KR20220027292A - 돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 바이러스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 관한 것이다. 바이러스는 유전자 분석되고, 조직 배양에서의 반복 계대배양에 의한 변형에 대해 계통발생학적 그룹화를 기초로 하여 선택된다. 변형된, 생 바이러스는 이종 바이러스에 대한 보호 면역을 제공하는 능력에 대해 평가된다. 변형된, 생 바이러스는 백신, 특히 다중 이종 바이러스에 의한 돼지의 감염을 치료할 수 있는 백신에서 유용하다.
Description
본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 관한 것이다. 변형된, 생 바이러스는 백신, 특히 이종 바이러스에 대한 보호를 제공하는 백신에 유용하다.
원래 미확인 돼지 질환으로 불린 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)은 유럽에서 최초로 보고되었고 현재 전세계로 확산되었다. PRRS는 번식 적령기 암퇘지에서의 후기 유산, 사산, 및 불임, 및 사육 및 성장 중/마감 돼지에서의 호흡기 질환, 감소된 성장 성능, 및 심지어 사망을 유발한다. PRRS는 미국에서만 매년 6억 달러가 넘는 경제적 손실을 유발한다.
성체 돼지과 동물에서의 PRRS 바이러스 감염의 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 및 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것을 포함한다. 임신한 암퇘지는 새끼를 조산하거나, 태아를 유산하거나, 미이라화된 또는 사산된 새끼돼지를 분만할 수 있고, 최대 10%의 임신한 암퇘지가 PRRS 바이러스 감염으로 사망할 수 있다. 감염된 새끼돼지는 이유전 사망률이 높고, 종종 약하고, 눈 주위에 부종이 있을 수 있다. 이유된 사육 또는 성장 중/마감 돼지에서의 PRRS 바이러스 감염은, 제한 없이, 성장 장애, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 및 거친 털을 유발할 수 있다.
PRRS 바이러스는 대략 15 kb, 선형, 양성-가닥, 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 외피보유 바이러스이고, 상기 바이러스는 패밀리 아르테리비리다에(Arteriviridae)로 분류되어 있다. 지금까지 적어도 9개의 오픈 리딩 프레임이 게놈에서 확인되었다. PRRS 바이러스는 2개의 일반 하위유형으로 나뉜다. 유럽 하위유형, 유형 1 PRRS 바이러스는 렐리스타드(Lelystad) 균주로 예시되며, 유형 2 북아메리카 PRRS 바이러스는 균주 VR-2332로 예시된다.
2종의 하위유형은 그의 게놈에서 약 60%만큼 낮은 서열 동일성을 가질 수 있고, 심지어 하위유형 내에서도 개개의 균주는 그의 게놈의 동일성에서 최대 약 20% 다를 수 있다. 이러한 가변성은 PRRS를 효과적으로 치료하고/거나 예방하기 위한 백신의 개발을 복잡하게 하고 있다. PRRS 바이러스의 변형된, 생 바이러스 (MLV) 변이체는 PRRS 바이러스에 의한 챌린지에 대해 면역을 생성할 수 있지만, 백신은 챌린지가 MLV와 유전학적으로 상동인 PRRS 바이러스에 의한 경우에 가장 효과적이다. MLV 백신은 이종 바이러스에 의한 챌린지에 대해 덜 효과적이었다. 또한, MLV는 병독성으로의 일부 반전을 나타내어, 백신 바이러스가 백신접종된 동물에서 질환을 유발한다. 불활성화된 (즉 사멸된) PRRS 바이러스를 함유하는 백신은 보다 우수한 안전성 프로파일을 갖지만, 이종 챌린지에 대한 효능은 제한되었다.
현재의 PRRS 백신은 PRRS 바이러스 감염의 경제적 영향을 감소시키는데 충분한 안전성 및 효능을 나타내지 않기 때문에, 신규의 개선된 백신이 필요하다. 바람직하게는, 그러한 백신은 안전할 뿐만 아니라 효과적일 것이다. 백신이 약독화된 MLV를 포함하는 경우, 그러한 약독화된 MLV는 본 분야에서의 사용에 대해 안전한 것으로 간주되기 위해 병독성으로의 반전을 입증하지 않아야 한다. 예를 들어, PRRS 균주를 조직 배양 세포에서의 성장에 적어도 80회 계대배양, 또는 바람직하게는 적어도 100회 계대배양 동안 적응시킴으로써, MLV는 병독성으로의 반전을 입증하지 않아야 한다. 효과적이기 위해서는, 백신 바이러스 균주는 계통발생학적으로 다양한 야생형 PRRS 균주 범위에 대해 돼지과 동물에서 보호 면역을 도출할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 새로운 PRRS 백신 바이러스 균주는 적어도 3종의 계통발생학적으로 다양한 야생형 PRRS 균주에 대해 돼지과 동물에서 보호 면역을 도출할 수 있을 것이다.
본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 백신 바이러스 균주를 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, PRRS 바이러스의 높은 돌연변이율로 인해, 변형된, 생 PRRS 균주는 각각이 상동이지만 동일하지는 않은 게놈을 갖는, 다중 하위집단을 포함할 수 있다.
본 발명은 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 제공하며, 여기서 PRRS 바이러스 균주는 계대배양된 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주이다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 바람직하게는 적어도 80회, 또는 보다 바람직하게는 84회 계대배양될 것이다. 가장 바람직하게는, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 가장 바람직하게는, 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.
본 발명은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, PRRS 바이러스의 높은 돌연변이율로 인해, 변형된, 생 PRRS 균주는 각각이 상동이지만 동일하지는 않은 게놈을 갖는, 다중 하위집단을 포함할 수 있다.
본 발명은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 계대배양된 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 백신을 제공한다. PRRS는 PRRS 바이러스에 의해 유발되기 때문에, 본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물의 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료하는데 사용하기 위한 백신을 제공한다. 감염은 PRRS 바이러스의 야생형 병독성 균주로 인한 것일 수 있다. 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것, 새끼의 조산, 유산, 사산, 부종, 성장 장애, 기침, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 거친 털, 폐 병변, 바이러스 배출 및 사망일 수 있다. 본 발명은 돼지과 동물의 요법에 사용하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 요법에 사용하기 위한 백신을 제공한다. 바람직하게는, 백신은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 가장 바람직하게는, 백신은 계대배양된 ND 99-14 또는 SD 11-21인 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 증상은, 제한 없이, 감소된 식욕, 기면, 열, 행동 변화 예컨대 균형 상실, 선회, 및 한쪽으로 쓰러지는 것, 새끼의 조산, 유산, 사산, 부종, 성장 장애, 기침, 호흡 곤란, 노력성 또는 빠른 호흡, 피부의 얼룩진 홍조, 거친 털, 폐 병변, 바이러스 배출 및 사망일 수 있다. 본 발명은 돼지과 동물의 요법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 요법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 감염은 백신 내 변형된, 생 PRRS 바이러스와 이종인 PRRS 바이러스의 야생형 병독성 균주로 인한 것일 수 있다. 바람직하게는, 백신은 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 가장 바람직하게는, 백신은 계대배양된 ND 99-14 또는 SD 11-21인 변형된, 생 PRRS 균주를 포함한다. 백신은 추가로 아주반트를 포함할 수 있다. 백신은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 돼지과 동물에게 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 보다 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 것이다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 계대배양된 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양된다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일하다. 보다 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물에게 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발되는 증상을 치료 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주는 계대배양된 ND 99-14 또는 SD 11-21이다. 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 수 있다. 가장 바람직하게는, 방법에 사용하기 위한 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 수 있다. 면역원성 조성물은 추가로 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 상이한 바이러스로부터의 또는 박테리아 균주로부터의 또는 기생충으로부터의 추가의 항원을 포함할 수 있다. PRRS 바이러스 감염은 면역원성 조성물 내 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주와 이종인 병독성 PRRS 바이러스에 의한 감염일 수 있다. 2종의 PRRS 바이러스 균주는 각각의 바이러스 균주의 게놈 컨센서스 서열이 상이한 계통발생적 군으로 맵핑될 경우 이종인 것으로 간주된다. 2종의 PRRS 바이러스 균주는 각각의 바이러스 균주의 상보적 DNA 컨센서스 서열이 상이한 계통발생학적 군으로 맵핑될 경우 이종인 것으로 간주된다.
본 발명은 PRRS의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 PRRS의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 계대배양된 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주의 용도를 제공한다. 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.
본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 PRRS 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 계대배양된 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.
본 발명은 돼지과 동물을 PRRS 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 의약의 제조에서의, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 포함한다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다. 이러한 용도를 위한 변형된, 생 균주는 또한 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13의 군으로부터 선택된 서열과 적어도 98% 동일한 컨센서스 상보적 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 돼지과 동물을 PRRS 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 의약의 제조에서의, 계대배양된 ND 99-14 균주 또는 SD 11-21 균주를 포함하는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서, 적어도 80회, 또는 바람직하게는 심지어 84회 계대배양될 것이다. 또한, PRRS 바이러스 균주는 조직 배양 세포에서 100회 계대배양될 것이다. 조직 배양 세포에서의 이러한 계대배양은 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 적절히 약독화하는데 유용하다. 약독화된 PRRS 바이러스 균주는 그러한 균주가 돼지과 동물에 투여될 경우 임상은 아니지만 준임상 질환을 유발할 수 있다. 적어도 80회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다. 100회 계대배양된 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 야생형 병독성으로 반전될 확률이 낮다.
도 1. 유형 2 PRRSV ORF5 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 2. 유형 2 PRRSV nsp1 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 3. 유형 2 PRRSV nsp2 OTU 도메인 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 4. IFN-알파 (IFN-α) 발현의 자극에 대한 상이한 PRRSV 필드 분리주의 변경.
도 5. 상이한 필드 PRRSV 분리주에 의한 탈ISG화 검정.
도 2. 유형 2 PRRSV nsp1 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 3. 유형 2 PRRSV nsp2 OTU 도메인 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 분석.
도 4. IFN-알파 (IFN-α) 발현의 자극에 대한 상이한 PRRSV 필드 분리주의 변경.
도 5. 상이한 필드 PRRSV 분리주에 의한 탈ISG화 검정.
하기 논의에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "바이러스"은 바이러스의 종, 또는 상호교환가능하게, 핵산, 단백질 및 지질 막을 함유할 수 있는 개별 감염 유닛을 의미할 수 있다. 개별 감염 유닛은 또한 "바이러스 입자" 또는 "비리온"으로 불리고, 후자의 용어는 동의어이다.
본원에 사용된 바이러스 "균주" 또는 "분리주"는 유전학적으로 상동인 비리온의 집합을 의미한다. 2종의 바이러스는 그러한 바이러스가 동일한 계통발생적 계통군으로 맵핑되면 "상동"인 것으로 간주될 것이다. 2종의 바이러스는 그러한 바이러스가 상이한 계통발생적 계통군으로 매핑되면 "이종"인 것으로 간주될 것이다. PRRS 바이러스가 높은 돌연변이율을 갖기 때문에, 단일 PRRS 균주는 관련이 있지만 가변적인 유전자 서열을 갖는 개별 비리온을 포함한다는 것이 인지될 것이다. 따라서, 각각의 PRRS 균주 내에 균주의 하위집단이 존재하고, PRRS 균주의 유전자 서열은 PRRS 균주의 개별 구성원의 유전자 서열이 그러한 균주에 대한 컨센서스 서열과 동일하지 않을 수 있는 컨센서스 서열이다. "컨센서스" 서열은 주어진 위치의 각각의 핵산 잔기가 PRRS 바이러스 균주 또는 분리주의 폴리뉴클레오티드의 >50%에 존재하는 핵산 서열이다.
"퍼센트 동일성"은 핵산 또는 단백질의 동일한 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 계산함으로써 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성의 계산은 2개 이상의 서열 사이에서 최적 정렬을 결정하는 것을 포함한다. 정렬은 시험될 각각의 서열 내의, 예컨대 제한 없이, 핵산의 비-코딩 영역 및 폴리펩티드 서열의 말단절단 또는 연장 내의 삽입 및 결실 (즉 "갭")을 고려할 수 있다. 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘 예컨대 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST)을 사용하여 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다. BLAST는 미국 국립 생물 정보 센터에 의해 제공되는 많은 리소스 중 하나이다. 유전자 코드는 축중성이고 1개 초과의 코돈이 주어진 아미노산을 코딩할 수 있기 때문에, 핵산의 코딩 영역은 핵산이 동일한 폴리펩티드를 코딩할 경우 동일한 것으로 간주된다. 따라서, 퍼센트 동일성은 또한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 기초하여 계산될 수 있다. 퍼센트 동일성은 전장 컨센서스 게놈 서열 또는 게놈 서열의 분획, 예컨대 예를 들어 제한 없이 개별 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 기초하여 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변형된, 생 바이러스"는 유전자 서열이 자연 발생 야생형 바이러스의 유전자 서열에서 변경된 임의의 개별 바이러스 입자 (즉, "비리온") 또는 다수의 바이러스 입자에 적용된다. 변경은, 제한 없이, 유전자 돌연변이 예컨대 뉴클레오티드의 삽입 및 결실, 및 하나의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드로 변화시키는 전이 및 전환을 포함한다. 변경은 야생형 바이러스를 조직 배양 시스템에서의 복제에 적응시키고, 바이러스를 조직 배양 시스템에서 계속해서 계대배양하여 바이러스의 유전자 돌연변이를 축적시킴으로써 달성될 수 있다. 변경은 또한 분자 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 약독화된 바이러스는 변형된, 생 바이러스의 하위세트를 형성한다.
본원에 사용된 용어 "약독화된" 또는 "약독화"는 바이러스가 임상 질환을 유발하거나 악화시키는 능력이 감소 또는 제거되었음을 의미한다. 약독화된 바이러스는 여전히 숙주 세포를 시험관내 또는 생체내에서 감염시킬 수 있고, 그러한 감염은 숙주 유기체에서 준임상 효과를 발생시킬 수 있지만, 그러한 감염은 1종 이상의 임상 질환 증상은 발생시키지 않는다.
대조적으로, 본원에 사용된 "불활성화된" 바이러스는 숙주 세포에서 더 이상 복제할 수 없는 바이러스를 의미한다. 불활성화된 바이러스는 죽은 또는 사멸된 바이러스로 간주된다. 불활성화는 바이러스 단백질의 화학적 변경, 비리온의 구조의 화학적 또는 물리적 변경, 또는 바이러스 핵산의 화학적 또는 물리적 변경을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
"항원"은 유기체의 면역계에 의해 특이적으로 검출될 수 있는 임의의 분자이다. 전형적으로 바이러스 항원은 바이러스 게놈에 의해 코딩되거나 바이러스 게놈의 생성물로부터 유래된 바이러스 단백질이다. 바이러스 항원의 존재는 숙주 T 림프구 및 숙주 B 림프구 둘 다의 표면 항원 수용체에 의해, 및 숙주 세포에 의해 합성된 항체 분자에 의해 특이적으로 검출될 수 있다.
"면역원성"은 면역 반응을 도출하는 항원의 능력을 지칭하고, 상기 면역 반응은 항원-특이적 반응 및 비-항원-특이적 반응 둘 다 또는 선천성 면역 반응을 포함한다. "보호 면역"은 면역화된 동물이 챌린지되거나 병원성 바이러스 균주에 노출된 경우 임상 증상을 감소시키거나 방지할 수 있는 면역 반응이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 보호 면역은 시간에 따라 또는 면역화된 동물의 연령 증가에 따라 저하될 수 있다. 본원에 사용된 보호 면역은 최종 면역화 일로부터 적어도 4개월, 그러나 바람직하게는 적어도 6개월 동안 효과적일 것이다. 보호 면역은 단일 용량의 백신에 의해 도출될 수 있다. 보호 면역 반응을 증가 또는 연장시키기 위해 제2 또는 추가의 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종 암퇘지에서 보호 면역 반응을 증가시키는 것은 새끼돼지에서 증가된 모체 유래 항체 수준을 발생시킬 수 있다.
항원과 대조적으로, "아주반트"는 면역 반응의 비-특이적 자극제이다. 아주반트는 패턴 인식 수용체 (PRR)에 결합하여 활성화함으로써 선천성 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 PRR의 자극제는 예를 들어 바이러스 또는 박테리아 핵산, 박테리아 또는 기생충으로부터의 지질, 또는 박테리아 단백질 또는 독소, 또는 이러한 분자의 임의의 인공적으로 구축된 모방체일 수 있다. 아주반트는 또한, 제한 없이: B 림프구에 의한 인식 또는 식세포에 의한 섭취를 용이하게 하도록 항원을 응집시키는 무기 화합물, 예컨대 명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘 히드록시드 또는 황산암모늄; 오일; 및 세제를 포함한다. 아주반트는 또한 면역 신호전달의 숙주 매개자, 예컨대, 제한 없이, 시토카인, 림포카인, 케모카인, 인터페론, 아나필라톡신, 성장 인자, 분화 인자, 및 부착 분자일 수 있다.
본원에 사용된 "면역원성 조성물"은 동물에게 투여 시 면역 반응을 도출하는 조성물이다. 면역원성 조성물은 적어도 1종의 항원 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제의 설명은, 예를 들어, 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lloyd V. Allen, ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 22nd edition, 2012]에서 찾아볼 수 있다. 항원은 살아있거나 불활성화된 전체 바이러스, 박테리아 또는 다른 병원체일 수 있다. 항원은 또한 바이러스, 박테리아 또는 다른 병원체로부터 단리, 정제 또는 부분 정제된 항원 분자일 수 있다. 항원은 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 핵산 또는 지질일 수 있다.
본원에 사용된 "백신"은 동물에게 투여 시 병원성 유기체, 예를 들어 바이러스에 의해 유발된 질환 증상으로부터 보호, 그에 대한 저항성, 그의 방지, 또는 그의 치료를 부여하는 면역원성 조성물이다. PRRS 백신은, 제한 없이, 제약상 허용되는 아주반트, 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제를 포함하는 조성물 중에, 살아있거나 불활성화된 바이러스 항원 또는 무손상 비리온을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하기 위해", 또는 "치료"는 제한 없이 현존하는 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 억제, 둔화, 정지, 감소, 완화 또는 역전시키는 것을 포함한다. 치료는 치유적으로 적용 또는 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "방지하는", "방지하기 위해", 또는 "방지"는 제한 없이 증상, 장애, 상태 또는 질환의 위험을 감소, 감축, 또는 완화시키고, 동물을 증상, 장애, 상태 또는 질환으로부터 보호하는 것을 포함한다. 방지는 예방적으로 적용 또는 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "동물에게 투여"는, 피부, 피하, 근육내, 점막, 점막하, 경피, 경구 또는 비강내 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여는 주사 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.
하기 실험 실시예는 변형된, 생 PRRS 바이러스의 예시이다. 하기 실험 실시예는 또한 변형된, 생 PRRS 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물의 예시이다. 하기 실험 실시예는 또한 돼지과 동물에서 PRRS의 증상을 치료하기 위해, 변형된, 생 PRRS 바이러스를 사용하는 것의 예시이다. 다른 실시양태 및 사용이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 발명은 이들 특정의 예시된 실시예 또는 바람직한 실시양태로 제한되지 않는다는 것이 인지될 것이다.
실시예 1
본 발명자들은 PRRS에 대한 광범위한 보호 MLV 백신을 개발하고자 한다. 유전자 마커 및 감별 진단 시험 개발을 위해 백신 바이러스 내 고유 영역을 확인하였다. 구체적 목적은: 1) 후보 PRRS 백신 균주를 확립하는 것; 2) 후보 백신 바이러스 내 고유 마커 영역을 확인하고, 감별 진단 시약을 개발하고, 야생형 바이러스 감염된 동물로부터 백신접종된 동물의 감별에 대해 시험하는 것; 및 3) 후보 백신의 안전성 및 효능의 생체내 평가를 수행하고, 동반 진단 검정의 감별 능력을 평가하는 것이다.
본 발명자들은 9종의 후보 백신 바이러스를 생성하였다. 이들 후보 바이러스의 상세한 특징화를 하기 제시한다.
통상적으로 사육한 3- 내지 9-주령의 돼지의 폐로부터 수득한, 돼지 폐포 대식세포에서의 성장에 의해 바이러스를 처음 단리하였다. 폐를 절제하고, 포스페이트-완충 염수, pH 7.2로 3 또는 4회 세척하였다. 세포를 800 X g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 유체를 경사분리하고, 세포를 포스페이트-완충 염수로 세척하고, 2회 재-펠릿화하였다. 세포를 10% 방사선조사된 태아 소 혈청 및 적절한 수준의 항생제로 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 대식세포를 24-웰 플레이트에 106개 세포/ml로 시딩하고, 7시간 동안 부착되도록 하였다. 비-부착 세포를 경사분리하고, 웰을 10% 태아 소 혈청 및 RPMI 배지로 다시 채웠다. RT-PCR에 의해 PRRSV 양성인 것으로 확인된 필드 돼지 혈청 샘플을 사용하여 대식세포 배양 72시간 후에 대식세포에 접종하였다. 접종 48시간 후, PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 사용한 직접 형광 항체 시험에 의해 감염을 확인하였다.
이어서 각각의 바이러스 분리주를 플라크-정제하였다. 전면생장 세포 단층을 바이러스로 0.1의 감염 다중도 (MOI)로 감염시켰다. 2시간 후에, 세포 배양 상청액을 제거하고, 한천 오버레이를 적용하였다. 플라크는 37℃에서 5일 후에 검출되었다. 각각의 바이러스 분리주로부터 적어도 10개의 단일 플라크를 골라내어 배양된 세포에서 확장시켰다.
세포를 플라크-정제된 바이러스로 MOI 0.1로 감염시켜 바이러스의 후속 계대배양을 수행하였다. 3일 후에, 배양물 상청액을 0.5 M 수크로스 쿠션 상에 층형성하고, 100,000 X g에서 14시간 동안 원심분리하였다. 바이러스 펠릿을 PBS로 세척하였고, 이를 -80℃에서 저장할 수 있다.
각각의 바이러스 분리주의 게놈 서열을 결정하기 위해, 퀴아앰프(QiaAmp) 바이러스 RNA 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수크로스 쿠션 정제된 바이러스로부터 RNA를 추출하였다. 퍼듀 대학교 게놈 코어 시설에서 차세대 서열분석을 사용하여 전장 게놈 서열을 결정하였다.
뉴클레오티드 서열을 클러스탈(CLUSTAL) W 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬시켰다. 진화 의학 및 정보 센터 (미국 애리조나주 템피)에서 입수가능한 분자 진화 유전학 분석 (MEGA4) 소프트웨어를 사용하여, 생성된 거리 매트릭스에 대해 이웃-연결 거리 분석을 수행하였다. NJBOOT를 사용하여 5000개의 복제물로부터 부트스트랩 옵션을 수행하여, 계통수의 내부 가지의 강건성을 평가하였다.
총 32종의 PRRSV 필드 분리주를 백신 후보로서 그의 잠재력에 대해 평가하였다. 처음에, 계통발생학적 분석을 위해 바이러스의 가장 초가변 영역 중 3개 (nsp1, nsp2 및 ORF5)를 서열분석하였다. 도 1-3은 nsp1, nsp2 난소 종양 (OTU) 도메인, 또는 ORF5의 서열에 기초하여 이웃-연결 방법에 의해 구축된 계통수의 결과를 보여준다. 계통수 내의 각각의 주요 클러스터를 대표하는 9종의 분리주 (박스로 강조표시됨)를 추가의 특징화를 위해 선택하였다. 모든 3개의 계통수에서, 분리주 ND99-14 및 ND99-17은 현재의 상업적 PRRSV 백신 균주를 함유하는 계통군으로부터 개별 계통군에 위치하였다. 이들 2종의 바이러스는 또한 인터페론 (IFN)-α 생산을 자극하는 능력을 갖는다 (도 4 참조). 분리주 SD95-10 및 SD95-47은 VR2332, 및 VR2332로부터 유래된 인겔백(INGELVAC)® PRRS MLV 균주와 동일한 계통군으로 그룹화되었다. 분리주 12-7455 및 SD11-21은 보다 최근의 필드 균주의 계통군을 나타낸다. nsp1 및 nsp2 OTU 도메인 계통수에서, SD04-89 및 SD98-163은 중국의 고도의 병원성 균주 JX143, 및 JA142 균주로부터 유래된 인겔백® PRRS ATP 균주가 포함된 계통군으로 그룹화되었다. ORF5 및 nsp2 OTU 도메인 계통수에서, MN05-68은 JX143 및 인겔백® PRRS ATP 균주가 포함된 계통군으로 그룹화되었다.
백신 개발에 대한 기준 중 하나는 후보 바이러스가 숙주 면역 반응을 자극하는 능력을 가져야한다는 것이다. 이전의 연구는 PRRSV가 숙주 세포의 선천성 면역 반응을 억제하고 nsp2가 인터페론 (IFN) 및 인터페론 자극된 유전자 (ISG)의 발현을 억제하는 선천성 길항제 중 하나라는 것을 제시하였다. 바이러스 균주가 인터페론 알파 (IFN-α)를 유도할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 돼지 대식세포를 상이한 필드 분리주로 MOI 1로 감염시키거나, 또는 모의 감염시켰다. 감염 후 24시간 째에 세포-배양 상청액을 수거하여, 이전에 기재된 바와 같이 (Lawson et al., Vaccine 28: 5356-64 (2010)) 형광 마이크로구체 면역검정을 사용하여 IFN-α 발현을 정량화하였다. 평균 형광 강도 값을 사용하여 IFN-α의 양을 결정하고, 결과를 모의-감염된 대조군 세포로부터의 평균 값과 비교하였다.
시험관내 탈ISG화 검정을 수행하여 ISG 발현을 억제하는 능력이 약한 바이러스를 선택하였다. 탈ISG화 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Sun et al., J. Virology 86(7): 3839-50 (2012)). 간략하게, HeLa 세포를 접합 효소 E1/E2/E3, FLAG-태그부착된 ISG15 및 PRRSV PLP2 (aa386-578)를 발현하는 플라스미드 DNA로 공동-형질감염시켰다. 공벡터 플라스미드를 대조군으로서 포함시켰다. 형질감염 6시간 후, 세포를 IFN-α 1,000 U/ml로 자극하였다. 자극 24시간 후에 세포를 수거하고, 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 막을 항-FLAG 항체로 프로빙하여 ISG15의 유리 및 접합된 형태의 발현을 검출하였다. PRRSV PLP2의 발현은 nsp2-특이적 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 분리주 SD95-10 및 SD11-21은 세포 단백질의 ISG화에 대해 낮은 효과를 가졌고, 이는 이들 2종의 분리주가 향후 백신 개발에 사용될 잠재력을 가질 것임을 시사한다. 본 발명자들은 바이러스가 IFN-α 발현을 자극하는 능력을 추가로 시험하였다. SD04-30 및 MO04-25는 IFN-α 생산을 증진시킬 수 있는 것으로 이전에 문서화되었다. 이들 2종의 분리주를 대조군으로서 사용하여, IFN-α 발현 수준을 PRRSV-감염된 돼지 폐포 대식세포에서 측정하였다. 본 발명자들이 예상한 바와 같이, SD04-30 및 MO04-25는 유의한 양의 IFN-α 발현을 자극하였다 (도 4). 대조적으로, 분리주 SD95-21, ND99-17, SD06-21 및 SD92-18은 SD04-30 및 MO04-25와 대등한 IFN-α 수준을 자극하였다. 분리주 MN91-45, ND99-14 및 NE06-05는 IFN-α 발현의 약한 자극을 나타내었다.
면역 검정 결과 및 계통발생 분석에 기초하여, 배양된 비-돼지 세포에서의 80회 계대배양 동안의 연속 계대배양을 위해 9종의 유형 2 분리주를 먼저 선택하였다. 이들 9종의 유형 2 바이러스에 더하여, SD03-15 (유형 1 균주), SD02-11 (유형 1 균주) 및 SD02-10 (유형 1 및 유형 2 바이러스의 믹스)을 또한 추가의 분석에 포함시켰다. 세포 배양에서 2회 플라크 정제를 위해 총 9종의 계대배양-80 (P80) 바이러스를 선택하고, 수크로스 쿠션을 통해 계대배양-82 (P82) 바이러스를 추가로 정제하고, 바이러스 스톡으로서 저장하였다. 각각의 후보 백신 바이러스의 계대배양 동안 바이러스 역가를 결정하였고, 이는 4.5-7 log 형광 초점 단위 (FFU)/ml 범위였다. 5 log FFU/ml보다 낮은 역가를 갖는 바이러스 분리주는 추가의 연구에서 제외하였다. 11종의 후보 바이러스 분리주에 대한 전장 게놈 서열은 2013년 2월 11일에 처음 결정되었고, 플라크 정제 및 수크로스 쿠션에 의해 정제된 9종의 후보 백신 바이러스 (P83)의 최종 생성물을 다시 서열분석하여 2013년 12월 22일에 문서화하였다.
계대배양 83 (P83)에서의 9종의 PRRS 바이러스 분리주에 대한 cDNA 컨센서스 서열을 진뱅크(GenBank) 유전자 서열 데이터베이스에 기탁하고, 모든 공중 이용가능한 핵산 서열의 집합으로 주석을 달았다. 진뱅크 데이터베이스는 미국 국립 보건원 (NIH)의 일부인 국립 생물 정보 센터 (NCBI)에 의해 유지된다. 진뱅크는 국제 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 협업의 일부이다.
P83에서의 PRRS 균주 SD 95-10의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131565 (서열식별번호: 1)를 배정받았다. 서열식별번호: 1로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 95-47의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131564 (서열식별번호: 2)를 배정받았다. 서열식별번호: 2로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 98-163의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131563 (서열식별번호: 3)을 배정받았다. 서열식별번호: 3으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 ND 99-14의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131562 (서열식별번호: 4)를 배정받았다. 서열식별번호: 4로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 02-10의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131561 (서열식별번호: 5)을 배정받았다. 서열식별번호: 5로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 03-15의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131560 (서열식별번호: 6)을 배정받았다. 서열식별번호: 6으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 04-89의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131559 (서열식별번호: 7)를 배정받았다. 서열식별번호: 7로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 MN 05-68의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131558 (서열식별번호: 8)을 배정받았다. 서열식별번호: 8로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
P83에서의 PRRS 균주 SD 11-21의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131557 (서열식별번호: 9)을 배정받았다. 서열식별번호: 9로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 다음과 같다:
관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 2
본 연구의 목적은 병독성 PRRS 바이러스에 의한 이종 챌린지 후 성장 중인 돼지에서의 실험적 PRRSV 백신의 효능을 평가하기 위한 것이다. 시험 백신의 효능은 비-백신접종된 대조군과 비교하여 폐 병변 및 바이러스혈증을 감소시키는 백신의 유효성을 기초로 하였다. 이 연구의 설계를 표 1에 제공한다.
표 1. 연구 설계.
1 형광 초점 단위 (FFU).
2 위약 대조군 동물에는 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 제공하였다.
3 IM = 근육내.
챌린지 전 단계는 연구 장소에 도달한 날 (제-1일)에서 챌린지 날 (제35일)까지이다. 형광 초점 중화 (FFN) 시험을 사용한 PRRSV 혈청 항체 결정을 위해 혈액 샘플을 제0일, 제14일, 제28일 및 제35일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제0일 및 제35일에 수집하였다. 바이러스 로드를 평가하기 위한 비강 스왑은 제0일 및 제35일에 수집하였다. 체중 측정 (lb)은 제0일 및 제35일에 챌린지 전에 행하였다.
제35일에, 3 mL 비-루어 록(luer lock) 시린지를 사용하여 2 mL 용량을 비강내로, 비공당 대략 1 mL를 전달하였다. 챌린지 후 단계는 제35일부터 제49일까지였다. 모든 돼지를 제35일-제49일 동안 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. PRRSV 혈청 항체 결정 (FFN)을 위한 혈액 샘플을 제42일 및 제49일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 바이러스 로드를 평가하기 위한 비강 스왑은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 체중 측정치는 제49일에 부검 시 수득하였다. 제49일에, 동물을 현장 표준 수술 절차에 따라 인도적으로 안락사시키고, 치료에 대해 맹검상태인 연구 조사자가 폐를 점수화하였다. 7개의 폐엽 각각을 PRRSV에 기인한 거시적인 특징적 병변에 대해 시각적으로 및 촉진 둘 다에 의해 검사하였다. 각각의 폐엽 내 병변/경화의 양을 엽의 0 내지 100% 실제로서 점수화하였다. 각각의 엽에 대한 점수를 칭량 공식에 입력하여 병변을 갖는 폐의 백분율을 계산하였다.
PRRSV에 대해 혈청-음성이고 양호한 건강상태인 것으로 평가된, 대략 3주령의 96마리의 이유된 교배육종 미분만돼지 및 거세돼지를 본 연구에 사용하였다. 연구 장소에 도달했을 때, 선택된 연구 동물을 무작위로 치료군 (T01-T09) 및 연구 우리로 배정하였다. 도달했을 때 하기 포함 기준을 충족시키는 모든 후보 동물을 연구에 포함시켰고, 기준을 충족시키지 못하는 것은 제외하였다: 1) 제0일에 혈청 중화 시험 (FFN)에 의할 때 PRRSV에 대해 혈청음성; 및 2) 제0일에 수행된 신체 검사에 기초하여 양호한 건강상태인 것으로 임상 평가된 동물.
연구 장소에 도달한 후, 돼지를 5개의 BSL-2 환경-제어된 봉쇄 룸에 치료군별로 수용하였다. 각각의 봉쇄 룸은 우리당 5마리의 돼지를 둘 수 있는 5개의 우리를 가졌다. 각각의 백신접종 룸 내의, 2개의 치료군을 플라스틱 울타리 벽으로 분리하였고, 군은 동일한 공기공간을 공유하지 않았다. 룸 내의 백신접종 군을 분리한 2개의 구역 사이에는 방역을 철저하게 유지시켰다. 돼지에게 생산에 적절한, 표준 돼지 사육 사료 (NRC, 2012)를 자유롭게 공급하였다. 돼지는 깨끗한 음용수에 자유롭게 접근하였다.
전반적 건강 관찰은 연구 장소에 도달한 시간부터 챌린지 전날까지 (제-1일에서 제34일) 1일 1회 수행하였다. 모든 돼지를 제35일-제49일에 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 점수화 시스템에 규정된 바와 같이 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다.
제35일 전에 임상적으로 유의한 병행 질환이 발생한 동물은 연구에서 제거하였다. 제외 전에 돼지에서 수집된 임의의 데이터는 데이터 분석에 포함시키지 않았다. 제35일에 챌린지 후, 사망한 채로 발견되거나 죽음에 임하여 희생시킨 임의의 돼지를 부검하여 가능한 경우에 사망 원인을 결정하였다. 에스. 수이스(S. suis)에 기인한 사망 및 동일한 우리 (T08)에서 확인된 질병으로 인해, 엑세데(EXCEDE)® 항생제 (조에티스 애니멀 헬스(Zoetis Animal Health))를 필요에 따라 개별 연구 동물에게, 및 제30일에 모든 동물에게 투여하였다.
모든 후보 PRRSV 균주를 MARC-145 세포 상에서 83회 계대배양하였다. 8종의 백신 각각에 대한 역가를 결정하였고, 이는 표 I에 제시된 바와 같다. USDA 9 C.F.R. 요건에 따른 멸균 시험을 네브래스카주 링컨 소재의 벤치마크 바이오랩스(Benchmark BioLabs)에서 성공적으로 완료하였다. 백신은 제약상 허용되는 부형제, 즉, 생리 염수 중에 PRRSV를 포함하였다.
사용 직전에, PRRSV NADC-20 챌린지 균주의 3개의 1 mL 스톡 바이알을 실온에서 해동시키고, 스톡 3 mL를 멸균 용기 내의 미디어테크, 인크.(Mediatech, Inc.)로부터의 얼스 염 및 L-글루타민을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) 이글 297 mL에 첨가하였다. 접종물 (바이러스 스톡 및 배지로 이루어짐)을 수동 혼합하고, 동물에게의 투여 동안 습윤 얼음 상에 유지시켰다. 챌린지 전에, 역가 결정을 위해 진단 실험실에 제출하기 위한 멸균 용기 내에 5 mL의 챌린지 접종물을 직접 분취하였다. 역가 결과는 102.75 TCID50/mL였다.
동물은 실험 유닛이다. 군 사이의 차이를 양측 검정, 알파 = 0.05를 사용하여 평가하였다.
병변이 있는 총 폐의 백분율을 하기 공식에 따라 계산하였다:
병변이 있는 총 폐의 백분율 = {(0.10 x 좌측 정단) + (0.10 x 좌측 심장) + (0.25 x 좌측 횡경막) + (0.10 x 우측 정단) + (0.10 x 우측 심장) + (0.25 x 우측 횡경막) + (0.10 x 중간)}.
각각의 위약/백신접종 쌍에 대해 완화 분율 및 연관 95% 신뢰 구간을 계산하여 (MF; CI; 노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트(SAS Institute)의 SAS® 소프트웨어의 FREQ 절차), 총 폐 병변의 백분율에 대한 백신접종의 영향을 평가하였다. 또한, 병변이 있는 총 폐의 백분율을 추가의 분석 전에 아크사인 제곱근을 사용하여 변환시켰다. 변환된 데이터를 유일한 인자로서 고정된 치료 효과를 포함하는 혼합 선형 모델에 의해 분석하였다 (SAS® 소프트웨어의 믹스드(MIXED) 절차). 치료의 효과가 통계적으로 유의하면, 선형 대조 및 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 위약 및 백신접종된 군 사이의 쌍별 비교를 행하였다. 백신접종된 돼지가 대조군과 비교 시 폐 병변 점수에서 유의한 감소를 나타낼 경우, 백신은 시험 대상이 된다.
반복 측정에 적절한 방법을 사용하여 정규 분포의 가정 하에 바이러스혈증 값에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다 (노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트의 SAS® 소프트웨어의 믹스드 절차). 분석 전 데이터를 변환하여 나머지를 안정화하였다. 통계 모델은 고정 효과로서 치료, 시간, 및 시간별 치료 상호작용을 포함하였다. 시간별 치료 상호작용이 유의하면, 그러한 시간 내 백신 치료의 효과를 평가하였다. 시간 내 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 치료의 주요 효과를 평가하였다. 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 최소 제곱 평균, 표준 오차, 평균의 95% 신뢰 구간, 및 범위를 적절하게 나타내었다.
연속 또는 이항 데이터의 반복 측정에 적절한 방법을 사용하여 정규/이항 분포의 가정 하에 혈청 항체 및 비강 스왑 값에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다 (노스 캐롤라이나주 캐리 소재의 SAS 인스티튜트의 SAS® 소프트웨어의 믹스드 또는 글림믹스(GLIMMIX) 절차). 분석 전 데이터를 변환하여 나머지를 안정화하였다. 통계 모델은 고정 효과로서 치료, 시간, 및 시간별 치료 상호작용을 포함하였다. 시간별 치료 상호작용이 유의하면, 시간 내 치료의 효과를 평가하였다. 시간 내 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 치료의 주요 효과를 평가하였다. 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 사이의 비교를 행하였다. 최소 제곱 평균, 표준 오차, 평균의 95% 신뢰 구간, 및 범위를 적절하게 나타내었다.
체중 (제35일 및 제49일), 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수 (제35일-제49일)를 반복 측정에 적절한 ANCOVA를 사용하여 통계적으로 분석하였다 (믹스드 절차). 적절한 경우에, 제0일 값을 공변량으로서 포함시켰다. 치료군, 시간, 및 시간별 군 상호작용을 모델에 고정 효과로서 포함시켰다. 상호작용항이 유의하면, 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 각각의 백신접종 군을 대조군과 비교하여 시간 내 군 효과를 평가하였다. 상호작용이 유의하지 않으면, 군의 주요 효과를 평가하고, 유의하면, 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 각각의 백신접종 군을 대조군과 비교하여 군 효과를 평가하였다. 연구 동안 오직 1건의 사망만이 존재하여 사망률은 평가하지 않았다.
대조군의 평균 퍼센트 폐 침범은 37.9% (표 2)였고, 이는 유형-2 균주 NADC-20을 사용하여 이러한 PRRSV 챌린지 모델에 대해 예상된 병리상태 (범위 30 내지 50%, L. Kesl of Veterinary Resources, Inc., personal communication)와 일치하였다. PRRS 바이러스 챌린지는 백신 균주 후보를 평가하는데 충분한 것으로 결론내려졌다.
평균 폐 병변 점수를 표 2에 나타낸다. PRRSV EU-유사 (즉 유형 1 PRRSV) 균주 SD 03-15를 함유하는 백신을 제외하고, 모든 실험적 백신은 대조군과 비교하여 폐 병변을 감소시켰다 (P<0.05). 주목할 것으로, 균주 SD 95-10, SD 11-21 및 ND 99-14는 높은 정도의 보호를 유도하여 매우 낮은 폐 침범을 발생시켰다 (각각 2.7%, 1.0% 및 1.6%). 균주 SD 04-89 및 SD 02-10이 허용되는 한편, 균주 SD 95-47 및 MN 05-68도 또한 잘 수행하였다. 각각의 백신 대 대조군의 완화 분율을 표 3에 제시한다. 이들 결과는 약독화된 PRRSV 균주 SD 95-10 (T04), SD 11-21 (T05) 및 ND 99-14 (T08)로 백신접종된 돼지가 대조군의 돼지보다 덜 중증인 폐 병변을 가질 확률이 적어도 90%임을 나타낸다.
표 2. 평균 폐 병변 점수.
1비변환된 평균.
2역 변환된 평균.
*T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
표 3. 폐 병변 점수.
1완화 분율은 백신접종 폐 병변 (T02-T09)이 비-백신접종 폐 병변 (T01)보다 덜 중증일 확률의 상대적 증가를 의미함.
바이러스 배출의 지표로서, 비즙으로부터 qtRT-PCR에 의해 열거된 PRRSV의 기하 평균을 표 4에 나타낸다. 균주 SD 02-10으로 백신접종된 돼지를 제외하고, 제35일에 모든 백신접종된 군의 비강 스왑에서 백신 바이러스가 검출되었다. 균주 SD 03-15, SD 95-10 및 SD 95-47로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지보다 통계적으로 더 많은 (P<0.05) 게놈 카피/mL를 가졌고, 평균 값은 각각 277, 337 및 7 게놈 카피/mL였다. 제35일에 챌린지 시, 모든 군은 제38일, 제42일, 제45일 및 제49일 (각각 챌린지 후 3, 7, 10 및 14일 (DPC))에 일부 바이러스를 배출하였다. 균주 SD 95-10, SD 95-47 및 ND 99-14로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 모든 시점에서 대조군보다 낮은 (P<0.05) 수준의 배출을 가졌다. 10 및 14 DPC에, 균주 SD 04-89 및 SD 03-15를 제외한 모든 백신 균주는 대조군과 비교하여 배출에서 감소 (P<0.05)를 유도하였다.
표 4. 비강 스왑 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.
*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
혈청으로부터 qtRT-PCR에 의해 열거된 PRRSV의 기하 평균 (게놈 카피/mL)을 표 5에 나타낸다. 모든 백신접종된 군은 제35일의 백신접종에 기인한 일부 측정가능한 바이러스혈증을 가졌지만, SD 04-89 및 SD 11-21로 백신접종된 군에서의 수준은 음성인 대조군과 통계적으로 상이하지 않았다 (P >0.05). 제35일의 챌린지 시, 모든 군은 3, 7, 10 및 14 DPC에 바이러스혈증성이었다. 균주 SD 95-10 및 ND 99-14로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 모든 시점에서 대조군보다 낮은 (P < 0.05) 수준의 바이러스혈증을 가졌다. 10 및 14 DPC에, 균주 SD 04-89 및 SD 03-15를 제외한 모든 백신 균주는 대조군과 비교하여 바이러스혈증에서 감소 (P < 0.05)를 유도하였다.
표 5. 혈청 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.
*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
표 6에 제시된 바와 같이, 기하 평균 형광 초점 중화 (FFN) 역가를 측정하여 혈청전환을 결정하였다. 대조군 동물은 제35일 (챌린지일)까지 혈청음성으로 유지되었고, 제42일 (7 DPC)에 혈청전환되기 시작하여, 제49일 (14 DPC)에 혈청전환되었다. 모든 백신접종된 군은 SD 03-15를 제외하고 백신접종 후 제14일에 혈청전환되었다. 모든 백신접종 군에서 기하 평균 역가는 제28일, 제35일 및 제42일에 대조군의 것을 초과하였고 (P<0.05), 이는 제49일의 대조군의 것과 유사하거나 또는 그 미만이었다. 백신접종 군에서의 최고 FFN 역가 반응은 제35일 및 제42일에 일어났다. 균주 SD 95-10, SD 11-21, SD 95-47 및 ND 99-14는 가장 강건한 혈청학적 반응을 도출하는 것으로 보였다.
표 6. 형광 초점 중화 (FFN) 역가의 기하 평균.
*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
최소 제곱 평균 체중을 표 7에 포함시켰다. 제0일 체중을 분석에서 공변량으로서 사용하였다. 챌린지일 (제35일)에, 각각 균주 SD 03-15, SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68로 백신접종한 4개의 군은 대조군의 것보다 낮은 평균 체중을 가졌다 (P<0.05). 모든 다른 군은 대조군의 것과 유사한 평균 체중을 가졌다 (P>0.05). 부검일 (제49일), 14 DPC에, 균주 SD 11-21, SD 95-47 및 ND 99-14로 백신접종된 3개의 군은 대조군의 것을 초과하는 평균 체중을 가졌다 (P<0.05). 모든 다른 군의 체중은 대조군의 것과 유사하였다 (P>0.05).
표 7. 최소 제곱 평균 체중 (lb).
*일 내에서 T01 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
합산한 임상 점수 (호흡 + 우울증 + 신체 상태)의 평균을 각각의 동물에 대해 수집하여 각각의 군별로 평균하였다. 임상 징후는 챌린지 후 최대 7일 동안 임의의 군에서 분명하지 않았다. 제42일 및 제43일에, 임상 징후가 백신 군의 일부에서 명백하였지만 그의 평균 점수는 대조군의 것과 상이하지 않았다 (P < 0.05). 제44일에서 제49일까지, 모든 백신 군은, 제44일에 균주 SD 04-89 및 SD 02-10으로 백신접종된 군을 제외하고, 대조군보다 낮은 합산 점수를 가졌다 (P < 0.05).
결론적으로, 8종의 약독화된 PRRSV 백신 균주가 바이러스 챌린지 모델에서 성공적으로 평가되었다. EU-유사 균주 SD 03-15를 제외하고, 모든 균주는 병독성 NADC-20 유형-2 PRRSV에 의한 챌린지에 대해 일부 보호를 도출하였다. 4종의 균주, SD 11-21, SD 95-10, SD 95-47, 및 ND 99-14는, 폐 병변 및 바이러스혈증의 보다 높은 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 최대의 보호를 제공하였다.
실시예 3
본 연구의 목적은 2종의 별개의 병독성 PRRSV 유형-2 균주에 의한 챌린지 후 성장 중인 돼지에서의 4종의 실험적 PRRSV 백신의 교차-보호 효능을 평가하기 위한 것이다. 효능은 폐 병변 및 바이러스혈증의 정도에 의해 평가하였다. 연구는 아이오와주 캠브리지 소재의 베테리너리 리소시즈, 인크.(Veterinary Resources, Inc.) (VRI)의 BSL-2 시설에서 수행하였다. 연구 설계를 표 8에 제공한다.
표 8. 연구 설계.
1 형광 초점 단위 (FFU).
2 위약 대조군 동물에는 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 제공하였다.
건강 관찰을 수행하거나 샘플을 수집하는 연구 인력은 치료 실체에 대해, 뿐만 아니라 치료군으로의 돼지의 배정에 대해 맹검상태에 있다. 바이러스 중화 시험 (FFN)에 의해 PRRSV에 대해 혈청음성이고 양호한 건강상태인 것으로 평가된, 대략 3주령의 100마리의 이유된 교배육종 미분만돼지 및 거세돼지를 본 연구에 사용하였다. 돼지는 위스콘신주 버링턴 소재의 윌슨 프레리 뷰 농장에서 공급되었다. 제-1일에, 돼지를 치료 및 우리로 할당하고, 3개의 BSL-2 봉쇄 룸의 우리 내에 치료군별로 수용하였다. 각각의 룸 내의 4개의 백신접종 군을 빈 우리 또는 좁은 통로 및 단단한 우리 파티션으로 분리하여 다른 우리와의 임의의 직접 접촉 및 폐기물 오염을 방지하였다. 돼지에게 표준 상업용 약물첨가 (CTC/DENAGARD® 항생제) 출발 식이 (NRC, 2012)를 자유롭게 공급하였다. 돼지는 깨끗한 음용수에 자유롭게 접근하였다.
전반적 건강 관찰은 연구 장소에 도달한 시간부터 챌린지 전날까지 (제-3일에서 제34일) 1일 1회 수행하였다. 모든 돼지를 제35일-제49일에 우울증, 신체 상태 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다.
이유 및 VRI로의 운송 전, 각각의 돼지를 단일 용량의 바이탈(VITAL) E-500 (비타민 E), 단일 용량의 엑세데® 항생제 (세프티오푸르 결정질, 조에티스 애니멀 헬스)로 치료하고, 인겔백 썰코플렉스(INGELVAC CIRCOFLEX)® 백신 (베링거 잉겔하임 베트메디카(Boehringer Ingelheim Vetmedica))으로 백신접종하였다. 또한, 모든 돼지에게 제13일 또는 제14일에 단일 용량의 엑세데® 항생제를 투여하였다.
임상 질병 또는 손상의 징후를 나타내는 임의의 돼지는 연구에서 제거하였다. 진단 평가를 위해 관련 샘플을 아이오와 주립 대학교 수의학 진단 실험실 (VDL)에 제출하였다. 동물의 챌린지 후 연구에서 제거된 날짜, 이유, 및 배치를 기록하였다. 연구에서 제거된 돼지에 대해 수집된 데이터는 통계적 분석에서 제외하였다.
모든 후보 PRRSV 균주를 MARC-145 세포 상에서 83회 계대배양하였다. 4종의 백신 각각에 대한 역가를 결정하였다. USDA 9 CFR 요건에 따른 멸균 시험을 네브래스카주 링컨 소재의 벤치마크 바이오랩스에서 성공적으로 완료하였다. 백신을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.
연구에 등록된 100마리의 돼지 각각을 제0일에 백신접종하였다. 돼지에게 그의 배정된 치료를 0.5 mL 근육내 용량으로서 목의 우측으로 주사하였다. 주사 후 1시간 내에, 연구 조사자는 각각의 돼지를 임의의 유해 사건에 대해 검사하였다.
백신접종 후 단계는 제1일에서 제35일까지이다. 형광 초점 중화 (FFN) 시험을 사용한 PRRSV 혈청 항체 결정을 위해 혈액 샘플을 제-1일, 제14일, 제28일 및 제35일에 수집하였다. FFN 검정을 위해, 혈청의 2배 희석물 (1:4 내지 1:512)을 각각 동등 부피의, 100 초점 형성 단위 (FFU)의 시험 PRRSV 균주 (MN-184)를 함유하는 배양 배지와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 96-웰 조직 배양 플레이트 내의 MARC-145 세포의 전면생장 배양물에 첨가하였다. 약 1일 후, 플레이트를 물 중 80% (v/v) 아세톤 중에 고정시키고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합된 (FITC) 항-N-단백질 모노클로날 항체 SDOW17과의 인큐베이션에 의해 감염된 세포 (초점)를 검출하였다. 혈청 대조군과 비교하여 초점 형성을 약 90% 감소시키는 최고 희석의 역수로서 혈청 중화 FFN 역가를 표현하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위해 혈액 샘플을 제-1일, 제14일 및 제35일에 수집하였다. 바이러스 배출을 평가하기 위한 비강 스왑은 제-1일, 제14일 및 제35일에 수집하였다. 체중 측정치 (lb)는 제-1일 및 제35일 챌린지 전에 인증된 추로 보정된 저울눈을 사용하여 수득하였다.
MN-184 PRRSV 챌린지 균주 (아이오와 주립 대학교 VDL로부터 수득함)는 남부 미네소타에서 중증 생식 질환 및 암퇘지 사망을 겪은 돼지 무리로부터의 2001마리로부터 단리하였다. KS-11 PRRSV 챌린지 균주 (캔자스 주립 대학교 VDL로부터 수득함)는 북동부 캔자스에서 중증 생식 질환을 경험한 돼지 무리로부터의 2011마리로부터 단리하였다. 제35일에, 챌린지 직전에 MN-184 및 KS-11의 동결 분취물을 해동시켜 챌린지 물질을 제조하였다. 챌린지 물질은 어떠한 희석도 필요없는 즉시 사용가능한 형태이다. 각각의 접종물의 샘플 (MN-184 및 KS-11)을 역가 결정을 위해 ISUVDL에 제출하였다. MN-184 및 KS-11 균주의 경우 제0일 역가는 각각 4.2 x 105 및 6.7 x 103 TCID50/ml인 것으로 결정되었다. 3 mL 비-루어 록 시린지를 사용하여 2 mL 용량을 비강내로, 비공당 대략 1 mL를 전달하였다.
챌린지 후 단계는 제35일에서 제49일까지이다. 제35일에서 제49일에 모든 돼지를 우울증, 신체 상태, 및 호흡 곤란에 대해 개별적으로 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. 또한 이와 동일한 기간 동안 보정된 온도계를 사용하여 직장 온도 (℉)를 기록하였다. PRRSV 중화 항체 결정 (FFN)을 위한 혈액 샘플을 제42일 및 제49일에 수집하였다. PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 바이러스 배출을 평가하기 위한 비강 스왑은 제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일에 수집하였다. 체중 측정치 (lb)는 제49일에 부검 시 인증된 추로 보정된 저울눈을 사용하여 수득하였다. 제49일에, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 치료에 대해 맹검상태인 연구 조사자가 폐를 절제하여 점수화하였다. 7개의 폐엽 각각을 PRRSV에 기인한 거시적인 특징적 병변에 대해 시각적으로 및 촉진 둘 다에 의해 검사하였다. 각각의 폐엽 내 병변/경화의 양을 엽의 0 내지 100% 실제 값으로서 점수화하였다. 각각의 엽에 대한 점수를 칭량 공식에 입력하여 병변을 갖는 폐의 백분율을 계산하였다.
병변을 갖는 총 폐의 백분율을 실시예 2에 주어진 공식 및 절차에 따라 계산하였다.
직장 온도, 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수 (제35일에서 제49일)를 반복 측정에 적절한 방법 (믹스드 절차)을 사용하여 통계적으로 분석하였다. 임상 점수를 각각의 동물에 대해 1일 내 합산하였다. 합산 점수를 개별 점수에 대해 상기 기재된 바와 같이 통계적으로 분석하였다.
평균 매일 체중 증가 (ADWG)를 하기 기간 동안 결정하였다: 제-1일 내지 제35일; 제-1일 내지 제49일; 및 제35일 내지 제49일. 각각의 기간 동안의 평균 매일 체중 증가 (ADWG)는 ANOVA (믹스드 절차)를 사용하여 분석하였다. 치료를 고정 효과로서 모델에 포함시켰고, 차단은 임의 효과로서 포함시켰다. 치료의 주요 효과가 유의한 경우, 각각의 백신접종 군을 대조군과 비조정 알파 = 0.05를 사용하여 비교하여 치료 효과를 평가하였다.
1마리의 돼지 (T09)가 의심되는 에스. 수이스 감염으로 인해 제28일에 사망하였다. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)와 연관된 기관지폐렴으로 인해, 1마리는 T03으로부터의 것이고 또 다른 것은 T09로부터의 것인 2마리의 돼지를 연구에서 제거하였다. 어떠한 유해 사건도 백신에서 기인하지 않았다.
MN-184로 챌린지된 대조군에서 폐 병변의 평균 퍼센트는 52.4%였고, 이는 이러한 PRRSV 챌린지 균주에 대해 예상된 병리상태와 일치하였다. KS-11로 챌린지된 대조군에서 폐 병변의 평균 퍼센트는 22.5%였다. 이러한 PRRSV 균주는 이전에 챌린지 물질로서 사용된 바 없고, 따라서 예상되는 폐 병리상태의 정도는 미지였다. 본 연구에서 달성된 수준은 백신 후보를 평가하는데 충분한 것으로 간주되었다.
PRRSV와 연관된 질환의 방지를 위해, 챌린지 후 폐 병변 및 바이러스혈증은 주요 결과 변수였다. 백신접종된 군의 평균 폐 병변 점수 및 바이러스혈증 수준이 대조군의 것보다 유의하게 낮으면 (P < 0.05) 효과적인 것으로 간주되었다.
평균 폐 병변 점수 (역-변환된 평균)를 표 9에 제시한다. MN-184로 챌린지된 경우에, 모든 백신접종된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 낮은 (P < 0.05) 폐 병변을 가졌다. KS-11 균주로 챌린지되고 SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 낮은 (P < 0.05) 폐 병변을 가졌다. MN 05-68 균주로 백신접종되고 KS-11 균주로 챌린지된 돼지는 비-백신접종된 대조군 돼지와 비교하여 유사한 (P > 0.05) 폐 병변을 가졌다.
비-변환된 데이터로부터 완화 분율 및 연관 95% 신뢰 구간을 계산하여 폐 병변 점수에 대한 백신접종의 효과를 평가하였다. 표 10에 제시된 바와 같이, 완화 분율은 -0.06 내지 0.98 범위였다. 95% 신뢰 구간은 MN 05-68 균주로 백신접종되고 KS-11 균주로 챌린지된 돼지의 경우 0을 포함하였고, 이는 폐 병변 점수에 대해 백신접종의 효과가 없다는 것을 나타낸다. 모든 다른 백신은, 챌린지 균주와 관계 없이, 폐 병변 점수를 감소시키는데 있어서 백신접종의 효과를 나타내었다.
표 9. 평균 폐 점수 - 폐 침범 퍼센트.
1 비변환된 평균.
2 역 변환된 평균.
* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
표 10. 폐 병변 점수.
1완화 분율은 백신접종 (T02-T05, T07-T10) 폐 병변이 비-백신접종 (T01, T06) 폐 병변보다 덜 중증일 확률의 상대적 증가를 의미함.
비강 배출 데이터의 분석 결과를 표 11에 요약한다. 백신접종된 군에 대한 시간별 치료 상호작용은 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 백신 바이러스 배출은 제14일에 모든 백신 군에서 검출되었다. 제35일에, MN-184 챌린지 룸에서 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지 만이 대조군 돼지보다 더 높은 수준으로 (P < 0.05) 백신 바이러스를 배출하였다.
MN-184 균주에 의한 챌린지 시, ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 각각의 챌린지 후 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 대조군 돼지와 비교하여 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌다. SD 95-10 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제42일, 제45일, 및 제49일에 대조군 돼지와 비교하여 유의하게 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 제38일에 대조군 돼지와 비교하여 더 높은 배출을 가졌지만, 제42일, 제45일, 및 제49일에는 더 낮은 (P < 0.05) 배출을 가졌다.
KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제45일에 감소된 (P < 0.05) 비강 배출을 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제49일에 유의하게 더 낮은 비강 배출을 입증하였다. MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일에 감소된 (P < 0.05) 배출을 가졌지만, 제42일, 제45일, 및 제49일에는 2개의 치료군이 상이하지 않았다 (P > 0.05).
표 11. 비강 스왑 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.
* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
바이러스혈증의 분석 결과를 표 12에 요약한다. 시간별 치료 상호작용은 백신접종된 군의 경우 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 예상된 바와 같이, 모든 백신접종된 군은 백신접종 후 제14일 및 제35일에, 백신 바이러스의 존재로 인해 그의 각각의 대조군과 비교하여 더 높은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다.
표 12. 혈청 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.
* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 모든 백신접종된 군은 챌린지 후 각각의 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 대조군과 비교하여 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다. KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 각각의 시점에 (제38일, 제42일, 제45일, 및 제49일) 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다. MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 제42일, 및 제49일에 더 낮은 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌고, SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 제38일, 및 제49일에 감소된 (P < 0.05) 바이러스혈증 수준을 가졌다.
혈청학의 분석 결과를 표 13에 요약한다. 시간별 치료 상호작용은 백신접종된 군의 경우 챌린지 대조군과 비교하여 고도로 유의하였다 (P < 0.0001). 모든 돼지는 백신접종 전 제-1일에 혈청음성이었다. 바이러스 중화 항체가 SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지에서, 챌린지 균주와 관계 없이, 제28일부터 검출되기 시작하였고, 연구 지속기간 내내 계속 존재하였다. 바이러스 중화 항체는 SD 95-10 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지에서 대조군 돼지와 비교하여 제28일, 제35일, 제42일, 및 제49일에 더 높았다 (P < 0.05).
표 13. 형광 초점 중화 (FFN) 역가의 기하 평균.
* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 바이러스 중화 항체는 SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지에서 제42일까지 나타나지 않았고, 제49일까지 그러하였다. 바이러스 중화 항체는 둘 다의 시점에 대조군 돼지보다 더 높았다 (P < 0.05). MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제49일까지 검출가능한 바이러스 중화 항체 수준을 갖지 않았지만, 수준은 대조군의 돼지의 것보다 더 높았다 (P < 0.05).
KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 11-21 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 제49일까지 검출가능한 바이러스 중화 항체 수준을 갖지 않았지만, 둘 다의 백신 균주의 경우 수준은 대조군 돼지와 비교하여 더 높았다 (P < 0.05).
연구 지속기간 내내 대조군 중 어느 것에서도 바이러스 중화 항체는 검출되지 않았다. 바이러스 중화 항체는 종종 노출후 28-35일까지는 검출되지 않기 때문에, 이는 예상외의 것은 아니었다.
직장 온도 및 합산 임상 점수 (호흡 + 우울증 + 신체 상태)의 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 고도로 유의한 (P < 0.0005) 시간별 치료 상호작용이 둘 다의 챌린지 군에 대해 관찰되었다.
MN-184 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교하여 챌린지 약 6일 후 (제41일)에 시작된, 일관되게 더 낮은 (P < 0.05) 체온 및 임상 점수를 가졌다. SD 11-21 균주로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교하여 챌린지 약 8일 후 (제43일)에 시작된, 일관되게 더 낮은 (P < 0.05) 체온 및 더 적은 (P < 0.05) 임상 징후를 가졌다. 체온의 유의한 감소 (P < 0.05)는 SD 95-10, ND 99-14 및 MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지에서 챌린지 후 2일 일찍 주목되었다.
KS-11 균주에 의한 챌린지 시, 4종의 백신 균주 중 어느 하나로 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 챌린지 9일 후 (제44일)에 시작된, 임상 점수에서 유의한 감소 (P < 0.05)를 가졌고, 연구 완료 내내 계속해서 더 적은 (P < 0.05) 임상 징후를 가졌다. 체온은 SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 군에서 챌린지 약 6일 후에 감소되기 시작하였다 (P < 0.05). MN 05-68 균주로 백신접종된 돼지만이 대조군 돼지와 비교할 경우 제37일 및 제46일에 더 낮은 (P < 0.05) 체온을 가졌다.
체온 증가 데이터의 분석을 표 14에 제시하며, 기간별 체중 증가의 최소 제곱 평균으로서 제공한다. 제35일-제49일의 챌린지 후 기간 동안 체중 증가에 대해 백신 효과가 존재하였다. 이는 제-1일에서 제49일의 전체 치료 기간 동안 백신 효과를 발생시켰다. 챌린지 전 기간 (제-1일에서 제35일) 동안은 군 사이에 체중 증가 차이가 존재하지 않았다 (P > 0.05). 챌린지 후 기간 (제35일-제49일) 동안, 모든 백신접종된 군은, 백신 균주에 관계 없이, MN-184 및 KS-11 챌린지 둘 다의 경우에 대조군 돼지와 비교하여 개선된 (P < 0.05) ADWG를 가졌다. SD 95-10, ND 99-14, 및 MN 05-68 균주에 의한 백신접종은 MN-184 챌린지 룸에서 대조군 돼지와 비교하여 전체 ADWG (제-1일에서 제49일)를 개선시켰다 (P < 0.05). 전체 ADWG는 SD 11-21로 백신접종되고 MN-184로 챌린지된 돼지에서, 대조군 돼지와 비교하여 상이하지 않았다 (P > 0.05). 모든 균주에 의한 백신접종은 KS-11 챌린지 룸에서 대조군 돼지와 비교하여 전체 ADWG (제-1일에서 제49일)를 개선시켰다 (P < 0.05).
표 14. 최소 제곱 평균 체중 증가 (lb).
* 챌린지 균주 내에서 대조군 대비, P < 0.05로 유의하게 상이함.
결론적으로, 모든 백신접종된 군은 백신접종 14 및 35일 후에 바이러스혈증성이었고, 백신 바이러스를 배출하였다.
MN-184 균주에 의한 챌린지 시, 모든 백신은 챌린지 후 기간 동안 폐 병변, 바이러스혈증, 비강 배출, 임상 징후 및 직장 온도를 감소시켰다 (P < 0.05). 또한, 모든 백신은 챌린지 후 기간 동안 ADWG를 개선시켰다 (P < 0.05).
KS-11 균주에 의한 챌린지 시, SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주로 백신접종된 돼지는 챌린지 후 기간 동안 감소된 (P < 0.05) 폐 병변, 바이러스혈증, 비강 배출, 임상 징후 및 직장 온도를 가졌다. 또한, 모든 백신 균주는 챌린지 후 기간 동안 ADWG를 유의하게 개선시켰다 (P < 0.05).
4종의 백신 균주 중 3종은 둘 다의 PRRSV 균주에 의한 챌린지 후 폐 병변 및 바이러스혈증을 감소시키는데 효과적이었다. SD 95-10, SD 11-21, 및 ND 99-14 균주는 둘 다의 챌린지 균주에 대해 효과적이었다. MN 05-68 균주는 MN-184 챌린지 시 폐 병변을 감소시키는 데에만 효과적이었고, KS-11 균주로 챌린지된 돼지에서는 폐 병변을 감소시키지 않았다.
실시예 4
본 연구의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 균주 ND 99-14의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 제조하기 위한 것이다. 이러한 종자는 PRRSV 백신 개발에 사용될 것이다.
PRRSV ND 99-14 균주를 MARC-145 세포에서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 초기 특징화 및 서열분석 전에, 2 라운드의 플라크 정제 및 1 라운드의 수크로스 구배 정제를 포함하여 83회 (P83) 계대배양하여 변형시켰다. ND 99-14 균주는 5% 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 및 50 μg 겐타미신/mL (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 보충된 성장 배지 OPTI-MEM® I (라이프 테크놀로지스) 중의 MARC-145 세포에서 12회 (P95) 계대배양하여 추가로 약독화하고, 겐타미신 부재 하의 2% FBS가 보충된 동일한 성장 배지에서 추가의 5회 계대배양을 수행하였다. PRRSV ND 99-14의 100번째 계대배양물 (P100)을 프리-마스터 종자 바이러스 (Pre-MSV)로서 사용하였다.
하기 절차를 사용하여 PRRSV MSV ND 99-14의 역가를 결정하였다. MARC-145 세포를 96-웰 플레이트에 성장 배지 (5% FBS 및 50 μg/mL 겐타마이신이 보충된 OPTI-MEM® I 배지) 100 μL 중 0.75-1.5x104개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포가 95% 전면생장을 초과할 때까지 48-72시간 동안 37±2℃ 및 5±1% CO2 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션하였다. 적정일에, 96-웰 플레이트로부터 모든 배지를 제거하고 신선한 성장 배지 100 μL로 대체하였다.
희석제 (OPTI-MEM® I 배지, 50 μg/mL 겐타마이신)를 사용하여 MSV의 10-배 연속 희석물을 제조하고, 이를 희석제 단독으로 이루어진 음성 대조군과 함께 상기와 같이 제조된 플레이트 상의 상응하는 웰로 옮겼다. 적정 플레이트를 5±1% CO2 인큐베이터를 사용하여 37±2℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, 각각의 플레이트를 도립 현미경을 사용하여 각각의 샘플 웰에서의 바이러스-유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재에 대해 관찰하였다. 리드-뮌흐 방법을 사용하여 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50)을 계산하고, 역가를 log10 TCID50/mL로 기록하였다. PRRSV MSV ND 99-14의 평균 역가는 3.50 log10 TCID50/mL였다. MSV 제조 과정에 걸쳐 역가에서 구별가능한 차이는 존재하지 않았다.
PRRS ND 99-14 MLV 균주를 "마스터 종자 바이러스 (MSV)"로 표시하여, 37 C.F.R. §1.14 및 35 U.S.C. §122 하에 자격이 부여된 특허상표청장에 의해 결정된 자에게 본 특허 출원의 계류 동안 배양물에 대한 접근이 이용가능할 것임을 보장하는 조건 하에 기탁하였다. 기탁물은 본 출원의 대응물 또는 그의 자손이 출원된 국가에서 해외 특허법이 요구하는 바에 따라 이용가능하다. 그러나, 기탁의 이용가능성이 정부 조치에 의해 승인된 특허권의 적용배제로 대상 발명을 실시할 허가에 해당하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 대상 배양 기탁물은 보관될 것이고 공중에게 이용가능해질 것이며, 즉 기탁물 샘플의 제공에 대한 가장 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간 동안, 및 임의의 경우에는 기탁일 후 적어도 30년의 기간 동안 또는 기탁된 배양물의 개시를 허여할 수 있는 임의의 특허의 시행 기간 동안 이것이 생존하고 오염되지 않게 유지하는데 필요한 모든 관리를 받으면서 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태로 인해 요청 시 기탁기관이 샘플을 제공할 수 없으면 기탁물을 교체할 의무를 인정한다. 공중에 대한 대상 배양 기탁물의 이용가능성에 대한 모든 제한은 이를 개시하는 특허의 승인 시 취소불가능하게 제거될 것이다. PRRSV MSV ND 99-14의 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에 2015년 12월 2일에 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치하는 아메리칸 타입 컬처 래버러토리(American Type Culture Laboratory) 특허 기탁소의 영구 수집물이 되었고, 이때 저장소에서 수탁 번호 ATCC PTA-122675가 배정되었다.
실시예 5
본 연구의 목적은 유전자 동일성을 확립하고, 컨센서스 서열을 수득하고, 둘 다 실시예 4에 기재된 PRRSV 균주 ND 99-14 계대배양 84 및 계대배양 100 제제 내에 존재하는 게놈 변이체 (하위집단)를 평가하기 위해 차세대 서열분석을 사용하는 것이다.
대규모 병렬 서열분석 (MP-Sep) 시스템을 사용하는 서열 특징화는 바이러스 제제로부터의 핵산 추출, cDNA 라이브러리 합성 및 정량화, PCR에 의한 클론 증폭 및 DNA 라이브러리의 풍부화 및 로슈(Roche)/454 차세대 서열분석 플랫폼에 의한 라이브러리의 서열분석을 포함하는, 여러 단계로 구성된 표준 절차이다. 합성에 의한 서열분석은 cDNA 라이브러리 내 단편의 뉴클레오티드 순서를 동시에 결정하기 위해 사용된다. 각각의 데이터 세트를 참조 서열에 맵핑함으로써, 생성된 단편의 생물정보학 분석을 사용하여 게놈 확인 및 특징화를 수행하였다. 바이오릴라이언스(BioReliance)에 의한 본 분석에 사용된 참조 서열은 실시예 1에 개시된 전장 서열 PRRSV ND 99-14 계대배양 83 (P83) (서열식별번호: 4)으로 이루어졌다.
PRRSV ND 99-14 게놈의 서열분석은 P84 및 P100 샘플 둘 다에 대해 완전한 게놈 범위를 생성하였다. P84 및 P100에 대한 완전한 컨센서스 게놈은 각각 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11에서 찾아볼 수 있다. cDNA 컨센서스 서열을 또한 진뱅크에 기탁하였다. PRRS 균주 ND 99-14의 P84의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131567 (서열식별번호: 10)을 배정받았다. 서열식별번호: 10으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:
PRRS 균주 ND 99-14의 P100의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131569 (서열식별번호: 11)를 배정받았다. 서열식별번호: 11로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:
관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또한 변이체 확인을 수행하여 둘 다의 계대배양의 경우 바이러스 집단에서의 뉴클레오티드 변화의 수 및 빈도를 결정하였다. 표 15는 참조 서열과 비교하여 P84 및 P100에서 발견된 7개의 뉴클레오티드 변화를 보여준다. 전체 변이체 위치는, P100에는 존재하지 않는 P84에서의 2개의 뉴클레오티드 변화를 제외하고, 계대배양 사이에서 일치하였다. 또한, 각각의 변이체의 빈도는 계대배양 사이에 유사하였고, 상대적으로 낮은 빈도로 검출되어, 이는 ND 99-14의 P84 및 P100 둘 다에서 유사한 하위-집단이 발견되었음을 시사한다.
표 15. PRRSV ND 99-14 서열 변이체.
ND = 검출되지 않음.
실시예 6
본 연구의 목적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 균주 SD 11-21의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 제조하기 위한 것이다. 이러한 종자는 PRRSV 백신 개발에 사용될 것이다.
PRRSV SD 11-21 균주를 MARC-145 세포에서, 실시예 1에 기재된 바와 같은 초기 특징화 및 서열분석 전에, 2 라운드의 플라크 정제 및 1 라운드의 수크로스 구배 정제를 포함하여 83회 (P83) 계대배양하여 변형시켰다. SD 11-21 균주는 5% 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치) 및 50 μg 겐타미신/mL (라이프 테크놀로지스)가 보충된 성장 배지 Opti-MEM® I (라이프 테크놀로지스) 중의 MARC-145 세포에서 12회 (P95) 계대배양하여 추가로 약독화하고, 겐타미신 부재 하의 2% FBS가 보충된 동일한 성장 배지에서 추가의 5회 계대배양을 수행하였다. PRRSV SD 11-21의 100번째 계대배양물 (P100)을 프리-마스터 종자 바이러스 (Pre-MSV)를 제조하는데 사용하였다.
하기 절차를 사용하여 PRRSV MSV SD 11-21의 역가를 결정하였다. MARC-145 세포를 96-웰 플레이트에 성장 배지 (5% FBS 및 50 μg/mL 겐타마이신이 보충된 OPTI-MEM® I 배지) 100 μL 중 0.75-1.5x104개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포가 95% 전면생장을 초과할 때까지 48-72시간 동안 37±2℃ 및 5±1% CO2 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션하였다. 적정일에, 96-웰 플레이트로부터 모든 배지를 제거하고 신선한 성장 배지 100 μL로 대체하였다.
희석제 (OPTI-MEM® I 배지, 50 μg/mL 겐타마이신)를 사용하여 MSV의 10-배 연속 희석물을 제조하고, 이를 희석제 단독으로 이루어진 음성 대조군과 함께 상기와 같이 제조된 플레이트 상의 상응하는 웰로 옮겼다. 적정 플레이트를 5±1% CO2 인큐베이터를 사용하여 37±2℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말미에, 각각의 플레이트를 도립 현미경을 사용하여 각각의 샘플 웰에서의 바이러스-유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재에 대해 관찰하였다. 리드-뮌흐 방법을 사용하여 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50)을 계산하고, 역가를 log10 TCID50/mL로 기록하였다. PRRSV MSV SD 11-21의 평균 역가는 3.25 log10 TCID50/mL였다. MSV 제조 과정에 걸쳐 역가에서 구별가능한 차이는 존재하지 않았다.
PRRS SD 11-21 MLV 균주를 "마스터 종자 바이러스 (MSV)"로 표시하여, 37 C.F.R. §1.14 및 35 U.S.C. §122 하에 자격이 부여된 특허상표청장에 의해 결정된 자에게 본 특허 출원의 계류 동안 배양물에 대한 접근이 이용가능할 것임을 보장하는 조건 하에 기탁하였다. 기탁물은 본 출원의 대응물 또는 그의 자손이 출원된 국가에서 해외 특허법이 요구하는 바에 따라 이용가능하다. 그러나, 기탁의 이용가능성이 정부 조치에 의해 승인된 특허권의 적용배제로 대상 발명을 실시할 허가에 해당하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 대상 배양 기탁물은 보관될 것이고 공중에게 이용가능해질 것이며, 즉 기탁물 샘플의 제공에 대한 가장 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간 동안, 및 임의의 경우에는 기탁일 후 적어도 30년의 기간 동안 또는 기탁된 배양물의 개시를 허여할 수 있는 임의의 특허의 시행 기간 동안 이것이 생존하고 오염되지 않게 유지하는데 필요한 모든 관리를 받으면서 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태로 인해 요청 시 기탁기관이 샘플을 제공할 수 없으면 기탁물을 교체할 의무를 인정한다. 공중에 대한 대상 배양 기탁물의 이용가능성에 대한 모든 제한은 이를 개시하는 특허의 승인 시 취소불가능하게 제거될 것이다. PRRSV MSV SD 11-21의 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에 2015년 12월 2일에 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 위치하는 아메리칸 타입 컬처 래버러토리 특허 기탁소의 영구 수집물이 되었고, 이때 저장소에서 수탁 번호 ATCC PTA-122674가 배정되었다.
실시예 7
본 연구의 목적은 유전자 동일성을 확립하고, 컨센서스 서열을 수득하고, 둘 다 실시예 6에 기재된 PRRSV 균주 SD 11-21 계대배양 84 및 계대배양 100 제제 내에 존재하는 게놈 변이체 (하위집단)를 평가하기 위해 차세대 서열분석을 사용하는 것이다.
대규모 병렬 서열분석 (MP-Sep) 시스템을 사용하는 서열 특징화는 바이러스 제제로부터의 핵산 추출, cDNA 라이브러리 합성 및 정량화, PCR에 의한 클론 증폭 및 DNA 라이브러리의 풍부화 및 로슈/454 차세대 서열분석 플랫폼에 의한 라이브러리의 서열분석을 포함하는, 여러 단계로 구성된 표준 절차이다. 합성에 의한 서열분석은 cDNA 라이브러리 내 단편의 뉴클레오티드 순서를 동시에 결정하기 위해 사용된다. 각각의 데이터 세트를 참조 서열에 맵핑함으로써, 생성된 단편의 생물정보학 분석을 사용하여 게놈 확인 및 특징화를 수행하였다. 바이오릴라이언스에 의한 본 분석에 사용된 참조 서열은 실시예 1에 개시된 전장 서열 PRRSV SD 11-21 계대배양 83 (P83) (서열식별번호: 9)으로 이루어졌다.
PRRSV SD 11-21 게놈의 서열분석은 P84 및 P100 샘플 둘 다에 대해 완전한 게놈 범위를 생성하였다. P84 및 P100에 대한 완전한 컨센서스 게놈은 각각 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13에서 찾아볼 수 있다. cDNA 컨센서스 서열을 또한 진뱅크에 기탁하였다. PRRS 균주 SD 11-21의 P84의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131566 (서열식별번호: 12)을 배정받았다. 서열식별번호: 12로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:
PRRS 균주 SD 11-21의 P100의 cDNA 컨센서스 서열은 진뱅크 수탁 번호 KU131568 (서열식별번호: 13)을 배정받았다. 서열식별번호: 13으로 지정된 cDNA 컨센서스 서열은 하기와 같다:
관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 게놈 컨센서스 서열의 폴리-아데노신 꼬리가 상기 보고된 서열과 길이상 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다.
변이체 확인을 수행하여 둘 다의 계대배양의 경우 바이러스 집단에서의 뉴클레오티드 변화의 수 및 빈도를 결정하였다. 표 16은 참조 서열과 비교하여 P84 및 P100에서 발견된 11개의 뉴클레오티드 변화를 보여준다. 11개의 변이체 위치 중 6개는, P84에는 존재하지 않는 P100에서의 5개의 뉴클레오티드 변화를 제외하고, 계대배양 사이에서 일치하였다. 이들 변화는 대략 절반 조금 더 미만의 하위집단 변이체가 바이러스의 84에서 100회 계대배양 동안 발생하였음을 시사한다.
표 16. PRRSV SD 11-21 서열 변이체.
ND = 검출되지 않음.
실시예 8
본 연구의 목적은 백신접종-챌린지 연구에서 실험적 변형된 생 PRRSV 백신의 용량 반응 및 면역 개시 (OOI)를 평가하기 위한 것이다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 연구를 실시예 2 및 3에 기재된 것과 유사한 절차 및 조건을 사용하여, 아이오와주 캠브리지 소재의 베테리너리 리소시즈, 인크.의 BSL-2 시설에서 수행하였다. 실험실 검정은 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이, 아이오와주 에임스 소재의 아이오와 주립 대학교 수의학 진단 실험실에서 수행하였다. PRRSV에 대해 혈청음성인 80마리의 임상적으로 건강한, 14 또는 15일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 4개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=20마리/군). 치료군은 위약-매칭 대조군 및 3개의 PRRSV 백신 용량 군 (2.7, 4.1 또는 5.1 log10 TCID50/mL)을 포함하였다.
돼지에게 그의 각각의 백신 또는 위약을 제0일에 목의 우측으로 근육내로 제공하였다 (1.0 mL). SD 11-21 PRRSV 균주, 안정화제 및 보존제 (겐타미신)를 포함시켜 백신을 제제화하였다. OPTI-MEM® I 감소된 혈청 배지를 블렌딩 희석제로서 사용하였다. 마스터 세포 스톡 (MCS) 상에서 최고 계대배양 수준 (MCS+20)으로 성장시킨, 생산을 위해 의도되는 최고 계대배양 수준 (MSV+5)의 마스터 종자 바이러스 (MSV)를 사용하여 백신을 제조하였다. 각각의 백신에 대한 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID50)은 MARC-145 세포를 감염시켜 결정하였다. 백신접종 후 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 위약 대조군과 비교하여, 직장 온도의 일시적 증가가 모든 백신 군에서 백신접종 후 제2일에 관찰되었지만, 이는 정상 생리학적 범위 내에서 유지되었고, 그 이후에는 관찰되지 않았다.
백신접종 후 제28일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NADC-20 (계대배양 3) 4 mL (1 mL/비공 및 2 mL IM)로, 3.98 x 104 TCID50/mL로 챌린지하였다. 위약 군에서 폐 병변 침범의 평균 퍼센트는 54%였다. 본 연구에서 달성된 수준은 백신 후보를 평가하는데 충분한 것으로 간주되었다.
폐 병변 점수의 통계학적 분석의 결과를 표 17 및 18에 요약한다. 치료의 주요 효과는 통계적으로 유의하였다 (P < 0.0001). 모든 용량 군에서 백신접종된 돼지는 대조군 돼지보다 유의하게 낮은 (P<0.05) 폐 병변 점수를 가졌다 (표 17). 선형 및 2차 대조는 통계적으로 유의하지 않았다. 완화 분율이 표 18에 제공된다. 군 T02 (2.7 log), T03 (4.1 log) 및 T04 (5.1 log)에 대한 완화 분율은 군 T01 (위약)과 비교하여 유의하였다. T02, T03 및 T04에 의한 백신접종은 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 각각 0.9200, 0.9450 및 0.9789만큼 증가시켰다.
표 17. 평균 폐 병변 점수1
1아크사인 변환된 퍼센트 폐 침범.
2비변환된 평균.
3역 변환된 평균.
*T01 대 T02, T03 또는 T04는 P < 0.05로 유의하게 상이함.
표 18. 완화 분율 - 폐 병변 점수
제42일에, 절제된 폐로부터 BAL 액을 무균 수득하였다. PRRSV 핵산의 존재의 qRT-PCR 분석을 위해 BAL 액의 분취물을 ISUVDL에 제출하였다. 결과를 표 19에 요약한다. 모든 3개의 용량 군에서 백신접종된 돼지는 대조군 돼지와 비교할 경우 폐에서 유의하게 낮은 (P<0.05) 바이러스 로드를 가졌다. 치료의 주요 효과는 유의하였다 (P<0.0001).
표 19. BAL 액 내 PRRSV 게놈 카피/mL의 기하 평균.
*T01 대 T02, T03 또는 T04는 P < 0.05로 유의하게 상이함.
1비변환된 평균.
2역 변환된 평균.
PRRSV 항체 수준 및 PRRSV 바이러스혈증의 결정을 위한 혈액 샘플을 모든 연구 동물로부터 제-1일, 제28일 (챌린지 전) 및 제42일에 수집하였다. 혈청학 및 바이러스혈증을 각각 ELISA 및 qRT-PCR 방법론에 의해 결정하였다. ELISA 항체 역가에 의해 결정된 바와 같이, 모든 돼지는 제-1일에 혈청음성이었다. 제28일 및 제42일 둘 다에, 모든 백신접종된 군에서 ELISA 값은 위약 군에서의 값보다 유의하게 더 높았다 (P<0.05).
제-1일에, 어떠한 돼지도 바이러스혈증에 대해 양성이 아니었다. 챌린지 시 (제28일), 위약 대조군의 모든 돼지는 음성인 반면에, 군 T02, T03 및 T04의 돼지 중 95%, 75% 및 89%는 백신 바이러스의 존재로 인해 양성이었다. 모든 군의 모든 돼지는 제42일 챌린지 후 양성이었지만, 백신접종된 군 (T02, T03 및 T04)의 값은 위약 대조군 (T01)의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05).
모든 연구 동물을 챌린지일 (제28일) 및 부검일 (제42일)에 개별적으로 파운드 단위로 칭량하고, 그의 체중을 기록하였다. 하기 기간 동안 평균 1일 체중 증가 (ADWG)를 결정하였다: 백신접종 전일에서 챌린지일까지 (제-1일에서 제28일까지); 백신접종 전일에서 부검일까지 (제-1일에서 제42일까지); 및 챌린지일에서 부검일까지 (제28일에서 제42일까지). 치료의 주요 효과는 챌린지 전까지 (제-1일에서 제28일까지) 유의하지 않았다 (P=0.2304). 챌린지 기간 동안 (제28일에서 제42일까지) 및 전체 42일 연구 기간 동안, 치료의 주요 효과는 유의하였다 (P<0.0001). 이들 2개의 기간 각각의 경우, 백신접종된 군의 돼지는 위약 대조군의 돼지보다 더 체중이 증가하였다 (P<0.05).
모든 동물을 챌린지 후 14일 동안 (제28일-제42일) 매일 기준으로 우울증, 신체 상태, 및 호흡 곤란에 대해 평가하고, 각각의 임상 징후에 대해 점수화하였다. 우울증 점수, 호흡 점수 및 신체 상태 점수를 시간별로 요약하였다. 또한 각각의 동물에 대해 1일 내의 임상 점수를 합산하였다. 제8일에, T02 및 T04의 값은 위약 대조군 (T01)의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 제9일에, T02의 값은 T01의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 제10일-제14일에, 모든 백신접종된 군 (T02, T03, 및 T04)의 값은 T01의 값보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.05). 임상 징후에 대해 어떠한 용량 효과도 존재하지 않았다.
결론적으로, 백신의 모든 용량 수준이 폐 병변, 폐 내 바이러스 로드, 바이러스혈증, 및 임상 징후를 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 임의의 용량 수준에서 백신에 대해 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 백신 효능의 파생 이익은 대조군 동물과 비교하여 평균 1일 체중 증가에서의 유의한 개선이었다 (P<0.05). 따라서, 14-15일령만큼 조기에 백신접종된 돼지에서 28-일 면역 개시 (OOI)가 달성가능하였다.
요약으로서, 표 20은 다양한 PRRS 바이러스 백신 균주 및 그의 컨센서스 게놈 cDNA 서열의 참조를 열거한다.
표 20. PRRS 바이러스 백신 균주.
실시예 9
본 연구의 목적은 돼지에서 변형된 생 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 백신의 마스터 종자 바이러스 (MSV) SD 11-21 X+1의 병독성으로의 복귀의 결여를 입증하기 위한 것이다.
PRRSV에 대해 혈청음성이고 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 음성인 총 80마리의 임상적으로 건강한, 14-15일령의 이유된 돼지를 4개의 별개의 역계대배양에 등록하였다. 각각의 역계대배양은 20마리의 돼지를 포함하였고, 10마리의 돼지는 대조군, 10마리의 돼지는 임상시험용 수의학 제품 (IVP) 군이었다. D-2 또는 D-1에 돼지를 치료군에 무작위 할당하였다. 역계대배양 1 (BP)에서, IVP는 SD 11-21 MSV X+1로 이루어졌다. BP 2-4에서, IVP는 이전 역계대배양 돼지로부터의 기관지-폐포 세척 (BAL) 액으로부터 단리된 PRRSV로 이루어졌다. 대조군 제품은 포스페이트 완충 염수 (PBS)였다. 동물은 PRRSV 감염의 전형적인 발열 및 임상 징후를 나타낼 경우; 진단 보고에 기초하여 PRRSV로 인해 사망하였거나 제거된 경우; 또는 PRRSV에 기인한 거시적인 폐 병변을 갖는 경우에, PRRSV에 의해 임상적 영향을 받는 것으로 간주되었다.
PRRSV SD 11-21 MSV의 역가는 3.3 log10 TCID50 (796-70-23Sep14)이었다. 과잉을 포함하여 전형적인 백신 용량의 역가 수준을 달성하기 위해 MSV X+1을 생성하였다. X+1을 생성하기 위해, 전면생장 MARC-145 세포를 PRRSV 마스터 종자 바이러스 (MSV) SD 11-21 (796-70-23Sep14)로 감염시키고, 95% 초과의 세포병변 효과 (CPE)가 관찰될 때 PRRSV SD 11-21 X+1을 수거하였다.
제0일에, IVP 군의 돼지에게 IVP 1.0 ml를 비강내로 투여하였다 (IN; 0.5 ml/콧구멍). 돼지를 임상 징후 (우울증, 호흡, 및 신체 상태) 및 발열에 대해 BP 1-3은 14일 동안 및 BP 4는 21일 동안 매일 관찰하였다. 돼지를 BP 1-3은 D14에, BP 4는 D21에 안락사시켰다. 폐를 절제하고, 거시적인 폐 병변의 존재에 대해 평가하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 수집하여 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 분석하고, 바이러스 단리를 수행하였다. (표 21). RT-qPCR은 EZ-PRRSV MPX 4.0 RT-PCR 키트 (테트라코어(Tetracore))를 사용하여 수행하였다. RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 양성인 BAL 액을 수크로스 쿠션으로 농축시키고, 풀링하였다. 풀링된 물질을 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하고, 다음 동물 군에의 투여 전에 세포병변 효과 (CPE)에 의해 역가를 결정하였다. 역계대배양 후 동물에서 바이러스를 단리할 수 없는 것은, MSV가 안정하고 병독성으로 복귀되지 않는 것으로 간주하였다. RT-qPCR에 의해 양성으로 판정된, 최종 역계대배양으로부터 풀링된 BAL 액 내에 존재하는 PRRSV를 원래의 MSV X+1 내의 PRRSV와 표현형적 및 유전자형적 둘 다로 비교하였다. 표현형 비교는 PRRSV 특이적 항체를 사용하여 IFA 시험에 의해 수행하였고, 유전자형 비교는 ORF5 유전자의 게놈 서열분석을 비교하여 수행하였다.
MSV X+1의 경우 바이러스 역가는 8.2 log10 TCID50/ml였다. MARC-145 세포를 바이러스의 10-배 연속 희석물로 감염시키고 감염된 세포를 4일 동안 인큐베이션하여, 각각의 바이러스에 대한 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID50)을 결정하였다. 인큐베이션 기간 말미에 각각의 감염을 바이러스 유도된 세포병변 효과 (CPE)의 존재 또는 부재에 대해 검사하고, 양성 또는 음성으로서 점수화하였다. 이어서 수집된 데이터를 사용하여 TCID50 계산을 위한 리드-뮌흐 방법을 사용하여 바이러스의 역가를 계산하고, log10 TCID50/ml로서 보고하였다. MSV X+1의 효력은 제품의 예상 표적 방출 용량을 초과하였다. BP 2 및 3에 투여된 물질의 바이러스 역가는 각각 2.1 및 2.6 log10 TCID50/ml였다. BP 4에 투여된 물질은 CPE에 대해 음성이었다. 4개의 역계대배양물 중 임의의 것에서 IVP가 투여된 어떠한 돼지도 PRRSV에 의해 임상적으로 영향을 받는 돼지의 사례 정의에 양성이 아니었다. 추가적으로, 최종 양성 역계대배양으로부터의 풀링된 BAL 액으로부터의 바이러스는 MSV X+1과 표현현상 유사하고 ORF5 유전자와 비교할 경우 MSV X+1과 유전자형상 매칭되는 것으로 나타났다.
본 연구는 14-15일령의 돼지에 투여된 변형된 생 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신의 마스터 종자 바이러스 SD 11-21 X+1의 병독성으로의 복귀의 결여를 입증하고, 유전자 안정성을 확인시켜준다.
표 21. 역계대배양에 의한 BAL 액 바이러스 단리 결과
NA-적용되지 않음; 모든 개별 BAL 액은 PCR 및 면역형광 둘 다에 의한 것이며, 따라서 어떠한 풀도 생성되지 않음.
실시예 10
본 연구의 목적은 백신접종된 동물로부터 감시 동물로의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) SD 11-21 마스터 종자 바이러스 (MSV)의 배출 및 전염을 평가하기 위한 것이다. PRRSV에 대해 혈청음성이고 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 음성인 20마리의 임상적으로 건강한, 14일령의, 이유된 돼지를 등록시켰다. D-1에, 돼지를 신체 검사하고, 감시/대조군 또는 PRRSV SD 11-21 MSV X+1 치료군으로 무작위 할당하였다. PRRSV SD 11-21 MSV X+1을 실시예 9에서와 같이 생성하였다. 돼지를 우리 내에 4마리의 돼지/우리로 수용하고, 각각의 우리는 2마리의 돼지/치료군을 포함하였다.
D0에, MSV X+1 치료군의 돼지를 목의 우측으로 근육내로 (IM) 1.0 ml 백신접종하는 한편, 감시 돼지는 비치료로 두었다. 비강 스왑 및 혈청 샘플을 D-1, D3, D5, D7, D10, D14, D17, 및 D21에 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. D21에, 돼지를 인도적으로 안락사시키고, 폐를 절제하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 무균 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. 또한, 폐, 비장, 편도, 흉선, 및 우측 및 좌측 기관기관지 림프절로부터 조직 샘플을 수집하고, RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다. 조직 샘플이 RT-qPCR에 의해 PRRSV에 대해 양성으로 판정된 경우, ORF5 영역을 사용하여 게놈 서열분석에 의해 샘플을 동일성 시험하고 MSV X+1의 ORF5 영역과 비교하였다. 체중을 D-1 및 D21에 수집하였다.
10마리의 백신접종된 돼지 중 9마리 (90%)는 21일 연구 기간 동안 PRRSV에 양성인 적어도 1개의 비강 스왑을 가졌다. 일부 돼지 (4/9마리)는 21일 연구 기간의 말미에 여전히 백신을 배출하였다. 모든 백신접종된 돼지는 D3-D21에 바이러스혈증성이었다. 추가적으로, 백신접종된 돼지로부터의 모든 BAL 액 및 조직 샘플은 D21에 RT-qPCR에 의하면 PRRSV에 대해 양성이었다. 조직 샘플로부터 단리된 RNA의 뉴클레오티드 서열은 MSV X+1과 99.67-100% 유사성을 제시하였고, 이는 돼지에 존재하는 유일한 바이러스가 백신 바이러스로부터 기원한 것임을 나타낸다. 10마리의 감시 돼지 중 1마리 (10%)는 백신 바이러스에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 단일 비강 스왑이 21일 샘플링 기간 동안 양성이었다. 어떠한 혈청 샘플, BAL 액 샘플, 또는 조직 샘플도 감시 돼지 중 임의의 것에서 RT-qPCR에 의하면 PRRSV에 대해 양성으로 판정되지 않았다.
MSV X+1은 백신접종된 동물로부터 투여 후 적어도 21일 동안 배출되었다. 단일 양성 비강 스왑 외에는 감시 동물 중 임의의 것에서 어떠한 백신 바이러스도 검출되지 않았기 때문에, 백신접종된 동물에서 감시 동물로의 MSV X+1 전염은 제한되었다.
실시예 11
본 연구의 목적은 유형-2 PRRSV 균주 (SD 11-21)를 4.45 log10 TCID50/mL로 함유하는 실험적 변형된-생 PRRSV 백신의, PRRSV 혈청음성 14-일령 새끼돼지에게 투여하고 후속해서 최신의 병독성 유형-2 PRRSV 균주 (NC-174)로 챌린지한 경우의, 효능을 평가하기 위한 것이다. NC-174 PRRS 바이러스는 노스 캐롤라이나주 해럴스 소재의 돼지 농장에서 호흡기 증상을 겪고 있는 9주령의 돼지의 혈청 샘플로부터 단리되었다. 농장으로부터의 상세한 증후성 관찰사항은 식욕부진, 기면, 과호흡, 호흡곤란, 15% 이환율 및 5% 사망률이었다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다.
PRRSV에 대해 혈청음성인 40마리의 임상적으로 건강한, 14일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 체중 감소에 따라 순위를 정하고, 2개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=20마리/군). 치료군은 실험적 백신 및 위약-매칭 대조군을 포함하였다. 챌린지 시까지 백신 바이러스의 배출로 인한 노출을 막기 위해 돼지를 치료군별로 수용하였다. 챌린지 시, 우리 내 각각의 치료군으로부터 2마리의 돼지가 존재하도록 돼지를 합했다.
돼지에게 제0일에 백신 또는 위약을 목의 우측으로 근육내로 (1.0 mL) 제공하였다. 제-1일, 제28일, 제35일 및 제42일에 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 ELISA에 의해 PRRSV 항체 수준에 대해 시험하고, 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 바이러스 로드에 대해 시험하였다. 제28일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NC-174 (계열 1, 계대배양 3) 4 mL (1 mL/비공 및 2 mL IM)로, 1.3 X 106 TCID50/mL로 챌린지하였다. 호흡 곤란, 우울증 및 신체 상태를 나타내는 임상 점수를 제28일에서 제42일까지 매일 기록하였다. 돼지를 제-1일, 제28일 및 제42일에 칭량하여 체중 증가를 평가하였다. 돼지를 제42일에 안락사시키고, 폐를 절제하고, 폐 병변의 정도를 결정하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 제42일에 수집하여 qRT-PCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다.
백신접종 후 어떠한 국부 또는 전신 유해 반응도 관찰되지 않았다. 실험적 백신은 퍼센트 폐 병변 (대조군 45.9% vs 백신접종군 4.0%), 폐 내 바이러스 로드 (95% 감소), 바이러스혈증 (챌린지 14일 후), 및 임상 징후를 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 폐 병변 데이터의 완화 분율 평가는 백신접종이, 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 0.9368만큼 증가시킨다는 것을 나타내었다.
백신 효능의 파생 이익은 14-일 챌린지 기간 동안 대조군 동물과 비교하여 평균 1일 체중 증가에서의 유의한 개선이었다 (P<0.05) (0.43 vs 0.25 kg/일).
결론적으로, 나이브 14-일령 돼지에의 균주 SD 11-21을 함유하는 실험적 PRRSV 백신의 단일 1.0 mL 용량으로의 투여는 안전하고, 최신의 PRRSV 필드 균주 NC-174에 의한 챌린지에 대해 효과적이었다.
실시예 12
본 연구의 목적은 유형-2 PRRSV 균주 (SD 11-21)를 4.45 log10 TCID50/mL로 함유하는 실험적 변형된-생 PRRSV 백신의, PRRSV 혈청음성 14-일령 새끼돼지에게 투여하고 후속해서 병독성 유형-2 PRRSV 균주 (NADC-20)로 챌린지한 경우의, 면역의 최소 26주 (182일) 지속기간을 확인하기 위한 것이다. 백신을 폐 병변, 폐 및 혈액 내 바이러스 로드, 및 임상 징후를 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. PRRSV에 대해 혈청음성인 64마리의 임상적으로 건강한, 14-일령의 이유된 돼지를 연구에 등록시켰다. 돼지를 깔짚으로 차단하고, 2개의 치료군 중 1개로 무작위 배정하였다 (n=32마리/군). 치료군은 실험적 백신 (T02) 및 위약-매칭 대조군 (T01)을 포함하였다. 챌린지 시까지 백신 바이러스의 배출로 인한 노출을 막기 위해 돼지를 치료군별로 수용하였다. 챌린지 시, 우리 내 각각의 치료군으로부터 2마리의 돼지가 존재하도록 돼지를 합했다.
돼지에게 제0일에 백신 또는 위약을 목의 우측으로 근육내로 (1.0 mL) 제공하였다. 제-1일, 제28일, 제112일, 제168일, 제181일, 제189일 및 제196일에 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 ELISA에 의해 PRRSV 항체 수준에 대해 시험하고, 정량적 PCR (qRT-PCR)에 의해 바이러스 로드에 대해 시험하였다. 제182일에, 모든 돼지를 PRRSV 균주 NADC-20 10 mL (4 mL/비공 및 2 mL IM)로 106.7 TCID50/mL로 챌린지하였다. 호흡 곤란, 우울증 및 신체 상태를 나타내는 임상 점수를 제182일에서 제196일까지 매일 기록하였다. 돼지를 제196일 (챌린지 14일 후)에 안락사시키고, 폐를 절제하고, 폐 병변의 정도를 결정하였다. 기관지-폐포 세척 (BAL) 액을 수집하여 qRT-PCR에 의해 PRRSV에 대해 시험하였다.
실험적 백신은 퍼센트 폐 병변 (대조군 12.3% vs 백신접종군 1.1%)을 감소시키는데 효과적이었다 (P<0.05). 폐 병변 데이터의 완화 분율 평가는 백신접종이, 백신접종된 동물이 비-백신접종된 대조군 동물보다 폐 병변을 덜 가질 확률을 0.6566만큼 증가시킨다는 것을 나타내었다.
본 연구의 결과는 나이브 14-일령 돼지에의 균주 SD 11-21을 함유하는 실험적 PRRSV 백신의 단일 1.0 mL 용량으로의 투여가 26주 늦게 주어진 병독성 PRRSV 챌린지에 대해 효과적이라는 것을 확인시켜주었다.
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VACCINE VIRUS
<130> X20718
<150> 62/296658
<151> 2016-02-18
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaacttgct gcacggaaac gcccttccgt gacagccctc ttcaggggag 120
tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccaa 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcctct 300
gaatctccaa gttcccgagc ttggagtgct gggcctattt tacaggcccg aagagccgct 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcttgctg 420
gctttctgcg atcttcccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480
aatggtgcgg gtcgctgccg agatttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa 540
ggctctacaa gtttatgaac ggggttgccg ctggtacccc attgtcggac ctgtccctgg 600
agtggccgtt ttcgccaact ccctacatgt gagtgacaaa ccttttccgg gagcaactca 660
tgtgttaacc aatctaccgc tcccgcagag gcccaagcct gaagactttt gcccttttga 720
gtgtgctatg gctgacatct atgacatcgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccggaga 780
gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa tttgaaaatg ttcccaagga 840
gttgaagttg attgcgaacc gactccacat ctccttcccg ccccaccacg tagtggacat 900
gtccaagttt accttcatag cccccgggag tggtgtctcc atgcgggttg agtgccaaca 960
cggctgcctc cccgctgata ctgttcctga aggaaactgc tggtggcgct tgttcgactc 1020
gctcccgccg gaagtccagc acaaagaaat tcgctatgct aaccaatttg gttatcaaac 1080
caagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaacg gtctccgagc 1140
agtgaccgac gtacatggac ctatcgtcat acagtacttc tctgttaagg agagttggat 1200
ccgccacttc aggctggcgg aagaacctag cctccctggg ttcgaagacc tcctcagaat 1260
tagggttgag cccaatacat caccactggc tggcgaggat gggaagatct tccggtttgg 1320
cagtcacaag tggtacggtg ctggaaggag agcaaggaaa gcacgttctg gtgcgaccac 1380
catggtcgct catcgcgctt tgtccgctcg tgaaacccag caggcaaaga aggacgaggg 1440
tgccgacgct aacaaggctg agcatctcaa gcactactct ccgcccgccg aagggaactg 1500
tggttggcac tgtatttccg ccatcgccaa ccggatgata aattccaaat ttgaaactac 1560
ccttcccgaa agagtaaggc ctctggatga ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatac 1620
catccaaatc ctcaggctcc ccgcggcctt ggataggaac ggtgcttgta gtagcgccaa 1680
gtacgtgctt aagctggaag gtgtgcattg gactgtctct gtgacccctg ggatgtcccc 1740
ttccttgctc ccccttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gttttggctc 1800
cccagatgcg gtcgaagttt ccggatttga ccctgcctgc cttgaccgac tggctgaggt 1860
aatgcacttg cctagcagtg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgactccaa 1920
tcgtccggct tccccggtca acactgtgtg gactgtttcg caattctatg cccgtcatac 1980
aggaggaaat catcctgacc aggtgtgctt agagcagatc attaatctct gtcaggttat 2040
tgaggtttgt tgctgccatc aaaacaaaac caaccgggcc accccggaag aggtcgcggc 2100
aaagattgat cagtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttga ccaggcttga 2160
gagggtttgc ccgccgagcg ctgcggacac ctcctttgat tggaatgttg tgctccctgg 2220
ggttgaggct gcaactcaga caaccaaaca gccccacgtc aaccagtgct gcgctctggt 2280
tcctgtcgtg actcaagagc ctttggacaa agactcggtc cctctgaccg ccttctcgct 2340
gtccaattgc tactaccctg cacaaggtga agaggttcgt caccgtgaga gactaaactc 2400
cgtactctcg aagttggagg gggctgttcg tgaggaatat gggctcacgc caactgaacc 2460
tggcctgcaa cccgcactac cgaacgggct cgacgaactt aaagaccgga tggaggagga 2520
tctgctgaaa ctagtcaacg ctcaggcaac ttcagaaatg atggcctggg cagccgagca 2580
gattgattta aaagcttggg tcaaaaacta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc 2640
aagagctcag cctcggaaaa cgaagtctgt taagagcttg ccagggaaca agcctatccc 2700
tgctccacgc aggaaggtca gatctgattt gactgttaat ggcccccttg atctttcgac 2760
accatccgag ccgatgacac ccctgagtga gcctgcactt atgcccgcgt tgcaacatat 2820
ttctaggcca gtgacatctt tgagtgagcc ggtcccagtt cctgcaccgc gtagagctgt 2880
gtcccgaccg gtgacgccct tgagtgggcc aacttttgag tttgcgccgc gacacaaatt 2940
tcagcaggtg ggagaagtga atctggcggc aacaacgctg acgcaccagg acgaacctct 3000
agatttgtct gcatcctcac agactgaata tgaggcttct cccctagtac caccgcagaa 3060
catgggtatc ctgggggtgg gggggcaaga ggctgaagaa gttctgagtg aaatctcgga 3120
tatactgagt gacattaacc ctgcacctgt gtcattaagc agctccctgt caagtgttaa 3180
gatcacacgc ccaaaatact cagctcaagc catcattgac tcgggcgggc cctgcagtgg 3240
gcatctccga agggaaaaag aagcatgcct cagcgtcatg cgtgaggctt gtgatgcggc 3300
taaacttagc gaccctgcca cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggata gggttgacat 3360
gctgacctgg cgcaataagt ctgcttacca ggcgtttcgc atcttggatg gcaggtttga 3420
gtttctccca aagatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgggt ttgtgatgct 3480
gcctcacacg cctgcacctt ccgtgagtgc agagagtgac cttaccattg gttcagtcgc 3540
cactgaagat gttccacgca tcctcgggaa aatagaaaac gccggcgagg tgcccaacca 3600
ggggctctcg gcatcctccg gggaagaacc gatgtatgac caacctgcca aagactcccg 3660
gatgtcgtcg cgggggtttg acgagagcat aacggctccg tccgtaggta caggtggcgc 3720
tgacttactc actgatttgc caccttcagg tggtgtggat gtggacgggg gggggccgtt 3780
acggacggta agaaagaaaa ttgaaaggct cttcgaccaa tttagccgtc aggtttttaa 3840
cctcgtctcc catctccctg ttttcttctc acacctcttc aaacctgaca gtggttattc 3900
tccgggtgat tggggttttg cagctttcac tctactttgc ctctttttgt gttatagcta 3960
cccattcttt ggcttcgctc ccctcttggg tgtattttct gggtcttctc ggagggtgcg 4020
catgggggtt tttggctgct ggttggcttt tgctgttggc ctgttcaagc ctgtgtccga 4080
cccagtcggc actgcttgtg aatttgactc gccagagtgt aggaacgtcc ttcattcttt 4140
tgagcttctc aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg caggtctcgg 4200
tcttgccatt cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctac atctggcatt ttttgcttag 4260
gcttggcatt gttgcagatt gtgtcttggc tggagcttat gtgctttctc aaggtaggtg 4320
taaaaagtgc tggggatctt gtataagaac tgctcctaat gaaatcgcct tcaacgtgtt 4380
ccctttcacg cgtgcgacca ggtcgtcact catcgacctg tgcgaccggt ttcgtgcgcc 4440
aaaaggcatg gaccctgttt tcctcgctac tgggtggcgc gggtgctgga ccggtcaaag 4500
tcccattgag caaccctctg aaaaacccat cgcgttcgcc cagttggatg aaaagaggat 4560
cacggctaga actgtggtcg ctcagcctta tgatcctaac caagccgtaa agtgcttgcg 4620
ggtgctacag gcgggtgggg cgatggtggc cgaggcagtc ccaaaagtgg tcaaggtttc 4680
cgctattcca ttccgagccc ccttttttcc caccggagtg aaggttgatc ctgagtgcag 4740
gatcgtggtc gaccccgaca cttttactac agctctccgg tctggttact ccaccacaaa 4800
cctcgtcctt ggtgtggggg actttgccca attgaatgga ttgaaaatca ggcaaatttc 4860
caagccttcg ggaggaggcc cacacctcat tgctgccctg catgttgcgt gctctatggc 4920
gttgcacatg cttgctgggg tttatgtaac tgcagtgggg tcttgcggta ccggcaccaa 4980
cgatccgtgg tgcactaacc cattcgccgt ccctggctac ggacctggct ctctctgcac 5040
gtccagattg tgcatctccc aacatggcct caccctgccc ttgacagcac ttgtggcagg 5100
attcggtctt caggaaattg ccttagtcgt tttgattttc gtttccatcg gaggcatggc 5160
tcataggttg agttgtaagg ctgacatgct gtgcatctta cttgcaatcg ccagctatgt 5220
ttgggtaccc cttacctggt tgctctgtgt gtttccttgc tggttgcgct ggttcacttt 5280
gcaccctctc accatcctat ggttggtgtt tttcctgatt tctgtaaata tgccttcggg 5340
aatcttggcc atggtgttat tggttgctct ttggctttta ggccgttata ctaatgttgt 5400
tggtcttgtt accccctatg atattcacca ttacaccagt ggcccccgcg gtgtagccgc 5460
cttggccacc gcaccagatg ggacttactt ggccgctgtc cgccgcgctg cgttgactgg 5520
ccgcaccgtg ctgtttaccc cgtctcagct tgggtccctt cttgagggcg ctttcaggac 5580
tcgaaagccc tcattgaaca ccgtcaatgt ggtcgggtcc tccatgggct ctggcggagt 5640
gttcactatc gacgggaaaa tcaagtgcgt gactgccgca catgtcctta cgggtaattc 5700
agccagggtt tccggggtcg gcttcaatca aatgcttgac tttaatgtaa agggggactt 5760
cgccatagct gattgcccga attggcaagg ggctgctccc aagacccaat tctgcgagga 5820
tggatggact ggtcgtgcct attggctgac atcctctggt gtcgaacccg gtatcattgg 5880
gaatggattt gccttctgct tcaccgcgtg cggcgattct ggatccccag tgattaccga 5940
agccggtgag cttgtcggcg ttcacacagg atcgaacaaa caaggaggag gcattgtcac 6000
gcgcccctcg ggccagtttt gtaatgtggc gcccatcaag ctgagcgaat tgagtgaatt 6060
cttcgctgga cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtt ggcagccaca taattaaaga 6120
catatgcgag gtaccttcag acctttgcgc cttgcttgct gccaaacccg aactggaagg 6180
aggcctctct accgtccaac ttctgtgtgt gtttttcctc ctgtggagaa tgatggggca 6240
tgcctggacg cccttggttg ctgtggggtt ttttatcttg aatgaggtcc tcccagctgt 6300
cctggtccgg agtgttttct cctttggaat gtttgtgcta tcttggctca cgccatggtc 6360
tgcgcaagtt ctgatgatca ggcttctaac agcagctctt aacaggaaca gattttcact 6420
cgccttttac agccttggtg cagcgaccgg ttttgtcgca gatctggcga caactcaagg 6480
gcatccgttg caggcagtaa tgaatttaag tacctatgcc ttcctgcctc ggatgatggt 6540
tgtgacatca ccagtcccag tgattgcgtg tggtgttgtg cacctccttg ccataatttt 6600
gtacttgttc aagtaccgtt gcctgcacaa tgtccttgtt ggcgacggag cgttctctgc 6660
ggcttttttc ttgcgatact ttgccgaggg aaagttgaga gaaggggtgt cgcagtcctg 6720
cgggatgaat cacgagtcac tgactggagc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt 6780
ggacttcctt acgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt tctgcttcca atatgaggaa 6840
tgcagcgggc caattcatcg aggcagccta tgctaaagca cttagaatag aacttgccca 6900
gttggtgcag gtcgacaagg ttcgaggtgt tttggccaaa cttgaagctt ttgctgatac 6960
tgtggcaccc caactctcgc ccggtgacat tgtcgttgct cttggccata cgcctgttgg 7020
tagtatcttc gacctaaagg ttggtagcac caagcatact ctccaagcca ttgagaccag 7080
agtccttgcc gggtccaaga tgaccgtggc gcgcgtcgtt gacccaaccc ccacgccccc 7140
acccgcaccc gtgcctatcc ccctcccgcc aaaaattctg gagaatggtc ccaacgcctg 7200
gggggatgag gaccgtttga ataagaagaa gaggcgcagg atggaagccg ttggcatctt 7260
tgttatgggc gggaagaagt accagaaatt ttgggacaag agctccggtg atgtgtttta 7320
cgaggaagtc catgataaca cagatgcatg ggagtgcttc agagttgaca accctgccga 7380
ctttgaccct gagaagggaa ctctgtgtgg gcataccacc attgaaaata aggcttacaa 7440
tgtctacgtc tccccatctg gcaggaagtt tctagtccct gtcaacccag agagtggaaa 7500
agcccaatgg gaagctgcaa ggctttccgt ggagcaggcc cttggcatga tgaatgtcaa 7560
cggtgaactg acagccaaag aactggagaa actgaaaaga ataattgaca aactccagga 7620
cctgactaag gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg gcttgacccg ctgtggtcgc 7680
ggcggcttag ttgttactga gacagcggta aaaatagtca aatttcacaa ccggaccttc 7740
accctaggac ccgtaaactt aaaagtggcc agtgaggttg agctaaaaga cgcggtcgag 7800
cataaccaac acccggttgc aagaccggtt gatggcggtg ttgtgctcct gcgctccgca 7860
gttccttcgc ttatagacgt cttgatctcc ggcgctgatg catctcctaa gttactcgcc 7920
cgccacgggc cgggaaacac tgggatcgat ggcacgcttt gggactttga ggccgaggcc 7980
actagagagg aaattgcact cagtgcgcaa ataatacagg cttgtgacat taggcgcggc 8040
gacgcgcccg aaattggtct tccttataag ctgtaccctg ttaggggcaa ccctgagcgg 8100
gtaaaaggag ttttacagaa cacaaggttt ggagacatac cttacaaaac ccccagtgac 8160
actggaagcc cagtacacgc ggctgcctgc ctcacgccca atgccactcc ggtgactgat 8220
gggcgctccg tcttggctac gactatgccc tccggttttg agttgtatgt accgaccatt 8280
ccagcgtctg tccttgatta tcttgattct aggcctgact gccctaaaca gttgacagag 8340
cacggttgtg aggatgccgc attgagagac ctctccaagt atgacttgtc cacccaaggt 8400
tttgttttgc ctggagttct tcgccttgtg cggaagtacc tgtttgccca tgtgggtaag 8460
tgcccgtccg ttcatcggcc ttccacttac cctgccaaga attctatggc tggaataaat 8520
gggaacaggt ttccaaccaa ggacattcag agcgtccctg aaatcgacgt tctgtgcgca 8580
caggccgtgc gagagaactg gcaaactgtc accccttgta ccctcaagaa acagtattgt 8640
gggaagaaga agactaggac aatactcggc accaataact tcattgcgtt ggcccaccga 8700
gcagcgttga gtggtgtcac ccagggcttc atgaaaaagg cgtttaactc gcccatcgcc 8760
ctcgggaaaa acaaatttaa ggagctgcag actccggtct taggcaggtg ccttgaagct 8820
gatcttgcat cctgcgatcg atccacacca gcaattgttc gctggtttgc cgccaatctt 8880
ctttatgaac ttgcctgtgc tgaggagcat ctgccatcgt acgtgctgaa ctgctgccac 8940
gacttactgg tcacgcagtc cggcgcggtg actaagagag gtggcctgtc gtctggcgac 9000
ccgattactt ctgtgtcaaa caccatttac agcttggtga tatatgcaca gcacatggtg 9060
ctcagttact ttaaaagtgg tcaccctcat ggccttctgt ttctgcaaga ccagctgaag 9120
tttgaggaca tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt cggacgacct cgtgctgtat 9180
gccgagtctc ccaccatgcc aaactaccac tggtgggtgg aacatctgaa tcttatgctg 9240
ggttttcaga cggacccaag gaagacagcc ataacagatt cgccatcatt tctaggctgt 9300
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ccgtacaagc ctccacggac tgtaatcatg catgtggagc agggtctcac ccctcttgac 9840
ccaggtagat accagactcg ccgcggatta gtctccgtta ggcgtggcat caggggaaat 9900
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ggtgctggga aaacatactg gctccttcaa caggtccaag atggtgatgt catttacacg 10080
ccgactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg ggacgtgccg gttcaacgtc 10140
ccggcaggta caacgctgca attccccgcc ccctcccgta ccggcccgtg ggttcgcatc 10200
ctagccggcg gttggtgtcc tggtaagaat tccttcctgg atgaagcagc gtattgcaat 10260
caccttgatg tcttgaggct tcttagcaaa actaccctta cctgcctagg agacttcaaa 10320
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caactgaaga ccatctggag gtttggacag aacatctgtg atgccatcca accagattac 10440
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ctcaacaggc aaagagccct tgttgctatc accagggcaa gacatgctat ctttgtgtat 10680
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ctcgctgtgc accgtgacga gcagctgatc gtactagata gaaataacaa agaatgcacg 10800
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cttccgcgct tccttcccaa ggaatcagtc gcggtagtcg gggtttcaag ccccgggaaa 11400
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atttataagg ccactgccac cagcatgagg tttcattttc ccccgggccc tgtcattgaa 12000
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ttggtttgct ccgcggtact ccgtgcgcgc cctaccgttc accctgagca attacagaag 12240
atcttatgag gcctttcttt ctcagtgcca ggtggacatt cccacctggg gaaccaaaca 12300
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catgacaggg tcaaatgtaa ccttagtgta taatagcact ttgaatcagg tgttcgctat 12600
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cagacctatt atcaacatca ggtcgacggc ggcaactggt ttcacctaga atggctgcgt 13200
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agccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaagaccaa cactaccgca gcatcaggct 13320
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atgtcacaga tgagaattat ttgcattctt ctgatctcct catgctttct tcttgccttt 13500
tctatgcttc tgagatgagt gaaaagggat tcaaggtggt gtttggcaat gtgtcaggca 13560
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gatggttccg cggcaacccc tttaaccaga atttcagcgg aacaatggtg tcgtccctag 14340
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gcaagtacat tttggcccct gcccaccacg tcgaaagtgc cgcgggcttt catccgattg 14700
cggcaaatga taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca 14760
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ttcaattagg gcgaccgtgt gggggtaaag tttaattggc gagaaccatg cggccgcaat 15360
taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 15386
<210> 2
<211> 15444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
tatgtacgta taggtgttgg ctctatgcct ttggcatttg tattgtcagg agctgtgacc 60
attggcacag cccaaaactt gctacacaga aacacccttc tgtgatagcc tccttcaggg 120
gagcttaggg tttgtcccta gcaccttgct tccggagttg cactgcttta cggtctctcc 180
acccctttaa ccatgtctgg gatacttgat cggtgcacgt gtacccccaa tgccagggtg 240
tttatggcgg agggccaagt ctactgcaca cgatgcctca gtgcacggtc tctccttccc 300
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tggcgcaata cgtctgctta ccaggcgatt tgcaccttag atggcaggtt aaagttcctc 3480
ccaaaaatga tactcgagac accgccgccc tatccgtgtg agtttgtgat gatgcctcac 3540
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gattggggtt ttgcagcttt tactctattg tgcctctttt tatgttacag ttacccagcc 4020
tttggtattg ctcccctctt gggtgtgttt tctgggtctt ctcggcgcgt tcgaatgggg 4080
gtttttggct gctggttggc ttttgctgtt ggtctgttca agcctgtgtc cgacccagtc 4140
ggcgctgctt gtgagtttga ctcgccagag tgtagaaaca tccttcattc ttttgagctt 4200
ctcaaacctt gggaccctgt tcgcagcctt gttgtgggcc ccgtcggtct cggtcttgcc 4260
attcttggca ggctactggg cggggcacgc tgtatctggc actttttgct taggcttggc 4320
attgttgcag actgtatctt ggctggagct tacgtgcttt ctcaaggtag gtgtaaaaag 4380
tgctggggat cttgtataag aactgctcct aatgaggtcg cttttaacgt gtttcctttc 4440
acacgtgcga ccaggtcgtc acttatcgac ctgtgcgatc ggttttgtgc accaaaagga 4500
atggacccca tttttctcgc cactgggtgg cgcgggtgct gggccggccg aagccccatt 4560
gagcaaccct ctgaaaaacc catcgcgttt gcccaattgg atgaaaagaa gattacggct 4620
aggactgtgg tcgcccagcc ttatgacccc aaccaagccg taaagtgctt gcgggtgttg 4680
caggcgggtg gggcgatggt ggctgaggcg gtcccaaaag tggtcaaggt ttccgctgtt 4740
ccattccgag cccccttctt tcccactgga gtgaaagttg atcctgattg cagggtcgtg 4800
gttgaccctg atactttcac tgcagctctc cggtctggct actccaccac aaacctcgtc 4860
cttggtgtag gggactttgc ccagctgaat ggattaaaaa tcaggcaaat ttccaagcct 4920
tcagggggag gcccacatct catggctgcc ctgcatgttg cctgctcgat ggctctgcac 4980
atgcttgctg ggatctatgt gactgcggtg ggttcttgcg gcaccggcac caacgacccg 5040
tggtgcgcta acccgtttgc cgtccctggc tacggacctg gctctctctg cacgtccaga 5100
ttgtgcattt cccaacacgg ccttaccctg cccttgacag cacttgtggc gggattcggt 5160
attcaagaaa ttgccttagt cgttttgatt tttgtttcca tcggaggcat ggctcatagg 5220
ttgagctgta aggctgacat gctgtttgtt ttgcttgcaa tcgccagcta tgtttgggta 5280
cctcttacct ggttgctttg tgtgtttcct tgctggttgc gctgtttttc tttgcacccc 5340
ctcaccgtcc tatggttggt gtttttcttg atttctgtga atatgccttc aggaatcttg 5400
gccatggtgt tgttggtttc tctttggctt cttggtcgtt atactaatgt tgctggcctt 5460
gtcaccccct acgacattca ccattacacc agcggccccc gcggtgttgc cgccttggct 5520
accgctccag atgggaccta cttggccgct gtccgccgcg ctgcgttgac tggccgcacc 5580
atgctgttta ccccgtccca gcttgggtct cttcttgagg gtgctttcag aactcgaaag 5640
ccctcactga acaccgtcaa tgtgatcggg tcctccatgg gctctggcgg ggtgtttacc 5700
atcgacggga aagtcaagtg cgtaactgcc gcacatgtcc ttacgggcaa ttcagctcgg 5760
gtttccgggg tcggcttcaa tcaaatgctt gactttgacg taaagggaga ttttgctata 5820
gctgattgcc cgaattggca aggggctgcc cccaagaccc aattctgcac ggatggatgg 5880
actggccgtg cctattggct aacatcctct ggcgtcgaac ccggcgtcat tggaaaagga 5940
ttcgccttct gcttcaccgc atgtggcgat tccgggtccc cagtgatcac cgaggccggt 6000
gagcttgtcg gcgttcacac gggatcgaat aaacaagggg ggggcattgt tacgcgcccc 6060
tcaggccagt tttgtaatgt ggcacccatc aagctaagcg aattaagtga attctttgct 6120
gggcctaagg tcccgctcgg tgatgtgaag gtcggcagcc acataattat agacataagc 6180
gaggtgcctt cagatctttg tgccttgctt gctgccaaac ctgaactgga aggaggcctc 6240
tccaccgtcc aacttctttg tgtgtttttt ctcctgtgga gaatgatggg acatgcctgg 6300
acgcccttgg ttgctgtgag tttctttatt ctgaatgagg ttctccctgc cgtcctggtc 6360
cggagtgttt tctcctttgg aatgtttgtg ctatcctggc tcacgccatg gtctgcgcaa 6420
gttctgatga tcaggcttct gacagcagct cttaacagga acagatggtc acttgccttt 6480
ttcagcctcg gtgcagtgac cggttttgtc gcagatcttg cggccactca ggggcatccg 6540
ttgcaggcag tgatgaattt gagcacctat gcattcctgc ctcggatgat ggttgtgacc 6600
tcaccagtcc cagtgatcac gtgtggtgtc gtgcacctac ttgccatcat tttgtacttg 6660
tttaagtacc gtggcctgca ccatatcctt gttggcgatg gagtgttctc tgcggctttc 6720
ttcttgagat actttgccga gggaaagttg agggaagggg tgtcgcaatc ctgcggaatg 6780
aatcatgagt ctctgactgg tgccctcgct atgagactca atgacgagga cttggatttc 6840
cttatgaaat ggactgattt taagtgcttt gtttctgcgt ccaacatgag gaatgcagcg 6900
ggtcaattta tcgaggctgc ctatgctaaa gcacttagag tagaactggc ccagttggtg 6960
caggttgata aagttcgagg tactttggcc aaacttgaag cttttgctga taccgtggca 7020
cctcaactct cgcccggtga cattgttgtc gctctcggcc acacgcctgt tggcagtatc 7080
ttcgacctaa aggttggtag caccaagcat accctccaag ccattgagac cagagtcctt 7140
gctgggtcca aaatgaccgt ggcgcgcgtc gtcgacccga cccccacgcc cccgcccgca 7200
cccgtgccca tccccctccc accgaaagtt ctggagaatg gccccaacgc ttggggggat 7260
gaggaccgtt tgaataagaa gaagaggcgc aggatggaag ccctcggcat ctatgttatg 7320
ggcgggaaaa agtaccagaa attttgggac aagaattccg gtgatgtgtt ttatgaggag 7380
gtccataata acacagatga ttgggagtgt ctcagagttg gcgaccctgc cgactttgac 7440
cctgagaagg gaactctgtg tggacatgtc accattgaaa acaaggctta ccatgtttac 7500
acctccccat ctggtaagaa gttcttggtc cccgtcaacc cagagaatgg aagagttcaa 7560
tgggaagctg caaagctttc cgtggagcag gccctaggta tgatgaatgt cgacggcgaa 7620
ctgactgcca aagaactgga gaaactgaaa agaataattg acaaactcca gggcctgact 7680
aaggagcagt gtttaaactg ctagccgcta gcgacttgac ccgctgtggt cgcggcggct 7740
tggttgttac tgaaacagcg gtaaaaatag tcaaatttca caaccggacc ttcaccctgg 7800
gacctgtgaa tttaaaagtg gccagtgagg ttgagctaaa agacgcggtt gagcacaacc 7860
aacacccggt tgcgagaccg atcgatggtg gagttgtgct cctgcgttcc gcggttcctt 7920
cgcttataga cgtcttgatc tccggtgctg atgcatctcc caagttactt gcccatcacg 7980
ggccgggaaa cactgggatc gatggcacgc tctgggattt tgagtccgaa gccactaaag 8040
aggaagtcgc actcagtgcg caaataatac aggcttgtga cattaggcgc ggcgacgctc 8100
ctgaaattgg tctcccttac aagctgtacc ctgttagggg taaccctgag cgggtgaaag 8160
gagttctgca gaatacaagg tttggagaca taccttacaa aacccccagt gacactggaa 8220
gcccagtgca cgcggctgcc tgccttacgc ccaacgccac tccggtgact gatgggcgct 8280
ccgtcttggc cacgaccatg ccccccgggt ttgagttata tgtaccgacc atacctgcgt 8340
ctgtccttga ttaccttgac tctaggcctg actgccctaa acagctgaca gagcacggct 8400
gcgaagatgc cgcactgaaa gacctctcca aatatgactt gtccacccaa ggctttgttt 8460
tacctggagt tcttcgcctt gtgcggaaat acctgtttgc ccatgtaggt aagtgcccac 8520
ccgttcatcg gccttctact taccctgcta agaattctat ggctggaata aatgggaata 8580
ggttcccaac caaggacatt cagagcgtcc ctgaaatcga cgttctgtgc gcacaggctg 8640
tgcgagaaaa ctggcaaact gtcacccctt gcactcttaa gaaacagtat tgcgggaaga 8700
agaagactag gaccatactc ggcaccaata acttcatcgc actagcccac cgagcagtgt 8760
tgagtggtgt tacccagggc ttcatgaaaa aggcgtttaa ctcgcccatc gccctcggaa 8820
agaacaagtt taaggagcta cagactccgg tcctgggcag gtgccttgaa gctgatctcg 8880
catcctgcga tcgatccacg cctgcaattg tccgctggtt tgccgccaac cttctttatg 8940
aacttgcctg tgctgaagag catctaccgt cgtacgtgct gaactgctgc cacgacttac 9000
tggtcacgca gtccggcgca gtgactaaga gaggtggcct gtcgtctggc gacccgatca 9060
cctctgtgtc taacaccatt tatagtttgg tgatctatgc acagcatatg gtgcttagtt 9120
acttcaaaag tggtcacccc catggccttc tgttcttaca agaccagcta aagtttgagg 9180
acatgctcaa ggttcaaccc ctgatcgtct attcggacga cctcgtgctg tatgccgagt 9240
ctcccaccat gccaaactat cactggtggg ttgaacatct gaatttgatg ctggggtttc 9300
agacggaccc aaagaagaca gcaataacag actcgccatc atttctaggc tgtagaataa 9360
taaatgggcg ccagctagtc cccaaccgtg acaggatcct cgcggccctc gcctatcaca 9420
tgaaggcgag taatgtttct gaatactatg cctcagcggc tgcaatactc atggacagct 9480
gtgcttgttt ggagtatgat cctgaatggt ttgaagaact tgtagttgga atagcgcagt 9540
gcgcccgcaa ggacggctac agctttcccg gcacgccgtt cttcatgtcc atgtgggaaa 9600
aactcaggtc caattatgag gggaagaagt cgagagtgtg cgggtactgc ggggccccgg 9660
ccccgtacgc tactgcctgt ggcctcgacg tctgcattta ccacacccac ttccaccagc 9720
attgtccagt cacaatctgg tgtggccatc cagcgggttc tggttcttgt agtgagtgca 9780
aatcccctgt agggaaaggc acaagccctt tagacgaggt gctggaacaa gtcccgtata 9840
agcccccacg gaccgttatc atgcatgtgg agcagggtct cacccccctt gatccaggta 9900
gataccaaac tcgccgcgga ctggtctctg tcaggcgtgg aattagggga aatgaagttg 9960
aactaccaga cggtgattat gctagcaccg ccttgctccc tacctgcaaa gagatcaaca 10020
tggtcgctgt cgcttccaat gtattgcgca gcaggttcat catcggccca cccggtgctg 10080
ggaaaacata ctggctcctt caacaggtcc aggatggtga tgttatttac acaccaactc 10140
accagaccat gcttgacatg attagggctt tggggacgtg ccggttcaac gtcccggcag 10200
gcacaacgct gcaattcccc gtcccctccc gcaccggtcc gtgggttcgc atcctagccg 10260
gcggttggtg tcctggcaag aattccttcc tagatgaagc agcgtattgc aaccaccttg 10320
atgttttgag gcttctcagt aaaactaccc tcacctgtct aggagacttc aagcaactcc 10380
acccagtggg ttttgattct cattgctatg tttttgacat catgcctcaa actcaactga 10440
agaccatctg gaggtttgga cagaatatct gtgatgccat tcagccagat tacagggaca 10500
aactcatgtc catggtcaac acaacccgtg tgacctacgt ggaaaaacct gtcaggtatg 10560
ggcaggtcct caccccctac cacagggacc gagaggacga cgccatcact attgactcca 10620
gtcaaggcgc cacattcgat gtggttacgt tgcatttgcc cactaaagat tcactcaaca 10680
ggcaaagagc ccttgttgcc atcaccaggg caagacacgc tatctttgcg tatgacccac 10740
acaggcagct gcagggctta tttgatcttc ctgcaaaagg cacacccgtc aacctcgcag 10800
tgcaccgcga cgggcagctg atcgtgctgg atagaaataa caaagaatgc acggttgctc 10860
aggctctagg caacggggat aaatttaggg ccacagataa gcgtgttgta gattctctcc 10920
gcgccatttg tgctgatcta gaagggtcga gctctccgct ccccaaggtc gcacacaact 10980
tgggatttta tttctcacct gatttaacac agtttgctaa actcccagta gaacttgcac 11040
ctcactggcc cgtggtgaca acccagaaca atgaaaagtg gccagatcgg ctggttgcca 11100
gccttcgccc tatccataaa tacagccgcg cgtgcatcgg tgccggctat atggtgggcc 11160
cttcggtgtt tctaggcact cctggggtcg tgtcatacta tctcacaaaa tttgttaagg 11220
gcgaggctca attgcttcca gagacggttt tcagcaccgg ccgaattgag gtagactgcc 11280
gggaatatct tgatgatcgg gagcgagaag ttgctgcgtc cctcccacac gctttcattg 11340
gcgacgtcaa aggcactacc gttggaggat gtcatcatgt cacctccaga tacctcccgc 11400
gcgtccttcc caaggaatca gttgcggtag tcggggtttc aagccccgga aaagccgcga 11460
aagcattgtg cacactgaca gatgtgtacc tcccagatct tgaagcctat ctccacccgg 11520
agacccagtc caagtgctgg aaaatgatgt tggacttcaa agaagttcga ctaatggtct 11580
ggaaagacaa aacagcctat ttccaacttg aaggtcgcta tttcacctgg tatcagcttg 11640
ccagctatgc ctcgtacatc cgtgttcctg tcaactctac ggtgtacttg gacccctgca 11700
tgggccccgc cctttgcaac aggagagtcg tcgggtccac ccattggggg gctgacctcg 11760
cggtcacccc ttatgattac ggcgctaaaa ttatcctgtc tagcgcgtac catggtgaaa 11820
tgccccccgg atacaaaatt ctggcgtgcg cggagttctc gttggatgac ccagttaagt 11880
acaaacatac ctgggggttt gaatcggata cagcgtatct gtatgagttc accggaaacg 11940
gtgaggactg ggaggattac aatgatgcgt ttcgtgcgcg ccaggaaggg aaaatttaca 12000
aggccactgc caccagcttg aagtttcatt ttcccccggg ccctgtcatt gaaccaactt 12060
taggcctgaa ttgaaatgaa atggggtcca tgcaaagcct ttttcacaaa attggccaac 12120
tttttgtgga tgctttcacg gagttcttgg tgtccattgt tgatatcatc atatttttgg 12180
ccattttgtt tggcttcacc atcgccggtt ggctggtggt cttttgcatc agattggttt 12240
gctccgcgat actccgtacg cgctctgcca ttcactctga gcaattacag aagatcttat 12300
gaggcctttc tttcccagtg ccaagtggac attcccacct ggggaactaa acatcctttg 12360
gggattctct ggcaccataa ggtgtcaacc ctgattgatg aaatggtgtc gcgtcgaatg 12420
taccgcatca tggaaaaatc agggcaggct gcctggaaac aggtggtgag cgaggctacg 12480
ctgtctcgca ttagtagttt ggatgtggtg gctcattttc agcatctagc cgccattgaa 12540
gccgagacct gtaaatattt ggcctcccgg ctgcccatgc tacacaacct gcgcatgaca 12600
ggttcaaatg taaccatagt gtataatagc actttgaatc aggtgtttgc tatttttcca 12660
acctctggtt cccggccaaa gcttcatgat tttcagcaat ggttaatagc tgtacattcc 12720
tccatatttt cctctgttgc agcttcttgt actctttttg ttgtgctgtg gttgcgtgtt 12780
ccaatactac gtactgtttt tggtttccgc tggttagggg caatttttct ttcgaactca 12840
cagtgaatta cacggtgtgt ccaccttgcc tcacccggca agcagccgca gagatctacg 12900
aacccggtag gtctctttgg tgcaggatag ggtatgaccg atgtgaggag gatgatcatg 12960
acgagctagg gtttatggta ccgcctggcc tctccagcga aggccacttg actagtgttt 13020
acgcctggtt ggcgttcttg tccttcagct acacggccca gttccatccc gagatattcg 13080
ggatagggaa tgtgagtcga gtttatgttg acatcaaaca tcaactcatc tgcgccgaac 13140
atgacgggca gaacaccacc ttgcctcgtc atgacaacat ttcagccgtg tttcagacct 13200
attaccaaca tcaagtcgat ggcggcaatt ggtttcacct agaatggctt cgtcccttct 13260
tttcctcgtg gctggtttta aatgtctctt ggtttctcag gcgttcgcct gcaaaccatg 13320
tttcagttcg agtctcgcag atattgagac caacaccacc gcagcggcaa gctttgctgt 13380
cctccaagac atcagttgcc ttaggcatcg cgactcggcc tctgaggcga ttcgcaaaat 13440
ccctcagtgc cgtacggcga tagggacacc cgtgtatatt actatcacag ccaatgtgac 13500
agatgagaat tatttacatt cttctgatct cctcatgctt tcttcttgcc ttttctatgc 13560
ttctgagatg agtgaaaagg gatttaaggt ggtatttggc aatgtgtcag gcatcgtggc 13620
tgtgtgtgtc aattttacca gctacgtcca acatgtcaag gagttcaccc aacgctccct 13680
ggtggtcgac catgtgcggt tgctccattt catgacacct gagaccatga ggtgggcaac 13740
tgttttagcc tgtcttgttg ccattctgtt ggcaatttga atgtttaagt atgttggaga 13800
aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgctttcttt gtggtgtatc gtgccgttct 13860
gttttgctgt gctcgccaac gccagcagcg acagcagctc ccatctacag ctgatttaca 13920
acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc tgacaaattt gattgggcag 13980
cggagagttt tgtcatcttt cccgttttga ctcacattgt ctcctatggt gccctcacta 14040
ctagccattt ccttgacacg gtcgctttag ccactgtgtc taccgccggg tttgttcacg 14100
ggcggtatgt cctaagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg acttgcttcg 14160
tcattaggtt tgcaaagaat tgcatgtcct ggcgctacgc gtgtaccaga tataccaact 14220
ttcttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc atagagaaaa 14280
ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg cttgatggtt 14340
ccgtggcaac ccctataacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct tagatgactt 14400
ctgtcatgat agcacggctc cagaaaaggt gcttttggcg ttttctatta cctacacgcc 14460
agtgatgata tatgccctaa aggtgagtcg cggccgactg ctagggcttc tgcacctttt 14520
gatcttcctg aattgtgctt tcaccttcgg gtacatgact ttcgcgcact ttcagagtac 14580
aaataaggtc gcgctcacta tgggagcagt agttgcactc ctttgggggg tgtactcagc 14640
catagaaacc tggaaattca tcacctccag atgccgtttg tgcttgctag gccgcaagta 14700
cattctggcc cctgcccacc acgttgaaag tgccgcaggc tttcatccga ttgcggcaaa 14760
tgataaccac gcatttgtcg tccggcgtcc cggctccact acggtcaacg gcacattggt 14820
gcccgggtta aaaagcctcg tgttgggtgg cagaaaagct gttaaacagg gagtggtaaa 14880
ccttgtcaaa tatgccaaat aacaacggca agcagcagaa gagaaagaag ggggatggcc 14940
agccagtcaa tcagctgtgc cagatgctgg gtaagatcat cgctcagcaa aaccagtcca 15000
gaggcaaggg accgggaaag aaaaataaga agaaaaaccc ggagaagccc cattttcctc 15060
tagcgactga agatgatgtc agacatcact ttacccctag tgagcggcaa ttgtgtctgt 15120
cgtcaatcca gaccgccttt aatcaaggcg ctgggacttg caccctgtca gattcaggga 15180
ggataagtta cactgtggag tttagtttgc ctacgcatca tactgtgcgc ctgatccgcg 15240
tcacagcatc accctcagca tgatgggctg gcattcttga gacatctcag tgtttgaatt 15300
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agggcgaccg tgtgggggtg agatttaatt ggcgagaacc atgcggccga aattaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 15444
<210> 3
<211> 15013
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 3
atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60
ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttccg tgacagcctt cttcagggga 120
gcttaggggt ctgtccctaa caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180
accctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240
ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300
tgaatctcca agtttctgag cttggagtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360
tccggtggac gttgccacgt gcatacccca ctgtcgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420
ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg gaacctgaac tttcaacaaa 480
gaatggtgcg ggtcgcagct gagatttaca gagtcggtca gctcaccccc acagtcttga 540
agaatctaca agtttatgaa cggggttgcc gctggtaccc cattgtcgga cctgtccctg 600
gagtggccgt tttcgccaat tccctacatg tgagtgacaa accttttccg ggagcaactc 660
atgtgttaac taatctaccg ctcccgcaga ggcccaagcc tgaagacttt tgtccttttg 720
agtgtgctat ggctgacatc tatgacattg gtcatgacgc cgtcatgtat gtggccggag 780
ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaagggaa atttgaaact gtccccgagg 840
agttgaagtt aattgcgaac cgacttcaca tctccttccc gccccaccac gtagtggaca 900
tatctaagtt tgcctttata gcccccggga gtggtgtctc catgcgggtt gagtgccaac 960
atggctgcct ccccgctgat actgttcctg gagggaactg ctggtggcgc ttgttcgact 1020
cgctcccacc ggaagttcag aataaagaaa ttcgctatgc taaccaattt ggttatcaaa 1080
ccaagcatgg tgtctctggc aagtacctac agcggaggct gcaagttaat ggtctccgag 1140
cagtgactga tacaagtggg cctatcgtcg tacagtattt ctctgttaag gagagttgga 1200
tccgccactt aaggctggcg gaagaaccta gcctccctgg gtttgaggac ctcctcagaa 1260
taagggttga gcccaatacg tcaccattgg ttggcaagga tgtgaaaatc ttccggtttg 1320
gcaatcacaa atggtacggc gctggaaaga gagcaaggaa atcacgctct ggtgcgactg 1380
ccacggtcgc tcaccgcgct ttacccgttc gtgaaaccct gcaggctaag aggcgcgagg 1440
ttgccagcgc caacagggct gagcatatca agcactatta tccgccagcc gacggaaact 1500
gtggttggca ctgcatttcc gctattgtca accggatggt gaattctaaa tttgaaactg 1560
ctcttcccga gagagcgaga ccttctgatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaata 1620
ccatccaaat cctcagactc cctgcggcct tggacaggga cggtgcttgt gttagcgcca 1680
agtacgtgct taaactagaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgacccct gggatgtccc 1740
cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga acataagaac ggccttggtc 1800
ccccagatgc ggtcgaaagt tttggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg 1860
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attgtccggc atccccggtc accactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 1980
gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaagat catcagcctt tgtcaagttg 2040
ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggtcgcgg 2100
caaagattaa tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agactgcttg actaggcttg 2160
agagggcttg cccgccgagt gctgcggaca ccttctttga ttggaacgtt gtgctccctg 2220
gggttgaggc tgcaactccg ccaccccctc caccaagagt tcagcctcga aaaacaaagt 2280
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actgtggcag cccgattttg acgggcgaca atgatctttc gacgccatcc gagccgatga 2400
catctctgaa tgagcctgcg cttatgcctg cgttgcaatg tatctctagg ccagtgacat 2460
ctttgagtgt gccggcccca gttcctgcac cgcgtagagc tgtgtcccga ccggtgacgc 2520
ccttgagtga gccagttttt ttgtctgcac cgcgacacaa atttcagcag gtgaaagaag 2580
cgaatctggt ggcaacaacg ctgatgtgcc aggacgaacc tctagatttg tctgcatcct 2640
cacagactga atatgaagct tcccccccag caccactgca gaacatgggt attctggagg 2700
tggggggaca agaagctgtg gaagttctga gtgaaatctc ggatacactg aatgacacca 2760
accctgcacc tgtgtcatca agcagctccc tgtcaagtgt taagatcaca cgcccaaaat 2820
actcagctca agccatcatt gattcgggcg ggccctgcag tgggcacctc cgaaggggaa 2880
aagaagcatg cctcagcctc atgcgtgagg cttgtgatgc ggctaagctt agtgaccctg 2940
ccacgcaaga atggctttct cgcatgtggg atagggttga catgctgacc tggcgcaaca 3000
cgtctgccta ccaggcgttt cgcatcttag atggtaggtt tgagtttctc ccaaagatga 3060
tactcgagac accgccgccc tacccgtgtg ggtttgtgat gctgcctcac acgcctgcac 3120
cttccgtgag tgcagagagc gaccttacca ttggttcagt cgccactgaa gatgttccac 3180
gcattctcgg gaaaatagaa aacgccggcg agacgcccaa ccaggggctc ttggcaccct 3240
tcggggaaga accggtgtgc gaccaacctg tcaaagactc ccggatgttg tcgcgggggt 3300
ttgacgagag cacgacggct ccgtccgcag gtacaggtgg cgctgactta cccactgatt 3360
tgccaccttc agatggtgtg gatgcggacg gggtggggct gttacggacg gtaagaaaga 3420
aagctgaaag gctcttcgac caattgagcc gtcaggtttt taacctcgtc tcccatctcc 3480
ctgttttctt ctcacacctc ttcaaatctg acagtggtta ttctccgggt gattggggtt 3540
ttgcagcttt tactttattt tgcctctttt tatgttacag ctacccattc ttcggtttcg 3600
ctcccctctt gggtgtgttt tctgggtctt ctcggcgcgt gcgcatgggg gtttttggct 3660
gctggttggc ttttgctgtt ggcctgttca agcctgtgtc cgacccagtc ggcactgctt 3720
gtgagtttga ctcgccagag tgtaggaacg tccttcattc ttttgagctt ctcaaacctt 3780
gggaccctgt ccgcagcctt gttgtgggcc ccgtcggtct cggtcttgcc attcttggca 3840
ggttactggg cggggcacgc tacatctggc attttttcct taggcttggc attgttgcag 3900
attgcttctt ggctggagct tatgtgcttt ctcaaggtag gtgtaaaaaa tgctggggat 3960
cttgtgtaag aactgctcct aatgaaatcg ccttcaacgt gttccctttt acgcgtgcga 4020
ccaggtcgtc actcatcgac ctgtgcgatc ggttttgtgc gccaaaaggc atggacccca 4080
ttttcctcgc tactgggtgg cgtgggtgct ggaccggccg gagtcccatt gagcaaccct 4140
ctgaaaaacc tatcgcgttc gcccagttgg atgagaagag gattacggct agaactgtgg 4200
tcgttcagcc ttatgatcct aaccaagccg taaagtgctt gcgggtgtta caggcgggtg 4260
gggcgatggt ggccgaggca gtcccaaaag tggtcaaggt ttccgccatt ccattccgag 4320
ctcccttttt tcccaccgga gtgaaggttg atcctgagtg caggatcgtg gtcgaccccg 4380
acacttttac tacagctctc cggtctggtt actccaccac aaacctcgtc cttggtgtgg 4440
gggactttgc ccaactgaat ggattaaaaa tcaggcaaat ttccaagtct tcggggggag 4500
gcccacacct cattgctgcc ctgcatgttg cttgctcgat ggcgttgcac atgcttgctg 4560
gggtttatgt aactgcagtg gggtcttgcg gtaccggcac caatgatccg tggtgcacta 4620
acccattcgc cgtccctggc tacggacctg gctctctctg cacgtccaga ttgtgcatct 4680
cccaacatgg ccttaccctg cccttgacag cacttgtggc aggattcggt cttcaggaaa 4740
ttgccttagt cgttttgatt tttgtttcca tcggaggcat ggctcatagg ttgagttgca 4800
aggctgatat gctgtgcgtc ttacttgcaa tcgcaagcta tgtttgggta ccccttacct 4860
ggttgctctg tgtgtttcct tgctggttgc gctggttctc tttgcaccct ctcaccatcc 4920
tatggttggt gtttttctta atttccgtaa atatgccttc gggaatcttg gccgtggtgt 4980
tattggttgc tctttggctt ctaggccgtt atactaatgt tgttggtctt gttaccccct 5040
atgatattca tcatcacacc agtggccccc gcggtgttgc cgccttggct accgcaccgg 5100
atgggactta tttggccgct gtccgccgcg ctgcgttgac tggccgcacc gtgttgttta 5160
ccccgtccca gcttgggtcc ctccttgagg gcgctttcag aactcgaaag ccctcactga 5220
acaccgtcaa tgtggtcggg tcctctatgg gctctggcgg agtgttcact atcgatggga 5280
aaattaagtg cgtgactgcc gcacatgtcc ttacgggtaa ttcagctagg gtttccgggg 5340
ttggcttcaa tcaaatgctt gactttgatg taaaagggga cttcgccata gctgattgcc 5400
cgaattggca aggggctgct cctaagaccc aattctgcga ggatgggtgg actggccgtg 5460
cctattggct gacatcctct ggtgtcgaac ccggcgtcat tgggaatgga ttcgccttct 5520
gcttcaccgc gtgcggcgat tctgggtccc cagtgatcac cgaagccggt gagcttgtcg 5580
gcgttcacac aggatcaaat aaacaaggag gaggcattgt tacgcgcccc tcaggccagt 5640
tttgtaatgt ggcacccatc aagctgagcg aattaagtga gttctttgct ggacctaagg 5700
tcccgctcgg tgatgtgaag gttggcagcc acataattaa agatatatgc gaggtacctt 5760
cagacctttg cgccttgctt gccgccaaac ccgaattgga aggaggcctc tccaccgtcc 5820
aacttttatg tgtgtttttc ctcctgtgga gaatgatggg acatgcctgg acacccttgg 5880
ttgctgtggg tttttttatc ttgaatgaag tcctcccagc tgtcctggtc cggagtgttt 5940
tctcctttgg aatgtttgtg ctatcttggc tcacaccatg gtctgcgcaa gttctgatga 6000
tcaggcttct aacagcagct ctcaacagga acagattgtc actcgccttt tacagccttg 6060
gtgcggcgac cggctttgtc gcagatctgg cggcaactca agggcatccg ttgcaagcag 6120
taatgaattt aagtacctat gccttcctgc ctcggatgat ggttgtgacc tcaccagtcc 6180
cagttattgc gtgtggtgtc gtgcacctcc ttgccataat tttgtacttg tttaagtacc 6240
gctgcctgca caatgttctt gttggcgatg gagcgttctc tgcggctttc tttttgcgat 6300
actttgccga ggggaaattg agggaagggg tgtcgcaatc ctgcgggatg aatcatgagt 6360
cgctgactgg tgccctcgct atgagactca atgacgagga cttggatttc cttacgaaat 6420
ggactgattt taagtgcttt gtttctgcgt ccaacatgag gaatgcggcg ggccagttca 6480
tcgaggctgc ctatgcaaaa gcacttagaa ttgaacttgc ccagttggtg caggttgata 6540
aggttcgagg tactatggcc aaacttgaag cttttgctga taccgtggca ccccaactct 6600
cgcccggtga cattgttgtt gctcttggcc atacacctgt tggcggtatc ttcgacctaa 6660
aggttggtag caccaagcac accctccaat ccattgagac cagagtcctt gccgggtcca 6720
aaatgaccgt ggcgcgtgtc gttgacccaa cccccacacc cccacccgca cccgtgccca 6780
tccccctccc accgaaagtt ctggagaatg gtcctaacgc ctggggggat gaggatcgtt 6840
tgaacaagaa gaagaggcgc aggatggaag ccgtcggcat ctttgttatg ggtggaaaga 6900
aataccagaa attttgggac aagaattccg gtgatgtgtt ttatgaggag gtccatgata 6960
acacagacgc gtgggagtgc ctcagagttg acaaccctgc cgactttgac cctgagaagg 7020
gaactctgtg tgggcatact accattgaag gtaaggctta caatgtctac gcctccccat 7080
ctggcaagaa gtttctggtc cccgtcaacc cagagagtgg aagagcccaa tgggaagctg 7140
caaagctttc cgtggagcag gcccttggca tgatgaatgt cgacggtgag ctgacagcca 7200
aagaactgga gaaactgaaa agaataattg acaaactcca gggtctgact aaggagcagt 7260
gtttaaactg ttagccgcca gcggcttgac ccgctgtggt cgcggcggct tggttgttac 7320
tgagacagcg gtaaaaatag tcaaatttca caaccggacc ttcaccctag gacctgtgaa 7380
cttaaaagtg gccagtgagg ttgagctaaa agacgcggtc gagcacaacc aacacccggt 7440
tgcaagaccg gttgatggtg gcgttgtact cctgcgcccc gcagttcctt cgcttgtaga 7500
tgtcttgatc tctggcgctg atgcatcccc taagttactc gcccgccatg ggccgggaaa 7560
cactgggatc gatggcacgc tttgggattt tgagaccgaa gccaccaaag aggaaattac 7620
acttagtgcg caaataatac aggcttgtga cattaggcgc ggcgacgcac ctgaaattgg 7680
tctcccttat aagctgcacc ctgttagggg caaccctgag cggataaaag gagttttaca 7740
gaatacaagg tttggggaca taccttacaa aacccccagt gacactggca gcccagtgca 7800
tgcggctgcc tgcctcacgc ccaatgccac tccggtgacc gatgggcgct ccgtcttggc 7860
tacgactatg ccctccggtt ttgagttgta tataccgacc attccatcgt ctgtccttga 7920
ttatcttgat tctaggcctg actgccccaa acagttaaca gagcacggct gtgaggatgc 7980
cgcattgaga gacctctcca agtatgactt gtccacccaa ggctttgttt tgcctggagt 8040
tcttcgccta gtgcgtaagt acctgtttgc tcatgtgggt aagtgcccgc ccgttcatcg 8100
gccttccact tatcctgcca agaactctat ggctggaata aatgggaaca ggtttccaac 8160
caaggacatt cagagcatcc ctgaaatcga cgttctgtgc gcacaggctg tgcgagaaaa 8220
ctggcaaact gttacccctt gcaccctcaa gaaacaatat tgtgggaaga agaagactag 8280
gacaatactc ggcaccaata acttcgttgc gttggcccac cgggcagcgt tgagtggtgt 8340
cacccagggc tttatgaaaa aggcgtttaa ctcgcccatt gccctcggga aaaacaaatt 8400
taaagagcta cagactccgg tcttaggcag gtgccttgaa gctgatcttg catcctgcga 8460
tcggtccaca cctgcaattg tccgctggtt tgccgccaat cttctttatg aacttgcctg 8520
tactgaagaa catctaccgt cgtacgtgct gaactgctgc cacgacctac tggtcacgca 8580
gtccggcgcg gtgactaaga gaggtggcct gtcgtctggc gacccgatta cctctgtgtc 8640
aaacaccatt tacagcttag tgatatatgc acagcacatg gtgctcagtt actttaaaag 8700
tggtcaccct cacggccttc tgtttctgca agaccagcta aagtttgagg acatgctcaa 8760
ggttcaaccc ctgatcgtct attcggacga cctcgtgctg tatgccgagt ctcccaccat 8820
gccaaactac cactggtggg ttgaacatct gaatcttatg ttgggttttc aaacggaccc 8880
aaggaagaca gccataacag actcaccatc ttttctaggc tgtagaataa taaatgggcg 8940
ccagctagtc ccccaccgtg acaggattct cgcggccctt gcctaccata tgaaagcaag 9000
caatgtttct gaatattacg cctcggcggc tgcaatactc atggacagct gtgcttgttt 9060
agagtatgat cctgaatggt ttgaagagct cgtggttggg atggcgcagt gcgcccgcaa 9120
ggacggctac agttttcctg gcccgccgtt cttcttgtcc atgtgggaaa aactcaggtc 9180
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cactgcctgt ggcctcgatg tctgtgttta ccacacccac ttccaccagc attgtccagt 9300
cataatctgg tgtggccatc cggcgggttc tggttcttgt agtgagtgca aaccccccct 9360
agggaaaggc acaagccctc tggatgaggt gttggaacaa gtcccgtaca agcctccgcg 9420
gactgtaatc atgcatgtgg agcagggtct cacccctctt gacccaggta gataccaaac 9480
tcgccgcgga ttagtctccg ttaggcgtgg catcagggga aatgaagttg acctaccaga 9540
cggtgattat gccagtaccg ccctgctccc tacttgtaaa gagatcaaca tggtcgctgt 9600
cgcctctaat gtgttgcgca gcaggttcat catcggtccg cccggtgctg ggaaaacata 9660
ctggctcctt caacaggtcc aggatggtga tgtcatttac acaccaactc accagaccat 9720
gcttgacatg attagggctt tgggggcgtg ccggttcaac gtcccagcag gcacaacgct 9780
gcaattccct gccccctccc ataccggccc gtgggttcgc atcctagccg gcggttggtg 9840
tcctggtaag aattccttcc tggatgaagc agcgtattgt aatcaccttg atgtcttgag 9900
gctccttagc aaaactaccc tcacctgtct aggagatttc aaacaactcc acccagtggg 9960
ttttgattct cattgctatg tttttgacat tatgcctcag actcaactga agaccatctg 10020
gagatttgga cagaatatct gcgatgccat tcagccagat tacagggaca aacttgtatc 10080
catggtcaac acaacccgtg taacctactt ggaaaaacct gtcaagtatg ggcaagtcct 10140
caccccttac cacagggacc gagaggacgg cgccatcaca attgactcta gtcaaggcgc 10200
cacatttgat gtggttacac tgtatttgcc cactaaagat tcactcaaca ggcaaagagc 10260
ccttgttgct atcaccaggg caagacatgc tatctttgtg tatgacccac acaggcaact 10320
gcagagcatg tttgatcttc ccgcgaaagg cacacccgtc aacctcgctg tgcaccgtga 10380
cgagcagctg atcgtactag atagaaacaa caaagaatgc tcggttgctc aggctctagg 10440
caatggggat aaattcaggg ccacagacaa gcgcgttgta gattctctcc gcgccatttg 10500
tgcagatctt gaagggtcga gctccccgct tcccaaggtc gcacacaact tgggatttta 10560
tttctcgcct gatttgacac agtttgccaa actcccggta gaacttgcac cccactggcc 10620
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tgtccataag tatagccgcg cgtgcatcgg tgccggctac atggtgggcc cctcagtgtt 10740
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caaggaatca gtcgcggtag tcggggtttc aagccccggg aaagccgcaa aagcagtttg 11040
cacattaaca gatgtgtatc tcccagacct tgaagcttac ctccacccag agacccagtc 11100
caagtgctgg aaaatgatgt tggacttcaa ggaagttcga ctgatggtct ggaaaggcaa 11160
gacggcctat tttcaacttg aaggccgcca tttcacctgg tatcagcttg caagctacgc 11220
ctcgtacatc cgagtacctg ttaattctac ggtgtatttg gacccctgca tgggccctgc 11280
cctttgcaac agaagagttg tcgggtccac ccattgggga gccgacctcg cagtcacccc 11340
ttatgattac ggtgccaaag tcattctgtc tagtgcatac catggtgaaa tgcctcctgg 11400
gtacaaaatc ctggcgtgcg cggagttctc gcttgacgat ccagttaggt acaaacgcac 11460
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cccggccaag gcctcatgat tttcagcaat ggctaatagc tgtgcattcc tccatatttt 12300
cctctgttgc ggcttcttgt actctttttg ttgtgctgtg gttgcggatc ccaatgctac 12360
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gtctctttgg tgcaggatag ggcatgaccg atgtagtgag gacgatcacg acgaactagg 12540
gttcatggtt ccgcctggcc tctccagcga aggccactta accagtgttt atgcctggtt 12600
ggcgttcctg tctttcagct acacggccca attccatccc gagatatttg ggatagggaa 12660
tgtgagtaaa gtttatgttg acgtcaagca ccaattcatc tgcgccgttc atgacggaca 12720
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cgcacggcga tagggacacc cgtgtatatt accatcacag ccaatgtgtc agacgagaat 13080
tacttacatt cttcagatct cctcatgctt tcttcttgcc ttttctatgc ctctgagatg 13140
agtgaaaagg ggttcaaggt gatatttggc aatgtttcag gcattgtggc tgtgtgtgtc 13200
aactttacca gctacgtcca acatgttagg gagttcaccc aacgctctct ggcggtcgat 13260
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atgtgagctg aatggcacag attggctggc tggtaaattt gattgggcag tggagacttt 13560
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accggggaag aaaaataaaa agaaaaaccc ggagaagccc cattttcctc tagcgaccga 14640
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gactgccttt aaccagggcg ctggaacttg taccctgtca gattcaggga ggataagtta 14760
cactgtggag tttagtttgc cgacgcatca cactgtgcgc ctgattcgcg ccacagcatc 14820
accctcagcg tgatgggctg gcattcttga agcacctcag tgttagaatt ggaagaatgt 14880
gtggtggatg gcactgattg acactgtgcc tctaagtcac ctattcaatt agggcgaccg 14940
tgtgggggta aagtttaatt ggcgagaacc atgcggccga aattaaaaaa aaaaaaaaaa 15000
aaaaaaaaaa aaa 15013
<210> 4
<211> 15444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Construct
<400> 4
atgacgtata gttgttggct ctatgtcgtg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaacttgct gcgcgggaac gcccttccgt gacagccttc ttcaggggag 120
tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
tgtggcggag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttccttt 300
gaatctccaa gtttctgagc ttggggtgct gggcttattt tataggcccg aagagccgct 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcctgctg 420
gctttctgcg atttttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480
aatagtgcgg gtcgcagctg agctctacag agccggtcag ctcacccccg tagtcttgaa 540
gaatctacag gtttatgaac ggggttgccg ttggtacccc atcgttggac ctgttcctgg 600
agtggctgtt tatgccaatt ccttacacgt gagtgacaaa cctttcccgg gagcaactca 660
tgtgttaacc aacctaccgc tcccgcagag gcccaagcct gaagactttt gcccctttga 720
gtgtgctatg gctgacgtct atgacattgg tcatgacgct gtcatgtatg tggccggagg 780
gagagtctcc tgggcccctc gtggcgggga caaaggaaaa tttgaaatag ttcccaagga 840
gttgaagttg attgcgaatc gactccacat ttccttcccg ccccaccacg cagtggacat 900
gtccaagttt gcctttataa gccctgggag tggtgtttcc atgcgggtcg agtaccaaca 960
tggctgtctc cccgctgata ctgtccctga aggaaactgt tggtggcgct tgtttgactt 1020
gcttccaccg gaagttcaga acaaagagat tcgccatgct aaccaactcg gctatcagac 1080
caagcatggt gtcgctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gactccgagc 1140
agtaactgac gcgaatggac ctatcgtcat acagtatttt tgtgataggg aaagctggat 1200
ccgccactta agactggtag aagaacctag cctccctggg tttgaggacc tcctcagaat 1260
aagagttgag cccaatacgt tgccattggt tggcgaggat gagaaaatct tccgatttgg 1320
caatcacaaa tggtacggtg ctggaaagag ggcaaggaaa gcacgctttg gtgcggctgc 1380
cacggtcgct caccgcgctt tgcccgctca cgaaacccag caggccaaga agcacgaagt 1440
taccagcgcc aacagggctg agcatctcga gcactattcc ccgcctaccg acgggaactg 1500
tggttggcac tgcgtttccg ccattgtcaa ccggattgtg aattccaaat ttgaaaccac 1560
ccttcccgag agagtgagac ctttagatga ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatac 1620
tatccaaatc ctcaggctcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg tcggcgccaa 1680
gtacgtgctc aagctggaag gtgtgcactg gacagtctct gtggcccctg ggatgacccc 1740
ttctctgctc ccccttgaat gtgttcaggg ctgttgtgag cataagagcg gtcttggtcc 1800
cccagatgtg gctgaagttt ccggatttga ccctgcctgc cttaaccgac tggctgaggt 1860
aatgcacttg cctagttgtg tcatcccagc tgctctggct gaaatgtccg acgaccccaa 1920
tcgcccggct tccccagtca ccactgtgtg gactatttcg caattctttg cccattatag 1980
aggaggagag caccctgatc aggtgtgctt agggaaaatc atcagccttt gtcaggtgat 2040
tgaggaatgc tgttgttccc agaacaaaac caaccgggcc accccggaag aggtcgcggc 2100
aaaaattgac cagtacctcc gtgatgcagc aagccttgga gaatgcttag ccaagcttga 2160
gagggctcgc ccgccgagcg cgatggacac ctcctttgat tggaatgttg tgcttcctgg 2220
ggttgaggcg gcgaaccaga cgaccaaaca gctccatgtc aaccagcacc gtgctccggt 2280
tcctgccatg actcaggagc ctttggacaa agactcggtc cctttgaccg ccttctcgct 2340
gtctaattgc tactaccctg cacaaggtga cgaggttcgt caccgtgaga ggctgatctc 2400
cgtgctctct aagttggagg aggttgttcg tgaggaatat gggctcacgc caactggatc 2460
tggcccgcga cccgcactgc cgaacgggct cgacgagctc aaagaccaga tggaagagga 2520
tctgttgaaa ctggtcaacg cccaggcaac ttcagaaatg atggcccggg cagctgagca 2580
ggttgatcta aaagtttggg tcaaaaatta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc 2640
aagagttcag cctcgaaaaa caaagtctgc taagagcctg ccagagaaca agcctgtccc 2700
tgctccgcgc aggaaagtca gatctgattg tggcagcccg actttgaggg gcaacaatgt 2760
tcctaacggt tgggaagact tggccgttgg tggtcctctt gatctttcga caccatccga 2820
gccgatgaca cctctgagtg agcctgcact tatgcccgtg ttgcaacata tttctggacc 2880
agtgacgcct ttgagcgtgc cggcccctat tcctgcaccg cgtaaagctg tgtcccgacc 2940
gatggcgccc tcgagtgagc caatttttgt gtctgcaccg cggcaaaaat ttcagcaggt 3000
ggaagaagca aatctggcgg caacaacgct gacataccag gacgaaccta tagatctgtc 3060
agcatcctca cagactgaat atgaggctcc ttccctagca ccactgcaga acataggtac 3120
tctggaggtg ggggggcaag aagctgagga aattctgagt gaaacctcgg atataccgaa 3180
tgacatcaac cctgtgcctg tatcatcaag cagctccttg tcaagcgtta agatcacacg 3240
cccaagacac tcagctcaag ccatcatcga ctcgggcggg ccctgcagtg ggcatctcca 3300
aagggagaaa gaagcgtgcc tccgcatcat gcgtgaggct tgtgatgcga ctaagcttag 3360
tgaccctgcc acgcaggaat ggctttctcg catgtgggat agggtggaca tgctgacttg 3420
gcgcaacacg tctgctttcc aggcgtttcg catcttagac ggcaggcttg agtttcttcc 3480
aaagatgata ctcgagacgc cgccgcccta cccgtgtggg tttgtgatgc tgcctcacac 3540
ccctgcacct tccgtgagtg cagagagcga ccttaccatc ggttcagtcg ccactgaaga 3600
tattccacgc atcctcggga aaatagaaaa caccagtgag atgatcaacc agggaccctt 3660
ggcatcctct gaggaaaaac cggcatacaa ccaacccgct aaggactccc tgatatcgtc 3720
gcgggggttt gacgagagca cagcagctcc gtccgcaggt acgggtggcg ccggcttgtt 3780
tactgatttg ccaccttcag acggtgtaga tgcggacggg ggggggccgc tgcagacggt 3840
gaaaaagaac gctgaaaggc tcctcgaccg attgagccgt caggttttta acctcgtctc 3900
ccatctccct gttttcctct cacacctctt caaatctgac agtggttatt ctccgggtga 3960
ttggggtttt gcagctttta ctctattttg cctcttttta tgttacagct acccattctt 4020
tggtttcgct ccccttttgg gtgtgttttc tgggtcttct cggcgcgtgc gcatgggggt 4080
ttttggctgc tggttggctt ttgctgttgg tttgttcaag cctgtgtccg acccagtcgg 4140
cactgcttgt gagtttgatt cgccagagtg taggaatgtc cttcattctt ttgagcttct 4200
caaaccttgg gaccctgttc gcagccttgt tgtgggcccc gtcggtctcg gtcttgccat 4260
tcttggcagg ttactgggcg gggcacgcta catctggcat tttctgctta ggcttggcat 4320
tgttacagac tgtatcctgg ctggagctta tgtgctttct caaggtaggt gtaaaaagtg 4380
ctggggatct tgcataagaa cagctcctaa tgagattgcc tttaacgtgt tcccttttac 4440
acgtgcgact aggtcgtcac tcatcgacct gtgcaatcgg ttttgtgcgc caaagggcat 4500
ggaccctatt ctcctcgcca ctgggtggcg tgggtgctgg accggccgaa gccccattga 4560
acaaccctct gaaaaaccca tcgcgtttgc ccagttggac gaaaagagga ttacggccag 4620
gaccgtggtc gcccagcctt atgaccccaa ccaagccgta aagtgcttgc gggtgttaca 4680
ggcgggcggg gcgatggtgg ctgaggcagt cccaaaagtg gtcaaagttt ccgctattcc 4740
attccgagcc cccttttttc ccaccggagt gaaagttgac cctgagtgta ggatcgtggt 4800
tgaccccgac acttttacta cagccctccg gtccggctat tccaccacaa acctcgttct 4860
tggtgtgggg gactttgccc agctgaatgg attaaaaatc aggcaaattt ccaagccttc 4920
gggaggaggc ccgcacctca ttgctgccct acatgttgcc tgctcgatgg cgttgcacat 4980
gcttgctggg gtttatgtaa ctgcagtggg gtcttgcggt accggcacca acgatccgtg 5040
gtgcaccaac ccgtttgccg tccctggcta cgggcctggt actctttgca cgtccagatt 5100
gtgcatctcc caacatggcc ttaccctgcc cttgacagca cttgtggcag gattcggtct 5160
tcaggaaatt gccttggttg ttttgatttt cgtttccatc ggaggcatgg ctcacaggtt 5220
gagttgcaag gctgacatgc tgtgcgtttt acttgcaatc gccagctatg tttgggtgcc 5280
ccttacctgg tttctttgtg tgtttccttg ctggttgcgc tggttctctt tgcatcccct 5340
caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtaaat gtgccttcgg gaatcttggc 5400
tgtggtgttg ttagtttctc tttggctctt aggtcgttac actaatgttg ctggtcttgt 5460
caccccatat gacattcatc atcacaccag tggcccccga ggtgttgccg ccttggctac 5520
tgcaccggat gggacctact tggccgccgt tcgccgtgct gcgttgaccg gtcgtaccat 5580
gctgtttacc ccgtctcagc ttgggtccct tcttgagggt gctttcagaa ctcaaaagcc 5640
ctcactgaac accgtcaatg tggtcggatc ctctatgggc tccggcgggg tgttcaccat 5700
cgacgggaaa attaagtgcg taacagccgc acatgtcctt acgggtaatt cagctagggt 5760
ttccggggtc ggcttcaacc aaatgcttga ttttgatgtg aaaggggact tcgccatagc 5820
tgattgcccg aattggcaag gagctgcccc caagacccaa ttctgcgagg atggatggac 5880
tggccgtgcc tattggctga catcctctgg agtcgaaccc ggtgtcattg ggaatggatt 5940
cgccttctgc ttcaccgcgt gcggcgattc tggatccccg gtgattaccg aagccggtga 6000
gcttgtcggc gttcacacag gatcaaacaa acaaggagga ggcatagtca cacgcccctc 6060
aggccagttt tgtaatgtgg cgcccatcaa gctgagcgaa ttgagtgaat tcttcgctgg 6120
acctaaggtc ccgctcggtg atgtgaagat tggcagccac ataattaaag acgtatgcga 6180
ggtaccttca gatctttgcg ccttgctcgc tgccaaaccc gaactggaag gaggcctctc 6240
caccgtccaa cttctgtgtg tgtttttcct cctgtggaga atgatgggac atgcctggac 6300
gcccttggtt gctgtggggt tttttatctt gaatgaggtt ctcccagctg tcctggtccg 6360
gagtgtcttc tcctttggta tgtttgtgct atcttggctt acaccatggt ctgcgcaagt 6420
cctgatgatc aggcttctaa cagcagctct taacaggaac agggggtcac tcgccttcta 6480
cagcctcggt gcagtgaccg gatttatcgc agatcttgca gcaactcagg ggcatccgct 6540
gcaggcagtg atgaacttaa gcacctatgc cttcctgcct cggatgatgg ttgtgacctc 6600
accagtccca gtgcttgctt gtggtgttgt gcacctcctt gccataattt tgtacctgtt 6660
taagcaccgt tgcctgcatt atgtccttgt tggcgatgga gtgttctcta aagccttctt 6720
cttgcgatac tttgccgaag ggaagttgag ggaaggggtg tcgcagtcct gcgggatgaa 6780
tcacgagtca ctgactggtg ccctcgctat gagactcaat gacgaagact tggacttcct 6840
tacgaaatgg actgatttta agtgctttgt ttctgcgtcc aacatgagga atgcagcggg 6900
ccaattcatc gaggctgcct atgcaaaagc acttagaatt gagcttgccc agttagtaca 6960
ggttgataag gttcgaggta ctttggccaa acttgaagcc tttgctgata ccgtggcacc 7020
ccagctctcg cccggtgaca ttgttgttgc tcttggccac acgcctgttg gcagtatctt 7080
cgacctaaag gttggcagta ccaagcatac cctccaggcc attgagacca gagtccttgc 7140
cgggtccaaa atgaccgtgg cgcgtgtcgt tgatccaacc cccacgcccc cacccgcacc 7200
cgtgcccatc cccctcccac cgaaagtcct ggagaacggc cccaacgcct ggggggatga 7260
ggaccggttg aataagagga agagacgcag gatggaagcc gtcggcatct ttgttatggg 7320
tgggaagaag taccaaaaat tttgggacaa gaattccggt gatgtgtttt acgaggaggt 7380
ccatgataac acagatgcgt gggagtgcct cagagttggt gaccctgccg actttgaccc 7440
tgagaaggga actctgtgtg ggcatactac cattgaagac aaggcttata atgtctacac 7500
ctccccatct ggcaggaagt tcctggtccc cgtcaaccca gagagcggaa gagcccaatg 7560
ggaagctgca aagctttccg tagagcaggc ccttagcatg atgaatgtcg acggtgagct 7620
gacagccaaa gaactggaga aactgaaaag aataattgac aaactccagg gcctaactaa 7680
ggagcagtgt ttaaactgct agccgccagc ggcttgaccc gctgtggtcg cggcggcttg 7740
gttgttactg agacagcggt gaaaatagtt aaatttcaca accggacctt caccctagga 7800
cctgtgaatt taaaagtggc cagtgaggtt gagctaaaag acgcagtcga gcataaccaa 7860
cacccggttg caagaccggt tgatggtggt gttgtgctcc tgcgctccgc agttccttcg 7920
cttatagacg tcttgatctc tggcgctgat gcatctccta agttactcgc ccaccacggg 7980
ccgggaaaca ctgggatcga tggttcgctt tgggattttg aggccgaggc caccaaagag 8040
gaaattgcac tcagtgcgca aataatacag gcttgtgaca ttaggcgcgg cgacgcaccc 8100
gaaattggtc ttccttataa gctgcaccct gttaggggca accctgagcg ggtaaaaggg 8160
gttttacaga atacaaggtt tggagacata ccttataaaa cccccagtga cactgggagc 8220
ccagtgcacg cggctgcctg cctcacgccc aatgccactc cggtgactga cggtcgttcc 8280
gtcttggcta cgaccatgcc ctccggtttt gagttgtatg taccgaccat tccagcgtct 8340
gtccttgatt atcttgattc caggcctgat tgccccaaac agttgacaga gcacggctgt 8400
gaggatgccg cattaagaga cctctccaag tatgacttgt ccacccaagg ctttgtcttg 8460
cctggagttc ttcgccttgt gcgtaagtac ctgtttgctc atgtgggtaa gtgcccgcct 8520
attcatcggc cttccactta ccctgccaag aattccatgg ctggaataaa tgggaacagg 8580
tttccaacca aggacattca gagcgtccct gaaatcgacg ttttgtgcgc acaggccgtg 8640
cgagaaaact ggcaaactgt tactccttgt accctcaaga agcagtattg cgggaagaag 8700
aagactagga caatactcgg cactaataac ttcattgcgc tggcccaccg ggcagcattg 8760
agtggtgtca cccagggctt catgaaaaaa gcgtttaact cgcccatcgc actcgggaaa 8820
aacaaattca aggagctgca gactccggtc ttgggcagat gtcttgaagc tgaccttgca 8880
tcctgtgacc gatccacacc cgcaattgtc cgctggtttg ccgccaatct tctttatgaa 8940
cttgcctgtg ctgaggagca tataccatcg tacgtgttga actgctgcca cgacttactg 9000
gtcacgcagt ccggcgcggt gactaagaga ggtggcctat cgtctggcga cccgattact 9060
tctgtatcaa acaccattta cagcttggtg atatatgcac agcacatggt actcagttat 9120
tttaaaagtg gtcaccccca tggccttctg tttctacaag accagctaaa gtttgaggac 9180
atgctcaagg ttcagcccct gatcgtctat tcggacgacc tcgtgctgta cgccgagtct 9240
cccaccatgc caaactacca ctggtgggtt gaacatctga acctgatgct gggttttcag 9300
acggacccaa agaagacagc tataacagac tcgccatcat ttttgggttg taggataata 9360
aatggacgcc agttagtccc caaccgtgac aggatcctcg cggccctcgc ctaccatatg 9420
aaggcaaaca atgtttctga atactacgcc tcggcggctg caatactcat ggacagttgt 9480
gcttgtttgg agtacgatcc tgagtggttt gaagagctcg tggttgggat ggcgcagtgc 9540
gcccgcaagg acggctacag ttttcctggc ccgccgttct tcttgtccat gtgggaaaaa 9600
ctcaggtcca atcatgaggg gaagaagtct agaatgtgcg ggtactgtgg ggccccagct 9660
ccgtatgcca ctgcctgtgg ccttgatgtt tgtatttatc acacccactt ccaccagcat 9720
tgtccagtca taatctggtg tggccatccg gcgggttctg gctcttgtag tgagtgcaaa 9780
ccccccctag ggaaaggcac aagccctcta gatgtggtgt tagaacaagt cccgtacaag 9840
cctccacgaa ctgtaatcat gcatgtggag cagggtctca cccctcttga cccaggcaga 9900
taccagactc gccgcggatt agtctccgtt aggcgtggca tcaggggaaa cgaaatcgac 9960
ctaccagacg gtgattatgc tagtaccgcc ttgctcccca cttgtaaaga tatcaacatg 10020
gtcgctgtcg cttccaatgt gttgcgcagc aggttcatca tcggtccacc cggtgctggt 10080
aaaacatact ggctccttca acaggtccag gatggtgatg tcatttacac gccaactcat 10140
cagaccatgc ttgacatgat caaggctttg gggacgtgcc ggttcaacgc cccagcaggc 10200
acaacgctgc aattccctgc tccctcccgt accggcccgt gggttcgcat cctggccggc 10260
ggttggtgtc ctggcaagaa ttccttcctg gatgaagcag cgtattgtaa tcaccttgat 10320
gtcttgaggc ttcttagcaa aactaccctc acctgtctgg gagatttcaa acaactccac 10380
ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcagac tcaactgaag 10440
accatctgga ggtttggaca gaatatctgt gatgccattc agccagatta cagggacaaa 10500
cttgtgtcca tggtcaacac aacccgtgta acctacgtgg aaagacctgt caagcatggg 10560
caggtcctca ccccttacca cagggaccga gaggacggcg ccatcacaat tgactccagt 10620
caaggcgcca catttgatgt ggttacattg catttgccca ctaaagattc actcaacagg 10680
caaagagccc ttgttgctat caccagggcg agacatgcta tctttgtgta tgacccacat 10740
aggcaactgc agagcatgtt tgatcttcct gcaaaaggca cacccgtcaa ccttgccgtg 10800
caccgtgacg agcagctgat cgtactagat agaaataaca aagagtgcac ggttgctcag 10860
gctctaggca atggggacaa attcagggcc acagacaagc gcgttgtaga ttctctccgc 10920
gccatttgtg cagatcttga agggtcgagc tccccgctcc ccaaggtcgc acataacttg 10980
ggattttatt tctcacctga tttgacacag tttgctaaac tcccggcaga acttgcaccc 11040
cactggcccg tggtgacaac ccagaacaat gaaaagtggc cagacaggct ggttgccagc 11100
ctccgcccta tccataaata tagccgcgca tgcattggag ccggctatat ggtgggccct 11160
tcggtgtttc taggcacccc tggggttgtg tcatactatc tcacaaaatt tgttaagggg 11220
gaggctcagg tgcttccgga gacagtcttc agcaccggcc gaattgaggt agattgccgg 11280
gagtatcttg atgatcggga acgagaagtt gctgagtccc tcccacatgc cttcattggc 11340
gacgtcaaag gcactaccgt tgggggatgt caccatgtca cctctaaata ccttccgcgc 11400
ttccttccta aggaatcagt tgcggtggtt ggggtttcga gccccgggaa agccgcaaaa 11460
gcagtctgca cattaacaga tgtgtatctc ccagaccttg aagtttacct ccacccagag 11520
acccaatcca agtgctggaa aataatgttg gacttcaagg aagtccgact gatggtctgg 11580
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agctatgcct cgtacatccg agttcctgtt aactctacgg tgtatttgga cccctgcatg 11700
ggccctgccc tttgcaacag aagagttgtc gggtccactc attggggggc tgacctcgca 11760
gtcacccctt atgattatgg tgccaaaatc attctgtcta gtgcatacca tggtgaaatg 11820
cctcctgggt acaaaatcct ggcgtgcgcg gagttctcgc ttgacgaccc agtgaggtac 11880
aaacacacct gggggtttga atcggacaca gcgtatctgt acgagttcac cggaaacggt 11940
gaggactggg aggattacaa tgacgcattt cgtgcgcgcc agaaagggaa aatttataag 12000
gccactgcca ccagcatgag gtttcatttt cccccgggcc ccatcattga accaacttta 12060
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ccgcatcatg gaaaaatcag gacaggctgc ctggaaacag gttgtgagcg aggctacgct 12480
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gtcaaatgta accatagtgt ataatagtac tttgaatcag gtgttagcaa tcttcccgac 12660
ctctgaatcc cggccaaagc ttcatgattt tcaacaatgg ttaataactg tacattcctc 12720
catattttcc tccgttgtgg cttcctgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgaattcc 12780
aatgctacgt actgtttttg gtttccactg gttaggggca atttttcttt cgaactcaca 12840
gtgaattaca cggtgtgccc accttgcctc acccggcaag cagccgctga gatctacgaa 12900
cccggcaggt ctctttggtg caggataggg catgatcgat gtagcgagga cgatcatgac 12960
gaactagggt tcttggttcc gcctggcctc tccagcgaag gccacttgac cagtgtttac 13020
gcctggttgg cgttcctgtc cttcagctat acagcccagt tccatcccga gatatttggg 13080
atagggaatg tgagtaaaat ttatgttgac atcaagcacc aattcatctg cgccgaacac 13140
gacgggcaga acgccaccct gcctcgccat gacaacattt cagccgtgtt tcagacctac 13200
taccaacatc aggtcgatgg cggcaattgg tttcacctgg aatggctgcg ccccttcttt 13260
tcctcttggt tggttttaaa tgtttcgtgg tttctcaggc gttcgcctgc aagccatgtt 13320
tcagttcgag tctttcagac atcaaaacca acaccaccgc agcaccaaat tttgttgtcc 13380
tccaggacat cagctgcctt aggcatggcg acccgtcctc tccggcgatt cgcaaaagct 13440
ctcagtgccg cacggcgata ggaacacccg tgtatatcac catcacagcc aatgtgacag 13500
atgagaatta tttacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt 13560
ctgagatgag tgaaaagggg ttcaaggtgg tattcggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg 13620
tgtgtgtcaa ctttaccagt tacgtccaac atgtcaagga gtttacccaa cgctccttgg 13680
tggtcgagca tgtgcgactg cttcatttca tgacacctga aaccatgagg tgggcaaccg 13740
ttttagcctg tctttttgcc attctgttgg caatttgaat gtttaagtat gttggggaaa 13800
tgcttgaccg cgggctgttg ctcgccgttg ctttttttgt ggtgtatcgt gccgtcttgc 13860
tttgttgcgc ccgtcaacgt cgacgggaac gacagctcaa agttacagct gatttacaac 13920
ttgacgctat gtgagctgaa tggcacagat tggctggctg gtagatttga ctgggcagtg 13980
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agccatttcc ttgacacagt cggtctggtc actgtgtctg ccgccgggtt ccttcatgaa 14100
cggtatgttt tgagtagcat ctacgcggtc tgtgccctgg ctgcgttgat ttgcttcgtc 14160
attaggcttg cgaagaactg catgtcctgg cgctactcgt gtaccagata taccaacttc 14220
cttttggaca ccaaggggag actctatcgt tggcgatcgc ccgtcatcat agagaaaaag 14280
ggtaaagttg aggttgaagg tcatttgatc gacctcaaaa gagttgtgct tgatggttcc 14340
gtggcaaccc ctataaccaa aatttcagcg gaacaatggg gtcgtcctta gatgacttct 14400
gccatgatag cacggctcca caaaaggtgc ttttggcgtt ttccattacc tatacaccag 14460
tgatgatata tgccctaaag gtaagtcgcg gccgactgct agggcttttg caccttttga 14520
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acaaggtcgc gctcactatg ggagcagtag ttgcactcct ttggggggtg tactcagcca 14640
tagaaacctg gaaattcatc acctccagat gccgtttgtg cttgctaggc cgcaagtaca 14700
ttctggcccc tgcccaccac gttgagagtg ccgcaggctt tcatccgatt gcggcaaatg 14760
ataaccacgc atttgtcgtc cggcgtcccg gttccactac ggtcaacggc acattggtcc 14820
ccgggttgaa aagcctcgtg ttgggtggca gaaaagctgt caaacaggga gtggtaaacc 14880
ttgttaaata tgccaagtaa caacggcagg cagcagaaaa aaagaaaggg ggatggccag 14940
ccagtcaatc agctgtgtca gatgctgggt aaaattattg cccagcaaaa tcagtccagg 15000
ggcaagggac cgggaaagaa aaataacaag aaaaacccgg agaagcccca ttttcctcta 15060
gcgactgaag atgatgtcag acatcacttt accccgagtg agcgacaatt gtgtctgtcg 15120
tcaatccaga ctgccttcaa tcagggcgct ggaacttgta ccctgtcaga ttcaggcagg 15180
ataagttaca ctgtggagtt tagtttgccg acgcatcaca ctgtgcgcct gatccgcgct 15240
acagcatcac cctcagcatg atgagctggc attcctgggt atcccagtgt ttgaattgga 15300
agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcttct aagtcaccta ttcaattagg 15360
gcgaccgtgt gggagtagaa tttaattggc gagaaccacg cggccgaaat taaaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 15444
<210> 5
<211> 15413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Construct
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cgcccgggca tgtgttggct ccatgccacg acatttgtat tgtcaggagc tgtgaccact 60
ggcacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtc tgtccctaac accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgca cccccaatgc cagggtgttt 240
atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcctctg 300
aatctccaag tttctgaact aggggtgcta ggcctatttt acaggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420
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ggagggagtc accctgacca agtgcgttta gggaaaatta ttagcctttg tcaggtgatt 2040
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catctccctg ttttcttctc acgccttttc aacccgggcg gtagttattc tccgggtgat 3960
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gtgtgtcaat tttaccagct acgtccaaca tgtcagggag tttacccaac gctccttgat 13680
ggtcgaccat gtgcggctgc tccatttcat gacacctgag accatgaggt gggcaaccgt 13740
tttagcctgt cttgttgcca ttctgttggc aatttgaatg tttaagtatg ttggggaaat 13800
gcttgaccgc gggctgttgc tcgcgattgc tttctttgtg gtgtatcgtg ccgttctgtt 13860
ccactgtgct cgtcgacgcc aacggcaaca gcagctctca tctgcaattg atttacaact 13920
tgacgctatg tgagctgaat ggcacggatt ggctagctaa tagatttgat tgggcagtgg 13980
agagctttgt catctttcct gttttgactc acatagtctc ctatgttgcc ctcaccacca 14040
gccatttcct tgacacaatt gctttagtca ctgtatctac cgccggtttt cttcacgggc 14100
ggtatgtcct gagtagcatc tacgcggtct gtgccctggc tgcgttgact tgcttcgtca 14160
ttaggtttgt aaagaattgc atgtcttggc gctactcatg taccagatat accaattttc 14220
ttctggacac taagggcaga ctctatcgtt ggcggtcgcc tgtcatcata gagaagaggg 14280
gcaaagttga ggtcgaaggt catctgatcg atctcaaaag agttgtgctt gatggttccg 14340
tggcaacccc tataaccaga gtttcagcgg aacaatgggg tcgtccttag atgacttttg 14400
tcatgatagt gcggctccac aaaaggtgct tttggcattt tctattacct acacgccagt 14460
gatgatatat gccctaaagg tgagtcgcgg ccgactgcta gggctgctgc accttttgat 14520
tttcctgaac tgtgctttca cctttgggta catgacattc acgcactttc agagtacaaa 14580
taaggtcgcg ctcactatgg gagcagtagt tgcactcctt tggggggtgt actcagccat 14640
agaaacctgg aaattcatca cctccagatg ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat 14700
tctggcccct gcccaccacg ttgaaagtgc cgcaggcttt catccgattg cggcaaatga 14760
taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc 14820
cgggttgaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag tggtaaacct 14880
tgtcaaatat gccaaataac aacggcaagc agcagaagag aaagaagggg gatggccagc 14940
cagtcaatca gctgtgccag atgctgggta agatcatcgc ccagcaaaac cagtctagag 15000
gcaagggacc ggggaagaaa aataagaaga aaaacccgga gaagccccat tttcctctag 15060
ctactgaaga tgatgtcaga catcacttta cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt 15120
caatccagac tgcctttaat caaggcgctg ggacttgcac cctgtcagat tcagggagga 15180
taagttacac tgtggagttt agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcttg atccgcgtca 15240
cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca ttctgaggca tcccagtgtt tgaattggaa 15300
gaatgtgtgg tgaatggcac tgattgacat tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg 15360
cgaccgtgtg ggggtaatat ttaattggcg agaaccacac ggccgaaatt aaa 15413
<210> 6
<211> 15078
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct ggtgtttgtg taccttggag 60
gcgtgggtac agccccgccc caccccttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120
ccctcggggc gagcgcgccg cctactgctc ccttgcagta ggaaggacct cccgagtatt 180
tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240
ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac 300
ggtgtctcag tgcgcggtct cttctctctt cagaacttca ggacactgac ctcggtgcaa 360
ttggattgtt ccacaagcct agggacaagc ttcactggaa agtccccatc ggcatccctc 420
aggtggaatg tactccatcc gggtgctgtt ggctctcagc tatattccct atagcacgta 480
tgacctctgg caatcataac ttcctccaac gacttgttaa ggttgctgat gttttgtacc 540
gcgacggttg cttggcacct cgacaccttc gtgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600
actggtaccc gatcacgggg cccgtacccg ggatgggttt gtttgcgaac tccatgcacg 660
tatccgacca gccgttccct ggagccaccc atgtgttgac taactcgcct ctgcctcaac 720
gggcgtgccg gcaaccgttc tgtccatttg aggaagctca ttctaacgtg tataggtgga 780
ataaatttgt gattttcacg gactccactc tcaacggcca atctcgcatg atgtggacgc 840
cgggatccga tgattcagcc gccttggagg cgctaccgcc tgaattagaa cgtcaggtcg 900
gaatcctcat tcggagtttc cctgctcatc accccgttaa cctggccgac tgggagctca 960
ctgagacccc tgagaatggc ttctccttca gcacgtctca ttcttgtggt tatcttgtcc 1020
aaaaccccga tgtgtttgat agcaagtgct ggctcacttg cttttcgggc cagtcggtcg 1080
aagtgcgccg ctgtgaagaa catttagcca acgcccttgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140
tgcacggtaa gtaccttcag cgcaggctcc aagttcgcgg cattcgtgct gtagtcgatc 1200
ctgatggccc cattcacgtt gaagcgctgt cttgctccca gtcttggatc aggcacctga 1260
ctctgaataa tggtgttacc ccaggattcg ttcgcctgac atccattcgc attgtgccga 1320
acacagagcc taccactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380
ctggcaaacg ggctcgtgcc aagcgtgccg ctaaaagtgg gaaagattcg gcttccactc 1440
ccaaggttgc ccagccggcc cttacctgtg gagtcaccac ctactctcca ccaacagacg 1500
ggtcttgcgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgatgaac ggtgacttca 1560
cgtccccact gcctcagtac aatagaccag aagacgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620
ctcaggcgat tcaatgtcta caactgcctg caaccgtggt tcggaatcgt gcctgtccta 1680
acgccaagta ccttgtaaga cttaacgggg ttcactggga ggtagaggtg agatctggaa 1740
tggctccccg ctccctttct cgtgaatgtg tagttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800
ctccgcctta tccagcggac gggcttccta aacgcgcact agaggccttg gcgtctgctt 1860
acagactacc ctccgattgt gttagctctg gcattgatga ctttcttgct aatccacccc 1920
ctcaggaatt ttggactctt gacaaaatgc tgacctcccc gtcaccagaa cggtccggct 1980
tctctagttt gtataagtta ctgttagagg ttgttccgca aaagtgtggt gccacggaag 2040
gggctttcac ctatgctgtt gagaggatgt taaaggattg tccgagctct gaacaggcca 2100
tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tccctggacg 2160
ggtgtttccc tgcggatatt ccggctgatt tcgagccagc gtctcgggaa aggccccgaa 2220
gttccagcgt tgctgttgcc ctgtgttcac cggatgcaga aaggttcgag gaagtacccc 2280
cagaagaagt tcaagagaga ggctacaagg ccgtcaactc tgcactcctt gccgaaaacc 2340
ccaatgatga acaggcacag gtggttgccg gtgaacaact gaagctcggc ggttgtagtt 2400
tggcaatcgg gaatgctcag tccactccag gctccatgga agagaacatg cgcaatagcc 2460
gggaagacga accactagat ttgtccctac cagcactagc taccacgacg acccttgtga 2520
gagagcgaat actcgacaac ccaggtcctg atgccggtac cctccctgcc accgttcgag 2580
aatttgtctc gacagggcct atgctccgtc atgttgagca ttgtggcacg gagtctggcg 2640
acagcagttc acctttggat ctgtcttatg cgcaaactcc ggaccagcct ttaaatctgt 2700
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gcgagcctgt ctttgtaaag cctcgaaaag ctttttctga tggcgattca gcctttcagt 2820
tcggggggct ttctgagtcc agctctgtca tcgagtttga ccgaacaaaa gatgcatcgg 2880
aggttgacgc tcctgtcggc ttgacgactt cgaacgaggc cctctctgtg gtcgaccctt 2940
tcgaatttgc cgaactcaag cgcccgcgtt tctccgcaca agccttaatt gaccgaggcg 3000
gcccgcttgc cgatgtccat gcaaaaataa agcaccgggt gtatgaacaa tgccttcaag 3060
cttgtgagcc tggtagccgt gcaaccccag ccaccaagaa gtggctcgac aaaatgtggg 3120
acagggtgga catgaaaact tggcgctgca cctcgcagtt ccaagctggt cgcatccttg 3180
catccctcaa attccttcct gacatgattc aagacgcacc gcctcctgtt cccaggaaga 3240
accgagctag tgacaacgcc ggtttgaagc aactggtggc acagtgggat aggaaattga 3300
gtggaacccc ccccccaaaa ccggctgggt cagtgcttga ccaggccgtc cctccaccca 3360
cggacgtcca gcaagaagat gtcactcctt ccggcgggcc actccatgcg ccggatttcc 3420
ctagtcgagt tagcacgagc gggggttgga aaagccttat actttccggg acccgtctcg 3480
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cttttgcgct cacacttttc tcgccgcggg gctctatggc tccaggcgat tggttgtttg 3600
caggtattgt tttacttgct ctcttgttct gtcgttttta cccgatactc ggatgccttc 3660
ccttattggg tgtcttttct gggtctgtgc ggcgtgttcg tctgggtgtt tttggttctt 3720
ggatggcttt tgctgtattt ctattctcga ctccatccaa cccagtcggt tcttcttgtg 3780
accacgattc gccggagtgt catgctgagc ttttggttct tgagcagcgc caactttggg 3840
aacctgtgcg cggccttgtg gtcggcccct cgggcctcct atgtgtcatt cttggcaagt 3900
tactcggtgg gtcacgttat ctctggcatg ttctcctacg tttatgcatg cttacagatt 3960
tggccctttc tcttgtttat gtggtgtccc aggggcgttg tcacaagtgt tggggaaagt 4020
gtataaggac ggctcctgct gaggtagcac ttaatgtatt tcctttctcg cgcgccaccc 4080
gtagctctct tgtatccttg tgtgatcggt tccaagcgcc taaaggagtt gatcctgtgc 4140
acttggcaac gggttggcac gggtgttggt gtggcgagag ccccgttcat caatcacacc 4200
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ctgtcccata cgaccccagc caggctatca aatgcctgaa agttctgcag gcgggagggg 4320
ctatcgtaga ccagcctaca cctgaagttg ttcgcgtgtc cgaggtcccc ttctcagccc 4380
catttttccc aaaagttcct gtcaacccgg attgcaggat tgtggtggat tcggacactt 4440
ttgtggctgc ggtccgctgc ggttactcga cagcacaact ggtcctgggc cggggcaatt 4500
ttgccaagct aaatcagacc cccctcagga gctctacctc caccaaaacg actggggggg 4560
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gcctttggtt cacatcacct caagtgtgtg gccgagggac cgctgatcca tggtgttcaa 4680
atcccttttc ataccctgcc tatggccctg gagttgtatg ctcctctcga ctttgtgtgt 4740
ctgccgatgg ggtcaccctg ccattgtttt cagctgtggc acaactctcc ggcagagagg 4800
tggggatttt tattttggtg cttgtctccc tgatagcttt ggcccatcgc ttggctctta 4860
aggcagactt gttagtggtc tttttggctt tttgtgctta cgcctggccc atgagttcct 4920
ggctaatctg cttctttcct atactcttaa agtggatcac cctccaccct ctcaccatgc 4980
tttgggtgca ctcattcttg gtgttttgcc tgccagcagc cggcgtcctc tcactaggga 5040
taactggcct tctttgggca atcggccgct ttacccaggt tgccgggatt attacacctt 5100
atgacatcca ccagtacacc tccgggccgc gtggtgcagc tgctgtggcc acagccccag 5160
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tcactaattg tggtgattcg gggtcacccg tcatctcaga atccggtgat ctcatcggaa 5640
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ttctgtgtgt ctttttcctt ctctggcgca tgatgggcca tgcctggaca cccattgttg 5940
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ttgcggaggg caatctgagg aaaggtgttt cacagtcctg tggcatgaat aacgagtctc 6420
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tctactgtaa gatctgggat aagtctaccg gtgacacctt ttacaccgac gattcccggt 7020
atacccacga ccatgctttt caggacaggt cagccgacta cagagacagg gactacgaag 7080
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ccaagcctga caactgcctc gaagctgcca agctgtccct tgagcaggct ctcgctggga 7260
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cattcagcca gggcatgggg ccgggaatat gggcgtggaa ggttctattt gggatttcga 7680
aaccgcacct acaaaggcag aactcgagtt atccaagcaa ataattcaag catgtgaagt 7740
taggcgcggg gacgccccga acctccaact cccttacaag ctctatcctg ttagggggga 7800
tcctgagcgg catgagggcc gccttatcaa caccaggttt ggagatttat cttacaaaac 7860
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cgtgtctgat ggtaaatcaa cactaggtac cactcttcaa catggttttg agctttacgt 7980
ccctactgtg ccttatagtg tcatggagta cctcgattca cgccctgaca ccccttttat 8040
gtgcaccaaa catggcactt ccaaggctgc tgcagaggac cttcaaaaat acgacctgtc 8100
cactcaaggc ttcgtcctgc ctggggtcct acgcctagta cgtagataca tttttggcca 8160
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cgccaacctc ctgtatgaac ttgcgggatg tgaagagtac ttgcctagct atgtacttaa 8640
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gcacatggtg ttgtcagcct tgaaaatggg tcatgaaatc ggtcttaagt tcctcgagga 8820
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atactgtaat catctggaca ttctcagatt gctctccaaa acgccccttg tgtgtttggg 10020
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ccggcctgtg gcctttggtc aggtcctgac accataccat aaagatcgca tcggctctgc 10260
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taaaccccgg ctatcgcctg agcaggtgcc gtgaatttgg agtgatgcaa tggggtcact 11760
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agatggtctc tcgccgcatt taccagacca tggaacattc aggtcaagcg gcctggaagc 12120
aagtagttgg tgaggccact ctcacgaagc tgtcagggct cgatatagtc actcacttcc 12180
aacacctggc cgcagtggag gcggattctt gccgctttct cagctcacga ctcgtgatgc 12240
taaaaaatct tgccgttggc aatgtgagcc tacagtacaa caccacgctg gaccgcgttg 12300
agctcatttt tcccacgtca ggtacgaggc ccaagttaac cgacttcaga caatggctca 12360
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ggagttgttc gggattggga atgtgtcgcg tgtctttgtg gacaaacatc accagttcat 12780
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aggcctagat gatttttgca acgattctac cgctgcacaa aagctcgtgc tggctttcag 14100
catcacatac acacctataa tgatatatgc ccttaaggtg tcacgcggcc gactcctggg 14160
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gtcaggtgaa tggtcgcgat tggcgtgtgg cctttgagtc acctattcaa ttagggcgat 15000
cacatggggg tcatacttaa tcaggcagga accatgtgac cgaaattaaa aaaaaaaaaa 15060
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 15078
<210> 7
<211> 14885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
tatgacgtat aggtgttggc tctatgcctt ggcatttgta ttgtcaggag ctgtgaccat 60
tggcacagcc caaaacttgc tgcacagaaa cacccttctg tgatagcctc cttcagggga 120
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gacgtcaaag gcactaccgt tggaggatgt catcatgtca cctccagata cctcccgcgc 10860
gtccttccca aggaatcagt tgcggtagtc ggggtttcaa gccccggaaa agccgcaaaa 10920
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aaaaa 14885
<210> 8
<211> 15434
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<220>
<223> Synthetic Construct
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tgtccggtca taatctggtg tggtcatccg gcgggttctg gttcttgtag tgagtgcaaa 9780
cccccccttg ggaaaggtac aagccctcta gatgaggtgt tggaacaagt cccgtacaag 9840
cctccgcgga ccgtgatcat gcacgtagag cagggtctta ctccactcga cccaggtaga 9900
taccaaaccc gccgcggatt agtctccgtt aggcgtggca ttaggggaaa cgaagttgaa 9960
ctaccagacg gtgattatgc tagtaccgcc ttgctcccca cttgtaaaga gatcaacatg 10020
gttgctgttg cttctaacgt gttacgcagc aggttcatca tcggtccacc tggtgctggt 10080
aaaacatact ggctccttca acaggtccag gatggtgatg tcatttacac gccaactcat 10140
cagactatgc ttgacatgat taaggctttg gggacgtgcc ggttcaacgt tccagcaggc 10200
acaacgctgc aattccctgc cccctcccgc accggcccgt gggttcgcat cctggccggc 10260
ggttggtgtc ctggcaagaa ttccttcctg gatgaagcag cgtattgcaa tcatcttgac 10320
gtcttgaggc ttcttagcaa aactaccctc acctgcctgg gagatttcaa acaactccac 10380
ccggtgggtt ttgattccca ttgctatgtt tttgacatta tgcctcagac tcaactgaag 10440
accatctgga ggtttgggca gaacatctgt gacgccattc aaccagatta tagagacaaa 10500
cttgtgtcca tggtcaacac aacccgtgta acctacgtgg aaaaacctgt caagtatggg 10560
caagtcctca ccccctacca cagggaccga gaggacggcg ccgtcacaat tgactcaagt 10620
caaggcgcca catttgatgt ggttacactg catttgccca ctaaagattc actcaacagg 10680
caaagggccc ttgttgctat caccagggca agacatgcta tctttgtgta tgacccacac 10740
aggcaattgc agagcttgtt tgatcttcct gcaaaaagca cacccgtcaa tctcgcagtg 10800
caccgtgacg agcagctgac cgtgttagat agaaataaca aagagtgcac ggttgctcag 10860
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cttcgccctg tccatgagta tagccgtgcg tgtgtcggtg ccggctatat ggtgggcccc 11160
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ggccctgccc tttgcaacag gagggttgtc gggtccaccc attgggaagc tgacctcgca 11760
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gccactgccg ccagcatgag gttttatttt cccccgggcc ctatcgttga accaactttg 12060
ggcctagact gaaatgaaat ggggtctatg caaagcctct ttgacaaaat cggccaactt 12120
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gtcaaatgta accatagtgt ataatagcac tttgaatcag gtgtttgcta tttttccaac 12660
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taccagcatc aagtcgacgg cggcaattgg tttcacctag aatggctgcg tcccttcttt 13260
tcctcctggt tggttttaaa tgtctcgtgg tttctcaggc gttcgcctgc aagccatgtt 13320
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ctccgtgccg cacggcgcta gggacacccg tgtacatcac tgttacagcc aatgtcacgg 13500
atgagaatta tttacactcc tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt 13560
ctgagatgag tgaaaaggga ttcaaggtga tatttggcaa tgtgtcaggc atcgtggccg 13620
tgtgtgttaa ttttaccagc tacgtccaac atgtcaaaga gttcacccaa cgctctttgg 13680
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ttgacgctat gtgagctgaa tggcacagaa tggctgggag acaaatttaa ttgggcagtg 13980
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ggcgaccgtg tgggggtaga gtttaattgg cgagaaccac acggccgaaa ttaaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaa 15434
<210> 9
<211> 15047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
atgacgtata ggtgtttgct ttatgccgcg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccact 60
ggcacagccc gaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
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ccttttaacc atgtctggga ttcttgatcg gtgcacgtgc acccccaatg ccagggtgtt 240
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aaatctccaa gtttctgagc ttggggtact tggtttattc tacaggcccg aagagccatt 360
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gctttcgtta gaagctcagt ataaagaaat ccgctacgcc gcccaatttg gctatcagac 1080
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cactgctgtg gcccaaaggc cttcgccgaa agttcagcct cgaaaggcgg ggtctgttaa 2340
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tgcaccgcgc aagactgcgc ctcgattagt gtcgtcatca ttggcgtcga cccccgtacc 2580
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tgaggcatgt gatgcgacta agctcgatga ccctgccacg caagaatggc tctctcgcat 3000
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aaaagtagtc aaagtttctg ctgtcccgtt tcgagcccct ttttttcctg ccggagtgaa 4380
agttgaccct gaatgcaggg tcgtggttga ccctgacacc tttacaaccg ctctccggac 4440
cggctactcc accacaaacc tcattcttgg tgttggggac tttgcccagc tgaatgggtt 4500
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gcctggctct ctctgcacgt ccaggttgtg catttcccag cgtggcctga ccctgccctt 4740
aacagcgctt gtggcagggt ttggcgttca ggaaatcgct ttggttgttt taatctttgt 4800
ctccatcggg ggtatggccc acaggttgag ttgcaaggct gacgtgctgt gtatcctgct 4860
tgctattgtc agctatgttt ggccacccct tacctggttg ctttgtgtgt ttccttgctg 4920
gttgcgctgg ttttctttac atccccttac tattctatgg ttagtgtttt tcttgatttc 4980
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cctgcctcgt gcaatggccg tgacctcacc agtcccaata gttgcgtgtg gcgttgtgca 6240
cttgcttgcc atcattctgt acttgttcaa gtaccgtagc ctgcatgccg tcctggtcgg 6300
cgatggtgcg ttttccgcgg ctttcttctt gcgatacttt gcggagggaa agttgaggga 6360
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tggacacaca cctgtcggca gcatttttga cctgaaggtc ggcaatgtta agcacactct 6720
ccagtccatt gagaccagaa cccttgccgg gtctaaaatg actgtggcgc gcgtcgtaga 6780
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gaacggtccc aacgcctggg gggatgagaa cggtttgaac aaaaaaaagc ggcgcaagat 6900
ggaggccgtt ggcatttacg ttatgggcgg gaaaaagtat caaaaatttt gggataagaa 6960
ttctggtgat gtgttctatg aagaagtcca cgacaacaca gacgcgtggg aatgcctcag 7020
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ctatatgtgc cgaccattcc agcgtctgtc cttgattacc ttgactccag accagactgt 7980
cctaaacagt tgactgagca cgggtgtgaa gatgccgcgt tgaaggacct ttctaaatat 8040
gacctgtcca cccaaggctt tgtgttacct ggagttctac gcctcgtgcg aaaatatctg 8100
tttgctcatg taggtaagtg cccgcctgtc caccggccct ctacctatcc tgccaagaac 8160
tccatggccg gaataaatgg gaacaggttc ccaaccaagg atattcaaag catccctgag 8220
atcgacgttt tgtgtgcaca agctgtgcga gaaaactggc aaactgttac accctgcact 8280
cttaagaagc agtattgcgg taaaaagaag accaggacca tacttggcac caacaacttc 8340
gttgcgctgg cccaccgggc ggcgctgagt ggtgtcaccc agggtttcat gaagaaggcg 8400
tttaactcac ccatcgccct tgggaaaaat aaatttaagg agctacagac tccagtcttg 8460
ggtaggtgtc ttgaggctga tctcgcttcc tgcgatcgat ccacgcctgc aatcgttcgc 8520
tggtttgccg ccaaccttct ttatgaactt gcctgtgctg aggagcattt accgtcgtac 8580
gtgctgaact gttgtcacga cctattggtc acgcagtccg gcgcagtgac taagagaggt 8640
ggcctgtcgt ccggtgaccc aatcacctct gtgtccaaca ccatttatag cttggtgatc 8700
tatgcacagc atatggtgct tagttacttc aaaagtggtc acccccatgg ccttctgttt 8760
ttacaagacc agctaaagtt tgaagacatg ctcaaagttc aacccctaat cgtctattcg 8820
gacgacctcg tgttgtatgc cgagtctccc accatgccaa actatcactg gtgggttgaa 8880
cacctgaatt tgatgttggg atttcagacg gacccaaaga agactgcaat aacagactca 8940
ccttcattcc taggttgtag aataataaat ggccgccagt tagtacccaa ccgtgacaga 9000
attctcgcgg cccttgccta tcacatgaag gcgagtaatg tttctgagta ctacgcctcc 9060
gcagccgcaa tactcatgga cagttgtgct tgtctagagt atgatcctga gtggtttgaa 9120
gaacttgtgg ttggaatggc gcagtgcgcc cgtaaggacg gctatagttt ccccggcccg 9180
ccgttcttct tgtccatgtg ggaaaagctc aggtcaaatt atgaggggaa gaagttgaga 9240
gtgtgtggtt attgcggagc ttcagccccg tatgctactg cctgtggcct tgacgtttgt 9300
gtttaccaca cccactttca ccagcattgt ccagtcataa tatggtgtgg ccacccggcg 9360
ggttctgggt cctgcgatga gtgcaaatcc cctacaggga agggtacaag ccctctggat 9420
gaggtcttaa gacaagtccc ttataagcct ccacggacta ttcttatgca tgtggagcag 9480
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cgcgggataa ggggaaatga agttgacctg ccagatggtg attatgccag tactgcccta 9600
ctccccacct gcaaagacat agacatggtt gctgtggcct ccaatgtgtt gcgcagtagg 9660
ttcatcatcg gcccacctgg cgcagggaaa acacactggc ttcttcaaca ggttcaggat 9720
agtgatgtca tttacacgcc aacccatcag accatgcttg acatgatcaa ggctttgggg 9780
acgtgccggt tcaatgtccc ggcaggcaca acgctgcaat tccctgcccc ctcccgtacc 9840
ggcccgtggg ttcgcatcct tgccggcggt tggtgtccag gtaagaattc cttcctggat 9900
gaagcagcgt attgcaatca ccttgacgtc ttgaggcttc tcagcaaaac taccctcacc 9960
tgtctggggg atttcaaaca actccacccg gtgggttttg attctcattg ctatgttttt 10020
gatatcatgc ctcagactca actgaagacc atctggaggt ttggacagaa tatctgtgac 10080
gccattcagc cagattacag ggacaaactc gtgtccatgg tcaacacaac ccgtgtaacc 10140
tatgtggaaa gacctgtcaa gtatgggcaa gtcctcaccc cctaccacag agaccgagag 10200
gatggtgcta tcactattga ctccagtcaa ggcgccacat ttgatgtggt cacattgcat 10260
ttgcccacta aagattcact caacaggcaa agagcccttg ttgctatcac cagggcaagg 10320
catgcaatct ttgtgtatga cccacacagg caactgcaga gcatgtttcg tcttcctgca 10380
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aataacaaag agtgcacggt tgttcaggct ttaggcaatg gggacaaatt cagggccagt 10500
gacaagcgcg ttgtagattc tcttcgcgcc atttgtgcag atcttgaagg gtcgagctcc 10560
ccgctcccca aggtcgcaca caacttggga ttttatttct cacctgattt gacacagttt 10620
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tactatctca cacaatttgt caaaggggag gctcaggtgc ttccggagac ggtcttcagc 10860
accggccgaa ttgaggtaga ttgtcgagag tatcttgatg atcgggaacg agaagttgct 10920
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catgtcactt ctaaatatct cccacgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggttggg 11040
gtttcaagcc ccgggaaagc cgcaaaagca gtttgcacat taacagatgt gtacctccca 11100
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cgccatttca cctggtacca gcttgcaagt tatgcctcgt acatccgagt tcccgttaac 11280
tctacggtgt acctggaccc ctgtatgggc cctgcccttt gcaacagaag agtcgttggg 11340
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ccgggtcctg ccattgaacc aacattgggc ctgaactgaa atgaaatggg ggctgtgcag 11700
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gttgtcttct gtatccgact ggtttgctcc acggtactcc gtgcgcgctc taccattcac 11880
cctgagcaat tacagaagat cctatgaggc cttcctttcc cagtgccaag tggacattcc 11940
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tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa aaagcaggac aggctgcctg 12060
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acaatggctc atagctgtgc attcttccat attttcttct gttgcggctt cttgtactct 12360
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actcaccaac tcatctgcgc cgaacacgac gggcagaaca ccaccctgcg tcgccatgac 12780
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cgtccattga ggcgattcgc aaaagccgtc aatgccgcac ggcgatagga acgcccgtgt 13080
acatcactgt cacggccaat gtaacagatg agaattactt gcattcctct gatctcctca 13140
tgctttcctc ttgcctcttc tatgcttctg agatgagtga aaagggattc aatgtggtct 13200
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cacctgcgac catgaggtgg gcaacagttt tagcctgtct tttcgccatc ttgttggcga 13380
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tttttctggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgcgctcg tcaacgccgc cagcaacagc 13500
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cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa attcatcact tccagatgcc 14280
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cgggctttca tccgattgcg gcaagtgata accacgcatt tgtcgtccgg cgtcccggct 14400
ccactactgt taacggcaca ttggtgcccg ggttgaaaag cctcgtgttg ggtggcagaa 14460
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caaaaaaata agaaggggag tggccagcca gtcaatcagc tgtgccaaat gctgggcaag 14580
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caccacactg tgcgccttat tcgcgccaca gcatcacctc catcgtgatg ggcttacatt 14880
cttggagctc ctcagtttca caattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattggcact 14940
gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg gggtagagtt taattggcga 15000
gaaccatacg gccgaaatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 15047
<210> 10
<211> 15444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
atgacgtata gttgttggct ctatgtcgtg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaacttgct gcgcgggaac gcccttccgt gacagccttc ttcaggggag 120
tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
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gaatctccaa gtttctgagc ttggggtgct gggcttattt tataggcccg aagagccgct 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcctgctg 420
gctttctgcg atttttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480
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gcttccaccg gaagttcaga acaaagagat tcgccatgct aaccaactcg gctatcagac 1080
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caatcacaaa tggtacggtg ctggaaagag ggcaaggaaa gcacgctttg gtgcggctgc 1380
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tatccaaatc ctcaggctcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg tcggcgccaa 1680
gtacgtgctc aagctggaag gtgtgcactg gacagtctct gtggcccctg ggatgacccc 1740
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gtctaattgc tactaccctg cacaaggtga cgaggttcgt caccgtgaga ggctgatctc 2400
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ggcatcctct gaggaaaaac cggcatacaa ccaacccgct aaggactccc tgatatcgtc 3720
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ccatctccct gttttcctct cacacctctt caaatctgac agtggttatt ctccgggtga 3960
ttggggtttt gcagctttta ctctattttg cctcttttta tgttacagct acccattctt 4020
tggtttcgct ccccttttgg gtgtgttttc tgggtcttct cggcgcgtgc gcatgggggt 4080
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cactgcttgt gagtttgatt cgccagagtg taggaatgtc cttcattctt ttgagcttct 4200
caaaccttgg gaccctgttc gcagccttgt tgtgggcccc gtcggtctcg gtcttgccat 4260
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tggtgtgggg gactttgccc agctgaatgg attaaaaatc aggcaaattt ccaagccttc 4920
gggaggaggc ccgcacctca ttgctgccct acatgttgcc tgctcgatgg cgttgcacat 4980
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tcaggaaatt gccttggttg ttttgatttt cgtttccatc ggaggcatgg ctcacaggtt 5220
gagttgcaag gctgacatgc tgtgcgtttt acttgcaatc gccagctatg tttgggtgcc 5280
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caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtaaat gtgccttcgg gaatcttggc 5400
tgtggtgttg ttagtttctc tttggctctt aggtcgttac actaatgttg ctggtcttgt 5460
caccccatat gacattcatc atcacaccag tggcccccga ggtgttgccg ccttggctac 5520
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gctgtttacc ccgtctcagc ttgggtccct tcttgagggt gctttcagaa ctcaaaagcc 5640
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ggtaccttca gatctttgcg ccttgctcgc tgccaaaccc gaactggaag gaggcctctc 6240
caccgtccaa cttctgtgtg tgtttttcct cctgtggaga atgatgggac atgcctggac 6300
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cttgcgatac tttgccgaag ggaagttgag ggaaggggtg tcgcagtcct gcgggatgaa 6780
tcacgagtca ctgactggtg ccctcgctat gagactcaat gacgaagact tggacttcct 6840
tacgaaatgg actgatttta agtgctttgt ttctgcgtcc aacatgagga atgcagcggg 6900
ccaattcatc gaggctgcct atgcaaaagc acttagaatt gagcttgccc agttagtaca 6960
ggttgataag gttcgaggta ctttggccaa acttgaagcc tttgctgata ccgtggcacc 7020
ccagctctcg cccggtgaca ttgttgttgc tcttggccac acgcctgttg gcagtatctt 7080
cgacctaaag gttggcagta ccaagcatac cctccaggcc attgagacca gagtccttgc 7140
cgggtccaaa atgaccgtgg cgcgtgtcgt tgatccaacc cccacgcccc cacccgcacc 7200
cgtgcccatc cccctcccac cgaaagtcct ggagaacggc cccaacgcct ggggggatga 7260
ggaccggttg aataagagga agagacgcag gatggaagcc gtcggcatct ttgttatggg 7320
tgggaagaag taccaaaaat tttgggacaa gaattccggt gatgtgtttt acgaggaggt 7380
ccatgataac acagatgcgt gggagtgcct cagagttggt gaccctgccg actttgaccc 7440
tgagaaggga actctgtgtg ggcatactac cattgaagac aaggcttata atgtctacac 7500
ctccccatct ggcaggaagt tcctggtccc cgtcaaccca gagagcggaa gagcccaatg 7560
ggaagctgca aagctttccg tagagcaggc ccttagcatg atgaatgtcg acggtgagct 7620
gacagccaaa gaactggaga aactgaaaag aataattgac aaactccagg gcctaactaa 7680
ggagcagtgt ttaaactgct agccgccagc ggcttgaccc gctgtggtcg cggcggcttg 7740
gttgttactg agacagcggt gaaaatagtt aaatttcaca accggacctt caccctagga 7800
cctgtgaatt taaaagtggc cagtgaggtt gagctaaaag acgcagtcga gcataaccaa 7860
cacccggttg caagaccggt tgatggtggt gttgtgctcc tgcgctccgc agttccttcg 7920
cttatagacg tcttgatctc tggcgctgat gcatctccta agttactcgc ccaccacggg 7980
ccgggaaaca ctgggatcga tggttcgctt tgggattttg aggccgaggc caccaaagag 8040
gaaattgcac tcagtgcgca aataatacag gcttgtgaca ttaggcgcgg cgacgcaccc 8100
gaaattggtc ttccttataa gctgcaccct gttaggggca accctgagcg ggtaaaaggg 8160
gttttacaga atacaaggtt tggagacata ccttataaaa cccccagtga cactgggagc 8220
ccagtgcacg cggctgcctg cctcacgccc aatgccactc cggtgactga cggtcgttcc 8280
gtcttggcta cgaccatgcc ctccggtttt gagttgtatg taccgaccat tccagcgtct 8340
gtccttgatt atcttgattc caggcctgat tgccccaaac agttgacaga gcacggctgt 8400
gaggatgccg cattaagaga cctctccaag tatgacttgt ccacccaagg ctttgtcttg 8460
cctggagttc ttcgccttgt gcgtaagtac ctgtttgctc atgtgggtaa gtgcccgcct 8520
attcatcggc cttccactta ccctgccaag aattccatgg ctggaataaa tgggaacagg 8580
tttccaacca aggacattca gagcgtccct gaaatcgacg ttttgtgcgc acaggccgtg 8640
cgagaaaact ggcaaactgt tactccttgt accctcaaga agcagtattg cgggaagaag 8700
aagactagga caatactcgg cactaataac ttcattgcgc tggcccaccg ggcagcattg 8760
agtggtgtca cccagggctt catgaaaaaa gcgtttaact cgcccatcgc actcgggaaa 8820
aacaaattca aggagctgca gactccggtc ttgggcagat gtcttgaagc tgaccttgca 8880
tcctgtgacc gatccacacc cgcaattgtc cgctggtttg ccgccaatct tctttatgaa 8940
cttgcctgtg ctgaggagca tataccatcg tacgtgttga actgctgcca cgacttactg 9000
gtcacgcagt ccggcgcggt gactaagaga ggtggcctat cgtctggcga cccgattact 9060
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tttaaaagtg gtcaccccca tggccttctg tttctacaag accagctaaa gtttgaggac 9180
atgctcaagg ttcagcccct gatcgtctat tcggacgacc tcgtgctgta cgccgagtct 9240
cccaccatgc caaactacca ctggtgggtt gaacatctga acctgatgct gggttttcag 9300
acggacccaa agaagacagc tataacagac tcgccatcat ttttgggttg taggataata 9360
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aaggcaaaca atgtttctga atactacgcc tcggcggctg caatactcat ggacagttgt 9480
gcttgtttgg agtacgatcc tgagtggttt gaagagctcg tggttgggat ggcgcagtgc 9540
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ccgtatgcca ctgcctgtgg ccttgatgtt tgtatttatc acacccactt ccaccagcat 9720
tgtccagtca taatctggtg tggccatccg gcgggttctg gctcttgtag tgagtgcaaa 9780
ccccccctag ggaaaggcac aagccctcta gatgtggtgt tagaacaagt cccgtacaag 9840
cctccacgaa ctgtaatcat gcatgtggag cagggtctca cccctcttga cccaggcaga 9900
taccagactc gccgcggatt agtctccgtt aggcgtggca tcaggggaaa cgaaatcgac 9960
ctaccagacg gtgattatgc tagtaccgcc ttgctcccca cttgtaaaga tatcaacatg 10020
gtcgctgtcg cttccaatgt gttgcgcagc aggttcatca tcggtccacc cggtgctggt 10080
aaaacatact ggctccttca acaggtccag gatggtgatg tcatttacac gccaactcat 10140
cagaccatgc ttgacatgat caaggctttg gggacgtgcc ggttcaacgc cccagcaggc 10200
acaacgctgc aattccctgc tccctcccgt accggcccgt gggttcgcat cctggccggc 10260
ggttggtgtc ctggcaagaa ttccttcctg gatgaagcag cgtattgtaa tcaccttgat 10320
gtcttgaggc ttcttagcaa aactaccctc acctgtctgg gagatttcaa acaactccac 10380
ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcagac tcaactgaag 10440
accatctgga ggtttggaca gaatatctgt gatgccattc agccagatta cagggacaaa 10500
cttgtgtcca tggtcaacac aacccgtgta acctacgtgg aaagacctgt caagcatggg 10560
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ccgcatcatg gaaaaatcag gacaggctgc ctggaaacag gttgtgagcg aggctacgct 12480
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gtcaaatgta accatagtgt ataatagtac tttgaatcag gtgttagcaa tcttcccgac 12660
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catattttcc tccgttgtgg cttcctgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgaattcc 12780
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gtgaattaca cggtgtgccc accttgcctc acccggcaag cagccgctga gatctacgaa 12900
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atagggaatg tgagtaaaat ttatgttgac atcaagcacc aattcatctg cgccgaacac 13140
gacgggcaga acgccaccct gcctcgccat gacaacattt cagccgtgtt tcagacctac 13200
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tcctcttggt tggttttaaa tgtttcgtgg tttctcaggc gttcgcctgc aagccatgtt 13320
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ctcagtgccg cacggcgata ggaacacccg tgtatatcac catcacagcc aatgtgacag 13500
atgagaatta tttacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt 13560
ctgagatgag tgaaaagggg ttcaaggtgg tattcggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg 13620
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ggtaaagttg aggttgaagg tcatttgatc gacctcaaaa gagttgtgct tgatggttcc 14340
gtggcaaccc ctataaccaa aatttcagcg gaacaatggg gtcgtcctta gatgacttct 14400
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acagcatcac cctcagcatg atgagctggc attcctgggt atcccagtgt ttgaattgga 15300
agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcttct aagtcaccta ttcaattagg 15360
gcgaccgtgt gggagtagaa tttaattggc gagaaccacg cggccgaaat taaaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 15444
<210> 11
<211> 15444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
atgacgtata gttgttggct ctatgtcgtg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaacttgct gcgcgggaac gcccttccgt gacagccttc ttcaggggag 120
tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
tgtggcggag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttccttt 300
gaatctccaa gtttctgagc ttggggtgct gggcttattt tataggcccg aagagccgct 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcctgctg 420
gctttctgcg atttttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480
aatagtgcgg gtcgcagctg agctctacag agccggtcag ctcacccccg tagtcttgaa 540
gaatctacag gtttatgaac ggggttgccg ttggtacccc atcgttggac ctgttcctgg 600
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gagagtctcc tgggcccctc gtggcgggga caaaggaaaa tttgaaatag ttcccaagga 840
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gtacgtgctc aagctggaag gtgtgcactg gacagtctct gtggcccctg ggatgacccc 1740
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ggttgatcta aaagtttggg tcaaaaatta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc 2640
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tattccacgc atcctcggga aaatagaaaa caccagtgag atgatcaacc agggaccctt 3660
ggcatcctct gaggaaaaac cggcatacaa ccaacccgct aaggactccc tgatatcgtc 3720
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ccatctccct gttttcctct cacacctctt caaatctgac agtggttatt ctccgggtga 3960
ttggggtttt gcagctttta ctctattttg cctcttttta tgttacagct acccattctt 4020
tggtttcgct ccccttttgg gtgtgttttc tgggtcttct cggcgcgtgc gcatgggggt 4080
ttttggctgc tggttggctt ttgctgttgg tttgttcaag cctgtgtccg acccagtcgg 4140
cactgcttgt gagtttgatt cgccagagtg taggaatgtc cttcattctt ttgagcttct 4200
caaaccttgg gaccctgttc gcagccttgt tgtgggcccc gtcggtctcg gtcttgccat 4260
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tcaggaaatt gccttggttg ttttgatttt cgtttccatc ggaggcatgg ctcacaggtt 5220
gagttgcaag gctgacatgc tgtgcgtttt acttgcaatc gccagctatg tttgggtgcc 5280
ccttacctgg tttctttgtg tgtttccttg ctggttgcgc tggttctctt tgcatcccct 5340
caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtaaat gtgccttcgg gaatcttggc 5400
tgtggtgttg ttagtttctc tttggctctt aggtcgttac actaatgttg ctggtcttgt 5460
caccccatat gacattcatc atcacaccag tggcccccga ggtgttgccg ccttggctac 5520
tgcaccggat gggacctact tggccgccgt tcgccgtgct gcgttgaccg gtcgtaccat 5580
gctgtttacc ccgtctcagc ttgggtccct tcttgagggt gctttcagaa ctcaaaagcc 5640
ctcactgaac accgtcaatg tggtcggatc ctctatgggc tccggcgggg tgttcaccat 5700
cgacgggaaa attaagtgcg taacagccgc acatgtcctt acgggtaatt cagctagggt 5760
ttccggggtc ggcttcaacc aaatgcttga ttttgatgtg aaaggggact tcgccatagc 5820
tgattgcccg aattggcaag gagctgcccc caagacccaa ttctgcgagg atggatggac 5880
tggccgtgcc tattggctga catcctctgg agtcgaaccc ggtgtcattg ggaatggatt 5940
cgccttctgc ttcaccgcgt gcggcgattc tggatccccg gtgattaccg aagccggtga 6000
gcttgtcggc gttcacacag gatcaaacaa acaaggagga ggcatagtca cacgcccctc 6060
aggccagttt tgtaatgtgg cgcccatcaa gctgagcgaa ttgagtgaat tcttcgctgg 6120
acctaaggtc ccgctcggtg atgtgaagat tggcagccac ataattaaag acgtatgcga 6180
ggtaccttca gatctttgcg ccttgctcgc tgccaaaccc gaactggaag gaggcctctc 6240
caccgtccaa cttctgtgtg tgtttttcct cctgtggaga atgatgggac atgcctggac 6300
gcccttggtt gctgtggggt tttttatctt gaatgaggtt ctcccagctg tcctggtccg 6360
gagtgtcttc tcctttggta tgtttgtgct atcttggctt acaccatggt ctgcgcaagt 6420
cctgatgatc aggcttctaa cagcagctct taacaggaac agggggtcac tcgccttcta 6480
cagcctcggt gcagtgaccg gatttatcgc agatcttgca gcaactcagg ggcatccgct 6540
gcaggcagtg atgaacttaa gcacctatgc cttcctgcct cggatgatgg ttgtgacctc 6600
accagtccca gtgcttgctt gtggtgttgt gcacctcctt gccataattt tgtacctgtt 6660
taagcaccgt tgcctgcatt atgtccttgt tggcgatgga gtgttctcta aagccttctt 6720
cttgcgatac tttgccgaag ggaagttgag ggaaggggtg tcgcagtcct gcgggatgaa 6780
tcacgagtca ctgactggtg ccctcgctat gagactcaat gacgaagact tggacttcct 6840
tacgaaatgg actgatttta agtgctttgt ttctgcgtcc aacatgagga atgcagcggg 6900
ccaattcatc gaggctgcct atgcaaaagc acttagaatt gagcttgccc agttagtaca 6960
ggttgataag gttcgaggta ctttggccaa acttgaagcc tttgctgata ccgtggcacc 7020
ccagctctcg cccggtgaca ttgttgttgc tcttggccac acgcctgttg gcagtatctt 7080
cgacctaaag gttggcagta ccaagcatac cctccaggcc attgagacca gagtccttgc 7140
cgggtccaaa atgaccgtgg cgcgtgtcgt tgatccaacc cccacgcccc cacccgcacc 7200
cgtgcccatc cccctcccac cgaaagtcct ggagaacggc cccaacgcct ggggggatga 7260
ggaccggttg aataagagga agagacgcag gatggaagcc gtcggcatct ttgttatggg 7320
tgggaagaag taccaaaaat tttgggacaa gaattccggt gatgtgtttt acgaggaggt 7380
ccatgataac acagatgcgt gggagtgcct cagagttggt gaccctgccg actttgaccc 7440
tgagaaggga actctgtgtg ggcatactac cattgaagac aaggcttata atgtctacac 7500
ctccccatct ggcaggaagt tcctggtccc cgtcaaccca gagagcggaa gagcccaatg 7560
ggaagctgca aagctttccg tagagcaggc ccttagcatg atgaatgtcg acggtgagct 7620
gacagccaaa gaactggaga aactgaaaag aataattgac aaactccagg gcctaactaa 7680
ggagcagtgt ttaaactgct agccgccagc ggcttgaccc gctgtggtcg cggcggcttg 7740
gttgttactg agacagcggt gaaaatagtt aaatttcaca accggacctt caccctagga 7800
cctgtgaatt taaaagtggc cagtgaggtt gagctaaaag acgcagtcga gcataaccaa 7860
cacccggttg caagaccggt tgatggtggt gttgtgctcc tgcgctccgc agttccttcg 7920
cttatagacg tcttgatctc tggcgctgat gcatctccta agttactcgc ccaccacggg 7980
ccgggaaaca ctgggatcga tggttcgctt tgggattttg aggccgaggc caccaaagag 8040
gaaattgcac tcagtgcgca aataatacag gcttgtgaca ttaggcgcgg cgacgcaccc 8100
gaaattggtc ttccttataa gctgcaccct gttaggggca accctgagcg ggtaaaaggg 8160
gttttacaga atacaaggtt tggagacata ccttataaaa cccccagtga cactgggagc 8220
ccagtgcacg cggctgcctg cctcacgccc aatgccactc cggtgactga cggtcgttcc 8280
gtcttggcta cgaccatgcc ctccggtttt gagttgtatg taccgaccat tccagcgtct 8340
gtccttgatt atcttgattc caggcctgat tgccccaaac agttgacaga gcacggctgt 8400
gaggatgccg cattaagaga cctctccaag tatgacttgt ccacccaagg ctttgtcttg 8460
cctggagttc ttcgccttgt gcgtaagtac ctgtttgctc atgtgggtaa gtgcccgcct 8520
attcatcggc cttccactta ccctgccaag aattccatgg ctggaataaa tgggaacagg 8580
tttccaacca aggacattca gagcgtccct gaaatcgacg ttttgtgcgc acaggccgtg 8640
cgagaaaact ggcaaactgt tactccttgt accctcaaga agcagtattg cgggaagaag 8700
aagactagga caatactcgg cactaataac ttcattgcgc tggcccaccg ggcagcattg 8760
agtggtgtca cccagggctt catgaaaaaa gcgtttaact cgcccatcgc actcgggaaa 8820
aacaaattca aggagctgca gactccggtc ttgggcagat gtcttgaagc tgaccttgca 8880
tcctgtgacc gatccacacc cgcaattgtc cgctggtttg ccgccaatct tctttatgaa 8940
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tttaaaagtg gtcaccccca tggccttctg tttctacaag accagctaaa gtttgaggac 9180
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cccaccatgc caaactacca ctggtgggtt gaacatctga acctgatgct gggttttcag 9300
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taccagactc gccgcggatt agtctccgtt aggcgtggca tcaggggaaa cgaaatcgac 9960
ctaccagacg gtgattatgc tagtaccgcc ttgctcccca cttgtaaaga tatcaacatg 10020
gtcgctgtcg cttccaatgt gttgcgcagc aggttcatca tcggtccacc cggtgctggt 10080
aaaacatact ggctccttca acaggtccag gatggtgatg tcatttacac gccaactcat 10140
cagaccatgc ttgacatgat caaggctttg gggacgtgcc ggttcaacgc cccagcaggc 10200
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gtcttgaggc ttcttagcaa aactaccctc acctgtctgg gagatttcaa acaactccac 10380
ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcagac tcaactgaag 10440
accatctgga ggtttggaca gaatatctgt gatgccattc agccagatta cagggacaaa 10500
cttgtgtcca tggtcaacac aacccgtgta acctacgtgg aaagacctgt caagcatggg 10560
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caaagagccc ttgttgctat caccagggcg agacatgcta tctttgtgta tgacccacat 10740
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caccgtgacg agcagctgat cgtactagat agaaataaca aagagtgcac ggttgctcag 10860
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gccactgcca ccagcatgag gtttcatttt cccccgggcc ccatcattga accaacttta 12060
ggcctgaact gaaatgagat gggggctatg caaagccttt tctacaaaat tggccaactt 12120
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gtcaaatgta accatagtgt ataatagtac tttgaatcag gtgttagcaa tcttcccgac 12660
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catattttcc tccgttgtgg cttcctgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgaattcc 12780
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gcctggttgg cgttcctgtc cttcagctat acagcccagt tccatcccga gatatttggg 13080
atagggaatg tgagtaaaat ttatgttgac atcaagcacc aattcatctg cgccgaacac 13140
gacgggcaga acgccaccct gcctcgccat gacaacattt cagccgtgtt tcagacctac 13200
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tcagttcgag tctttcagac atcaaaacca acaccaccgc agcaccaaat tttgttgtcc 13380
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atgagaatta tttacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt 13560
ctgagatgag tgaaaagggg ttcaaggtgg tattcggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg 13620
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ttttagcctg tctttttgcc attctgttgg caatttgaat gtttaagtat gttggggaaa 13800
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cggtatgttt tgagtagcat ctacgcggtc tgtgccctgg ctgcgttgat ttgcttcgtc 14160
attaggcttg cgaagaactg catgtcctgg cgctactcgt gtaccagata taccaacttc 14220
cttttggaca ccaaggggag actctatcgt tggcgatcgc ccgtcatcat agagaaaaag 14280
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gtggcaaccc ctataaccaa aatttcagcg gaacaatggg gtcgtcctta gatgacttct 14400
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tgatgatata tgccctaaag gtaagtcgcg gccgactgct agggcttttg caccttttga 14520
tctttctgaa ctgtgctttc accttcgggt atatgacatt cacgcacttt cagagtacaa 14580
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acagcatcac cctcagcatg atgagctggc attcctgggt atcccagtgt ttgaattgga 15300
agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcttct aagtcaccta ttcaattagg 15360
gcgaccgtgt gggagtagaa tttaattggc gagaaccacg cggccgaaat taaaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 15444
<210> 12
<211> 15047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
atgacgtata ggtgtttgct ttatgccgcg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccact 60
ggcacagccc gaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtt tctccctaac gccctgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccat 180
ccttttaacc atgtctggga ttcttgatcg gtgcacgtgc acccccaatg ccagggtgtt 240
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aaatctccaa gtttctgagc ttggggtact tggtttattc tacaggcccg aagagccatt 360
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agtggccgtt tacgccaact ccctacatgt gagtgacaaa cccttcccag gagcgactca 660
cgtgctgacc aacttaccac tcccgcagag accaaaatct gaagatttct gccccttcga 720
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gctttcgtta gaagctcagt ataaagaaat ccgctacgcc gcccaatttg gctatcagac 1080
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gcgccacgtg agactggcgg aagagccagg ctatcctggg tttgaggatc tcctcaggat 1260
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tattcaaatc ctcaggctcc ctgcggcctt agacaggaac ggcgcctgta aaaacgccaa 1680
gtacatcctt aagctggaag gtgagcactg gactgtttca gtgacccccg gaatgccccc 1740
ctcttcactt cctcttgaat gcgttcaggg ttgttgcgag cataagggca attttgactc 1800
tcaaaacgcg gtcggtttct ttgggttcga ccctgccagc cttgaccgac tcgctggggt 1860
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cgggagttgc tgctgttctc agagtagggt caaccgggtc accccggaag aggtcgcagc 2100
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gagccgccgg gtttttgaca tcgtctccca tctccctgtt tttttttcac gccttttcgc 3540
gcccggtggt ttttactctt cgggtgactg gagttttgca gcttttactt tattgtgtct 3600
ctttttatgt tacagttatc cggcctttgg ttttgctccc ctcgtgggtg tattttctgg 3660
gtcttctcgg cgcgtgcgca tgggggtttt tggctgctgg ctggcttttg ctgttggttt 3720
gttcaagcct gcacccgacc cagtcggtgc tgcttgtgag tttgactcgc cagagtgtag 3780
agacatcctt cattcttttg agctcctgca accttgggac cctgttcgca gccttgtggt 3840
gggccccgtc ggtctcggcc ttgccatttt tggcaggtta ctgggcgggg cacgctacgt 3900
ctggctgctt ttgcttaggc ttggcatcgt ttcagactgt atcctggctg gagcctatgt 3960
gctttcgcaa ggcaggtgta aaaagtgttg gggatcttgt ataagaacag cccccagtga 4020
agttgccttc aatgtgtttc cctttacacg cgcaactaga tcgtcacttg tcaacctgtg 4080
cgaccggttc tgtgcaccca agggcatgga ccccatcttc cttgccacag gatggcgcgg 4140
atgctggtcc ggccagagcc ccattgagca accctctgaa aaacccatag cgttcgccca 4200
gttggacgaa aagaaaatca cggctaggac tgtggttgcc cagccttatg accccaacca 4260
agctgtgaag tgcctgcgag tcctccaggc gggtggagcg atggtagccg aggcagttcc 4320
aaaagtagtc aaagtttctg ctgtcccgtt tcgagcccct ttttttcctg ccggagtgaa 4380
agttgaccct gaatgcaggg tcgtggttga ccctgacacc tttacaaccg ctctccggac 4440
cggctactcc accacaaacc tcattcttgg tgttggggac tttgcccagc tgaatgggtt 4500
gaagatcaga caaatttcca agtccccagg agggggccct cacctcatgg cggctttaca 4560
tgttgcttgc tcgatgactt tgcacatgct tgttgggatt tatgtcacca tggtgggttc 4620
ttgtggctct ggcactaacg atccgtggtg cactaacccg tttgccgtcc ctgtctatgg 4680
gcctggctct ctctgcacgt ccaggttgtg catttcccag cgtggcctga ccctgccctt 4740
aacagcgctt gtggcagggt ttggcgttca ggaaatcgct ttggttgttt taatctttgt 4800
ctccatcggg ggtatggccc acaggttgag ttgcaaggct gacgtgctgt gtatcctgct 4860
tgctattgtc agctatgttt ggccacccct tacctggttg ctttgtgtgt ttccttgctg 4920
gttgcgctgg ttttctttac atccccttac tattctatgg ttagtgtttt tcttgatttc 4980
tgtaaatacg ccctcgggaa tcttggcctt ggtcctgtta atctctcttt ggctccttgg 5040
tcgctatacc aatgttgccg gccttgtcac cccttatgac attcaccatt acaccaacgg 5100
ccctcgcggc gttgccgcct tggccactgc cccggatggg acctacctgg ctgctgtccg 5160
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tgagggcgct tttagaaccc aaaagccttc actgaacact gtcaatgtag ttgggtcctc 5280
catgggctcc ggcggggtgt tcaccattga tgggaagatc aaatgtgtga ccgctgctca 5340
tgtcctcacg ggtaactctg ccagggtttc cggggttggc ttcaatcaaa tgttggactt 5400
tgatgttaaa ggggattttg ccatagccga ttgtccgaat tggcaaggag tcgcccccaa 5460
gtcccggttc tgcaaggatg attggactgg ccgtgcttat tggctcacgt cctccggcgt 5520
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gtccccagtg atcaccgagg ccggggagct tgtcggtgtc cacacgggat caaacaaaca 5640
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aagtgaattg agtgaattct tcgctggacc tagggtcccg cttggtgacg tgaaggttgg 5760
caatcacata atcaaagata taaatgaggt gccctcagat ctctgcgcct tactcgctgc 5820
caaacccgaa ttggaaggag gcctctccac cgttcaactt ctgtgcgtgt tttttctcct 5880
atggagaatg atgggacatg cctggacacc cttggttgcc gttggttttt tcatcttgaa 5940
tgaagttctc ccagcagtcc tggtccggag tgtcttctcc tttggaatgt tcgcactgtc 6000
ttggttcacg ccgtggtctg cacaaattct aatgatcagg ctcttgacag cagccctaaa 6060
cagaaacaga tcgtcacttg ccttttacag cctgggcgca ctaaccggtt ttgttgcaga 6120
tcttgcaacc aatcaggggt atttattgca cgcggtcatg aatgtgagca cctatgcatt 6180
cctgcctcgt gcaatggccg tgacctcacc agtcccaata gttgcgtgtg gcgttgtgca 6240
cttgcttgcc atcattctgt acttgttcaa gtaccgtagc ctgcatgccg tcctggtcgg 6300
cgatggtgcg ttttccgcgg ctttcttctt gcgatacttt gcggagggaa agttgaggga 6360
aggggtgtcg cagtcttgcg gcatgaatca tgagtcacta accggtgccc tcgccatgaa 6420
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tgaagctttc gctgacaccg tggcgcctca actttcaccc ggtgacattg ttgtcgccct 6660
tggacacaca cctgtcggca gcatttttga cctgaaggtc ggcaatgtta agcacactct 6720
ccagtccatt gagaccagaa cccttgccgg gtctaaaatg actgtggcgc gcgtcgtaga 6780
cccaaccccc acacccccgc ccgcacctgt gcccatttcc ctcccaccaa aggttttgga 6840
gaacggtccc aacgcctggg gggatgagaa cggtttgaac aaaaaaaagc ggcgcaagat 6900
ggaggccgtt ggcatttacg ttatgggcgg gaaaaagtat caaaaatttt gggataagaa 6960
ttctggtgat gtgttctatg aagaagtcca cgacaacaca gacgcgtggg aatgcctcag 7020
agttgacaac cctgccgact tggatcctga gaggggaacc ttgtgtggac acaccaccat 7080
agacaacagg ccttaccatg tttatgcttc tccgtctggt aggaagtttc tagtccctgt 7140
caacccggag agcggaaaag ctcagtggga agctgctaag ctttctttag atcaggccct 7200
cagtatgatg aatgtcgacg gcgaactgac cgccaaagaa gtggaaaaat tgaagagaat 7260
aattgacaaa ctccagggcc tgactaagga gcagtgttta aactgctagc cgccagcggc 7320
ttgacccgct gtggtcgcgg cggcttggtt gttactgaga cagcggtaaa gatagtcagg 7380
ttccacaacc ggacctttac cctagggcct gtgaatttga aagtagctag cgaagttgag 7440
ttgaaggacg cggtcgagca cggccaacac ccggtcgcga taccagccga tggtggcgtc 7500
gtgctcctgc gttccgctgt tccttcgctt atagacgtcc tgatctccgg tgctgacgca 7560
tcccccaggt tgctcgcccg tcacggaccg ggaaatactg gggtcaatgg cgcgctttgg 7620
gattttgagt ctgaagctac caaagaggaa gtagcactta gtgcgcaaat aatacaggcc 7680
tgtgacatta gacgcggcga tgcacctgag attggccttc cttacaagtt gtaccctgtt 7740
aggggcaacc ctgaacgggc aagaggggtt ctaatgaaca caagatttgg agacatacct 7800
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gccactccag taactgatgg gcgctccatc ctggccacga ccatgccctc cgggtttgaa 7920
ctatatgtgc cgaccattcc agcgtctgtc cttgattacc ttgactccag accagactgt 7980
cctaaacagt tgactgagca cgggtgtgaa gatgccgcgt tgaaggacct ttctaaatat 8040
gacctgtcca cccaaggctt tgtgttacct ggagttctac gcctcgtgcg aaaatatctg 8100
tttgctcatg taggtaagtg cccgcctgtc caccggccct ctacctatcc tgccaagaac 8160
tccatggccg gaataaatgg gaacaggttc ccaaccaagg atattcaaag catccctgag 8220
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cttaagaagc agtattgcgg taaaaagaag accaggacca tacttggcac caacaacttc 8340
gttgcgctgg cccaccgggc ggcgctgagt ggtgtcaccc agggtttcat gaagaaggcg 8400
tttaactcac ccatcgccct tgggaaaaat aaatttaagg agctacagac tccagtcttg 8460
ggtaggtgtc ttgaggctga tctcgcttcc tgcgatcgat ccacgcctgc aatcgttcgc 8520
tggtttgccg ccaaccttct ttatgaactt gcctgtgctg aggagcattt accgtcgtac 8580
gtgctgaact gttgtcacga cctattggtc acgcagtccg gcgcagtgac taagagaggt 8640
ggcctgtcgt ccggtgaccc aatcacctct gtgtccaaca ccatttatag cttggtgatc 8700
tatgcacagc atatggtgct tagttacttc aaaagtggtc acccccatgg ccttctgttt 8760
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cacctgaatt tgatgttggg atttcagacg gacccaaaga agactgcaat aacagactca 8940
ccttcattcc taggttgtag aataataaat ggccgccagt tagtacccaa ccgtgacaga 9000
attctcgcgg cccttgccta tcacatgaag gcgagtaatg tttctgagta ctacgcctcc 9060
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cgcgggataa ggggaaatga agttgacctg ccagatggtg attatgccag tactgcccta 9600
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ttcatcatcg gcccacctgg cgcagggaaa acacactggc ttcttcaaca ggttcaggat 9720
agtgatgtca tttacacgcc aacccatcag accatgcttg acatgatcaa ggctttgggg 9780
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ggcccgtggg ttcgcatcct tgccggcggt tggtgtccag gtaagaattc cttcctggat 9900
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tgtctggggg atttcaaaca actccacccg gtgggttttg attctcattg ctatgttttt 10020
gatatcatgc ctcagactca actgaagacc atctggaggt ttggacagaa tatctgtgac 10080
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tatgtggaaa gacctgtcaa gtatgggcaa gtcctcaccc cctaccacag agaccgagag 10200
gatggtgcta tcactattga ctccagtcaa ggcgccacat ttgatgtggt cacattgcat 10260
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catgcaatct ttgtgtatga cccacacagg caactgcaga gcatgtttcg tcttcctgca 10380
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aataacaaag agtgcacggt tgttcaggct ttaggcaatg gggacaaatt cagggccagt 10500
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ccgctcccca aggtcgcaca caacttggga ttttatttct cacctgattt gacacagttt 10620
gctaaactcc cggcggaact tgcaccccac tggcccgtgg tgacaactca gaacaacgaa 10680
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atcggagccg gctatatggt gggcccctca gtgtttctag gcactcctgg ggttgtgtca 10800
tactatctca cacaatttgt caaaggggag gctcaggtgc ttccggagac ggtcttcagc 10860
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catgtcactt ctaaatatct cccacgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggttggg 11040
gtttcaagcc ccgggaaagc cgcaaaagca gtttgcacat taacagatgt gtacctccca 11100
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cctgagcaat tacagaagat cctatgaggc cttcctttcc cagtgccaag tggacattcc 11940
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ttttcagcat cttgctgcca ttgaagccga gacttgcaaa tatttggcct ctcggctgcc 12180
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actcaccaac tcatctgcgc cgaacacgac gggcagaaca ccaccctgcg tcgccatgac 12780
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acatcactgt cacggccaat gtaacagatg agaattactt gcattcctct gatctcctca 13140
tgctttcctc ttgcctcttc tatgcttctg agatgagtga aaagggattc aatgtggtct 13200
tcggcaacgt gtcaggcatt gtggctgtgt gtgtcaactt taccagctat gtccaacatg 13260
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cacctgcgac catgaggtgg gcaacagttt tagcctgtct tttcgccatc ttgttggcga 13380
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cccagtgaac ggcaattgtg tctgtcgtcg atccagactg ccttcaacca gggcgctgga 14760
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caccacactg tgcgccttat tcgcgccaca gcatcacctc catcgtgatg ggcttacatt 14880
cttggagctc ctcagtttca caattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattggcact 14940
gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg gggtttagtt taattggcga 15000
gaaccacgcg gccgaaatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 15047
<210> 13
<211> 15047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 13
atgacgtata ggtgtttgct ttatgccgcg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccact 60
ggcacagccc gaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtt tctccctaac gccctgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccat 180
ccttttaacc atgtctggga ttcttgatcg gtgcacgtgc acccccaatg ccagggtgtt 240
tgtggcagag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtccc tccttcccct 300
aaatctccaa gtttctgagc ttggggtact tggtttattc tacaggcccg aagagccatt 360
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gctttctgca atttttccaa ttgcgcgaat gaccagtgga aacctgaatt tccagcaaag 480
gctggtacgt gtcgcagccg agctttacag agccggccag ctcaccccta caagcctgaa 540
aaccttacag gtctatgaaa ggggttgccg ttggtacccc attgttggac ctgttcctgg 600
agtggccgtt tacgccaact ccctacatgt gagtgacaaa cccttcccag gagcgactca 660
cgtgctgacc aacttaccac tcccgcagag accaaaatct gaagatttct gccccttcga 720
gtgcgccacg gccgccgtct atgacatcgg ccatgacgcc gtcatgtatg taaccgagga 780
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gttgaagttg actgcggaac gactctacac ctccttcccg cctcaccatg cggtggacat 900
gtcccttttc atcttcacag accttgagtg cggcgcttcc atgcgggtcg aacgccaata 960
tggttgcctc tctgctggca ctgtccctga aggcaactgc tggtggagtc tgtttggctc 1020
gctttcgtta gaagctcagt ataaagaaat ccgctacgcc gcccaatttg gctatcagac 1080
caaacatggc gttactggca agtacctgca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc 1140
agtggttgac ccgaatgggc ctcttgtcgt acagtatttc tccgttaagg agagctggat 1200
gcgccacgtg agactggcgg aagagccagg ctatcctggg tttgaggatc tcctcaggat 1260
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cggttacaag tggtacggtg ctgggcggag ggcaaggaga acacgtgcaa gagcagtcac 1380
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cggctggcac tgcatctccg ccatcatgaa ccggatggtg cattccaagt ttgaaaccgc 1560
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tgttgggacg gctgctcggg cagcagaact accccccacc gatgagtgtc gcgctctagt 2280
cactgctgtg gcccaaaggc cttcgccgaa agttcagcct cgaaaggcgg ggtctgttaa 2340
gagtctacca gagatcaggc ctgtccctgc cccacgcagg aaggttaagt ctagttgtgg 2400
tgatctggcc ccgttgggcg gcaatttccc tgatagctgg gaagatttgg ctggtggctc 2460
ccttaatctc cagatcttac ctgagccggt ggcacaatcc tttgaacctg tgcctgtccc 2520
tgcaccgcgc aagactgcgc ctcgattagt gtcgtcatca ttggcgtcga cccccgtacc 2580
tacaccacga tgtgggtttc ggcagtttga gggaatgaat ttgacagctg tgaccctagc 2640
atgccaggat gagtccctca atttgtctgc atcctcgcag actgaatatg aggcttctcc 2700
tttggcattg cagcagggtg aggatgtcct tgcggtgggg ggacgagaag ccgaagaagt 2760
cctgagcgga atctcgggaa tgtcaggtgg cattagatta gcgcccgcat catcaagtag 2820
ctccttgtca agcgtggaga tcacacgccc gaagtactca gctcaagcca tcattgactc 2880
aggtggaccc tgttgcgggc accttcaaga ggtgaaagag aaatacctta atgtcatgcg 2940
tgaggcatgt gatgcgacta agctcgatga ccctgccacg caagaatggc tctctcgcat 3000
gtgggagagg gtagacatgc taacctggcg caacacgtcc atctttcaag cgccttttac 3060
cttagctgac aagtttaagt ccctcccgaa gatgatactc gaaacgccgc caccctaccc 3120
ttgcgggttt gtgatgatgc cccgcacgcc cgcaccttct gtgggtgcgg aaagcgacat 3180
caccgttggt tcagttgcta ctgaagatgt cccgcgtata ctcggggagg tgggagatgt 3240
tggcaagatg accggccagg aacccttaga atccttcgca gatgaactgg cagatgacca 3300
acctgctagg gagtcccgaa cacaagctcc tcctgcaagc acaggtagcg ctggtttagt 3360
tttggattct ggagggtcgc tggggctcac tgacctgccg ctcccaaaca atatagacgc 3420
gggcgggaaa ggaccgtttc acgcggtcaa gaaaaaagct gtagggtgct ttgaccaact 3480
gagccgccgg gtttttgaca tcgtctccca tctccctgtt tttttttcac gccttttcgc 3540
gcccggtggt ttttactctt cgggtgactg gagttttgca gcttttactt tattgtgtct 3600
ctttttatgt tacagttatc cggcctttgg ttttgctccc ctcgtgggtg tattttctgg 3660
gtcttctcgg cgcgtgcgca tgggggtttt tggctgctgg ctggcttttg ctgttggttt 3720
gttcaagcct gcacccgacc cagtcggtgc tgcttgtgag tttgactcgc cagagtgtag 3780
agacatcctt cattcttttg agctcctgca accttgggac cctgttcgca gccttgtggt 3840
gggccccgtc ggtctcggcc ttgccatttt tggcaggtta ctgggcgggg cacgctacgt 3900
ctggctgctt ttgcttaggc ttggcatcgt ttcagactgt atcctggctg gagcctatgt 3960
gctttcgcaa ggcaggtgta aaaagtgttg gggatcttgt ataagaacag cccccagtga 4020
agttgccttc aatgtgtttc cctttacacg cgcaactaga tcgtcacttg tcaacctgtg 4080
cgaccggttc tgtgcaccca agggcatgga ccccatcttc cttgccacag gatggcgcgg 4140
atgctggtcc ggccagagcc ccattgagca accctctgaa aaacccatag cgttcgccca 4200
gttggacgaa aagaaaatca cggctaggac tgtggttgcc cagccttatg accccaacca 4260
agctgtgaag tgcctgcgag tcctccaggc gggtggagcg atggtagccg aggcagttcc 4320
aaaagtagtc aaagtttctg ctgtcccgtt tcgagcccct ttttttcctg ccggagtgaa 4380
agttgaccct gaatgcaggg tcgtggttga ccctgacacc tttacaaccg ctctccggac 4440
cggctactcc accacaaacc tcattcttgg tgttggggac tttgcccagc tgaatgggtt 4500
gaagatcaga caaatttcca agtccccagg agggggccct cacctcatgg cggctttaca 4560
tgttgcttgc tcgatgactt tgcacatgct tgttgggatt tatgtcacca tggtgggttc 4620
ttgtggctct ggcactaacg atccgtggtg cactaacccg tttgccgtcc ctgtctatgg 4680
gcctggctct ctctgcacgt ccaggttgtg catttcccag cgtggcctga ccctgccctt 4740
aacagcgctt gtggcagggt ttggcgttca ggaaatcgct ttggttgttt taatctttgt 4800
ctccatcggg ggtatggccc acaggttgag ttgcaaggct gacgtgctgt gtatcctgct 4860
tgctattgtc agctatgttt ggccacccct tacctggttg ctttgtgtgt ttccttgctg 4920
gttgcgctgg ttttctttac atccccttac tattctatgg ttagtgtttt tcttgatttc 4980
tgtaaatacg ccctcgggaa tcttggcctt ggtcctgtta atctctcttt ggctccttgg 5040
tcgctatacc aatgttgccg gccttgtcac cccttatgac attcaccatt acaccaacgg 5100
ccctcgcggc gttgccgcct tggccactgc cccggatggg acctacctgg ctgctgtccg 5160
ccgtgctgcg ttgactggcc gtaccatgct gttcaccccg tcccaacttg gctcgctcct 5220
tgagggcgct tttagaaccc aaaagccttc actgaacact gtcaatgtag ttgggtcctc 5280
catgggctcc ggcggggtgt tcaccattga tgggaagatc aaatgtgtga ccgctgctca 5340
tgtcctcacg ggtaactctg ccagggtttc cggggttggc ttcaatcaaa tgttggactt 5400
tgatgttaaa ggggattttg ccatagccga ttgtccgaat tggcaaggag tcgcccccaa 5460
gtcccggttc tgcaaggatg attggactgg ccgtgcttat tggctcacgt cctccggcgt 5520
cgaacccggc gtcattgggc aaggattcgc cttttgtttc accgcgtgcg gcgattccgg 5580
gtccccagtg atcaccgagg ccggggagct tgtcggtgtc cacacgggat caaacaaaca 5640
aggaggaggc attgttacgc gcccttcagg ccggttttgt aatgtgacac ccaccaaatt 5700
aagtgaattg agtgaattct tcgctggacc tagggtcccg cttggtgacg tgaaggttgg 5760
caatcacata atcaaagata taaatgaggt gccctcagat ctctgcgcct tactcgctgc 5820
caaacccgaa ttggaaggag gcctctccac cgttcaactt ctgtgcgtgt tttttctcct 5880
atggagaatg atgggacatg cctggacacc cttggttgcc gttggttttt tcatcttgaa 5940
tgaagttctc ccagcagtcc tggtccggag tgtcttctcc tttggaatgt tcgcactgtc 6000
ttggttcacg ccgtggtctg cacaaattct aatgatcagg ctcttgacag cagccctaaa 6060
cagaaacaga tcgtcacttg ccttttacag cctgggcgca ctaaccggtt ttgttgcaga 6120
tcttgcaacc aatcaggggt atttattgca cgcggtcatg aatgtgagca cctatgcatt 6180
cctgcctcgt gcaatggccg tgacctcacc agtcccaata gttgcgtgtg gcgttgtgca 6240
cttgcttgcc atcattctgt acttgttcaa gtaccgtagc ctgcatgccg tcctggtcgg 6300
cgatggtgcg ttttccgcgg ctttcttctt gcgatacttt gcggagggaa agttgaggga 6360
aggggtgtcg cagtcttgcg gcatgaatca tgagtcacta accggtgccc tcgccatgaa 6420
actcagcgac gaagacttgg acttcctcac aaaattgact gattttaagt gctttgtttc 6480
tgcatccaac atgaggaatg cggcgggtca atttatagag gccgcctacg ccaaagcact 6540
gagggtggaa cttgcccagt tggttcaagt cgataaagtt cgaggtgtcc tggccaaact 6600
tgaagctttc gctgacaccg tggcgcctca actttcaccc ggtgacattg ttgtcgccct 6660
tggacacaca cctgtcggca gcatttttga cctgaaggtc ggcaatgtta agcacactct 6720
ccagtccatt gagaccagaa cccttgccgg gtctaaaatg actgtggcgc gcgtcgtaga 6780
cccaaccccc acacccccgc ccgcacctgt gcccatttcc ctcccaccaa aggttttgga 6840
gaacggtccc aacgcctggg gggatgagaa cggtttgaac aaaaaaaagc ggcgcaagat 6900
ggaggccgtt ggcatttacg ttatgggcgg gaaaaagtat caaaaatttt gggataagaa 6960
ttctggtgat gtgttctatg aagaagtcca cgacaacaca gacgcgtggg aatgcctcag 7020
agttgacaac cctgccgact tggatcctga gaggggaacc ttgtgtggac acaccaccat 7080
agacaacagg ccttaccatg tttatgcttc tccgtctggt aggaagtttc tagtccctgt 7140
caacccggag agcggaaaag ctcagtggga agctgctaag ctttctttag atcaggccct 7200
cagtatgatg aatgtcgacg gcgaactgac cgccaaagaa gtggaaaaat tgaagagaat 7260
aattgacaaa ctccagggcc tgactaagga gcagtgttta aactgctagc cgccagcggc 7320
ttgacccgct gtggtcgcgg cggcttggtt gttactgaga cagcggtaaa gatagtcagg 7380
ttccacaacc ggacctttac cctagggcct gtgaatttga aagtagctag cgaagttgag 7440
ttgaaggacg cggtcgagca cggccaacac ccggtcgcga taccagccga tggtggcgtc 7500
gtgctcctgc gttccgctgt tccttcgctt atagacgtcc tgatctccgg tgctgacgca 7560
tcccccaggt tgctcgcccg tcacggaccg ggaaatactg gggtcaatgg cgcgctttgg 7620
gattttgagt ctgaagctac caaagaggaa gtagcactta gtgcgcaaat aatacaggcc 7680
tgtgacatta gacgcggcga tgcacctgag attggccttc cttacaagtt gtaccctgtt 7740
aggggcaacc ctgaacgggc aagaggggtt ctaatgaaca caagatttgg agacatacct 7800
tacaagaccc ccagcgacac cgggagcccg gtgcacgcgg ccgcctgcct tacgcccaac 7860
gccactccag taactgatgg gcgctccatc ctggccacga ccatgccctc cgggtttgaa 7920
ctatatgtgc cgaccattcc agcgtctgtc cttgattacc ttgactccag accagactgt 7980
cctaaacagt tgactgagca cgggtgtgaa gatgccgcgt tgaaggacct ttctaaatat 8040
gacctgtcca cccaaggctt tgtgttacct ggagttctac gcctcgtgcg aaaatatctg 8100
tttgctcatg taggtaagtg cccgcctgtc caccggccct ctacctatcc tgccaagaac 8160
tccatggccg gaataaatgg gaacaggttc ccaaccaagg atattcaaag catccctgag 8220
atcgacgttt tgtgtgcaca agctgtgcga gaaaactggc aaactgttac accctgcact 8280
cttaagaagc agtattgcgg taaaaagaag accaggacca tacttggcac caacaacttc 8340
gttgcgctgg cccaccgggc ggcgctgagt ggtgtcaccc agggtttcat gaagaaggcg 8400
tttaactcac ccatcgccct tgggaaaaat aaatttaagg agctacagac tccagtcttg 8460
ggtaggtgtc ttgaggctga tctcgcttcc tgcgatcgat ccacgcctgc aatcgttcgc 8520
tggtttgccg ccaaccttct ttatgaactt gcctgtgctg aggagcattt accgtcgtac 8580
gtgctgaact gttgtcacga cctattggtc acgcagtccg gcgcagtgac taagagaggt 8640
ggcctgtcgt ccggtgaccc aatcacctct gtgtccaaca ccatttatag cttggtgatc 8700
tatgcacagc atatggtgct tagttacttc aaaagtggtc acccccatgg ccttctgttt 8760
ttacaagacc agctaaagtt tgaagacatg ctcaaagttc aacccctaat cgtctattcg 8820
gacgacctcg tgttgtatgc cgagtctccc accatgccaa actatcactg gtgggttgaa 8880
cacctgaatt tgatgttggg atttcagacg gacccaaaga agactgcaat aacagactca 8940
ccttcattcc taggttgtag aataataaat ggccgccagt tagtacccaa ccgtgacaga 9000
attctcgcgg cccttgccta tcacatgaag gcgagtaatg tttctgagta ctacgcctcc 9060
gcagccgcaa tactcatgga cagttgtgct tgtctagagt atgatcctga gtggtttgaa 9120
gaacttgtgg ttggaatggc gcagtgcgcc cgtaaggacg gctatagttt ccccggcccg 9180
ccgttcttct tgtccatgtg ggaaaagctc aggtcaaatt atgaggggaa gaagttgaga 9240
gtgtgtggtt attgcggagc ttcagccccg tatgctactg cctgtggcct tgacgtttgt 9300
gtttaccaca cccactttca ccagcattgt ccagtcataa tatggtgtgg ccacccggcg 9360
ggttctgggt cctgcgatga gtgcaaatcc cctacaggga agggtacaag ccctctggat 9420
gaggtcttaa gacaagtccc ttataagcct ccacggacta ttcttatgca tgtggagcag 9480
ggcctcaccc cccttgaccc aggcagatac cagacccgcc gtgggttggt tgctgtcagg 9540
cgcgggataa ggggaaatga agttgacctg ccagatggtg attatgccag tactgcccta 9600
ctccccacct gcaaagacat agacatggtt gctgtggcct ccaatgtgtt gcgcagtagg 9660
ttcatcatcg gcccacctgg cgcagggaaa acacactggc ttcttcaaca ggttcaggat 9720
agtgatgtca tttacacgcc aacccatcag accatgcttg acatgatcaa ggctttgggg 9780
acgtgccggt tcaatgtccc ggcaggcaca acgctgcaat tccctgcccc ctcccgtacc 9840
ggcccgtggg ttcgcatcct tgccggcggt tggtgtccag gtaagaattc cttcctggat 9900
gaagcagcgt attgcaatca ccttgacgtc ttgaggcttc tcagcaaaac taccctcacc 9960
tgtctggggg atttcaaaca actccacccg gtgggttttg attctcattg ctatgttttt 10020
gatatcatgc ctcagactca actgaagacc atctggaggt ttggacagaa tatctgtgac 10080
gccattcagc cagattacag ggacaaactc gtgtccatgg tcaacacaac ccgtgtaacc 10140
tatgtggaaa gacctgtcaa gtatgggcaa gtcctcaccc cctaccacag agaccgagag 10200
gatggtgcta tcactattga ctccagtcaa ggcgccacat ttgatgtggt cacattgcat 10260
ttgcccacta aagattcact caacaggcaa agagcccttg ttgctatcac cagggcaagg 10320
catgcaatct ttgtgtatga cccacacagg caactgcaga gcatgtttcg tcttcctgca 10380
aaaggcacac ctgtcaacct tgccgtgcac cgtgacgagc agctcatcgt attagataga 10440
aataacaaag agtgcacggt tgttcaggct ttaggcaatg gggacaaatt cagggccagt 10500
gacaagcgcg ttgtagattc tcttcgcgcc atttgtgcag atcttgaagg gtcgagctcc 10560
ccgctcccca aggtcgcaca caacttggga ttttatttct cacctgattt gacacagttt 10620
gctaaactcc cggcggaact tgcaccccac tggcccgtgg tgacaactca gaacaacgaa 10680
aattggccag accggctggt tgctagcctc cgccctatcc acaaatatag ccgcgcgtgc 10740
atcggagccg gctatatggt gggcccctca gtgtttctag gcactcctgg ggttgtgtca 10800
tactatctca cacaatttgt caaaggggag gctcaggtgc ttccggagac ggtcttcagc 10860
accggccgaa ttgaggtaga ttgtcgagag tatcttgatg atcgggaacg agaagttgct 10920
gagtccctcc cacatgcctt tattggcgac gtcaaaggca ctaccgttgg gggatgtcac 10980
catgtcactt ctaaatatct cccacgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggttggg 11040
gtttcaagcc ccgggaaagc cgcaaaagca gtttgcacat taacagatgt gtacctccca 11100
gatcttgagg cttacctcca tccagagacc cagtctaagt gctggaaagt gatgttggac 11160
ttcaaggaag ttcgactgat ggtctggaga gataagacgg cctactttca acttgaaggc 11220
cgccatttca cctggtacca gcttgcaagt tatgcctcgt acatccgagt tcccgttaac 11280
tctacggtgt acctggaccc ctgtatgggc cctgcccttt gcaacagaag agtcgttggg 11340
tctgcacatt ggggagctga ccttgcagtt accccttatg attatggtgc caaaatcatt 11400
ctgtctagtg cgcaccatgg tgaaatgcct cctgggtaca gaattctagc gtgcgcggag 11460
ttctcgcttg atgacccagt gaggtacaaa cacacttggg ggtttgaatc ggatacagcg 11520
tatctgtacg agttcaccgg aaacggtgag gactgggagg attacaatga tgcgtttcgt 11580
gcacgccaga aagggaaaat ttataaggcc actgccacca gcatgagatt tcattttccc 11640
ccgggtcctg ccattgaacc aacattgggc ctgaactgaa atgaaatggg ggctgtgcag 11700
agccttttcg acaaaatttg ccaacttttt gtggatgctt tcacggaatt tttggtgtcc 11760
attgttgata tcatcatatt tttggccatt ttgtttggct tcaccatcgc aggctggctg 11820
gttgtcttct gtatccgact ggtttgctcc acggtactcc gtgcgcgctc taccattcac 11880
cctgagcaat tacagaagat cctatgaggc cttcctttcc cagtgccaag tggacattcc 11940
cgcctgggga actaagcatc ccttgggggt gctttggcac cacaaggtgt caactctgat 12000
tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa aaagcaggac aggctgcctg 12060
gaaacaggtt gtgagcgaag ctacattgtc tcgcataagt ggcttggatg tggtggctca 12120
ttttcagcat cttgctgcca ttgaagccga gacttgcaaa tatttggcct ctcggctgcc 12180
catgctacac aacctagtca tgtcagggtc gaatgtaacc atagtgtata atagcacttt 12240
gggtcaagtg tttgccattt tcccaacccc tggttcccgg ccaaaacttt ctgattttca 12300
acaatggctc atagctgtgc attcttccat attttcttct gttgcggctt cttgtactct 12360
ttttgttgtg ctgtggctgc gaattccaat actacgtact gtttttggtt tccgctggtt 12420
aggggcaact tttctttcga actcacagtg aattacacgg tgtgcccacc ctgcctcacc 12480
cggcaagcag ccgctgagat ctacgaacac agcgggtctc tttggtgcag gatagggcat 12540
gaccgatgta gccagagtga tcatgacgaa ctagggttct tggttccacc tggcctttcc 12600
agcgagggcc acttgaccag tgtttacgcc tggctggcgt tcttgtcttt cagctacaca 12660
gcccagttcc accccgagat atttggaata gggaatgtga gtagagttta tgttgacgtc 12720
actcaccaac tcatctgcgc cgaacacgac gggcagaaca ccaccctgcg tcgccatgac 12780
aatatctcag ccgtgtttca gacctattac caacatcagg tcgatggcgg caattggttt 12840
cacctagaat ggctgcgtcc cttcttttcc tcttggctgg ttttgaatgt ctcgtggttt 12900
ctcaggcgtt cgcctgcaaa ccgtgtttca gttcgagtct ttcagacatc aaaaccaaca 12960
ccaccgcagc tgcaggcttt gctgtcctcc aagacatcag ctgtcttagg catggctact 13020
cgtccattga ggcgattcgc aaaagccgtc aatgccgcac ggcgatagga acgcccgtgt 13080
acatcactgt cacggccaat gtaacagatg agaattactt gcattcctct gatctcctca 13140
tgctttcctc ttgcctcttc tatgcttctg agatgagtga aaagggattc aatgtggtct 13200
tcggcaacgt gtcaggcatt gtggctgtgt gtgtcaactt taccagctat gtccaacatg 13260
ttaaggagtt tactcagcgc tctttggtgg tcgaccacgt gcgactgctt catttcatga 13320
cacctgcgac catgaggtgg gcaacagttt tagcctgtct tttcgccatc ttgttggcga 13380
tttgaatgtt taagtatgtt ggggaaatgc ttgaccgcgg gctactgctc gcaattgctt 13440
tttttctggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgcgctcg tcaacgccgc cagcaacagc 13500
agctcccatt tacagttgat ttataacctg acgatatgcg agctgaatgg cacagattgg 13560
ttgaatcaaa agtttgattg ggcagtggag acttttgtca tttttcctgt gttgacccac 13620
attgtctcct acggtgccct taccaccagc catttccttg acacggccgg cctaatcact 13680
gtgtctaccg ccggatatta ccatgggcgg tatgtgttga gtagcatcta cgccgtcttt 13740
gccctggctg cgttgatttg ttttgtcatt aggttgacaa aaaactgtat gtcctggcgc 13800
tactcatgta ccagatatac caactttctt ctggacacca aaggcaatct ctatcgttgg 13860
cggtcacccg tcgttataga gagaaggggt aaagttgagg ttggagacca cctaatcgac 13920
ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgcg gcaaccccta taaccaagat ttcagcggaa 13980
caatggggtc gtccctagac gacttctgca atgacagcac agctgcacaa aaggtgcttt 14040
tggcgttttc catcacctat acgccaataa tgatatatgc cctgaaggta agtcgcggcc 14100
gactgttagg gcttttgcat cttttaattt tcttgaattg tgctttcacc ttcgggtaca 14160
tgacatttgt tcattttcag agtacaaaca aggtcgcgct cactatggga gcagttgttg 14220
cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa attcatcact tccagatgcc 14280
gtttgtgctt gctaggccgc aggtacattc tggcccctgc ccaccacgtt gaaagtgccg 14340
cgggctttca tccgattgcg gcaagtgata accacgcatt tgtcgtccgg cgtcccggct 14400
ccactactgt taacggcaca ttggtgcccg ggttgaaaag cctcgtgttg ggtggcagaa 14460
aagctgttaa gcggggagtg gtaaacctcg ttaaatatgc caaataacaa cggcaggcag 14520
caaaaaaata agaaggggag tggccagcca gtcaatcagc tgtgccaaat gctgggcaag 14580
atcatcgccc agcaaaatca gtccagaggc aagggaccgg gtaagaaaaa taagaagaga 14640
aacccggaga agccccattt tcctcttgcg accgaagatg acgtcaggca tcacttcacc 14700
cccagtgaac ggcaattgtg tctgtcgtcg atccagactg ccttcaacca gggcgctgga 14760
acttgcaccc tgtcagattc agggaggata agttacactg tggagtttag tttgccgacg 14820
caccacactg tgcgccttat tcgcgccaca gcatcacctc catcgtgatg ggcttacatt 14880
cttggagctc ctcagtttca caattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattggcact 14940
gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg gggtttagtt taattggcga 15000
gaaccacgcg gccgaaatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 15047
Claims (11)
- 변형된, 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 균주이며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주의 컨센서스 상보적 DNA 서열이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 10, 및 서열식별번호: 11의 군으로부터 선택된 것인, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 PRRS 바이러스 균주가 서열식별번호: 11의 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 PTA-122675인 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PRRS 바이러스 균주가 조직 배양 세포에서 계대배양된 것이고, 상기 조직 배양 세포는 돼지 폐포 대식세포 또는 MARC-145 세포인 것인 PRRS 바이러스 균주.
- 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 10, 및 서열식별번호: 11의 군으로부터 선택된 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주; 및
제약상 허용되는 부형제, 안정화제, 가용화제 또는 희석제
를 포함하는 면역원성 조성물. - 제4항에 있어서, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주가 서열식별번호: 11의 컨센서스 상보적 DNA 서열을 갖는 PTA-122675인 면역원성 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신이며, 여기서 상기 PRRS 바이러스 균주가 PTA-122675인 백신.
- 제4항 또는 제5항의 면역원성 조성물 또는 제7항의 백신을 돼지과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제4항 또는 제5항의 면역원성 조성물 또는 제7항의 백신을 돼지과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 돼지과 동물에서 유형 2 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
- 돼지과 동물에서 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항의 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신.
- 돼지과 동물에서 유형 2 PRRS 바이러스 감염에 의해 유발된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주를 포함하는 백신으로서, 상기 변형된, 생 PRRS 바이러스 균주는 PTA-122675인 것인 백신.
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