이종 챌린지에 대한 효능은 제한되었다.

현재의 PRRS 백신은 PRRS 바이러스 감염의 경제적 영향을 감소시키는데 충분한 안전성 및 효능을 나타내지 않기 때문에, 신규의 개선된 백신이 필요하다. 바람직하게는, 그러한 백신은 안전할 뿐만 아니라 효과적일 것이다. 백신이 약독화된 MLV를 포함하는 경우, 그러한 약독화된 MLV는 본 분야에서의 사용에 대해 안전한 것으로 간주되기 위해 병독성으로의 반전을 입증하지 않아야 한다. 예를 들어, PRRS 균주를 조직 배양 세포에서의 성장에 적어도 80회 계대배양, 또는 바람직하게는 적어도 100회 계대배양 동안 적응시킴으로써, MLV는 병독성으로의 반전을 입증하지 않아야 한다. 효과적이기 위해서는, 백신 바이러스 균주는 계통발생학적으로 다양한 야생형 PRRS 균주 범위에 대해 돼지과 동물에서 보호 면역을 도출할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 새로운 PRRS 백신 바이러스 균주는 적어도 3종의 계통발생학적으로 다양한 야생형 PRRS 균주에 대해 돼지과 동물에서 보호 면역을 도출할 수 있을 것이다.

본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 백신 바이러스 균주를 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, PRRS 바이러스의 높은 돌연변이율로 인해, 변형된, 생 PRRS 균주는 각각이 상동이지만 동일하지는 않은 게놈을 갖는, 다중 하위집단을 포함할 수 있다.

본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 제공하며, 여기서 PRRS 바이러스 균주는 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주이다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 바람직하게는 적어도 80회, 또는 보다 바람직하게는 84회 계대배양될 것이다. 가장 바람직하게는, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 가장 바람직하게는, 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.

본 발명은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, PRRS 바이러스의 높은 돌연변이율로 인해, 변형된, 생 PRRS 균주는 각각이 상동이지만 동일하지는 않은 게놈을 갖는, 다중 하위집단을 포함할 수 있다.

본 발명은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 백신을 제공한다. PRRS는 PRRS 바이러스에 의해 유발되기 때문에, 본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물의 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료하는데 사용하기 위한 백신을 제공한다. 감염은 PRRS 바이러스의 야생형 병독성 균주로 인한 것일 수 있다. 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것, 새끼의 조산, 유산, 사산, 부종, 성장 장애, 기침, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 거친 털, 폐 병변, 바이러스 배출 및 사망일 수 있다. 본 발명은 돼지과 동물의 요법에 사용하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 요법에 사용하기 위한 백신을 제공한다. 바람직하게는, 백신은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 가장 바람직하게는, 백신은 ND 99-14 또는 SD 11-21인 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것, 새끼의 조산, 유산, 사산, 부종, 성장 장애, 기침, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 거친 털, 폐 병변, 바이러스 배출 및 사망일 수 있다. 본 발명은 돼지과 동물의 요법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 요법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 감염은 백신 내 변형된, 생 PRRS 바이러스와 이종인 PRRS 바이러스의 야생형 병독성 균주로 인한 것일 수 있다. 바람직하게는, 백신은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 가장 바람직하게는, 백신은 ND 99-14 또는 SD 11-21인 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에게 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 보다 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양된다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발되는 증상을 치료 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다. PRRS 바이러스 감염은 면역원성 조성물 내 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주와 이종인 병독성 PRRS 바이러스에 의한 감염일 수 있다. 2종의 PRRS 바이러스 균주는 각각의 바이러스 균주의 게놈 컨센서스 서열이 상이한 계통발생적 군으로 맵핑될 경우 이종인 것으로 간주된다. 2종의 PRRS 바이러스 균주는 각각의 바이러스 균주의 상보적 DNA 컨센서스 서열이 상이한 계통발생학적 군으로 맵핑될 경우 이종인 것으로 간주된다.

본 발명은 PRRS의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 PRRS의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주의 용도를 제공한다. 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.

본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.

본 발명은 돼지과 동물을 PRRS 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 돼지과 동물을 PRRS 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 의약의 제조에서의, ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.

도 1. 유형 2 PRRSV ORF5 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 2. 유형 2 PRRSV nsp1 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 3. 유형 2 PRRSV nsp2 OTU 도메인 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 4. IFN-알파 (IFN-α) 발현의 자극에 대한 상이한 PRRSV 필드 분리주의 변경.
도 5. 상이한 필드 PRRSV 분리주에 의한 탈ISG화 검정.

하기 논의에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 사용된 용어 "바이러스"은 바이러스의 종, 또는 상호교환가능하게, 핵산, 단백질 및 지질 막을 함유할 수 있는 개별 감염 유닛을 의미할 수 있다. 개별 감염 유닛은 또한 "바이러스 입자" 또는 "비리온"으로 불리고, 후자의 용어는 동의어이다.

본원에 사용된 바이러스 "균주" 또는 "분리주"는 유전학적으로 상동인 비리온의 집합을 의미한다. 2종의 바이러스는 그러한 바이러스가 동일한 계통발생적 계통군으로 맵핑되면 "상동"인 것으로 간주될 것이다. 2종의 바이러스는 그러한 바이러스가 상이한 계통발생적 계통군으로 매핑되면 "이종"인 것으로 간주될 것이다. PRRS 바이러스가 높은 돌연변이율을 갖기 때문에, 단일 PRRS 균주는 관련이 있지만 가변적인 유전자 서열을 갖는 개별 비리온을 포함한다는 것이 인지될 것이다. 따라서, 각각의 PRRS 균주 내에 균주의 하위집단이 존재하고, PRRS 균주의 유전자 서열은 PRRS 균주의 개별 구성원의 유전자 서열이 그러한 균주에 대한 컨센서스 서열과 동일하지 않을 수 있는 컨센서스 서열이다. "컨센서스" 서열은 주어진 위치의 각각의 핵산 잔기가 PRRS 바이러스 균주 또는 분리주의 폴리뉴클레오티드의 >50%에 존재하는 핵산 서열이다.

"퍼센트 동일성"은 핵산 또는 단백질의 동일한 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 계산함으로써 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성의 계산은 2개 이상의 서열 사이에서 최적 정렬을 결정하는 것을 포함한다. 정렬은 시험될 각각의 서열 내의, 예컨대 제한 없이, 핵산의 비-코딩 영역 및 폴리펩티드 서열의 말단절단 또는 연장 내의 삽입 및 결실 (즉 "갭")을 고려할 수 있다. 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘 예컨대 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST)을 사용하여 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다. BLAST는 미국 국립 생물 정보 센터에 의해 제공되는 많은 리소스 중 하나이다. 유전자 코드는 축중성이고 1개 초과의 코돈이 주어진 아미노산을 코딩할 수 있기 때문에, 핵산의 코딩 영역은 핵산이 동일한 폴리펩티드를 코딩할 경우 동일한 것으로 간주된다. 따라서, 퍼센트 동일성은 또한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 기초하여 계산될 수 있다. 퍼센트 동일성은 전장 컨센서스 게놈 서열 또는 게놈 서열의 분획, 예컨대 예를 들어 제한 없이 개별 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 기초하여 계산될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "변형된, 생 바이러스"는 유전자 서열이 자연 발생 야생형 바이러스의 유전자 서열에서 변경된 임의의 개별 바이러스 입자 (즉, "비리온") 또는 다수의 바이러스 입자에 적용된다. 변경은, 제한 없이, 유전자 돌연변이 예컨대 뉴클레오티드의 삽입 및 결실, 및 하나의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드로 변화시키는 전이 및 전환을 포함한다. 변경은 야생형 바이러스를 조직 배양 시스템에서의 복제에 적응시키고, 바이러스를 조직 배양 시스템에서 계속해서 계대배양하여 바이러스의 유전자 돌연변이를 축적시킴으로써 달성될 수 있다. 변경은 또한 분자 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 약독화된 바이러스는 변형된, 생 바이러스의 하위세트를 형성한다.

본원에 사용된 용어 "약독화된" 또는 "약독화"는 바이러스가 임상 질환을 유발하거나 악화시키는 능력이 감소 또는 제거되었음을 의미한다. 약독화된 바이러스는 여전히 숙주 세포를 시험관내 또는 생체내에서 감염시킬 수 있고, 그러한 감염은 숙주 유기체에서 준임상 효과를 발생시킬 수 있지만, 그러한 감염은 1종 이상의 임상 질환 증상은 발생시키지 않는다.

대조적으로, 본원에 사용된 "불활성화된" 바이러스는 숙주 세포에서 더 이상 복제할 수 없는 바이러스를 의미한다. 불활성화된 바이러스는 죽은 또는 사멸된 바이러스로 간주된다. 불활성화는 바이러스 단백질의 화학적 변경, 비리온의 구조의 화학적 또는 물리적 변경, 또는 바이러스 핵산의 화학적 또는 물리적 변경을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.

"항원"은 유기체의 면역계에 의해 특이적으로 검출될 수 있는 임의의 분자이다. 전형적으로 바이러스 항원은 바이러스 게놈에 의해 코딩되거나 바이러스 게놈의 생성물로부터 유래된 바이러스 단백질이다. 바이러스 항원의 존재는 숙주 T 림프구 및 숙주 B 림프구 둘 다의 표면 항원 수용체에 의해, 및 숙주 세포에 의해 합성된 항체 분자에 의해 특이적으로 검출될 수 있다.

"면역원성"은 면역 반응을 도출하는 항원의 능력을 지칭하고, 상기 면역 반응은 항원-특이적 반응 및 비-항원-특이적 반응 둘 다 또는 선천성 면역 반응을 포함한다. "보호 면역"은 면역화된 동물이 챌린지되거나 병원성 바이러스 균주에 노출된 경우 임상 증상을 감소시키거나 방지할 수 있는 면역 반응이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 보호 면역은 시간에 따라 또는 면역화된 동물의 연령 증가에 따라 저하될 수 있다. 본원에 사용된 보호 면역은 최종 면역화 일로부터 적어도 4개월, 그러나 바람직하게는 적어도 6개월 동안 효과적일 것이다. 보호 면역은 단일 용량의 백신에 의해 도출될 수 있다. 보호 면역 반응을 증가 또는 연장시키기 위해 제2 또는 추가의 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종 암퇘지에서 보호 면역 반응을 증가시키는 것은 새끼돼지에서 증가된 모체 유래 항체 수준을 발생시킬 수 있다.

항원과 대조적으로, "아주반트"는 면역 반응의 비-특이적 자극제이다. 아주반트는 패턴 인식 수용체 (PRR)에 결합하여 활성화함으로써 선천성 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 PRR의 자극제는 예를 들어 바이러스 또는 박테리아 핵산, 박테리아 또는 기생충으로부터의 지질, 또는 박테리아 단백질 또는 독소, 또는 이러한 분자의 임의의 인공적으로 구축된 모방체일 수 있다. 아주반트는 또한, 제한 없이: B 림프구에 의한 인식 또는 식세포에 의한 섭취를 용이하게 하도록 항원을 응집시키는 무기 화합물, 예컨대 명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘 히드록시드 또는 황산암모늄; 오일; 및 세제를 포함한다. 아주반트는 또한 면역 신호전달의 숙주 매개자, 예컨대, 제한 없이, 시토카인, 림포카인, 케모카인, 인터페론, 아나필라톡신, 성장 인자, 분화 인자, 및 부착 분자일 수 있다.

본원에 사용된 "면역원성 조성물"은 동물에게 투여 시 면역 반응을 도출하는 조성물이다. 면역원성 조성물은 적어도 1종의 항원 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제의 설명은, 예를 들어, 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lloyd V. Allen, ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 22^nd edition, 2012]에서 찾아볼 수 있다. 항원은 살아있거나 불활성화된 전체 바이러스, 박테리아 또는 다른 병원체일 수 있다. 항원은 또한 바이러스, 박테리아 또는 다른 병원체로부터 단리, 정제 또는 부분 정제된 항원 분자일 수 있다. 항원은 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 핵산 또는 지질일 수 있다.

본원에 사용된 "백신"은 동물에게 투여 시 병원성 유기체, 예를 들어 바이러스에 의해 유발된 질환 증상으로부터 보호, 그에 대한 저항성, 그의 방지, 또는 그의 치료를 부여하는 면역원성 조성물이다. PRRS 백신은, 제한 없이, 제약상 허용되는 아주반트, 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함하는 조성물 중에, 살아있거나 불활성화된 바이러스 항원 또는 무손상 비리온을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하기 위해", 또는 "치료"는 제한 없이 현존하는 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지, 감소, 완화 또는 역전시키는 것을 포함한다. 치료는 치유적으로 적용 또는 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "방지하는", "방지하기 위해", 또는 "방지"는 제한 없이 증상, 장애, 상태 또는 질환의 위험을 감소, 감축, 또는 완화시키고, 동물을 증상, 장애, 상태 또는 질환으로부터 보호하는 것을 포함한다. 방지는 예방적으로 적용 또는 투여될 수 있다.

본원에 사용된 "동물에게 투여"는, 피부, 피하, 근육내, 점막, 점막하, 경피, 경구 또는 비강내 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여는 주사 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.

하기 실험 실시예는 변형된, 생 PRRS 바이러스의 예시이다. 하기 실험 실시예는 또한 변형된, 생 PRRS 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물의 예시이다. 하기 실험 실시예는 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 증상을 치료하기 위해, 변형된, 생 PRRS 바이러스를 사용하는 것의 예시이다. 다른 실시양태 및 사용이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 발명은 이들 특정의 예시된 실시예 또는 바람직한 실시양태로 제한되지 않는다는 것이 인지될 것이다.

실시예 1

본 발명자들은 PRRS에 대한 광범위한 보호 MLV 백신을 개발하고자 한다. 유전자 마커 및 감별 진단 시험 개발을 위해 백신 바이러스 내 고유 영역을 확인하였다. 구체적 목적은: 1) 후보 PRRS 백신 균주를 확립하는 것; 2) 후보 백신 바이러스 내 고유 마커 영역을 확인하고, 감별 진단 시약을 개발하고, 야생형 바이러스 감염된 동물로부터 백신접종된 동물의 감별에 대해 시험하는 것; 및 3) 후보 백신의 안전성 및 효능의 생체내 평가를 수행하고, 동반 진단 검정의 감별 능력을 평가하는 것이다.

본 발명자들은 9종의 후보 백신 바이러스를 생성하였다. 이들 후보 바이러스의 상세한 특징화를 하기 제시한다.

통상적으로 사육한 3- 내지 9-주령의 돼지의 폐로부터 수득한, 돼지 폐포 대식세포에서의 성장에 의해 바이러스를 처음 단리하였다. 폐를 절제하고, 포스페이트-완충 염수, pH 7.2로 3 또는 4회 세척하였다. 세포를 800 X g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 유체를 경사분리하고, 세포를 포스페이트-완충 염수로 세척하고, 2회 재-펠릿화하였다. 세포를 10% 방사선조사된 태아 소 혈청 및 적절한 수준의 항생제로 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 대식세포를 24-웰 플레이트에 10⁶개 세포/ml로 시딩하고, 7시간 동안 부착되도록 하였다. 비-부착 세포를 경사분리하고, 웰을 10% 태아 소 혈청 및 RPMI 배지로 다시 채웠다. RT-PCR에 의해 PRRSV 양성인 것으로 확인된 필드 돼지 혈청 샘플을 사용하여 대식세포 배양 72시간 후에 대식세포에 접종하였다. 접종 48시간 후, PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 사용한 직접 형광 항체 시험에 의해 감염을 확인하였다.

이어서 각각의 바이러스 분리주를 플라크-정제하였다. 전면생장 세포 단층을 바이러스로 0.1의 감염 다중도 (MOI)로 감염시켰다. 2시간 후에, 세포 배양 상청액을 제거하고, 한천 오버레이를 적용하였다. 플라크는 37℃에서 5일 후에 검출되었다. 각각의 바이러스 분리주로부터 적어도 10개의 단일 플라크를 골라내어 배양된 세포에서 확장시켰다.

세포를 플라크-정제된 바이러스로 MOI 0.1로 감염시켜 바이러스의 후속 계대배양을 수행하였다. 3일 후에, 배양물 상청액을 0.5 M 수크로스 쿠션 상에 층형성하고, 100,000 X g에서 14시간 동안 원심분리하였다. 바이러스 펠릿을 PBS로 세척하였고, 이를 -80℃에서 저장할 수 있다.

각각의 바이러스 분리주의 게놈 서열을 결정하기 위해, 퀴아앰프(QiaAmp) 바이러스 RNA 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수크로스 쿠션 정제된 바이러스로부터 RNA를 추출하였다. 퍼듀 대학교 게놈 코어 시설에서 차세대 서열분석을 사용하여 전장 게놈 서열을 결정하였다.

뉴클레오티드 서열을 클러스탈(CLUSTAL) W 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬시켰다. 진화 의학 및 정보 센터 (미국 애리조나주 템피)에서 입수가능한 분자 진화 유전학 분석 (MEGA4) 소프트웨어를 사용하여, 생성된 거리 매트릭스에 대해 이웃-연결 거리 분석을 수행하였다. NJBOOT를 사용하여 5000개의 복제물로부터 부트스트랩 옵션을 수행하여, 계통수의 내부 가지의 강건성을 평가하였다.

총 32종의 PRRSV 필드 분리주를 백신 후보로서 그의 잠재력에 대해 평가하였다. 처음에, 계통발생학적 분석을 위해 바이러스의 가장 초가변 영역 중 3개 (nsp1, nsp2 및 ORF5)를 서열분석하였다. 도 1-3은 nsp1, nsp2 난소 종양 (OTU) 도메인, 또는 ORF5의 서열에 기초하여 이웃-연결 방법에 의해 구축된 계통수의 결과를 보여준다. 계통수 내의 각각의 주요 클러스터를 대표하는 9종의 분리주 (박스로 강조표시됨)를 추가의 특징화를 위해 선택하였다. 모든 3개의 계통수에서, 분리주 ND99-14 및 ND99-17은 현재의 상업적 PRRSV 백신 균주를 함유하는 계통군으로부터 개별 계통군에 위치하였다. 이들 2종의 바이러스는 또한 인터페론 (IFN)-α 생산을 자극하는 능력을 갖는다 (도 4 참조). 분리주 SD95-10 및 SD95-47은 VR2332, 및 VR2332로부터 유래된 인겔백(INGELVAC)® PRRS MLV 균주와 동일한 계통군으로 그룹화되었다. 분리주 12-7455 및 SD11-21은 보다 최근의 필드 균주의 계통군을 나타낸다. nsp1 및 nsp2 OTU 도메인 계통수에서, SD04-89 및 SD98-163은 중국의 고도의 병원성 균주 JX143, 및 JA142 균주로부터 유래된 인겔백® PRRS ATP 균주가 포함된 계통군으로 그룹화되었다. ORF5 및 nsp2 OTU 도메인 계통수에서, MN05-68은 JX143 및 인겔백® PRRS ATP 균주가 포함된 계통군으로 그룹화되었다.

백신 개발에 대한 기준 중 하나는 후보 바이러스가 숙주 면역 반응을 자극하는 능력을 가져야한다는 것이다. 이전의 연구는 PRRSV가 숙주 세포의 선천성 면역 반응을 억제하고 nsp2가 인터페론 (IFN) 및 인터페론 자극된 유전자 (ISG)의 발현을 억제하는 선천성 길항제 중 하나라는 것을 제시하였다. 바이러스 균주가 인터페론 알파 (IFN-α)를 유도할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 돼지 대식세포를 상이한 필드 분리주로 MOI 1로 감염시키거나, 또는 모의 감염시켰다. 감염 후 24시간 째에 세포-배양 상청액을 수거하여, 이전에 기재된 바와 같이 (Lawson et al., Vaccine 28: 5356-64 (2010)) 형광 마이크로구체 면역검정을 사용하여 IFN-α 발현을 정량화하였다. 평균 형광 강도 값을 사용하여 IFN-α의 양을 결정하고, 결과를 모의-감염된 대조군 세포로부터의 평균 값과 비교하였다.

시험관내 탈ISG화 검정을 수행하여 ISG 발현을 억제하는 능력이 약한 바이러스를 선택하였다. 탈ISG화 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Sun et al., J. Virology 86(7): 3839-50 (2012)). 간략하게, HeLa 세포를 접합 효소 E1/E2/E3, FLAG-태그부착된 ISG15 및 PRRSV PLP2 (aa386-578)를 발현하는 플라스미드 DNA로 공동-형질감염시켰다. 공벡터 플라스미드를 대조군으로서 포함시켰다. 형질감염 6시간 후, 세포를 IFN-α 1,000 U/ml로 자극하였다. 자극 24시간 후에 세포를 수거하고, 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 막을 항-FLAG 항체로 프로빙하여 ISG15의 유리 및 접합된 형태의 발현을 검출하였다. PRRSV PLP2의 발현은 nsp2-특이적 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 분리주 SD95-10 및 SD11-21은 세포 단백질의 ISG화에 대해 낮은 효과를 가졌고, 이는 이들 2종의 분리주가 향후 백신 개발에 사용될 잠재력을 가질 것임을 시사한다. 본 발명자들은 바이러스가 IFN-α 발현을 자극하는 능력을 추가로 시험하였다. SD04-30 및 MO04-25는 IFN-α 생산을 증진시킬 수 있는 것으로 이전에 문서화되었다. 이들 2종의 분리주를 대조군으로서 사용하여, IFN-α 발현 수준을 PRRSV-감염된 돼지 폐포 대식세포에서 측정하였다. 본 발명자들이 예상한 바와 같이, SD04-30 및 MO04-25는 유의한 양의 IFN-α 발현을 자극하였다 (도 4). 대조적으로, 분리주 SD95-21, ND99-17, SD06-21 및 SD92-18은 SD04-30 및 MO04-25와 대등한 IFN-α 수준을 자극하였다. 분리주 MN91-45, ND99-14 및 NE06-05는 IFN-α 발현의 약한 자극을 나타내었다.

면역 검정 결과 및 계통발생 분석에 기초하여, 배양된 비-돼지 세포에서의 80회 계대배양 동안의 연속 계대배양을 위해 9종의 유형 2 분리주를 먼저 선택하였다. 이들 9종의 유형 2 바이러스에 더하여, SD03-15 (유형 1 균주), SD02-11 (유형 1 균주) 및 SD02-10 (유형 1 및 유형 2 바이러스의 믹스)을 또한 추가의 분석에 포함시켰다. 세포 배양에서 2회 플라크 정제를 위해 총 9종의 계대배양-80 (P80) 바이러스를 선택하고, 수크로스 쿠션을 통해 계대배양-82 (P82) 바이러스를 추가로 정제하고, 바이러스 스톡으로서 저장하였다. 각각의 후보 백신 바이러스의 계대배양 동안 바이러스 역가를 결정하였고, 이는 4.5-7 log 형광 초점 단위 (FFU)/ml 범위였다. 5 log FFU/ml보다 낮은 역가를 갖는 바이러스 분리주는 추가의 연구에서 제외하였다. 11종의 후보 바이러스 분리주에 대한 전장 게놈 서열은 2013년 2월 11일에 처음 결정되었고, 플라크 정제 및 수크로스 쿠션에 의해 정제된 9종의 후보 백신 바이러스 (P83)의 최종 생성물을 다시 서열분석하여 2013년 12월 22일에 문서화하였다.

계대배양 83 (P83)에서의 9종의 PRRS 바이러스 분리주에 대한 cDNA 컨센서스 서열을 진뱅크(GenBank) 유전자 서열 데이터베이스에 기탁하고, 모든 공중 이용가능한 핵산 서열의 집합으로 주석을 달았다. 진뱅크 데이터베이스는 미국 국립 보건원 (NIH)의 일부인 국립 생물 정보 센터 (NCBI)에 의해 유지된다. 진뱅크는 국제 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 협업의 일부이다.

P83에서의 PRRS 균주 SD 95-10의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131565 (서열식별번호: 1)를 배정받았다. 서열식별번호: 1로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 95-47의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131564 (서열식별번호: 2)를 배정받았다. 서열식별번호: 2로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 98-163의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131563 (서열식별번호: 3)을 배정받았다. 서열식별번호: 3으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 ND 99-14의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131562 (서열식별번호: 4)를 배정받았다. 서열식별번호: 4로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 02-10의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131561 (서열식별번호: 5)을 배정받았다. 서열식별번호: 5로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 03-15의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131560 (서열식별번호: 6)을 배정받았다. 서열식별번호: 6으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 04-89의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131559 (서열식별번호: 7)를 배정받았다. 서열식별번호: 7로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 MN 05-68의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131558 (서열식별번호: 8)을 배정받았다. 서열식별번호: 8로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

P83에서의 PRRS 균주 SD 11-21의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131557 (서열식별번호: 9)을 배정받았다. 서열식별번호: 9로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:

관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.

실시예 2

본 연구의 목적은 병독성 PRRS 바이러스에 의한 이종 챌린지 후 성장 중인 돼지에서의 실험적 PRRSV 백신의 효능을 평가하기 위한 것이다. 시험 백신의 효능은 비-백신접종된 대조군과 비교하여 폐 병변 및 바이러스혈증을 감소시키는 백신의 유효성을 기초로 하였다. 이 연구의 설계를 표 1에 제공한다.

표 1. 연구 설계.

¹ 형광 초점 단위 (FFU).

² 위약 대조군 동물에는 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 제공하였다.

³ IM = 근육내.

챌린지 전 단계는 연구 장소에 도달한 날 (제-1일)에서 챌린지 날 (제35일)까지이다. 형광 초점 중화 (FFN) 시험을 사용한 PRRSV 혈청 항체 결정을 위해 혈액 샘플을 제0일, 제14일, 제28일 및 제35일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제0일 및 제35일에 수집하였다. 바이러스 로드를 평가하기 위한 비강 스왑은 제0일 및 제35일에 수집하였다. 체중 측정 (lb)은 제0일 및 제35일에 챌린지 전에 행하였다.

제35일에, 3 mL 비-루어 록(luer lock) 시린지를 사용하여 2 mL 용량을 비강내로, 비공당 대략 1 mL를 전달하였다. 챌린지 후 단계는 제35일부터 제49일까지였다. 모든 돼지를 제35일-제49일 동안 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. PRRSV 혈청 항체 결정 (FFN)을 위한 혈액 샘플을 제42일 및 제49일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 바이러스 로드를 평가하기 위한 비강 스왑은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 체중 측정치는 제49일에 부검 시 수득하였다. 제49일에, 동물을 현장 표준 수술 절차에 따라 인도적으로 안락사시키고, 치료에 대해 맹검상태인 연구 조사자가 폐를 점수화하였다. 7개의 폐엽 각각을 PRRSV에 기인한 거시적인 특징적 병변에 대해 시각적으로 및 촉진 둘 다에 의해 검사하였다. 각각의 폐엽 내 병변/경화의 양을 엽의 0 내지 100% 실제로서 점수화하였다. 각각의 엽에 대한 점수를 칭량 공식에 입력하여 병변을 갖는 폐의 백분율을 계산하였다.

PRRSV에 대해 혈청-음성이고 양호한 건강상태인 것으로 평가된, 대략 3주령의 96마리의 이유된 교배육종 미분만돼지 및 거세돼지를 본 연구에 사용하였다. 연구 장소에 도달했을 때, 선택된 연구 동물을 무작위로 치료군 (T01-T09) 및 연구 우리로 배정하였다. 도달했을 때 하기 포함 기준을 충족시키는 모든 후보 동물을 연구에 포함시켰고, 기준을 충족시키지 못하는 것은 제외하였다: 1) 제0일에 혈청 중화 시험 (FFN)에 의할 때 PRRSV에 대해 혈청음성; 및 2) 제0일에 수행된 신체 검사에 기초하여 양호한 건강상태인 것으로 임상 평가된 동물.

연구 장소에 도달한 후, 돼지를 5개의 BSL-2 환경-제어된 봉쇄 룸에 치료군별로 수용하였다. 각각의 봉쇄 룸은 우리당 5마리의 돼지를 둘 수 있는 5개의 우리를 가졌다. 각각의 백신접종 룸 내의, 2개의 치료군을 플라스틱 울타리 벽으로 분리하였고, 군은 동일한 공기공간을 공유하지 않았다. 룸 내의 백신접종 군을 분리한 2개의 구역 사이에는 방역을 철저하게 유지시켰다. 돼지에게 생산에 적절한, 표준 돼지 사육 사료 (NRC, 2012)를 자유롭게 공급하였다. 돼지는 깨끗한 음용수에 자유롭게 접근하였다.

전반적 건강 관찰은 연구 장소에 도달한 시간부터 챌린지 전날까지 (제-1일에서 제34일) 1일 1회 수행하였다. 모든 돼지를 제35일-제49일에 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 점수화 시스템에 규정된 바와 같이 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다.

제35일 전에 임상적으로 유의한 병행 질환이 발생한 동물은 연구에서 제거하였다. 제외 전에 돼지에서 수집된 임의의 데이터는 데이터 분석에 포함시키지 않았다. 제35일에 챌린지 후, 사망한 채로 발견되거나 죽음에 임하여 희생시킨 임의의 돼지를 부검하여 가능한 경우에 사망 원인을 결정하였다. 에스. 수이스(S. suis)에 기인한 사망 및 동일한 우리 (T08)에서 확인된 질병으로 인해, 엑세데(EXCEDE)® 항생제 (조에티스 애니멀 헬스(Zoetis Animal Health))를 필요에 따라 개별 연구 동물에게, 및 제30일에 모든 동물에게 투여하였다.

모든 후보 PRRSV 균주를 MARC-145 세포 상에서 83회 계대배양하였다. 8종의 백신 각각에 대한 역가를 결정하였고, 이는 표 I에 제시된 바와 같다. USDA 9 C.F.R. 요건에 따른 멸균 시험을 네브래스카주 링컨 소재의 벤치마크 바이오랩스(Benchmark BioLabs)에서 성공적으로 완료하였다. 백신은 제약상 허용되는 부형제, 즉, 생리 염수 중에 PRRSV를 포함하였다.

사용 직전에, PRRSV NADC-20 챌린지 균주의 3개의 1 mL 스톡 바이알을 실온에서 해동시키고, 스톡 3 mL를 멸균 용기 내의 미디어테크, 인크.(Mediatech, Inc.)로부터의 얼스 염 및 L-글루타민을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) 이글 297 mL에 첨가하였다. 접종물 (바이러스 스톡 및 배지로 이루어짐)을 수동 혼합하고, 동물에게의 투여 동안 습윤 얼음 상에 유지시켰다. 챌린지 전에, 역가 결정을 위해 진단 실험실에 제출하기 위한 멸균 용기 내에 5 mL의 챌린지 접종물을 직접 분취하였다. 역가 결과는 10^2.75 TCID₅₀/mL였다.

동물은 실험 유닛이다. 군 사이의 차이를 양측 검정, 알파 = 0.05를 사용하여 평가하였다.

병변이 있는 총 폐의 백분율을 하기 공식에 따라 계산하였다:

병변이 있는 총 폐의 백분율 = {(0.10 x 좌측 정단) + (0.10 x 좌측 심장) + (0.25 x 좌측 횡경막) + (0.10 x 우측 정단) + (0.10 x 우측 심장) + (0.25 x 우측 횡경막) + (0.10 x 중간)}.

각각의 위약/백신접종 쌍에 대해 완화 분율 및 연관 95% 신뢰 구간을 계산하여 (MF; CI; 노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트(SAS Institute)의 SAS® 소프트웨어의 FREQ 절차), 총 폐 병변의 백분율에 대한 백신접종의 영향을 평가하였다. 또한, 병변이 있는 총 폐의 백분율을 추가의 분석 전에 아크사인 제곱근을 사용하여 변환시켰다. 변환된 데이터를 유일한 인자로서 고정된 치료 효과를 포함하는 혼합 선형 모델에 의해 분석하였다 (SAS® 소프트웨어의 믹스드(MIXED) 절차). 치료의 효과가 통계적으로 유의하면, 선형 대조 및 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 위약 및 백신접종된 군 사이의 쌍별 비교를 행하였다. 백신접종된 돼지가 대조군과 비교 시 폐 병변 점수에서 유의한 감소를 나타낼 경우, 백신은 시험 대상이 된다.

반복 측정에 적절한 방법을 사용하여 정규 분포의 가정 하에 바이러스혈증 값에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다 (노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트의 SAS® 소프트웨어의 믹스드 절차). 분석 전 데이터를 변환하여 나머지를 안정화하였다. 통계 모델은 고정 효과로서 치료, 시간, 및 시간별 치료 상호작용을 포함하였다. 시간별 치료 상호작용이 유의하면, 그러한 시간 내 백신 치료의 효과를 평가하였다. 시간 내 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 치료의 주요 효과를 평가하였다. 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 최소 제곱 평균, 표준 오차, 평균의 95% 신뢰 구간, 및 범위를 적절하게 나타내었다.

연속 또는 이항 데이터의 반복 측정에 적절한 방법을 사용하여 정규/이항 분포의 가정 하에 혈청 항체 및 비강 스왑 값에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다 (노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트의 SAS® 소프트웨어의 믹스드 또는 글림믹스(GLIMMIX) 절차). 분석 전 데이터를 변환하여 나머지를 안정화하였다. 통계 모델은 고정 효과로서 치료, 시간, 및 시간별 치료 상호작용을 포함하였다. 시간별 치료 상호작용이 유의하면, 시간 내 치료의 효과를 평가하였다. 시간 내 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 치료의 주요 효과를 평가하였다. 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 최소 제곱 평균, 표준 오차, 평균의 95% 신뢰 구간, 및 범위를 적절하게 나타내었다.

체중 (제35일 및 제49일), 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수 (제35일-제49일)를 반복 측정에 적절한 ANCOVA를 사용하여 통계적으로 분석하였다 (믹스드 절차). 적절한 경우에, 제0일 값을 공변량으로서 포함시켰다. 치료군, 시간, 및 시간별 군 상호작용을 모델에 고정 효과로서 포함시켰다. 상호작용항이 유의하면, 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 각각의 백신접종 군을 대조군과 비교하여 시간 내 군 효과를 평가하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 군의 주요 효과를 평가하고, 유의하면, 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 각각의 백신접종 군을 대조군과 비교하여 군 효과를 평가하였다. 연구 동안 오직 1건의 사망만이 존재하여 사망률은 평가하지 않았다.

대조군의 평균 퍼센트 폐 침범은 37.9% (표 2)였고, 이는 유형-2 균주 NADC-20을 사용하여 이러한 PRRSV 챌린지 모델에 대해 예상된 병리상태 (범위 30 내지 50%, L. Kesl of Veterinary Resources, Inc., personal communication)와 일치하였다. PRRS 바이러스 챌린지는 백신 균주 후보를 평가하는데 충분한 것으로 결론내려졌다.

평균 폐 병변 점수를 표 2에 나타낸다. PRRSV EU-유사 (즉 유형 1 PRRSV) 균주 SD 03-15를 함유하는 백신을 제외하고, 모든 실험적 백신은 대조군과 비교하여 폐 병변을 감소시켰다 (P<0.05). 주목할 것으로, 균주 SD 95-10, SD 11-21 및 ND 99-14는 높은 정도의 보호를 유도하여 매우 낮은 폐 침범을 발생시켰다 (각각 2.7%, 1.0% 및 1.6%). 균주 SD 04-89 및 SD 02-10이 허용되는 한편, 균주 SD 95-47 및 MN 05-68도 또한 잘 수행하였다. 각각의 백신 대 대조군의 완화 분율을 표 3에 제시한다. 이들 결과는 약독화된 PRRSV 균주 SD 95-10 (T04), SD 11-21 (T05) 및 ND 99-14 (T08)로 백신접종된 돼지가 대조군의 돼지보다 덜 중증인 폐 병변을 가질 확률이 적어도 90%임을 나타낸다.

표 2. 평균 폐 병변 점수.

¹비변환된 평균.

²역 변환된 평균.

*T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

표 3. 폐 병변 점수.

¹완화 분율은 백신접종 폐 병변 (T02-T09)이 비-백신접종 폐 병변 (T01)보다 덜 중증일 확률의 상대적 증가를 의미함.

바이러스 배출의 지표로서, 비즙으로부터 qtRT-PCR에 의해 열거된 PRRSV의 기하 평균을 표 4에 나타낸다. 균주 SD 02-10으로 백신접종된 돼지를 제외하고, 제35일에 모든 백신접종된 군의 비강 스왑에서 백신 바이러스가 검출되었다. 균주 SD 03-15, SD 95-10 및 SD 95-47로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지보다 통계적으로 더 많은 (P<0.05) 게놈 카피/mL를 가졌고, 평균 값은 각각 277, 337 및 7 게놈 카피/mL였다. 제35일에 챌린지 시, 모든 군은 제38일, 제42일, 제45일 및 제49일 (각각 챌린지 후 3, 7, 10 및 14일 (DPC))에 일부 바이러스를 배출하였다. 균주 SD 95-10, SD 95-47 및 ND 99-14로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 모든 시점에서 대조군보다 낮은 (P<0.05) 수준의 배출을 가졌다. 10 및 14 DPC에, 균주 SD 04-89 및 SD 03-15를 제외한 모든 백신 균주는 대조군과 비교하여 배출에서 감소 (P<0.05)를 유도하였다.

표 4. 비강 스왑 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.

*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

혈청으로부터 qtRT-PCR에 의해 열거된 PRRSV의 기하 평균 (게놈 카피/mL)을 표 5에 나타낸다. 모든 백신접종된 군은 제35일의 백신접종에 기인한 일부 측정가능한 바이러스혈증을 가졌지만, SD 04-89 및 SD 11-21로 백신접종된 군에서의 수준은 음성인 대조군과 통계적으로 상이하지 않았다 (P >0.05). 제35일의 챌린지 시, 모든 군은 3, 7, 10 및 14 DPC에 바이러스혈증성이었다. 균주 SD 95-10 및 ND 99-14로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 모든 시점에서 대조군보다 낮은 (P < 0.05) 수준의 바이러스혈증을 가졌다. 10 및 14 DPC에, 균주 SD 04-89 및 SD 03-15를 제외한 모든 백신 균주는 대조군과 비교하여 바이러스혈증에서 감소 (P < 0.05)를 유도하였다.

표 5. 혈청 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.

*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

표 6에 제시된 바와 같이, 기하 평균 형광 초점 중화 (FFN) 역가를 측정하여 혈청전환을 결정하였다. 대조군 동물은 제35일 (챌린지일)까지 혈청음성으로 유지되었고, 제42일 (7 DPC)에 혈청전환되기 시작하여, 제49일 (14 DPC)에 혈청전환되었다. 모든 백신접종된 군은 SD 03-15를 제외하고 백신접종 후 제14일에 혈청전환되었다. 모든 백신접종 군에서 기하 평균 역가는 제28일, 제35일 및 제42일에 대조군의 것을 초과하였고 (P<0.05), 이는 제49일의 대조군의 것과 유사하거나 또는 그 미만이었다. 백신접종 군에서의 최고 FFN 역가 반응은 제35일 및 제42일에 일어났다. 균주 SD 95-10, SD 11-21, SD 95-47 및 ND 99-14는 가장 강건한 혈청학적 반응을 도출하는 것으로 보였다.

표 6. 형광 초점 중화 (FFN) 역가의 기하 평균.

*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

최소 제곱 평균 체중을 표 7에 포함시켰다. 제0일 체중을 분석에서 공변량으로서 사용하였다. 챌린지일 (제35일)에, 각각 균주 SD 03-15, SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68로 백신접종한 4개의 군은 대조군의 것보다 낮은 평균 체중을 가졌다 (P<0.05). 모든 다른 군은 대조군의 것과 유사한 평균 체중을 가졌다 (P>0.05). 부검일 (제49일), 14 DPC에, 균주 SD 11-21, SD 95-47 및 ND 99-14로 백신접종된 3개의 군은 대조군의 것을 초과하는 평균 체중을 가졌다 (P<0.05). 모든 다른 군의 체중은 대조군의 것과 유사하였다 (P>0.05).

표 7. 최소 제곱 평균 체중 (lb).

*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

합산한 임상 점수 (호흡 + 우울증 + 신체 상태)의 평균을 각각의 동물에 대해 수집하여 각각의 군별로 평균하였다. 임상 징후는 챌린지 후 최대 7일 동안 임의의 군에서 분명하지 않았다. 제42일 및 제43일에, 임상 징후가 백신 군의 일부에서 명백하였지만 그의 평균 점수는 대조군의 것과 상이하지 않았다 (P < 0.05). 제44일에서 제49일까지, 모든 백신 군은, 제44일에 균주 SD 04-89 및 SD 02-10으로 백신접종된 군을 제외하고, 대조군보다 낮은 합산 점수를 가졌다 (P < 0.05).

결론적으로, 8종의 약독화된 PRRSV 백신 균주가 바이러스 챌린지 모델에서 성공적으로 평가되었다. EU-유사 균주 SD 03-15를 제외하고, 모든 균주는 병독성 NADC-20 유형-2 PRRSV에 의한 챌린지에 대해 일부 보호를 도출하였다. 4종의 균주, SD 11-21, SD 95-10, SD 95-47, 및 ND 99-14는, 폐 병변 및 바이러스혈증의 보다 높은 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 최대의 보호를 제공하였다.

실시예 3

본 연구의 목적은 2종의 별개의 병독성 PRRSV 유형-2 균주에 의한 챌린지 후 성장 중인 돼지에서의 4종의 실험적 PRRSV 백신의 교차-보호 효능을 평가하기 위한 것이다. 효능은 폐 병변 및 바이러스혈증의 정도에 의해 평가하였다. 연구는 아이오와주 캠브리지 소재의 베테리너리 리소시즈, 인크.(Veterinary Resources, Inc.) (VRI)의 BSL-2 시설에서 수행하였다. 연구 설계를 표 8에 제공한다.

표 8. 연구 설계.

¹ 형광 초점 단위 (FFU).

² 위약 대조군 동물에는 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 제공하였다.

건강 관찰을 수행하거나 샘플을 수집하는 연구 인력은 치료 실체에 대해, 뿐만 아니라 치료군으로의 돼지의 배정에 대해 맹검상태에 있다. 바이러스 중화 시험 (FFN)에 의해 PRRSV에 대해 혈청음성이고 양호한 건강상태인 것으로 평가된, 대략 3주령의 100마리의 이유된 교배육종 미분만돼지 및 거세돼지를 본 연구에 사용하였다. 돼지는 위스콘신주 버링턴 소재의 윌슨 프레리 뷰 농장에서 공급되었다. 제-1일에, 돼지를 치료 및 우리로 할당하고, 3개의 BSL-2 봉쇄 룸의 우리 내에 치료군별로 수용하였다. 각각의 룸 내의 4개의 백신접종 군을 빈 우리 또는 좁은 통로 및 단단한 우리 파티션으로 분리하여 다른 우리와의 임의의 직접 접촉 및 폐기물 오염을 방지하였다. 돼지에게 표준 상업용 약물첨가 (CTC/DENAGARD® 항생제) 출발 식이 (NRC, 2012)를 자유롭게 공급하였다. 돼지는 깨끗한 음용수에 자유롭게 접근하였다.

전반적 건강 관찰은 연구 장소에 도달한 시간부터 챌린지 전날까지 (제-3일에서 제34일) 1일 1회 수행하였다. 모든 돼지를 제35일-제49일에 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다.

이유 및 VRI로의 운송 전, 각각의 돼지를 단일 용량의 바이탈(VITAL) E-500 (비타민 E), 단일 용량의 엑세데® 항생제 (세프티오푸르 결정질, 조에티스 애니멀 헬스)로 치료하고, 인겔백 썰코플렉스(INGELVAC CIRCOFLEX)® 백신 (베링거 잉겔하임 베트메디카(Boehringer Ingelheim Vetmedica))으로 백신접종하였다. 또한, 모든 돼지에게 제13일 또는 제14일에 단일 용량의 엑세데® 항생제를 투여하였다.

임상 질병 또는 손상의 징후를 나타내는 임의의 돼지는 연구에서 제거하였다. 진단 평가를 위해 관련 샘플을 아이오와 주립 대학교 수의학 진단 실험실 (VDL)에 제출하였다. 동물의 챌린지 후 연구에서 제거된 날짜, 이유, 및 배치를 기록하였다. 연구에서 제거된 돼지에 대해 수집된 데이터는 통계적 분석에서 제외하였다.

모든 후보 PRRSV 균주를 MARC-145 세포 상에서 83회 계대배양하였다. 4종의 백신 각각에 대한 역가를 결정하였다. USDA 9 CFR 요건에 따른 멸균 시험을 네브래스카주 링컨 소재의 벤치마크 바이오랩스에서 성공적으로 완료하였다. 백신을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

연구에 등록된 100마리의 돼지 각각을 제0일에 백신접종하였다. 돼지에게 그의 배정된 치료를 0.5 mL 근육내 용량으로서 목의 우측으로 주사하였다. 주사 후 1시간 내에, 연구 조사자는 각각의 돼지를 임의의 유해 사건에 대해 검사하였다.

백신접종 후 단계는 제1일에서 제35일까지이다. 형광 초점 중화 (FFN) 시험을 사용한 PRRSV 혈청 항체 결정을 위해 혈액 샘플을 제-1일, 제14일, 제28일 및 제35일에 수집하였다. FFN 검정을 위해, 혈청의 2배 희석물 (1:4 내지 1:512)을 각각 동등 부피의, 100 초점 형성 단위 (FFU)의 시험 PRRSV 균주 (MN-184)를 함유하는 배양 배지와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 96-웰 조직 배양 플레이트 내의 MARC-145 세포의 전면생장 배양물에 첨가하였다. 약 1일 후, 플레이트를 물 중 80% (v/v) 아세톤 중에 고정시키고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합된 (FITC) 항-N-단백질 모노클로날 항체 SDOW17과의 인큐베이션에 의해 감염된 세포 (초점)를 검출하였다. 혈청 대조군과 비교하여 초점 형성을 약 90% 감소시키는 최고 희석의 역수로서 혈청 중화 FFN 역가를 표현하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위해 혈액 샘플을 제-1일, 제14일 및 제35일에 수집하였다. 바이러스 배출을 평가하기 위한 비강 스왑은 제-1일, 제14일 및 제35일에 수집하였다. 체중 측정치 (lb)는 제-1일 및 제35일 챌린지 전에 인증된 추로 보정된 저울눈을 사용하여 수득하였다.

MN-184 PRRSV 챌린지 균주 (아이오와 주립 대학교 VDL로부터 수득함)는 남부 미네소타에서 중증 생식 질환 및 암퇘지 사망을 겪은 돼지 무리로부터의 2001마리로부터 단리하였다. KS-11 PRRSV 챌린지 균주 (캔자스 주립 대학교 VDL로부터 수득함)는 북동부 캔자스에서 중증 생식 질환을 경험한 돼지 무리로부터의 2011마리로부터 단리하였다. 제35일에, 챌린지 직전에 MN-184 및 KS-11의 동결 분취물을 해동시켜 챌린지 물질을 제조하였다. 챌린지 물질은 어떠한 희석도 필요없는 즉시 사용가능한 형태이다. 각각의 접종물의 샘플 (MN-184 및 KS-11)을 역가 결정을 위해 ISUVDL에 제출하였다. MN-184 및 KS-11 균주의 경우 제0일 역가는 각각 4.2 x 10⁵ 및 6.7 x 10³ TCID₅₀/ml인 것으로 결정되었다. 3 mL 비-루어 록 시린지를 사용하여 2 mL 용량을 비강내로, 비공당 대략 1 mL를 전달하였다.

챌린지 후 단계는 제35일에서 제49일까지이다. 제35일에서 제49일에 모든 돼지를 우울증, 신체 상태, 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. 또한 이와 동일한 기간 동안 보정된 온도계를 사용하여 직장 온도 (℉)를 기록하였다. PRRSV 중화 항체 결정 (FFN)을 위한 혈액 샘플을 제42일 및 제49일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 바이러스 배출을 평가하기 위한 비강 스왑은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 체중 측정치 (lb)는 제49일에 부검 시 인증된 추로 보정된 저울눈을 사용하여 수득하였다. 제49일에, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 치료에 대해 맹검상태인 연구 조사자가 폐를 절제하여 점수화하였다. 7개의 폐엽 각각을 PRRSV에 기인한 거시적인 특징적 병변에 대해 시각적으로 및 촉진 둘 다에 의해 검사하였다. 각각의 폐엽 내 병변/경화의 양을 엽의 0 내지 100% 실제 값으로서 점수화하였다. 각각의 엽에 대한 점수를 칭량 공식에 입력하여 병변을 갖는 폐의 백분율을 계산하였다.

병변을 갖는 총 폐의 백분율을 실시예 2에 주어진 공식 및 절차에 따라 계산하였다.

직장 온도, 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수 (제35일에서 제49일)를 반복 측정에 적절한 방법 (믹스드 절차)을 사용하여 통계적으로 분석하였다. 임상 점수를 각각의 동물에 대해 1일 내 합산하였다. 합산 점수를 개별 점수에 대해 상기 기재된 바와 같이 통계적으로 분석하였다.

평균 매일 체중 증가 (ADWG)를 하기 기간 동안 결정하였다: 제-1일 내지 제35일; 제-1일 내지 제49일; 및 제35일 내지 제49일. 각각의 기간 동안의 평균 매일 체중 증가 (ADWG)는 ANOVA (믹스드 절차)를 사용하여 분석하였다. 치료를 고정 효과로서 모델에 포함시켰고, 차단은 임의 효과로서 포함시켰다. 치료의 주요 효과가 유의한 경우, 각각의 백신접종 군을 대조군과 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 비교하여 치료 효과를 평가하였다.

1마리의 돼지 (T09)가 의심되는 에스. 수이스 감염으로 인해 제28일에 사망하였다. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)와 연관된 기관지폐렴으로 인해, 1마리는 T03으로부터의 것이고 또 다른 것은 T09로부터의 것인 2마리의 돼지를 연구에서 제거하였다. 어떠한 유해 사건도 백신에서 기인하지 않았다.

MN-184로 챌린지된 대조군에서 폐 병변의 평균 퍼센트는 52.4%였고, 이는 이러한 PRRSV 챌린지 균주에 대해 예상된 병리상태와 일치하였다. KS-11로 챌린지된 대조군에서 폐 병변의 평균 퍼센트는 22.5%였다. 이러한 PRRSV 균주는 이전에 챌린지 물질로서 사용된 바 없고, 따라서 예상되는 폐 병리상태의 정도는 미지였다. 본 연구에서 달성된 수준은 백신 후보를 평가하는데 충분한 것으로 간주되었다.

PRRSV와 연관된 질환의 방지를 위해, 챌린지 후 폐 병변 및 바이러스혈증은 주요 결과 변수였다. 백신접종된 군의 평균 폐 병변 점수 및 바이러스혈증 수준이 대조군의 것보다 유의하게 낮으면 (P < 0.05) 효과적인 것으로 간주되었다.

평균 폐 병변 점수 (역-변환된 평균)를 표 9에 제시한다. MN-184로 챌린지된 경우에, 모든 백신접종된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 낮은 (P < 0.05) 폐 병변을 가졌다. KS-11 균주로 챌린지되고 SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 낮은 (P < 0.05) 폐 병변을 가졌다. MN 05-68 균주로 백신접종되고 KS-11 균주로 챌린지된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유사한 (P > 0.05) 폐 병변을 가졌다.

비-변환된 데이터로부터 완화 분율 및 연관 95% 신뢰 구간을 계산하여 폐 병변 점수에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다. 표 10에 제시된 바와 같이, 완화 분율은 -0.06 내지 0.98 범위였다. 95% 신뢰 구간은 MN 05-68 균주로 백신접종되고 KS-11 균주로 챌린지된 돼지의 경우 0을 포함하였고, 이는 폐 병변 점수에 대해 백신접종의 효과가 없다는 것을 나타낸다. 모든 다른 백신은, 챌린지 균주와 관계 없이, 폐 병변 점수를 감소시키는데 있어서 백신접종의 효과를 나타내었다.

표 9. 평균 폐 점수 - 폐 침범 퍼센트.

¹ 비변환된 평균.

² 역 변환된 평균.

* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

표 10. 폐 병변 점수.

¹완화 분율은 백신접종 (T02-T05, T07-T10) 폐 병변이 비-백신접종 (T01, T06) 폐 병변보다 덜 중증일 확률의 상대적 증가를 의미함.

비강 배출 데이터의 분석 결과를 표 11에 요약한다. 백신접종된 군에 대한 시간별 치료 상호작용은 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 백신 바이러스 배출은 제14일에 모든 백신 군에서 검출되었다. 제35일에, MN-184 챌린지 룸에서 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지 만이 대조군 돼지보다 더 높은 수준으로 (P < 0.05) 백신 바이러스를 배출하였다.

MN-184 균주에 의한 챌린지 시, ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 각각의 챌린지 후 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 대조군 돼지와 비교하여 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌다. SD 95-10 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제42일, 제45일, 및 제49일에 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 제38일에 대조군 돼지와 비교하여 더 높은 배출을 가졌지만, 제42일, 제45일, 및 제49일에는 더 낮은 (P < 0.05) 배출을 가졌다.

KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제45일에 감소된 (P < 0.05) 비강 배출을 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제49일에 유의하게 더 낮은 비강 배출을 입증하였다. MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일에 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌지만, 제42일, 제45일, 및 제49일에는 2개의 치료군이 상이하지 않았다 (P > 0.05).

표 11. 비강 스왑 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.

* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

바이러스혈증의 분석 결과를 표 12에 요약한다. 시간별 치료 상호작용은 백신접종된 군의 경우 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 예상된 바와 같이, 모든 백신접종된 군은 백신접종 후 제14일 및 제35일에, 백신 바이러스의 존재로 인해 그의 각각의 대조군과 비교하여 더 높은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다.

표 12. 혈청 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.

* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 모든 백신접종된 군은 챌린지 후 각각의 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 대조군과 비교하여 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다. KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 각각의 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다. MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제49일에 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌고, SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 및 제49일에 감소된 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다.

혈청학의 분석 결과를 표 13에 요약한다. 시간별 치료 상호작용은 백신접종된 군의 경우 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 모든 돼지는 백신접종 전 제-1일에 혈청음성이었다. 바이러스 중화 항체가 SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지에서, 챌린지 균주와 관계 없이, 제28일부터 검출되기 시작하였고, 연구 지속기간 내내 계속 존재하였다. 바이러스 중화 항체는 SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지에서 대조군 돼지와 비교하여 제28일, 제35일, 제42일, 및 제49일에 더 높았다 (P < 0.05).

표 13. 형광 초점 중화 (FFN) 역가의 기하 평균.

* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 바이러스 중화 항체는 SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지에서 제42일까지 나타나지 않았고, 제49일까지 그러하였다. 바이러스 중화 항체는 둘 다의 시점에 대조군 돼지보다 더 높았다 (P < 0.05). MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제49일까지 검출가능한 바이러스 중화 항체 수준을 갖지 않았지만, 수준은 대조군의 돼지의 것보다 더 높았다 (P < 0.05).

KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 11-21 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제49일까지 검출가능한 바이러스 중화 항체 수준을 갖지 않았지만, 둘 다의 백신 균주의 경우 수준은 대조군 돼지와 비교하여 더 높았다 (P < 0.05).

연구 지속기간 내내 대조군 중 어느 것에서도 바이러스 중화 항체는 검출되지 않았다. 바이러스 중화 항체는 종종 노출후 28-35일까지는 검출되지 않기 때문에, 이는 예상외의 것은 아니었다.

직장 온도 및 합산 임상 점수 (호흡 + 우울증 + 신체 상태)의 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 고도로 유의한 (P < 0.0005) 시간별 치료 상호작용이 둘 다의 챌린지 군에 대해 관찰되었다.

MN-184 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교하여 챌린지 약 6일 후 (제41일)에 시작된, 일관되게 더 낮은 (P < 0.05) 체온 및 임상 점수를 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교하여 챌린지 약 8일 후 (제43일)에 시작된, 일관되게 더 낮은 (P < 0.05) 체온 및 더 적은 (P < 0.05) 임상 징후를 가졌다. 체온의 유의한 감소 (P < 0.05)는 SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지에서 챌린지 후 2일 일찍 주목되었다.

KS-11 균주에 의한 챌린지 시, 4종의 백신 균주 중 어느 하나로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 챌린지 9일 후 (제44일)에 시작된, 임상 점수에서 유의한 감소 (P < 0.05)를 가졌고, 연구 완료 내내 계속해서 더 적은 (P < 0.05) 임상 징후를 가졌다. 체온은 SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 군에서 챌린지 약 6일 후에 감소되기 시작하였다 (P < 0.05). MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지만이 대조군 돼지와 비교할 경우 제37일 및 제46일에 더 낮은 (P < 0.05) 체온을 가졌다.

체온 증가 데이터의 분석을 표 14에 제시하며, 기간별 체중 증가의 최소 제곱 평균으로서 제공한다. 제35일-제49일의 챌린지 후 기간 동안 체중 증가에 대해 백신 효과가 존재하였다. 이는 제-1일에서 제49일의 전체 치료 기간 동안 백신 효과를 발생시켰다. 챌린지 전 기간 (제-1일에서 제35일) 동안은 군 사이에 체중 증가 차이가 존재하지 않았다 (P > 0.05). 챌린지 후 기간 (제35일-제49일) 동안, 모든 백신접종된 군은, 백신 균주에 관계 없이, MN-184 및 KS-11 챌린지 둘 다의 경우에 대조군 돼지와 비교하여 개선된 (P < 0.05) ADWG를 가졌다. SD 95-10, ND 99-14, 및 MN 05-68 균주에 의한 백신접종은 MN-184 챌린지 룸에서 대조군 돼지와 비교하여 전체 ADWG (제-1일에서 제49일)를 개선시켰다 (P < 0.05). 전체 ADWG는 SD 11-21로 백신접종되고 MN-184로 챌린지된 돼지에서, 대조군 돼지와 비교하여 상이하지 않았다 (P > 0.05). 모든 균주에 의한 백신접종은 KS-11 챌린지 룸에서 대조군 돼지와 비교하여 전체 ADWG (제-1일에서 제49일)를 개선시켰다 (P < 0.05).

표 14. 최소 제곱 평균 체중 증가 (lb).

* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.

결론적으로, 모든 백신접종된 군은 백신접종 14 및 35일 후에 바이러스혈증성이었고, 백신 바이러스를 배출하였다.

MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 모든 백신은 챌린지 후 기간 동안 폐 병변, 바이러스혈증, 비강 배출, 임상 징후 및 직장 온도를 감소시켰다 (P < 0.05). 또한, 모든 백신은 챌린지 후 기간 동안 ADWG를 개선시켰다 (P < 0.05).

KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 기간 동안 감소된 (P < 0.05) 폐 병변, 바이러스혈증, 비강 배출, 임상 징후 및 직장 온도를 가졌다. 또한, 모든 백신 균주는 챌린지 후 기간 동안 ADWG를 유의하게 개선시켰다 (P < 0.05).

4종의 백신 균주 중 3종은 둘 다의 PRRSV 균주에 의한 챌린지 후 폐 병변 및 바이러스혈증을 감소시키는데 효과적이었다. SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주는 둘 다의 챌린지 균주에 대해 효과적이었다. MN 05-68 균주는 MN-184 챌린지 시 폐 병변을 감소시키는 데에만 효과적이었고, KS-11 균주로 챌린지된 돼지에서는 폐 병변을 감소시키지 않았다.

실시예 4

본 연구의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 균주 ND 99-14의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 제조하기 위한 것이다. 이러한 종자는 PRRSV 백신 개발에 사용될 것이다.

PRRSV ND 99-14 균주를 MARC-145 세포에서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 초기 특징화 및 서열분석 전에, 2 라운드의 플라크 정제 및 1 라운드의 수크로스 구배 정제를 포함하여 83회 (P83) 계대배양하여 변형시켰다. ND 99-14 균주는 5% 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 및 50 μg 겐타미신/mL (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 보충된 성장 배지 OPTI-MEM® I (라이프 테크놀로지스) 중의 MARC-145 세포에서 12회 (P95) 계대배양하여 추가로 약독화하고, 겐타미신 부재 하의 2% FBS가 보충된 동일한 성장 배지에서 추가의 5회 계대배양을 수행하였다. PRRSV ND 99-14의 100번째 계대배양물 (P100)을 프리-마스터 종자 바이러스 (Pre-MSV)로서 사용하였다.

하기 절차를 사용하여 PRRSV MSV ND 99-14의 역가를 결정하였다. MARC-145 세포를 96-웰 플레이트에 성장 배지 (5% FBS 및 50 μg/mL 겐타마이신이 보충된 OPTI-MEM® I 배지) 100 μL 중 0.75-1.5x10⁴개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포가 95% 전면생장을 초과할 때까지 48-72시간 동안 37±2℃ 및 5±1% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션하였다. 적정일에, 96-웰 플레이트로부터 모든 배지를 제거하고 신선한 성장 배지 100 μL로 대체하였다.

희석제 (OPTI-MEM® I 배지, 50 μg/mL 겐타마이신)를 사용하여 MSV의 10-배 연속 희석물을 제조하고, 이를 희석제 단독으로 이루어진 음성 대조군과 함께 상기와 같이 제조된 플레이트 상의 상응하는 웰로 옮겼다. 적정 플레이트를 5±1% CO₂ 인큐베이터를 사용하여 37±2℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, 각각의 플레이트를 도립 현미경을 사용하여 각각의 샘플 웰에서의 바이러스-유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재에 대해 관찰하였다. 리드-뮌흐 방법을 사용하여 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀)을 계산하고, 역가를 log₁₀ TCID₅₀/mL로 기록하였다. PRRSV MSV ND 99-14의 평균 역가는 3.50 log₁₀ TCID₅₀/mL였다. MSV 제조 과정에 걸쳐 역가에서 구별가능한 차이는 존재하지 않았다.

PRRS ND 99-14 MLV 균주를 "마스터 종자 바이러스 (MSV)"로 표시하여, 37 C.F.R. §1.14 및 35 U.S.C. §122 하에 자격이 부여된 특허상표청장에 의해 결정된 자에게 본 특허 출원의 계류 동안 배양물에 대한 접근이 이용가능할 것임을 보장하는 조건 하에 기탁하였다. 기탁물은 본 출원의 대응물 또는 그의 자손이 출원된 국가에서 해외 특허법이 요구하는 바에 따라 이용가능하다. 그러나, 기탁의 이용가능성이 정부 조치에 의해 승인된 특허권의 적용배제로 대상 발명을 실시할 허가에 해당하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 대상 배양 기탁물은 보관될 것이고 공중에게 이용가능해질 것이며, 즉 기탁물 샘플의 제공에 대한 가장 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간 동안, 및 임의의 경우에는 기탁일 후 적어도 30년의 기간 동안 또는 기탁된 배양물의 개시를 허여할 수 있는 임의의 특허의 시행 기간 동안 이것이 생존하고 오염되지 않게 유지하는데 필요한 모든 관리를 받으면서 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태로 인해 요청 시 기탁기관이 샘플을 제공할 수 없으면 기탁물을 교체할 의무를 인정한다. 공중에 대한 대상 배양 기탁물의 이용가능성에 대한 모든 제한은 이를 개시하는 특허의 승인 시 취소불가능하게 제거될 것이다. PRRSV MSV ND 99-14의 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에 2015년 12월 2일에 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치하는 아메리칸 타입 컬처 래버러토리(American Type Culture Laboratory) 특허 기탁소의 영구 수집물이 되었고, 이때 저장소에서 수탁 번호 ATCC PTA-122675가 배정되었다.

실시예 5

본 연구의 목적은 유전자 동일성을 확립하고, 컨센서스 서열을 수득하고, 둘 다 실시예 4에 기재된 PRRSV 균주 ND 99-14 계대배양 84 및 계대배양 100 제제 내에 존재하는 게놈 변이체 (하위집단)를 평가하기 위해 차세대 서열분석을 사용하는 것이다.

대규모 병렬 서열분석 (MP-Sep) 시스템을 사용하는 서열 특징화는 바이러스 제제로부터의 핵산 추출, cDNA 라이브러리 합성 및 정량화, PCR에 의한 클론 증폭 및 DNA 라이브러리의 풍부화 및 로슈(Roche)/454 차세대 서열분석 플랫폼에 의한 라이브러리의 서열분석을 포함하는, 여러 단계로 구성된 표준 절차이다. 합성에 의한 서열분석은 cDNA 라이브러리 내 단편의 뉴클레오티드 순서를 동시에 결정하기 위해 사용된다. 각각의 데이터 세트를 참조 서열에 맵핑함으로써, 생성된 단편의 생물정보학 분석을 사용하여 게놈 확인 및 특징화를 수행하였다. 바이오릴라이언스(BioReliance)에 의한 본 분석에 사용된 참조 서열은 실시예 1에 개시된 전장 서열 PRRSV ND 99-14 계대배양 83 (P83) (서열식별번호: 4)으로 이루어졌다.

PRRSV ND 99-14 게놈의 서열분석은 P84 및 P100 샘플 둘 다에 대해 완전한 게놈 범위를 생성하였다. P84 및 P100에 대한 완전한 컨센서스 게놈은 각각 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11에서 찾아볼 수 있다. cDNA 컨센서스 서열을 또한 진뱅크에 기탁하였다. PRRS 균주 ND 99-14의 P84의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131567 (서열식별번호: 10)을 배정받았다. 서열식별번호: 10으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:

PRRS 균주 ND 99-14의 P100의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131569 (서열식별번호: 11)를 배정받았다. 서열식별번호: 11로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:

관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.

또한 변이체 확인을 수행하여 둘 다의 계대배양의 경우 바이러스 집단에서의 뉴클레오티드 변화의 수 및 빈도를 결정하였다. 표 15는 참조 서열과 비교하여 P84 및 P100에서 발견된 7개의 뉴클레오티드 변화를 보여준다. 전체 변이체 위치는, P100에는 존재하지 않는 P84에서의 2개의 뉴클레오티드 변화를 제외하고, 계대배양 사이에서 일치하였다. 또한, 각각의 변이체의 빈도는 계대배양 사이에 유사하였고, 상대적으로 낮은 빈도로 검출되어, 이는 ND 99-14의 P84 및 P100 둘 다에서 유사한 하위-집단이 발견되었음을 시사한다.

표 15. PRRSV ND 99-14 서열 변이체.

ND = 검출되지 않음.

실시예 6

본 연구의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 균주 SD 11-21의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 제조하기 위한 것이다. 이러한 종자는 PRRSV 백신 개발에 사용될 것이다.

PRRSV SD 11-21 균주를 MARC-145 세포에서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 초기 특징화 및 서열분석 전에, 2 라운드의 플라크 정제 및 1 라운드의 수크로스 구배 정제를 포함하여 83회 (P83) 계대배양하여 변형시켰다. SD 11-21 균주는 5% 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치) 및 50 μg 겐타미신/mL (라이프 테크놀로지스)가 보충된 성장 배지 Opti-MEM® I (라이프 테크놀로지스) 중의 MARC-145 세포에서 12회 (P95) 계대배양하여 추가로 약독화하고, 겐타미신 부재 하의 2% FBS가 보충된 동일한 성장 배지에서 추가의 5회 계대배양을 수행하였다. PRRSV SD 11-21의 100번째 계대배양물 (P100)을 프리-마스터 종자 바이러스 (Pre-MSV)를 제조하는데 사용하였다.

하기 절차를 사용하여 PRRSV MSV SD 11-21의 역가를 결정하였다. MARC-145 세포를 96-웰 플레이트에 성장 배지 (5% FBS 및 50 μg/mL 겐타마이신이 보충된 OPTI-MEM® I 배지) 100 μL 중 0.75-1.5x10⁴개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포가 95% 전면생장을 초과할 때까지 48-72시간 동안 37±2℃ 및 5±1% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션하였다. 적정일에, 96-웰 플레이트로부터 모든 배지를 제거하고 신선한 성장 배지 100 μL로 대체하였다.

희석제 (OPTI-MEM® I 배지, 50 μg/mL 겐타마이신)를 사용하여 MSV의 10-배 연속 희석물을 제조하고, 이를 희석제 단독으로 이루어진 음성 대조군과 함께 상기와 같이 제조된 플레이트 상의 상응하는 웰로 옮겼다. 적정 플레이트를 5±1% CO₂ 인큐베이터를 사용하여 37±2℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, 각각의 플레이트를 도립 현미경을 사용하여 각각의 샘플 웰에서의 바이러스-유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재에 대해 관찰하였다. 리드-뮌흐 방법을 사용하여 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀)을 계산하고, 역가를 log₁₀ TCID₅₀/mL로 기록하였다. PRRSV MSV SD 11-21의 평균 역가는 3.25 log₁₀ TCID₅₀/mL였다. MSV 제조 과정에 걸쳐 역가에서 구별가능한 차이는 존재하지 않았다.

PRRS SD 11-21 MLV 균주를 "마스터 종자 바이러스 (MSV)"로 표시하여, 37 C.F.R. §1.14 및 35 U.S.C. §122 하에 자격이 부여된 특허상표청장에 의해 결정된 자에게 본 특허 출원의 계류 동안 배양물에 대한 접근이 이용가능할 것임을 보장하는 조건 하에 기탁하였다. 기탁물은 본 출원의 대응물 또는 그의 자손이 출원된 국가에서 해외 특허법이 요구하는 바에 따라 이용가능하다. 그러나, 기탁의 이용가능성이 정부 조치에 의해 승인된 특허권의 적용배제로 대상 발명을 실시할 허가에 해당하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 대상 배양 기탁물은 보관될 것이고 공중에게 이용가능해질 것이며, 즉 기탁물 샘플의 제공에 대한 가장 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간 동안, 및 임의의 경우에는 기탁일 후 적어도 30년의 기간 동안 또는 기탁된 배양물의 개시를 허여할 수 있는 임의의 특허의 시행 기간 동안 이것이 생존하고 오염되지 않게 유지하는데 필요한 모든 관리를 받으면서 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태로 인해 요청 시 기탁기관이 샘플을 제공할 수 없으면 기탁물을 교체할 의무를 인정한다. 공중에 대한 대상 배양 기탁물의 이용가능성에 대한 모든 제한은 이를 개시하는 특허의 승인 시 취소불가능하게 제거될 것이다. PRRSV MSV SD 11-21의 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에 2015년 12월 2일에 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치하는 아메리칸 타입 컬처 래버러토리 특허 기탁소의 영구 수집물이 되었고, 이때 저장소에서 수탁 번호 ATCC PTA-122674가 배정되었다.

실시예 7

본 연구의 목적은 유전자 동일성을 확립하고, 컨센서스 서열을 수득하고, 둘 다 실시예 6에 기재된 PRRSV 균주 SD 11-21 계대배양 84 및 계대배양 100 제제 내에 존재하는 게놈 변이체 (하위집단)를 평가하기 위해 차세대 서열분석을 사용하는 것이다.

대규모 병렬 서열분석 (MP-Sep) 시스템을 사용하는 서열 특징화는 바이러스 제제로부터의 핵산 추출, cDNA 라이브러리 합성 및 정량화, PCR에 의한 클론 증폭 및 DNA 라이브러리의 풍부화 및 로슈/454 차세대 서열분석 플랫폼에 의한 라이브러리의 서열분석을 포함하는, 여러 단계로 구성된 표준 절차이다. 합성에 의한 서열분석은 cDNA 라이브러리 내 단편의 뉴클레오티드 순서를 동시에 결정하기 위해 사용된다. 각각의 데이터 세트를 참조 서열에 맵핑함으로써, 생성된 단편의 생물정보학 분석을 사용하여 게놈 확인 및 특징화를 수행하였다. 바이오릴라이언스에 의한 본 분석에 사용된 참조 서열은 실시예 1에 개시된 전장 서열 PRRSV SD 11-21 계대배양 83 (P83) (서열식별번호: 9)으로 이루어졌다.

PRRSV SD 11-21 게놈의 서열분석은 P84 및 P100 샘플 둘 다에 대해 완전한 게놈 범위를 생성하였다. P84 및 P100에 대한 완전한 컨센서스 게놈은 각각 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13에서 찾아볼 수 있다. cDNA 컨센서스 서열을 또한 진뱅크에 기탁하였다. PRRS 균주 SD 11-21의 P84의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131566 (서열식별번호: 12)을 배정받았다. 서열식별번호: 12로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:

PRRS 균주 SD 11-21의 P100의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131568 (서열식별번호: 13)을 배정받았다. 서열식별번호: 13으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:

관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.

변이체 확인을 수행하여 둘 다의 계대배양의 경우 바이러스 집단에서의 뉴클레오티드 변화의 수 및 빈도를 결정하였다. 표 16은 참조 서열과 비교하여 P84 및 P100에서 발견된 11개의 뉴클레오티드 변화를 보여준다. 11개의 변이체 위치 중 6개는, P84에는 존재하지 않는 P100에서의 5개의 뉴클레오티드 변화를 제외하고, 계대배양 사이에서 일치하였다. 이들 변화는 대략 절반 조금 더 미만의 하위집단 변이체가 바이러스의 84에서 100회 계대배양 동안 발생하였음을 시사한다.

표 16. PRRSV SD 11-21 서열 변이체.

ND = 검출되지 않음.

실시예 8

본 연구의 목적은 백신접종-챌린지 연구에서 실험적 변형된 생 PRRSV 백신의 용량 반응 및 면역 개시 (OOI)를 평가하기 위한 것이다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 연구를 실시예 2 및 3에 기재된 것과 유사한 절차 및 조건을 사용하여, 아이오와주 캠브리지 소재의 베테리너리 리소시즈, 인크.의 BSL-2 시설에서 수행하였다. 실험실 검정은 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이, 아이오와주 에임스 소재의 아이오와 주립 대학교 수의학 진단 실험실에서 수행하였다. PRRSV에 대해 혈청음성인 80마리의 임상적으로 건강한, 14 또는 15일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 4개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=20마리/군). 치료군은 위약-매칭 대조군 및 3개의 PRRSV 백신 용량 군 (2.7, 4.1 또는 5.1 log₁₀ TCID₅₀/mL)을 포함하였다.

돼지에게 그의 각각의 백신 또는 위약을 제0일에 목의 우측으로 근육내로 제공하였다 (1.0 mL). SD 11-21 PRRSV 균주, 안정화제 및 보존제 (겐타미신)를 포함시켜 백신을 제제화하였다. OPTI-MEM® I 감소된 혈청 배지를 블렌딩 희석제로서 사용하였다. 마스터 세포 스톡 (MCS) 상에서 최고 계대배양 수준 (MCS+20)으로 성장시킨, 생산을 위해 의도되는 최고 계대배양 수준 (MSV+5)의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 사용하여 백신을 제조하였다. 각각의 백신에 대한 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀)은 MARC-145 세포를 감염시켜 결정하였다. 백신접종 후 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 위약 대조군과 비교하여, 직장 온도의 일시적 증가가 모든 백신 군에서 백신접종 후 제2일에 관찰되었지만, 이는 정상 생리학적 범위 내에서 유지되었고, 그 이후에는 관찰되지 않았다.

백신접종 후 제28일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NADC-20 (계대배양 3) 4 mL (1 mL/비공 및 2 mL IM)로, 3.98 x 10⁴ TCID₅₀/mL로 챌린지하였다. 위약 군에서 폐 병변 침범의 평균 퍼센트는 54%였다. 본 연구에서 달성된 수준은 백신 후보를 평가하는데 충분한 것으로 간주되었다.

폐 병변 점수의 통계학적 분석의 결과를 표 17 및 18에 요약한다. 치료의 주요 효과는 통계적으로 유의하였다 (P < 0.0001). 모든 용량 군에서 백신접종된 돼지는 대조군 돼지보다 유의하게 낮은 (P<0.05) 폐 병변 점수를 가졌다 (표 17). 선형 및 2차 대조는 통계적으로 유의하지 않았다. 완화 분율이 표 18에 제공된다. 군 T02 (2.7 log), T03 (4.1 log) 및 T04 (5.1 log)에 대한 완화 분율은 군 T01 (위약)과 비교하여 유의하였다. T02, T03 및 T04에 의한 백신접종은 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 각각 0.9200, 0.9450 및 0.9789만큼 증가시켰다.

표 17. 평균 폐 병변 점수¹

¹아크사인 변환된 퍼센트 폐 침범.

²비변환된 평균.

³역 변환된 평균.

*T01 대 T02, T03 또는 T04는 P < 0.05로 유의하게 상이함.

표 18. 완화 분율 - 폐 병변 점수

제42일에, 절제된 폐로부터 BAL 액을 무균 수득하였다. PRRSV 핵산의 존재의 qRT-PCR 분석을 위해 BAL 액의 분취물을 ISUVDL에 제출하였다. 결과를 표 19에 요약한다. 모든 3개의 용량 군에서 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 폐에서 유의하게 낮은 (P<0.05) 바이러스 로드를 가졌다. 치료의 주요 효과는 유의하였다 (P<0.0001).

표 19. BAL 액 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.

*T01 대 T02, T03 또는 T04는 P < 0.05로 유의하게 상이함.

¹비변환된 평균.

²역 변환된 평균.

PRRSV 항체 수준 및 PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플을 모든 연구 동물로부터 제-1일, 제28일 (챌린지 전) 및 제42일에 수집하였다. 혈청학 및 바이러스혈증을 각각 ELISA 및 qRT-PCR 방법론에 의해 결정하였다. ELISA 항체 역가에 의해 결정된 바와 같이, 모든 돼지는 제-1일에 혈청음성이었다. 제28일 및 제42일 둘 다에, 모든 백신접종된 군에서 ELISA 값은 위약 군에서의 값보다 유의하게 더 높았다 (P<0.05).

제-1일에, 어떠한 돼지도 바이러스혈증에 대해 양성이 아니었다. 챌린지 시 (제28일), 위약 대조군의 모든 돼지는 음성인 반면에, 군 T02, T03 및 T04의 돼지 중 95%, 75% 및 89%는 백신 바이러스의 존재로 인해 양성이었다. 모든 군의 모든 돼지는 제42일 챌린지 후 양성이었지만, 백신접종된 군 (T02, T03 및 T04)의 값은 위약 대조군 (T01)의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05).

모든 연구 동물을 챌린지일 (제28일) 및 부검일 (제42일)에 개별적으로 파운드 단위로 칭량하고, 그의 체중을 기록하였다. 하기 기간 동안 평균 1일 체중 증가 (ADWG)를 결정하였다: 백신접종 전일에서 챌린지일까지 (제-1일에서 제28일까지); 백신접종 전일에서 부검일까지 (제-1일에서 제42일까지); 및 챌린지일에서 부검일까지 (제28일에서 제42일까지). 치료의 주요 효과는 챌린지 전까지 (제-1일에서 제28일까지) 유의하지 않았다 (P=0.2304). 챌린지 기간 동안 (제28일에서 제42일까지) 및 전체 42일 연구 기간 동안, 치료의 주요 효과는 유의하였다 (P<0.0001). 이들 2개의 기간 각각의 경우, 백신접종된 군의 돼지는 위약 대조군의 돼지보다 더 체중이 증가하였다 (P<0.05).

모든 동물을 챌린지 후 14일 동안 (제28일-제42일) 매일 기준으로 우울증, 신체 상태, 및 호흡 곤란에 대해 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수를 시간별로 요약하였다. 또한 각각의 동물에 대해 1일 내의 임상 점수를 합산하였다. 제8일에, T02 및 T04의 값은 위약 대조군 (T01)의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 제9일에, T02의 값은 T01의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 제10일-제14일에, 모든 백신접종된 군 (T02, T03, 및 T04)의 값은 T01의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 임상 징후에 대해 어떠한 용량 효과도 존재하지 않았다.

결론적으로, 백신의 모든 용량 수준이 폐 병변, 폐 내 바이러스 로드, 바이러스혈증, 및 임상 징후를 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 임의의 용량 수준에서 백신에 대해 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 백신 효능의 파생 이익은 대조군 동물과 비교하여 평균 1일 체중 증가에서의 유의한 개선이었다 (P<0.05). 따라서, 14-15일령만큼 조기에 백신접종된 돼지에서 28-일 면역 개시 (OOI)가 달성가능하였다.

요약으로서, 표 20은 다양한 PRRS 바이러스 백신 균주 및 그의 컨센서스 게놈 cDNA 서열의 참조를 열거한다.

표 20. PRRS 바이러스 백신 균주.

실시예 9

본 연구의 목적은 돼지에서 변형된 생 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 백신의 마스터 종자 바이러스 (MSV) SD 11-21 X+1의 병독성으로의 복귀의 결여를 입증하기 위한 것이다.

PRRSV에 대해 혈청음성이고 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 음성인 총 80마리의 임상적으로 건강한, 14-15일령의 이유된 돼지를 4개의 별개의 역계대배양에 등록하였다. 각각의 역계대배양은 20마리의 돼지를 포함하였고, 10마리의 돼지는 대조군, 10마리의 돼지는 임상시험용 수의학 제품 (IVP) 군이었다. D-2 또는 D-1에 돼지를 치료군에 무작위 할당하였다. 역계대배양 1 (BP)에서, IVP는 SD 11-21 MSV X+1로 이루어졌다. BP 2-4에서, IVP는 이전 역계대배양 돼지로부터의 기관지-폐포 세척 (BAL) 액으로부터 단리된 PRRSV로 이루어졌다. 대조군 제품은 포스페이트 완충 염수 (PBS)였다. 동물은 PRRSV 감염의 전형적인 발열 및 임상 징후를 나타낼 경우; 진단 보고에 기초하여 PRRSV로 인해 사망하였거나 제거된 경우; 또는 PRRSV에 기인한 거시적인 폐 병변을 갖는 경우에, PRRSV에 의해 임상적 영향을 받는 것으로 간주되었다.

PRRSV SD 11-21 MSV의 역가는 3.3 log₁₀ TCID₅₀ (796-70-23Sep14)이었다. 과잉을 포함하여 전형적인 백신 용량의 역가 수준을 달성하기 위해 MSV X+1을 생성하였다. X+1을 생성하기 위해, 전면생장 MARC-145 세포를 PRRSV 마스터 종자 바이러스 (MSV) SD 11-21 (796-70-23Sep14)로 감염시키고, 95% 초과의 세포병변 효과 (CPE)가 관찰될 때 PRRSV SD 11-21 X+1을 수거하였다.

제0일에, IVP 군의 돼지에게 IVP 1.0 ml를 비강내로 투여하였다 (IN; 0.5 ml/콧구멍). 돼지를 임상 징후 (우울증, 호흡, 및 신체 상태) 및 발열에 대해 BP 1-3은 14일 동안 및 BP 4는 21일 동안 매일 관찰하였다. 돼지를 BP 1-3은 D14에, BP 4는 D21에 안락사시켰다. 폐를 절제하고, 거시적인 폐 병변의 존재에 대해 평가하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 수집하여 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 분석하고, 바이러스 단리를 수행하였다. (표 21). RT-qPCR은 EZ-PRRSV MPX 4.0 RT-PCR 키트 (테트라코어(Tetracore))를 사용하여 수행하였다. RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 양성인 BAL 액을 수크로스 쿠션으로 농축시키고, 풀링하였다. 풀링된 물질을 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하고, 다음 동물 군에의 투여 전에 세포병변 효과 (CPE)에 의해 역가를 결정하였다. 역계대배양 후 동물에서 바이러스를 단리할 수 없는 것은, MSV가 안정하고 병독성으로 복귀되지 않는 것으로 간주하였다. RT-qPCR에 의해 양성으로 판정된, 최종 역계대배양으로부터 풀링된 BAL 액 내에 존재하는 PRRSV를 원래의 MSV X+1 내의 PRRSV와 표현형적 및 유전자형적 둘 다로 비교하였다. 표현형 비교는 PRRSV 특이적 항체를 사용하여 IFA 시험에 의해 수행하였고, 유전자형 비교는 ORF5 유전자의 게놈 서열분석을 비교하여 수행하였다.

MSV X+1의 경우 바이러스 역가는 8.2 log₁₀ TCID₅₀/ml였다. MARC-145 세포를 바이러스의 10-배 연속 희석물로 감염시키고 감염된 세포를 4일 동안 인큐베이션하여, 각각의 바이러스에 대한 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀)을 결정하였다. 인큐베이션 기간 말미에 각각의 감염을 바이러스 유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재 또는 부재에 대해 검사하고, 양성 또는 음성으로서 점수화하였다. 이어서 수집된 데이터를 사용하여 TCID₅₀ 계산을 위한 리드-뮌흐 방법을 사용하여 바이러스의 역가를 계산하고, log₁₀ TCID₅₀/ml로서 보고하였다. MSV X+1의 효력은 제품의 예상 표적 방출 용량을 초과하였다. BP 2 및 3에 투여된 물질의 바이러스 역가는 각각 2.1 및 2.6 log₁₀ TCID₅₀/ml였다. BP 4에 투여된 물질은 CPE에 대해 음성이었다. 4개의 역계대배양물 중 임의의 것에서 IVP가 투여된 어떠한 돼지도 PRRSV에 의해 임상적으로 영향을 받는 돼지의 사례 정의에 양성이 아니었다. 추가적으로, 최종 양성 역계대배양으로부터의 풀링된 BAL 액으로부터의 바이러스는 MSV X+1과 표현현상 유사하고 ORF5 유전자와 비교할 경우 MSV X+1과 유전자형상 매칭되는 것으로 나타났다.

본 연구는 14-15일령의 돼지에 투여된 변형된 생 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신의 마스터 종자 바이러스 SD 11-21 X+1의 병독성으로의 복귀의 결여를 입증하고, 유전자 안정성을 확인시켜준다.

표 21. 역계대배양에 의한 BAL 액 바이러스 단리 결과

NA-적용되지 않음; 모든 개별 BAL 액은 PCR 및 면역형광 둘 다에 의한 것이며, 따라서 어떠한 풀도 생성되지 않음.

실시예 10

본 연구의 목적은 백신접종된 동물로부터 감시 동물로의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) SD 11-21 마스터 종자 바이러스 (MSV)의 배출 및 전염을 평가하기 위한 것이다. PRRSV에 대해 혈청음성이고 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 음성인 20마리의 임상적으로 건강한, 14일령의, 이유된 돼지를 등록시켰다. D-1에, 돼지를 신체 검사하고, 감시/대조군 또는 PRRSV SD 11-21 MSV X+1 치료군으로 무작위 할당하였다. PRRSV SD 11-21 MSV X+1을 실시예 9에서와 같이 생성하였다. 돼지를 우리 내에 4마리의 돼지/우리로 수용하고, 각각의 우리는 2마리의 돼지/치료군을 포함하였다.

D0에, MSV X+1 치료군의 돼지를 목의 우측으로 근육내로 (IM) 1.0 ml 백신접종하는 한편, 감시 돼지는 비치료로 두었다. 비강 스왑 및 혈청 샘플을 D-1, D3, D5, D7, D10, D14, D17, 및 D21에 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. D21에, 돼지를 인도적으로 안락사시키고, 폐를 절제하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 무균 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. 또한, 폐, 비장, 편도, 흉선, 및 우측 및 좌측 기관기관지 림프절로부터 조직 샘플을 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. 조직 샘플이 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 양성으로 판정된 경우, ORF5 영역을 사용하여 게놈 서열분석에 의해 샘플을 동일성 시험하고 MSV X+1의 ORF5 영역과 비교하였다. 체중을 D-1 및 D21에 수집하였다.

10마리의 백신접종된 돼지 중 9마리 (90%)는 21일 연구 기간 동안 PRRSV에 양성인 적어도 1개의 비강 스왑을 가졌다. 일부 돼지 (4/9마리)는 21일 연구 기간의 말미에 여전히 백신을 배출하였다. 모든 백신접종된 돼지는 D3-D21에 바이러스혈증성이었다. 추가적으로, 백신접종된 돼지로부터의 모든 BAL 액 및 조직 샘플은 D21에 RT-qPCR에 의하면 PRRSV에 대해 양성이었다. 조직 샘플로부터 단리된 RNA의 뉴클레오티드 서열은 MSV X+1과 99.67-100% 유사성을 제시하였고, 이는 돼지에 존재하는 유일한 바이러스가 백신 바이러스로부터 기원한 것임을 나타낸다. 10마리의 감시 돼지 중 1마리 (10%)는 백신 바이러스에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 단일 비강 스왑이 21일 샘플링 기간 동안 양성이었다. 어떠한 혈청 샘플, BAL 액 샘플, 또는 조직 샘플도 감시 돼지 중 임의의 것에서 RT-qPCR에 의하면 PRRSV에 대해 양성으로 판정되지 않았다.

MSV X+1은 백신접종된 동물로부터 투여 후 적어도 21일 동안 배출되었다. 단일 양성 비강 스왑 외에는 감시 동물 중 임의의 것에서 어떠한 백신 바이러스도 검출되지 않았기 때문에, 백신접종된 동물에서 감시 동물로의 MSV X+1 전염은 제한되었다.

실시예 11

본 연구의 목적은 유형-2 PRRSV 균주 (SD 11-21)를 4.45 log₁₀ TCID₅₀/mL로 함유하는 실험적 변형된-생 PRRSV 백신의, PRRSV 혈청음성 14-일령 새끼돼지에게 투여하고 후속해서 최신의 병독성 유형-2 PRRSV 균주 (NC-174)로 챌린지한 경우의, 효능을 평가하기 위한 것이다. NC-174 PRRS 바이러스는 노스 캐롤라이나주 해럴스 소재의 돼지 농장에서 호흡기 증상을 겪고 있는 9주령의 돼지의 혈청 샘플로부터 단리되었다. 농장으로부터의 상세한 증후성 관찰사항은 식욕부진, 기면, 과호흡, 호흡곤란, 15% 이환율 및 5% 사망률이었다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다.

PRRSV에 대해 혈청음성인 40마리의 임상적으로 건강한, 14일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 체중 감소에 따라 순위를 정하고, 2개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=20마리/군). 치료군은 실험적 백신 및 위약-매칭 대조군을 포함하였다. 챌린지 시까지 백신 바이러스의 배출로 인한 노출을 막기 위해 돼지를 치료군별로 수용하였다. 챌린지 시, 우리 내 각각의 치료군으로부터 2마리의 돼지가 존재하도록 돼지를 합했다.

돼지에게 제0일에 백신 또는 위약을 목의 우측으로 근육내로 (1.0 mL) 제공하였다. 제-1일, 제28일, 제35일 및 제42일에 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 ELISA에 의해 PRRSV 항체 수준에 대해 시험하고, 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 바이러스 로드에 대해 시험하였다. 제28일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NC-174 (계열 1, 계대배양 3) 4 mL (1 mL/비공 및 2 mL IM)로, 1.3 X 10⁶ TCID₅₀/mL로 챌린지하였다. 호흡 곤란, 우울증 및 신체 상태를 나타내는 임상 점수를 제28일에서 제42일까지 매일 기록하였다. 돼지를 제-1일, 제28일 및 제42일에 칭량하여 체중 증가를 평가하였다. 돼지를 제42일에 안락사시키고, 폐를 절제하고, 폐 병변의 정도를 결정하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 제42일에 수집하여 qRT-PCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다.

백신접종 후 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 실험적 백신은 퍼센트 폐 병변 (대조군 45.9% vs 백신접종군 4.0%), 폐 내 바이러스 로드 (95% 감소), 바이러스혈증 (챌린지 14일 후), 및 임상 징후를 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 폐 병변 데이터의 완화 분율 평가는 백신접종이, 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 0.9368만큼 증가시킨다는 것을 나타내었다.

백신 효능의 파생 이익은 14-일 챌린지 기간 동안 대조군 동물과 비교하여 평균 1일 체중 증가에서의 유의한 개선이었다 (P<0.05) (0.43 vs 0.25 kg/일).

결론적으로, 나이브 14-일령 돼지에의 균주 SD 11-21을 함유하는 실험적 PRRSV 백신의 단일 1.0 mL 용량으로의 투여는 안전하고, 최신의 PRRSV 필드 균주 NC-174에 의한 챌린지에 대해 효과적이었다.

실시예 12

본 연구의 목적은 유형-2 PRRSV 균주 (SD 11-21)를 4.45 log₁₀ TCID₅₀/mL로 함유하는 실험적 변형된-생 PRRSV 백신의, PRRSV 혈청음성 14-일령 새끼돼지에게 투여하고 후속해서 병독성 유형-2 PRRSV 균주 (NADC-20)로 챌린지한 경우의, 면역의 최소 26주 (182일) 지속기간을 확인하기 위한 것이다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. PRRSV에 대해 혈청음성인 64마리의 임상적으로 건강한, 14-일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 깔짚으로 차단하고, 2개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=32마리/군). 치료군은 실험적 백신 (T02) 및 위약-매칭 대조군 (T01)을 포함하였다. 챌린지 시까지 백신 바이러스의 배출로 인한 노출을 막기 위해 돼지를 치료군별로 수용하였다. 챌린지 시, 우리 내 각각의 치료군으로부터 2마리의 돼지가 존재하도록 돼지를 합했다.

돼지에게 제0일에 백신 또는 위약을 목의 우측으로 근육내로 (1.0 mL) 제공하였다. 제-1일, 제28일, 제112일, 제168일, 제181일, 제189일 및 제196일에 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 ELISA에 의해 PRRSV 항체 수준에 대해 시험하고, 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 바이러스 로드에 대해 시험하였다. 제182일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NADC-20 10 mL (4 mL/비공 및 2 mL IM)로 10^6.7 TCID₅₀/mL로 챌린지하였다. 호흡 곤란, 우울증 및 신체 상태를 나타내는 임상 점수를 제182일에서 제196일까지 매일 기록하였다. 돼지를 제196일 (챌린지 14일 후)에 안락사시키고, 폐를 절제하고, 폐 병변의 정도를 결정하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 수집하여 qRT-PCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다.

실험적 백신은 퍼센트 폐 병변 (대조군 12.3% vs 백신접종군 1.1%)을 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 폐 병변 데이터의 완화 분율 평가는 백신접종이, 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 0.6566만큼 증가시킨다는 것을 나타내었다.

본 연구의 결과는 나이브 14-일령 돼지에의 균주 SD 11-21을 함유하는 실험적 PRRSV 백신의 단일 1.0 mL 용량으로의 투여가 26주 늦게 주어진 병독성 PRRSV 챌린지에 대해 효과적이라는 것을 확인시켜주었다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VACCINE VIRUS <130> X20718 <150> 62/296658 <151> 2016-02-18 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60 ggtacagccc aaaacttgct gcacggaaac gcccttccgt gacagccctc ttcaggggag 120 tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccaa 180 ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240 catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcctct 300 gaatctccaa gttcccgagc ttggagtgct gggcctattt tacaggcccg aagagccgct 360 ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcttgctg 420 gctttctgcg atcttcccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480 aatggtgcgg gtcgctgccg agatttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa 540 ggctctacaa gtttatgaac ggggttgccg ctggtacccc attgtcggac ctgtccctgg 600 agtggccgtt ttcgccaact ccctacatgt gagtgacaaa ccttttccgg gagcaactca 660 tgtgttaacc aatctaccgc tcccgcagag gcccaagcct gaagactttt gcccttttga 720 gtgtgctatg gctgacatct atgacatcgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccggaga 780 gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa tttgaaaatg ttcccaagga 840 gttgaagttg attgcgaacc gactccacat ctccttcccg ccccaccacg tagtggacat 900 gtccaagttt accttcatag cccccgggag tggtgtctcc atgcgggttg agtgccaaca 960 cggctgcctc cccgctgata ctgttcctga aggaaactgc tggtggcgct tgttcgactc 1020 gctcccgccg gaagtccagc acaaagaaat tcgctatgct aaccaatttg gttatcaaac 1080 caagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaacg gtctccgagc 1140 agtgaccgac gtacatggac ctatcgtcat acagtacttc tctgttaagg agagttggat 1200 ccgccacttc aggctggcgg aagaacctag cctccctggg ttcgaagacc tcctcagaat 1260 tagggttgag cccaatacat caccactggc tggcgaggat gggaagatct tccggtttgg 1320 cagtcacaag tggtacggtg ctggaaggag agcaaggaaa gcacgttctg gtgcgaccac 1380 catggtcgct catcgcgctt tgtccgctcg tgaaacccag caggcaaaga aggacgaggg 1440 tgccgacgct aacaaggctg agcatctcaa gcactactct ccgcccgccg aagggaactg 1500 tggttggcac tgtatttccg ccatcgccaa ccggatgata aattccaaat ttgaaactac 1560 ccttcccgaa agagtaaggc ctctggatga ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatac 1620 catccaaatc ctcaggctcc ccgcggcctt ggataggaac ggtgcttgta gtagcgccaa 1680 gtacgtgctt aagctggaag gtgtgcattg gactgtctct gtgacccctg ggatgtcccc 1740 ttccttgctc ccccttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gttttggctc 1800 cccagatgcg gtcgaagttt ccggatttga ccctgcctgc cttgaccgac tggctgaggt 1860 aatgcacttg cctagcagtg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgactccaa 1920 tcgtccggct tccccggtca acactgtgtg gactgtttcg caattctatg cccgtcatac 1980 aggaggaaat catcctgacc aggtgtgctt agagcagatc attaatctct gtcaggttat 2040 tgaggtttgt tgctgccatc aaaacaaaac caaccgggcc accccggaag aggtcgcggc 2100 aaagattgat cagtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttga ccaggcttga 2160 gagggtttgc ccgccgagcg ctgcggacac ctcctttgat tggaatgttg tgctccctgg 2220 ggttgaggct gcaactcaga caaccaaaca gccccacgtc aaccagtgct gcgctctggt 2280 tcctgtcgtg actcaagagc ctttggacaa agactcggtc cctctgaccg ccttctcgct 2340 gtccaattgc tactaccctg cacaaggtga agaggttcgt caccgtgaga gactaaactc 2400 cgtactctcg aagttggagg gggctgttcg tgaggaatat gggctcacgc caactgaacc 2460 tggcctgcaa cccgcactac cgaacgggct cgacgaactt aaagaccgga tggaggagga 2520 tctgctgaaa ctagtcaacg ctcaggcaac ttcagaaatg atggcctggg cagccgagca 2580 gattgattta aaagcttggg tcaaaaacta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc 2640 aagagctcag cctcggaaaa cgaagtctgt taagagcttg ccagggaaca agcctatccc 2700 tgctccacgc aggaaggtca gatctgattt gactgttaat ggcccccttg atctttcgac 2760 accatccgag ccgatgacac ccctgagtga gcctgcactt atgcccgcgt tgcaacatat 2820 ttctaggcca gtgacatctt tgagtgagcc ggtcccagtt cctgcaccgc gtagagctgt 2880 gtcccgaccg gtgacgccct tgagtgggcc aacttttgag tttgcgccgc gacacaaatt 2940 tcagcaggtg ggagaagtga atctggcggc aacaacgctg acgcaccagg acgaacctct 3000 agatttgtct gcatcctcac agactgaata tgaggcttct cccctagtac caccgcagaa 3060 catgggtatc ctgggggtgg gggggcaaga ggctgaagaa gttctgagtg aaatctcgga 3120 tatactgagt gacattaacc 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tgaatttaag tacctatgcc ttcctgcctc ggatgatggt 6540 tgtgacatca ccagtcccag tgattgcgtg tggtgttgtg cacctccttg ccataatttt 6600 gtacttgttc aagtaccgtt gcctgcacaa tgtccttgtt ggcgacggag cgttctctgc 6660 ggcttttttc ttgcgatact ttgccgaggg aaagttgaga gaaggggtgt cgcagtcctg 6720 cgggatgaat cacgagtcac tgactggagc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt 6780 ggacttcctt acgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt tctgcttcca atatgaggaa 6840 tgcagcgggc caattcatcg aggcagccta tgctaaagca cttagaatag aacttgccca 6900 gttggtgcag gtcgacaagg ttcgaggtgt tttggccaaa cttgaagctt ttgctgatac 6960 tgtggcaccc caactctcgc ccggtgacat tgtcgttgct cttggccata cgcctgttgg 7020 tagtatcttc gacctaaagg ttggtagcac caagcatact ctccaagcca ttgagaccag 7080 agtccttgcc gggtccaaga tgaccgtggc gcgcgtcgtt gacccaaccc ccacgccccc 7140 acccgcaccc gtgcctatcc ccctcccgcc aaaaattctg gagaatggtc ccaacgcctg 7200 gggggatgag gaccgtttga ataagaagaa gaggcgcagg atggaagccg ttggcatctt 7260 tgttatgggc gggaagaagt accagaaatt ttgggacaag agctccggtg atgtgtttta 7320 cgaggaagtc catgataaca 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Claims (19)

1. 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주이며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 것인, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 것인, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 것인, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PRRS 균주가 ND 99-14 또는 SD 11-21인 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PRRS 바이러스 균주가 조직 배양 세포에서 적어도 80회 계대배양된 것인 PRRS 균주.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PRRS 바이러스 균주가 조직 배양 세포에서 100회 계대배양된 것인 PRRS 균주.
7. 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주; 및
   제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제
   를 포함하는 면역원성 조성물.
8. 제7항에 있어서, 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 것인 면역원성 조성물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 것인 면역원성 조성물.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주가 ND 99-14 또는 SD 11-21인 면역원성 조성물.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
12. 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신이며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주가 ND 99-14 또는 SD 11-21인 백신.
13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신을 돼지과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군의 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신을 돼지과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
15. 제14항에 있어서, PRRS 바이러스 감염이 면역원성 조성물 또는 백신 내의 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주와 이종인 병독성 PRRS 바이러스에 의해 유발된 것인 방법.
16. PRRS를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주의 용도.
17. PRRS를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도.
18. 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군의 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신.
19. 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신.

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