TWI704225B - 豬繁殖與呼吸綜合症疫苗病毒 - Google Patents

Abstract

本發明係關於經改造之豬繁殖與呼吸綜合症活病毒。對病毒進行遺傳分析並基於系統發生分群(phylogenetic grouping)進行選擇，以藉由在組織培養物中重複傳代進行改造。評估該等經改造之活病毒提供對異源病毒之保護性免疫之能力。該等經改造之活病毒可用於疫苗中，尤其用於可治療受到多種異源病毒感染的豬的疫苗中。

Description

豬繁殖與呼吸綜合症疫苗病毒

本發明係關於經改造之豬繁殖與呼吸綜合症活病毒。經改造之活病毒可用於疫苗中，特定而言可用於提供保護免於異源病毒之疫苗中。

最初稱為神秘豬病(Mystery Swine Disease)之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)最早闡述於歐洲，但現今已在全世界傳播。PRRS在繁殖年齡母豬中造成晚期流產、死產及不育，且在保育及生長/育肥豬中造成呼吸疾病、生長性能降低及甚至死亡。僅在美國，PRRS即造成每年超過$600百萬之經濟損失。 成年豬動物中PRRS病毒感染之症狀包括(但不限於)食欲下降、嗜睡、發燒及行為改變(例如失去平衡、迴旋及跌落至一側)。懷孕母豬可早產、流產胎兒、或產木乃伊化或死胎仔豬，且高達10%之懷孕母豬可死於PRRS病毒感染。受感染仔豬具有較高之斷乳前死亡率，通常較虛弱，且可在眼睛周圍具有水腫。在斷乳保育或生長/育肥豬中之PRRS病毒感染可造成(但不限於)成長遲緩、呼吸窘迫、呼吸困難或急促、皮膚斑點變紅及被毛粗糙。 PRRS病毒係具有大約15 kb之線性、正鏈單鏈RNA基因體之包膜病毒，且該病毒已分類為動脈炎病毒科(Arteriviridae )。迄今為止在基因體中已鑑別出至少9個開放閱讀框。PRRS病毒分為兩種一般亞型。歐洲亞型即1型PRRS病毒係由賴利斯德(Lelystad)毒株來例示，而2型北美PRRS病毒係由毒株VR-2332來例示。 兩種亞型在其基因體中可僅具有約60%之序列一致性，且甚至在亞型內個別毒株在其基因體之一致性上之變化可高達約20%。此變化性使得開發有效治療及/或預防PRRS之疫苗變得複雜。PRRS病毒之經改造之活病毒(MLV)變體可產生對抗PRRS病毒攻毒之免疫力，但在與MLV遺傳同源之PRRS病毒攻毒時疫苗最有效。MLV疫苗對抗異源病毒之攻毒不太有效。此外，MLV已顯示出一些毒力回復，使得疫苗病毒在接種動物中引起疾病。含有不活化(即殺死) PRRS病毒之疫苗具有較佳之安全性概況，但對抗異源攻毒之效能有限。 由於現有PRRS疫苗不顯示足夠之安全性及效能以降低PRRS病毒感染之經濟影響，因此需要新穎及改良之疫苗。較佳地，彼等疫苗將既安全又有效。若疫苗包含減毒MLV，則彼等減毒MLV不應展示毒力回復以便在該領域中視為使用安全。舉例而言，藉由使PRRS毒株適應於在組織培養細胞中生長達至少80代或較佳至少100代，MLV應不展示毒力回復。為了有效，疫苗病毒株應能夠在豬動物中引發對抗一系列系統發生多樣性野生型PRRS毒株之保護性免疫。較佳地，新穎PRRS疫苗病毒株將能夠在豬動物中引發豬對抗至少三種系統發生多樣性野生型PRRS毒株之保護性免疫。

本發明提供經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活疫苗病毒株，其中該PRRS毒株之共有互補DNA序列與選自以下之群之序列至少90%一致：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。較佳地，經改造之活毒株可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。更佳地，經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。如熟習此項技術者將瞭解，由於PRRS病毒之高突變率，經改造之PRRS活毒株可包含多個亞種群，其各自具有同源但不一致之基因體。 本發明提供經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活病毒株，其中PRRS病毒株係ND 99-14毒株或SD 11-21毒株。PRRS病毒株應在組織培養細胞中傳代至少80次或更佳84次。最佳地，PRRS病毒株應在組織培養細胞中傳代100次。在組織培養細胞中之此傳代可用於使經改造之PRRS活病毒株適當地減毒。當將減毒PRRS病毒株投與豬動物時，彼等毒株可引起亞臨床但非臨床疾病。傳代至少80次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。最佳地，傳代100次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。 本發明提供包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物，該PRRS活病毒株具有與選自以下之群之序列至少90%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。較佳地，經改造之活毒株可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。更佳地，經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。如熟習此項技術者將瞭解，由於PRRS病毒之高突變率，經改造之PRRS活毒株可包含多個亞種群，其各自具有同源但不一致之基因體。 本發明提供包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物，其中該PRRS病毒株係ND 99-14或SD 11-21。ND 99-14毒株或SD 11-21毒株可在組織培養細胞中傳代至少80次或較佳地甚至84次。最佳地，ND 99-14毒株或SD 11-21毒株可在組織培養細胞中傳代100次。免疫原性組合物可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。免疫原性組合物亦可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供包含經改造之PRRS活病毒株之疫苗，其中該PRRS毒株之共有互補DNA序列與選自以下之群之序列至少90%一致：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。較佳地，經改造之活毒株可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。最佳地，經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。疫苗可進一步包含佐劑。疫苗可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。疫苗可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供用於治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之疫苗。由於PRRS係因PRRS病毒引起，因此本發明提供用於治療PRRS病毒感染之疫苗。本發明亦提供用於治療豬動物中因PRRS病毒感染所引起之症狀之疫苗。感染可來自PRRS病毒之野生型毒性株。症狀可係(但不限於)食欲下降、嗜睡、發燒、行為改變(例如失去平衡、迴旋及跌落至一側)、早產、流產、死產、水腫、成長遲緩、咳嗽、呼吸窘迫、呼吸困難或急促、皮膚斑點變紅、被毛粗糙、肺損傷、病毒剝落及死亡。本發明提供用於豬動物療法中之疫苗。本發明亦提供用於治療豬動物中之PRRS之疫苗。較佳地，疫苗包含經改造之PRRS活毒株，該經改造之PRRS活毒株具有與選自以下之群之序列至少90%、至少95%或至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。最佳地，疫苗包含為ND 99-14或SD 11-21之經改造之PRRS活毒株。疫苗可進一步包含佐劑。疫苗可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。疫苗可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供用於治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之包含經改造之PRRS活病毒株之疫苗。本發明亦提供用於治療或預防豬動物中因PRRS病毒感染所引起之症狀之包含經改造之PRRS活病毒株之疫苗。症狀可係(但不限於)食欲下降、嗜睡、發燒、行為改變(例如失去平衡、迴旋及跌落至一側)、早產、流產、死產、水腫、成長遲緩、咳嗽、呼吸窘迫、呼吸困難或急促、皮膚斑點變紅、被毛粗糙、肺損傷、病毒剝落及死亡。本發明提供用於豬動物療法中之包含經改造之PRRS活病毒株之疫苗。本發明亦提供用於豬動物中PRRS之療法中之包含經改造之PRRS活病毒株之疫苗。感染可來自與疫苗中經改造之PRRS活病毒異源之PRRS病毒之野生型毒性毒株。較佳地，疫苗包含經改造之PRRS活毒株，該經改造之PRRS活毒株具有與選自以下之群之序列至少90%、至少95%或至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。最佳地，疫苗包含為ND 99-14或SD 11-21之經改造之PRRS活毒株。疫苗可進一步包含佐劑。疫苗可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。疫苗可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之症狀之方法，其包含向該豬動物投與包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物。本發明亦提供治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之方法，其包含向該豬動物投與包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物。較佳地，用於該方法中之經改造之PRRS活病毒株將具有與選自以下之群之序列至少90%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。更佳地，用於該方法中之經改造之PRRS活病毒株將具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。最佳地，用於該方法中之經改造之PRRS活病毒株將具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。免疫原性組合物可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。免疫原性組合物可包含來自不同病毒或來自細菌或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之方法，其包含向該豬動物投與包含經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活病毒株之免疫原性組合物，其中該PRRS病毒株係ND 99-14或SD 11-21。ND 99-14毒株或SD 11-21毒株用於該方法中之可傳代至少80次或較佳地甚至84次，在組織培養細胞中。最佳地，用於該方法中之ND 99-14毒株或SD 11-21毒株在組織培養細胞中傳代100次。免疫原性組合物可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。免疫原性組合物可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供治療或預防豬動物中因PRRS病毒感染所引起之症狀之方法，其包含向該豬動物投與包含經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活病毒株之免疫原性組合物，其中該PRRS毒株之共有互補DNA序列較佳與選自以下之群之序列至少90%一致：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。更佳地，用於該方法中之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。最佳地，用於該方法中之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。免疫原性組合物可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。免疫原性組合物亦可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。 本發明提供治療或預防豬動物中因PRRS病毒感染所引起之症狀之方法，其包含向該豬動物投與包含經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活病毒株之免疫原性組合物，其中該PRRS病毒株係ND 99-14或SD 11-21。用於該方法中之ND 99-14毒株或SD 11-21毒株在組織培養細胞中可傳代至少80次或較佳地甚至84次。最佳地，用於該方法中之ND 99-14毒株或SD 11-21毒株在組織培養細胞中可傳代100次。免疫原性組合物可進一步包含醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。免疫原性組合物亦可包含來自不同病毒或來自細菌菌株或來自寄生蟲之另一抗原。PRRS病毒感染可係因與免疫原性組合物中經改造之PRRS活病毒株異源之毒性PRRS病毒之感染。若每一病毒株之基因體共有序列映射至不同之系統發生組，則視兩種PRRS病毒株為異源。若每一病毒株之互補DNA共有序列映射至不同之系統發生組，則視兩種PRRS病毒株為異源。 本發明提供經改造之PRRS活病毒株之用途，其用於製造用於治療或預防PRRS之症狀之藥劑，其中該經改造之PRRS活病毒包含與選自以下之群之序列至少90%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。較佳地，經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。更佳地，經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。 本發明提供包含ND 99-14毒株或SD 11-21毒株之經改造之PRRS活病毒株之用途，其用於製造用於治療或預防PRRS之症狀之藥劑。經改造之PRRS活病毒株在組織培養細胞中應傳代至少80次或較佳地甚至84次。此外，PRRS病毒株在組織培養細胞中應傳代100次。在組織培養細胞中之此傳代可用於使經改造之PRRS活病毒株適當地減毒。當將減毒PRRS病毒株投與豬動物時，彼等毒株可引起亞臨床但非臨床疾病。傳代至少80次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。傳代100次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。 本發明提供包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於治療PRRS病毒感染之藥劑，其中該經改造之PRRS活病毒株包含與選自以下之群之序列至少90%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。用於此用途之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。用於此用途之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。 本發明提供包含包括ND 99-14毒株或SD 11-21毒株之經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於治療PRRS病毒感染之藥劑。PRRS病毒株在組織培養細胞中應傳代至少80次或較佳地甚至84次。此外，PRRS病毒株在組織培養細胞中應傳代100次。在組織培養細胞中之此傳代可用於使經改造之PRRS活病毒株適當地減毒。當將減毒PRRS病毒株投與豬動物時，彼等毒株可引起亞臨床但非臨床疾病。傳代至少80次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。傳代100次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。 本發明提供包含經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於保護豬動物免於PRRS病毒感染之藥劑，其中該經改造之PRRS活病毒株包含與選自以下之群之序列至少90%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。用於此用途之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少95%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。用於此用途之經改造之活毒株亦可具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。 本發明提供包含包括ND 99-14毒株或SD 11-21毒株之經改造之PRRS活病毒株之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於保護豬動物免於PRRS病毒感染之藥劑。PRRS病毒株在組織培養細胞中應傳代至少80次或較佳地甚至84次。此外，PRRS病毒株在組織培養細胞中應傳代100次。在組織培養細胞中之此傳代可用於使經改造之PRRS活病毒株適當地減毒。當將減毒PRRS病毒株投與豬動物時，彼等毒株可引起亞臨床但非臨床疾病。傳代至少80次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。傳代100次之經改造之PRRS活病毒株具有較低之回復至野生型毒力之機率。

如以下論述中所使用，除非另有指定，否則術語「一(a或an)」應理解為涵蓋一或多者。 如本文中所使用，術語「病毒」可意指病毒物種或可互換地意指可含有核酸、蛋白質及脂質膜之個別感染單位。個別感染單位亦稱為「病毒顆粒」或「病毒粒子」，該兩個術語係同義詞。 如本文中所使用，病毒之「毒株」或「分離株」意指遺傳上同源之病毒粒子之集合。若兩種病毒映射至相同之系統發生進化枝，則視彼等病毒「同源」。若兩種病毒映射至不同之系統發生進化枝，則視彼等病毒「異源」。由於PRRS病毒具有高突變率，因此應瞭解，單一PRRS毒株包含具有相關但可變之基因序列之個別病毒粒子。因此，毒株亞種群存在於每一PRRS毒株內，且PRRS毒株之基因序列係共有序列，使得PRRS毒株之個別成員之基因序列可不與彼毒株之共有序列一致。「共有」序列係其中既定位置處之每一核酸殘基存在於PRRS病毒毒株或分離株中＞50%之多核苷酸中之核酸序列。 「一致性百分比」可藉由計算核酸或蛋白質中相同位置處之相同核苷酸或胺基酸之數量來確定。計算一致性百分比包括確定兩個或更多個序列之間之最佳比對。比對可慮及每一欲測試序列中(例如(但不限於)核酸之非編碼區及多肽序列之截斷或延伸中)之插入及缺失(即「缺口」)。可使用電腦程式及演算法(例如基本局部比對搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST))來確定一致性百分比。BLAST係美國國家生物技術資訊中心(U.S. National Center for Biotechnology Information)所提供之許多資源之一。由於遺傳密碼係簡並性的且不止一個密碼子可編碼給定胺基酸，因此若核酸編碼相同多肽，則核酸之編碼區視為相同的。因此，一致性百分比亦可基於由核酸編碼之多肽來計算。一致性百分比可基於全長共有基因體序列或基於基因體序列之一部分(例如(但不限於)基於個別開放閱讀框(ORF))來計算。 如本文中所使用，術語「經改造之活病毒」適用於其基因序列已自天然野生型病毒之基因序列改變之任何個別病毒顆粒(即「病毒粒子」)或多個病毒顆粒。改變包括(但不限於)基因突變，例如核苷酸之插入及缺失及將一種核苷酸變為另一種核苷酸之轉換及顛換。可藉由使野生型病毒適應在組織培養系統中之複製且繼續在組織培養系統中使病毒傳代，藉此病毒累積基因突變來完成改變。亦可使用分子技術來完成改變。減毒病毒形成經改造之活病毒之子組。 如本文中所使用，術語「減毒(attenuated或attenuation)」意指病毒引起或加劇臨床疾病之能力已降低或消除。減毒病毒仍可在活體外或活體內感染宿主細胞，且該感染可在宿主生物體中導致亞臨床效應，但該感染不會導致一或多種臨床疾病症狀。 相比之下，如本文中所使用，「不活化」病毒意指不能再在宿主細胞中複製之病毒。認為不活化病毒係殺滅或死亡之病毒。不活化可藉由各種方法來完成，包括(但不限於)病毒蛋白之化學改變、病毒粒子之結構中之化學或物理改變或病毒核酸中之化學或物理改變。 「抗原」係能夠由生物體之免疫系統特異性檢測之任何分子。通常，病毒抗原係由病毒基因體編碼或自病毒基因體之產物衍生之病毒蛋白。病毒抗原之存在可藉由宿主T淋巴球及宿主B淋巴球二者之表面抗原受體及藉由由宿主細胞合成之抗體分子特異性地檢測。 「免疫原性」係指抗原引發免疫反應之能力，該免疫反應包括抗原特異性反應及非抗原特異性反應二者或先天免疫反應。「保護性免疫」係當免疫動物受攻毒或暴露於致病性病毒株時可減少或預防臨床症狀之免疫反應。如熟習此項技術者將瞭解，保護性免疫可隨時間或免疫動物之年齡增長而下降。如本文中所用之保護性免疫應自免疫之最後日期起至少4個月但較佳地至少6個月有效。保護性免疫可由單一劑量之疫苗引發。第二或另一劑量可用以增加或延長保護性免疫反應。舉例而言，增加育種母豬中之保護性免疫反應可使得仔豬中母源性抗體之含量增加。 與抗原相反，「佐劑」係免疫反應之非特異性刺激物。佐劑可藉由結合並活化模式識別受體(PRR)來刺激先天免疫反應。PRR之此等刺激物可係(例如)病毒或細菌核酸、來自細菌或寄生蟲之脂質、或細菌蛋白質或毒素、或此等分子之任何人工構築之模擬物。佐劑亦包括(但不限於)：聚集抗原以有助於由B淋巴球識別或由吞噬細胞攝取之無機化合物，例如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、羥磷灰石或硫酸銨；油；及清潔劑。佐劑亦可係免疫信號傳導之宿主介質，例如(但不限於)細胞介素、淋巴介質、趨化介素、干擾素、過敏毒素、生長因子、分化因素及黏附分子。 如本文中所使用，「免疫原性組合物」係當投與動物時引發免疫反應之組合物。免疫原性組合物包含至少一種抗原及至少一種醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑之闡述可參見(例如) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy,」 Lloyd V. Allen編輯，Pharmaceutical Press, London, UK, 第22版, 2012。抗原可係活或不活化之整個病毒、細菌或其他病原體。抗原亦可係來自病毒、細菌或其他病原體之經分離、純化或部分純化之抗原性分子。抗原可係多肽、多醣、核酸或脂質。 如本文中所使用，「疫苗」係當投與動物時，賦予保護免於、抵抗、預防或治療疾病症狀之免疫原性組合物，其中該症狀係由致病性生物體(例如病毒)引起。PRRS疫苗可包括(但不限於)與醫藥上可接受之佐劑、賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑組合之活或不活化之病毒抗原或完整病毒粒子。 如本文中所使用，術語「治療(treating、to treat或treatment)」包括(但不限於)遏製、減緩、終止、減少、改善或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重性。治療可以治療方式施加或投與。 如本文中所使用，術語「預防(preventing、to prevent或prevention)」包括(但不限於)降低、減少或改善症狀、病症、病狀或疾病之風險，並保護動物免於症狀、病症、病狀或疾病。預防可以預防性方式施加或投與。 如本文中所使用，「投與動物」包括(但不限於)皮膚、皮下、肌內、黏膜、黏膜下、經皮、經口或鼻內投與。投與可包括注射或局部投與。 以下實驗實例說明經改造之PRRS活病毒。以下實驗實例亦說明包含經改造之PRRS活病毒之免疫原性組合物。以下實驗實例亦說明使用經改造之PRRS活病毒治療豬動物之PRRS之症狀。應瞭解，其他實施例及用途將對熟習此項技術者顯而易見，且本發明不限於該等具體說明性實例或較佳實施例。 實例1 本發明意欲開發針對PRRS之廣泛保護性MLV疫苗。鑑別疫苗病毒中之獨特區域用於遺傳標記物及鑑別診斷測試開發。具體目標係：1) 確立候選PRRS疫苗毒株；2) 在候選疫苗病毒中鑑別獨特標記物區域並開發用於區分接種動物與受野生型病毒感染之動物之鑑別診斷試劑及測試；及3) 進行候選疫苗之安全性及效能之活體內評估並評估伴隨式診斷分析之鑑別能力。 已產生9種候選疫苗病毒。下文呈現該等候選病毒之詳細表徵。 首先藉由在豬肺泡巨噬細胞(自常規養育之3至9週齡豬之肺獲得)中生長來分離病毒。將肺切除，並用磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.2)洗滌三或四次。將細胞在4℃下在800 ×下離心10 min。傾析出上清液，並將細胞在磷酸鹽緩衝鹽水中洗滌並再沈澱兩次。將細胞重新懸浮於補充有10%輻照胎牛血清及適當含量之抗生素之RPMI 1640培養基中。將巨噬細胞以10⁶ 細胞/ml接種至24孔板並容許黏附7 h。傾析出非黏附細胞，並用10%胎牛血清及RPMI培養基將孔重新填充。使用藉由RT-PCR證實為PRRSV陽性之野外豬血清樣品在巨噬細胞培養72 h後接種巨噬細胞。在接種後48 h，藉由使用針對PRRSV核衣殼蛋白之單株抗體(mAb)之直接螢光抗體測試證實感染。 然後將每一病毒分離株進行噬菌斑純化。利用病毒以0.1之感染複數(MOI)感染鋪滿之細胞單層。2 h後，去除細胞培養上清液並施加瓊脂覆層。在37℃下5天後檢測噬菌斑。挑取至少10個來自每一病毒分離株之單一噬菌斑並在培養細胞中進行擴增。 藉由用經噬菌斑純化之病毒以0.1之MOI感染細胞進行病毒之隨後傳代。3天後，將培養上清液鋪在0.5 M蔗糖墊上並在100,000 ×g 下離心14 h。用PBS洗滌病毒沈澱物並可儲存在-80℃下。 為測定每一病毒分離株之基因體序列，使用QiaAmp病毒RNA套組(Qiagen)自蔗糖墊純化之病毒提取RNA。使用普渡大學基因體定序核心實驗室(Purdue University Genomic Core Facility)之次世代定序測定全長基因體序列。 使用CLUSTAL W多序列比對程式比對核苷酸序列。使用可自Center for Evolutionary Medicine and Informatics (Tempe, AZ, USA)獲得之分子演化遺傳分析(MEGA4)軟體對所得距離矩陣進行鄰接距離分析。利用NJBOOT自5000次重複實施引導選項以評估系統發生樹之內部分支之穩健性。 評估總共32株PRRSV野外分離株作為疫苗候選者之潛力。初始，已對病毒之最高度可變區中之三者(nsp1、nsp2及ORF5)進行定序用於系統發生分析。圖1-3顯示藉由鄰接方法基於nsp1、nsp2卵巢腫瘤(OTU)結構域或ORF5之序列之構築之系統發生樹之結果。選擇代表系統發生樹中之每一主要簇之9種分離株(以框突出顯示)用於進一步表徵。在所有三個系統發生樹中，分離株ND99-14及ND99-17位於來自含有現有市售PRRSV疫苗毒株之進化枝之單獨進化枝中。該兩種病毒亦具有刺激干擾素(IFN)-α產生之能力(參見圖4)。分離株SD95-10及SD95-47歸群於與VR2332及自VR2332衍生之INGELVAC® PRRS MLV毒株之相同進化枝中。分離株12-7455及SD11-21代表更近期的野外毒株之進化枝。在nsp1及nsp2 OTU結構域系統發生樹中，SD04-89及SD98-163與中國高致病性毒株JX143及自JA142毒株衍生之INGELVAC® PRRS ATP毒株一起歸群於進化枝中。在ORF5及nsp2 OTU結構域系統發生樹中，MN05-68與JX143及INGELVAC® PRRS ATP毒株一起歸群於進化枝中。 疫苗開發之標準之一係候選病毒應具有刺激宿主免疫反應之能力。先前研究已顯示PRRSV阻抑宿主細胞先天免疫反應，且nsp2係阻抑干擾素(IFN)及干擾素刺激基因(ISG)之表現之先天拮抗劑之一。為評估病毒株是否可誘導干擾素α (IFN-α)，用不同野外分離株感染(MOI為1)或模擬感染豬巨噬細胞。在感染後24小時，收穫細胞培養上清液，使用如先前所述(Lawson等人，Vaccine 28: 5356-64 (2010))之螢光微球免疫分析用於量化IFN-α表現。使用平均螢光強度值測定IFN-α之量，並將結果與來自模擬感染之對照細胞之平均值進行比較。 已進行活體外去ISG化分析以選擇具有較弱之阻抑ISG表現之能力之病毒。如先前所述進行去ISG化分析(Sun等人，J. Virolog y 86(7): 3839-50 (2012))。簡言之，用表現偶聯酶E1/E2/E3、帶FLAG標籤之ISG15及PRRSV PLP2 (aa386-578)之質體DNA共轉染HeLa細胞。包括空載體質體作為對照。在轉染後6 h，用1,000 U/ml之IFN-α刺激細胞。在刺激後24 h收穫細胞並藉由免疫印漬進行分析。用抗FLAG抗體探測膜以檢測遊離及偶聯形式之ISG15之表現。使用nsp2特異性單株抗體檢測PRRSV PLP2之表現。如圖5中所顯示，分離株SD95-10及SD11-21對於細胞蛋白質之ISG化具有較小影響，此表明該兩種分離株將具有用於未來疫苗開發之潛力。進一步測試病毒刺激IFN-α表現之能力。先前記錄SD04-30及MO04-25能夠增強IFN-α產生。使用該兩種分離株作為對照，在受PRRSV感染之豬肺泡巨噬細胞中量測IFN-α表現含量。如預期，SD04-30及MO04-25刺激大量IFN-α表現(圖4)。相比之下，分離株SD95-10、ND99-17、SD06-21及SD92-18刺激IFN-α之含量與SD04-30及MO04-25相配。分離株MN91-45、ND99-14及NE06-05顯示較弱之IFN-α表現之刺激。 基於免疫分析結果及系統發生分析，首先選擇9種2型分離株用於在培養之非豬細胞中連續傳代80代。除該9種2型病毒以外，進一步分析中亦包括SD03-15 (1型毒株)、SD02-11 (1型毒株)及SD02-10 (1型及2型病毒之混合物)。選擇總計9種第80代(P80)病毒用於在細胞培養物中進行兩次噬菌斑純化，並藉助蔗糖墊將第82代(P82)病毒進一步純化並作為病毒原液儲存。在每一候選疫苗病毒之傳代期間測定病毒效價，該等效價在4.5-7 log螢光灶單位(FFU)/ml之間之範圍內。進一步研究不包括效價低於5 log FFU/ml之病毒分離株。11種候選病毒分離株之全長基因體序列最初於2013年2月11日測定，並將藉由噬菌斑純化及蔗糖墊純化之9種候選疫苗病毒(P83)之終產物再次定序並記錄於2013年12月22日。 將9種處於第83代(P83)之PRRS病毒分離株之cDNA共有序列寄存於基因庫(GenBank)基因序列資料庫中，該基因序列資料庫係所有可公開獲得之核酸序列之注釋集合。基因庫資料庫由國家生物技術資訊中心(NCBI)維護，NCBI係美國國立衛生研究院(United States National Institutes of Health，NIH)之一部分。基因庫係國際協作核苷酸序列資料庫(International Nucleotide Sequence Database Collaboration)之一部分。 處於P83之PRRS毒株SD 95-10之cDNA共有序列已分配基因庫登錄號KU131565 (SEQ. ID. NO:1)。指定為SEQ. ID. NO:1之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GGTGTTGGCT CTATGCCATG ACATTTGTAT AGTCAGGAGC TGCGACCATT 61 GGTACAGCCC AAAACTTGCT GCACGGAAAC GCCCTTCCGT GACAGCCCTC TTCAGGGGAG 121 TTTAGGGGTC TATCCCTAGC ACCTTGCTTC CGGAGTTGCA CTGCTTTACG GTCTCTCCAA 181 CCCTTTAACC ATGTCTGGGA TACTTGATCG GTGCACGTGT ACCCCCAATG CCAGGGTGTT 241 CATGGCGGAG GGCCAAGTCT ACTGCACACG ATGTCTCAGT GCACGGTCTC TCCTTCCTCT 301 GAATCTCCAA GTTCCCGAGC TTGGAGTGCT GGGCCTATTT TACAGGCCCG AAGAGCCGCT 361 CCGGTGGACG TTGCCACGTG CATTCCCCAC TGTCGAGTGC TCCCCCGCCG GGGCTTGCTG 421 GCTTTCTGCG ATCTTCCCAA TTGCACGAAT GACCAGTGGA AACCTGAACT TTCAACAAAG 481 AATGGTGCGG GTCGCTGCCG AGATTTACAG AGCCGGCCAG CTCACCCCTG CAGTCTTGAA 541 GGCTCTACAA GTTTATGAAC GGGGTTGCCG CTGGTACCCC ATTGTCGGAC CTGTCCCTGG 601 AGTGGCCGTT TTCGCCAACT CCCTACATGT GAGTGACAAA CCTTTTCCGG GAGCAACTCA 661 TGTGTTAACC AATCTACCGC TCCCGCAGAG GCCCAAGCCT GAAGACTTTT GCCCTTTTGA 721 GTGTGCTATG GCTGACATCT ATGACATCGG TCATGACGCC GTCATGTATG TGGCCGGAGA 781 GAAAGTCTCC TGGGCCCCTC GTGGCGGGGA TGAAGTGAAA TTTGAAAATG TTCCCAAGGA 841 GTTGAAGTTG ATTGCGAACC GACTCCACAT CTCCTTCCCG CCCCACCACG TAGTGGACAT 901 GTCCAAGTTT ACCTTCATAG CCCCCGGGAG TGGTGTCTCC ATGCGGGTTG AGTGCCAACA 961 CGGCTGCCTC CCCGCTGATA CTGTTCCTGA AGGAAACTGC TGGTGGCGCT TGTTCGACTC 1021 GCTCCCGCCG GAAGTCCAGC ACAAAGAAAT TCGCTATGCT AACCAATTTG GTTATCAAAC 1081 CAAGCATGGT GTCTCTGGCA AGTACCTACA GCGGAGGCTG CAAGTTAACG GTCTCCGAGC 1141 AGTGACCGAC GTACATGGAC CTATCGTCAT ACAGTACTTC TCTGTTAAGG AGAGTTGGAT 1201 CCGCCACTTC AGGCTGGCGG AAGAACCTAG CCTCCCTGGG TTCGAAGACC TCCTCAGAAT 1261 TAGGGTTGAG CCCAATACAT CACCACTGGC TGGCGAGGAT GGGAAGATCT TCCGGTTTGG 1321 CAGTCACAAG TGGTACGGTG CTGGAAGGAG AGCAAGGAAA GCACGTTCTG GTGCGACCAC 1381 CATGGTCGCT CATCGCGCTT TGTCCGCTCG TGAAACCCAG CAGGCAAAGA AGGACGAGGG 1441 TGCCGACGCT AACAAGGCTG AGCATCTCAA GCACTACTCT CCGCCCGCCG AAGGGAACTG 1501 TGGTTGGCAC TGTATTTCCG CCATCGCCAA CCGGATGATA AATTCCAAAT TTGAAACTAC 1561 CCTTCCCGAA AGAGTAAGGC CTCTGGATGA CTGGGCTACT GACGAGGATC TTGTGAATAC 1621 CATCCAAATC CTCAGGCTCC CCGCGGCCTT GGATAGGAAC GGTGCTTGTA GTAGCGCCAA 1681 GTACGTGCTT AAGCTGGAAG GTGTGCATTG GACTGTCTCT GTGACCCCTG GGATGTCCCC 1741 TTCCTTGCTC CCCCTTGAAT GTGTTCAGGG CTGTTGCGAG CATAAGGGCG GTTTTGGCTC 1801 CCCAGATGCG GTCGAAGTTT CCGGATTTGA CCCTGCCTGC CTTGACCGAC TGGCTGAGGT 1861 AATGCACTTG CCTAGCAGTG CCATCCCAGC CGCTCTGGCC GAAATGTCCG GCGACTCCAA 1921 TCGTCCGGCT TCCCCGGTCA ACACTGTGTG GACTGTTTCG CAATTCTATG CCCGTCATAC 1981 AGGAGGAAAT CATCCTGACC AGGTGTGCTT AGAGCAGATC ATTAATCTCT GTCAGGTTAT 2041 TGAGGTTTGT TGCTGCCATC AAAACAAAAC CAACCGGGCC ACCCCGGAAG AGGTCGCGGC 2101 AAAGATTGAT CAGTACCTCC GTGGTGCAAC AAATCTTGAA GAATGCTTGA CCAGGCTTGA 2161 GAGGGTTTGC CCGCCGAGCG CTGCGGACAC CTCCTTTGAT TGGAATGTTG TGCTCCCTGG 2221 GGTTGAGGCT GCAACTCAGA CAACCAAACA GCCCCACGTC AACCAGTGCT GCGCTCTGGT 2281 TCCTGTCGTG ACTCAAGAGC CTTTGGACAA AGACTCGGTC CCTCTGACCG CCTTCTCGCT 2341 GTCCAATTGC TACTACCCTG CACAAGGTGA AGAGGTTCGT CACCGTGAGA GACTAAACTC 2401 CGTACTCTCG AAGTTGGAGG GGGCTGTTCG TGAGGAATAT GGGCTCACGC CAACTGAACC 2461 TGGCCTGCAA CCCGCACTAC CGAACGGGCT CGACGAACTT AAAGACCGGA TGGAGGAGGA 2521 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TCTTGCCATT CTTGGCAGGT TACTGGGCGG GGCACGCTAC ATCTGGCATT TTTTGCTTAG 4261 GCTTGGCATT GTTGCAGATT GTGTCTTGGC TGGAGCTTAT GTGCTTTCTC AAGGTAGGTG 4321 TAAAAAGTGC TGGGGATCTT GTATAAGAAC TGCTCCTAAT GAAATCGCCT TCAACGTGTT 4381 CCCTTTCACG CGTGCGACCA GGTCGTCACT CATCGACCTG TGCGACCGGT TTCGTGCGCC 4441 AAAAGGCATG GACCCTGTTT TCCTCGCTAC TGGGTGGCGC GGGTGCTGGA CCGGTCAAAG 4501 TCCCATTGAG CAACCCTCTG AAAAACCCAT CGCGTTCGCC CAGTTGGATG AAAAGAGGAT 4561 CACGGCTAGA ACTGTGGTCG CTCAGCCTTA TGATCCTAAC CAAGCCGTAA AGTGCTTGCG 4621 GGTGCTACAG GCGGGTGGGG CGATGGTGGC CGAGGCAGTC CCAAAAGTGG TCAAGGTTTC 4681 CGCTATTCCA TTCCGAGCCC CCTTTTTTCC CACCGGAGTG AAGGTTGATC CTGAGTGCAG 4741 GATCGTGGTC GACCCCGACA CTTTTACTAC AGCTCTCCGG TCTGGTTACT CCACCACAAA 4801 CCTCGTCCTT GGTGTGGGGG ACTTTGCCCA ATTGAATGGA TTGAAAATCA GGCAAATTTC 4861 CAAGCCTTCG GGAGGAGGCC CACACCTCAT TGCTGCCCTGCATGTTGCGT GCTCTATGGC 4921 GTTGCACATG CTTGCTGGGG TTTATGTAAC TGCAGTGGGG TCTTGCGGTA CCGGCACCAA 4981 CGATCCGTGG TGCACTAACC CATTCGCCGT CCCTGGCTAC GGACCTGGCT CTCTCTGCAC 5041 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ID. NO:2)。指定為SEQ. ID. NO:2之cDNA共有序列係： 1 TATGTACGTA TAGGTGTTGG CTCTATGCCT TTGGCATTTG TATTGTCAGG AGCTGTGACC 61 ATTGGCACAG CCCAAAACTT GCTACACAGA AACACCCTTC TGTGATAGCC TCCTTCAGGG 121 GAGCTTAGGG TTTGTCCCTA GCACCTTGCT TCCGGAGTTG CACTGCTTTA CGGTCTCTCC 181 ACCCCTTTAA CCATGTCTGG GATACTTGAT CGGTGCACGT GTACCCCCAA TGCCAGGGTG 241 TTTATGGCGG AGGGCCAAGT CTACTGCACA CGATGCCTCA GTGCACGGTC TCTCCTTCCC 301 CTGAACCTCC AAGTTTCTGA GCTCGGGGTG CTAGGCCTAT TCTACAGGCC CGAAGAGCCA 361 CTCCGGTGGA CGTTGCCACG TGCATTCCCC ACTGTTGAGT GCTCCCCCGC CGGGGCCTGC 421 TGGCTTTCTG CAATCTTTCC AATCGCACGA ATGACCAGTG GAAACCTGAA CTTCCAACAA 481 AGAATGGTAC GGGTCGCAGC TGAGCTTTAC AGAGCCGGCC AGCTCACCCC TGCAGTCTTG 541 AAGGCTCTAC AAGTTTATGA ACGGGGTTGC CGCTGGTACC CCATTGTTGG ACCTGTCCCT 601 GGAGTGGCCG TTTTCGCCAA TTCCCTACAT GTGAGTGATA AACCTTTCCC GGGAGCAACT 661 CACGTGTTGA CCAACCTGCC GCTCCCGCAG AGACCCAAGC CTGAAGACTT TTGCCCCTTT 721 GAGTGTGCTA TGGCTACTGT CTATGACATT GGTCATGACG CCGTCATGTA TGTGGCCGAA 781 AGGAAAATCT CCTGGGCCCC TCGTGGCGAG GATGAAGTGA AATTTGAAGC TGTCCCCGGG 841 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ID. NO:3)。指定為SEQ. ID. NO: 3之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GGTGTTGGCT CTATGCCACG GCATTTGTAT TGTCAGGAGC TGTGACCATT 61 GGCACAGCCC AAAACTTGCT GCACGGAAAA CGCCCTTCCG TGACAGCCTT CTTCAGGGGA 121 GCTTAGGGGT CTGTCCCTAA CACCTTGCTT CTGGAGTTGC ACTGCTTTAC GGTCTCTCCA 181 ACCCTTTAAC CATGTCTGGG ATACTTGATC GGTGCACGTG CACCCCCAAT GCCAGGGTGT 241 TTATGGCGGA GGGCCAAGTC TACTGCACAC GATGTCTCAG TGCACGGTCT CTCCTTCCTC 301 TGAATCTCCA AGTTTCTGAG CTTGGAGTGC TGGGCCTATT TTATAGGCCC GAAGAGCCAC 361 TCCGGTGGAC GTTGCCACGT GCATACCCCA CTGTCGAGTG CTCCCCCGCC GGGGCCTGCT 421 GGCTTTCTGC GATCTTTCCA ATTGCACGAA TGACCAGTGG GAACCTGAAC TTTCAACAAA 481 GAATGGTGCG GGTCGCAGCT GAGATTTACA GAGTCGGTCA GCTCACCCCC ACAGTCTTGA 541 AGAATCTACA AGTTTATGAA CGGGGTTGCC GCTGGTACCC CATTGTCGGA CCTGTCCCTG 601 GAGTGGCCGT TTTCGCCAAT TCCCTACATG TGAGTGACAA ACCTTTTCCG GGAGCAACTC 661 ATGTGTTAAC TAATCTACCG CTCCCGCAGA GGCCCAAGCC TGAAGACTTT TGTCCTTTTG 721 AGTGTGCTAT GGCTGACATC TATGACATTG GTCATGACGC CGTCATGTAT GTGGCCGGAG 781 GGAAAGTCTC CTGGGCCCCT CGTGGCGGGG ATGAAGGGAA ATTTGAAACT GTCCCCGAGG 841 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ID. NO:8)。指定為SEQ. ID. NO:8之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GGTGTTGGCT CTATGCCGTG ACATTTGTAT AGTCAGGAGC TGCGACCATT 61 GGTACAGCCC AAAACTTGCT GCACGGGAAC GCCCTTCCGT GACAGCCTTC TTCAGGGGAG 121 TTTAGGGATC TATCCCTAGC ACCTTGCTTC CGGAGTTGCA CTGCTTTACG GTCTCTCCAA 181 CCCTTTAACC ATGTCTGGGA TACTTGATCG GTGCACGTGC ACCCCCAATG CCAGGGTGTT 241 TATGGCGGAG GGCCAAGTCT ACTGCACACG ATGTCTCAGT GCACGGTCTC TCCTTCCTCT 301 GAATCTCCAA GTCCCTGAGC TTGGGGTGCT GGGCCTATTT TACAGGCCCG AAGAGCCACT 361 CCGGTGGACA TTGCCGCGTG CATTCCCCAC TGTCGAGTGC TCCCCCGCCG GGGCCTGCTG 421 GCTTTCTGCG ATCTTCCCAA TTGCACGAAT GACCAGTGGA AACCTGAACT TTCAACAAAG 481 AATGGTGCGG GTCGCAGCTG AGATTTACAG AGCCGGTCAG CTCACTCCCA CAGTCTTGAA 541 GAATCTACAA GTTTATGAGC GGGGTTGCCG TTGGTACCCT ATTGTCGGGC CTGTCCCCGG 601 AGTGGCCGTT TACGCCAACT CCCTACATGT GAGTGACAAA CCCTTTCCGG GAGCAACTCA 661 TGTGTTAACT AATCTACCGC TCCCGCAGAG GCCCAAGCTT GAAGATTTTT GCCCCTTTGA 721 GTGTGCTATG GCTGACGTCT ATGATATCGG TCATGACGCC GTCATGTACG TGGCCAAAGG 781 GAAAGTCTCC TGGGCTCCTC GTGGTGGGGA CAAGACAAAA TTTGAAACTG TCCCTAGGGA 841 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ID. NO:9)。指定為SEQ. ID. NO:9之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GGTGTTTGCT TTATGCCGCG GCATTTGTAT TGTCAGGAGC TGTGACCACT 61 GGCACAGCCC GAAACTTGCT GCACAGAAAC ACCCTTCTGT GACAGCCTCC TTCAGGGGAG 121 TTTAGGGGTT TCTCCCTAAC GCCCTGCTTC CGGAGTTGCA CTGCTTTACG GTCTCTCCAT 181 CCTTTTAACC ATGTCTGGGA TTCTTGATCG GTGCACGTGC ACCCCCAATG CCAGGGTGTT 241 TGTGGCAGAG GGCCAAGTCT ACTGCACACG ATGTCTCAGT GCACGGTCCC TCCTTCCCCT 301 AAATCTCCAA GTTTCTGAGC TTGGGGTACT TGGTTTATTC TACAGGCCCG AAGAGCCATT 361 ACGGTGGACG TTGCCACACG CATTCCCCAC TGTCGAGTGT GCTCCTGCTG GCGCTTGTTG 421 GCTTTCTGCA ATTTTTCCAA TTGCGCGAAT GACCAGTGGA AACCTGAATT TCCAGCAAAG 481 GCTGGTACGT GTCGCAGCCG AGCTTTACAG AGCCGGCCAG CTCACCCCTA CAAGCCTGAA 541 AACCTTACAG GTCTATGAAA GGGGTTGCCG TTGGTACCCC ATTGTTGGAC CTGTTCCTGG 601 AGTGGCCGTT TACGCCAACT CCCTACATGT GAGTGACAAA CCCTTCCCAG GAGCGACTCA 661 CGTGCTGACC AACTTACCAC TCCCGCAGAG ACCAAAATCT GAAGATTTCT GCCCCTTCGA 721 GTGCGCCACG GCCGCCGTCT ATGACATCGG CCATGACGCC GTCATGTATG TAACCGAGGA 781 AAAGGTTTCC TGGGCTCCTC GTGGCGGGGA TAAAGGGAAA TTTGAGACTG TTCCTGAGGG 841 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CTAGGGTTCT TGGTTCCACC TGGCCTTTCC 12601 AGCGAGGGCC ACTTGACCAG TGTTTACGCC TGGCTGGCGT TCTTGTCTTT CAGCTACACA 12661 GCCCAGTTCC ACCCCGAGAT ATTTGGAATA GGGAATGTGA GTAGAGTTTA TGTTGACGTC 12721 ACTCACCAAC TCATCTGCGC CGAACACGAC GGGCAGAACA CCACCCTGCG TCGCCATGAC 12781 AATATCTCAG CCGTGTTTCA GACCTATTAC CAACATCAGG TCGATGGCGG CAATTGGTTT 12841 CACCTAGAAT GGCTGCGTCC CTTCTTTTCC TCTTGGCTGG TTTTGAATGT CTCGTGGTTT 12901 CTCAGGCGTT CGCCTGCAAA CCGTGTTTCA GTTCGAGTCT TTCAGACATC AAAACCAACA 12961 CCACCGCAGC TGCAGGCTTT GCTGTCCTCC AAGACATCAG CTGTCTTAGG CATGGCTACT 13021 CGTCCATTGA GGCGATTCGC AAAAGCCGTC AATGCCGCAC GGCGATAGGA ACGCCCGTGT 13081 ACATCACTGT CACGGCCAAT GTAACAGATG AGAATTACTT GCATTCCTCT GATCTCCTCA 13141 TGCTTTCCTC TTGCCTCTTC TATGCTTCTG AGATGAGTGA AAAGGGATTC AATGTGGTCT 13201 TCGGCAACGT GTCAGGCATT GTGGCTGTGT GTGTCAACTT TACCAGCTAT GTCCAACATG 13261 TTAAGGAGTT TACTCAGCGC TCTTTGGTGG TCGACCACGT GCGACTGCTT CATTTCATGA 13321 CACCTGCGAC CATGAGGTGG GCAACAGTTT TAGCCTGTCT TTTCGCCATC TTGTTGGCGA 13381 TTTGAATGTT TAAGTATGTT 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GGGGGTGTAC TCAGCCATAG AAACCTGGAA ATTCATCACT TCCAGATGCC 14281 GTTTGTGCTT GCTAGGCCGC AGGTACATTC TGGCCCCTGC CCACCACGTT GAAAGTGCCG 14341 CGGGCTTTCA TCCGATTGCG GCAAGTGATA ACCACGCATT TGTCGTCCGG CGTCCCGGCT 14401 CCACTACTGT TAACGGCACA TTGGTGCCCG GGTTGAAAAG CCTCGTGTTG GGTGGCAGAA 14461 AAGCTGTTAA GCGGGGAGTG GTAAACCTCG TTAAATATGC CAAATAACAA CGGCAGGCAG 14521 CAAAAAAATA AGAAGGGGAG TGGCCAGCCA GTCAATCAGC TGTGCCAAAT GCTGGGCAAG 14581 ATCATCGCCC AGCAAAATCA GTCCAGAGGC AAGGGACCGG GTAAGAAAAA TAAGAAGAGA 14641 AACCCGGAGA AGCCCCATTT TCCTCTTGCG ACCGAAGATG ACGTCAGGCA TCACTTCACC 14701 CCCAGTGAAC GGCAATTGTG TCTGTCGTCG ATCCAGACTG CCTTCAACCA GGGCGCTGGA 14761 ACTTGCACCC TGTCAGATTC AGGGAGGATA AGTTACACTG TGGAGTTTAG TTTGCCGACG 14821 CACCACACTG TGCGCCTTAT TCGCGCCACA GCATCACCTC CATCGTGATG GGCTTACATT 14881 CTTGGAGCTC CTCAGTTTCA CAATTGGAAG AATGTGTGGT GAATGGCACT GATTGGCACT 14941 GTGCCTCTAA GTCACCTATT CAATTAGGGC GACCGTGTGG GGGTAGAGTT TAATTGGCGA 15001 GAACCATACG GCCGAAATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 熟習此項技術者將認識到，每一基因體共有序列之聚腺苷尾可在長度上與上文所報告之序列不同。 實例2 本研究之目的係評估在生長期豬中用毒性PRRS病毒異源攻毒後實驗性PRRSV疫苗之效能。測試疫苗之效能係基於與未接種對照相比疫苗減少肺損傷及病毒血症之有效性。本研究之設計於表1中給出。 表1. 研究設計。

¹ 螢光灶單位(FFU)。² 安慰劑對照動物接受磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。³ IM =肌內。 攻毒前階段係自到達研究地點之日(第-1天)直至攻毒之日(第35天)。在第0天、第14天、第28天及第35天採集血液樣品用於使用螢光灶中和(FFN)測試之PRRSV血清抗體測定。在第0天及第35天採集血液樣品用於測定PRRSV病毒血症。在第0天及第35天採集鼻拭子以評估病毒負荷。在第0天及在第35天攻毒之前進行體重量測(lbs)。 在第35天，使用3 mL非魯爾(luer)鎖注射器鼻內遞送2 mL劑量，每個鼻孔大約1 mL。攻毒後階段係自第35天至第49天。在第35-49天針對抑鬱、身體條件及呼吸窘迫個別地評估所有豬並對每一臨床徵象進行評分。在第42天及第49天採集血液樣品用於PRRSV血清抗體測定(FFN)。在第38天、第42天、第45天及第49天採集血液樣品用於測定PRRSV病毒血症。在第38天、第42天、第45天及第49天採集鼻拭子以評估病毒負荷。在第49天屍體剖檢時獲得體重量測值。在第49天，根據現場標準操作程序對動物進行人道安樂死，並由對治療不知情之研究調查者對肺進行評分。肉眼並觸診檢查7個肺葉中之每一者由PRRSV所致之肉眼可見特徵性損傷。每一肺葉中損傷/實變之量評分為肺葉之0%與100%之間之實際值。將每一肺葉之評分輸入加權公式中以計算具有損傷之肺之百分比。 利用96隻大約3週齡之斷乳雜交母豬及閹公豬用於本研究，該等豬對PRRSV為血清陰性並評估為健康良好。在到達研究地點後，將所選擇之研究動物隨機分配至治療組(T01-T09)及研究畜欄。在到達後，將所有滿足以下納入準則之候選動物納入本研究中且將不滿足準則之彼等排除：1) 藉由在第0天之血清中和測試(FFN)對於PRRSV為血清陰性；及2) 基於在第0天進行之體檢臨床評估為健康良好之動物。 在到達研究地點後，按治療組將豬容納在5個BSL-2環境控制之阻隔室中。每一阻隔室含有5個畜欄，每個畜欄能夠容納5隻豬。在每一接種室內，兩個治療組由塑膠薄片障壁分開且各組不共享相同空間。在室內將接種組分開之兩個區域之間嚴格維持生物安全性。豬隨時自由地進食適當生產之標準豬生長日糧(NRC, 2012)。豬隨時自由地獲得清潔飲用水。 自到達研究地點之時間起每天進行一次一般健康觀察，直至攻毒前一天為止(第-1天直至第34天)。在第35-49天針對抑鬱、身體條件及呼吸窘迫對所有豬個別地進行評估，並對如在評分系統中所定義之每一臨床徵象進行評分。 將在第35天之前出現臨床上嚴重併發疾病之動物自研究移除。在排除之前自豬收集之所有數據不納入數據分析。在第35天攻毒之後，若可能，將發現死亡或在瀕死時處死之任何豬進行屍體剖檢以確定死亡原因。由於在同一畜欄(T08)中死亡可歸因於豬鏈球菌(S. suis )及確診疾病，故視需要向個別研究動物投與EXCEDE®抗生素(Zoetis Animal Health)且在第30天向所有動物投與。 將所有候選PRRSV毒株在MARC-145細胞上傳代83次。測定八(8)種疫苗之每一者之效價，如表I中所顯示。在Benchmark生物實驗室(Lincoln, Nebraska)成功地根據USDA 9 C.F.R.要求完成無菌測試。疫苗包含於醫藥上可接受之賦形劑(即生理鹽水)中之PRRSV。 在即將使用之前，在室溫下將三個1 mL儲備小瓶之PRRSV NADC-20攻毒毒株解凍並於無菌容器中將3 mL原液添加至297 mL之來自Mediatech, Inc.之具有厄爾鹽(Earle’s salt)及L-麩醯胺酸之最低必需伊格爾培養基(Minimum Essential Medium Eagle) (MEM)。手工混合接種物(由病毒原液及培養基組成)並在向動物投與期間保留在濕冰上。在攻毒之前，將五(5) mL之攻毒接種物直接等分至無菌容器中以提交至診斷實驗室用於效價測定。效價結果為10^2.75 TCID₅₀ /mL。 動物為實驗單元。使用α = 0.05之雙側測試評估組間差異。 根據下式計算具有損傷之總肺之百分比： 具有損傷之總肺之百分比= {(0.10 ×左側頂葉) + (0.10 ×左側心葉) + (0.25 ×左側膈葉) + (0.10 ×右側頂葉) + (0.10 ×右側心葉) + (0.25 ×右側膈葉) + (0.10 ×中葉)}。 藉由計算每一安慰劑/接種對之緩和分率及相關95%信賴區間(MF; CI; SAS®軟體中之FREQ程序, SAS Institute, Cary NC)來評估接種對總肺損傷之百分比之影響。另外，在進一步分析之前，使用反正弦平方根轉換具有損傷之總肺之百分比。藉由包括治療之固定效應(SAS®軟體中之MIXED程序)作為唯一因子之混合線性模型分析轉換數據。若治療效應統計學上顯著，則使用線性對比及未調整之α = 0.05進行安慰劑與接種組間之逐對比較。若在與對照比較時接種豬顯示肺損傷評分顯著降低，則疫苗符合測試。 使用適於重複量測之方法以評估在假定正態分佈下接種對病毒血症值之效應(SAS®軟體中之MIXED程序，SAS Institute, Cary NC)。在分析之前轉換數據以穩定殘差。統計模型包括治療、時間及治療與時間交互作用作為固定效應。若治療與時間交互作用顯著，則評估疫苗在彼時間內治療之效應。將彼時間內之接種動物與未接種動物之間進行比較。若交互作用不顯著，則評估治療之主要效應。在接種動物與未接種動物之間進行比較。適當呈現最小均方平均值、標準誤差、平均值之95%信賴區間及範圍。 使用適於連續或二項式數據之重複量測之方法以評估在假定正態/二項式分佈下接種對血清抗體及鼻拭子值之效應(SAS®軟體中之MIXED或GLIMMIX程序，SAS Institute, Cary NC)。在分析之前轉換數據以穩定化殘差。統計模型包括治療、時間及治療與時間交互作用作為固定效應。若治療與時間交互作用顯著，則評估彼時間內治療之效應。將彼時間內之接種動物與未接種動物之間進行比較。若交互作用不顯著，則評估治療之主要效應。在接種動物與未接種動物之間進行比較。適當呈現最小均方平均值、標準誤差、平均值之95%信賴區間及範圍。 使用適於重複量測之ANCOVA (MIXED程序)對體重(第35及第49天)、抑鬱評分、呼吸評分及身體條件評分(第35-49天)進行統計學分析。若適當，則將第0天之值包括為共變量。將治療組、時間及組與時間交互作用納入模型中作為固定效應。若交互作用項顯著，則使用未調整之α = 0.05藉由將每一接種組與對照進行比較來評估彼時間內之群組效應。若交互作用不顯著，則評估組之主要效應，且若顯著，則使用未調整之α = 0.05藉由將每一接種組與對照進行比較來評估組效應。由於在研究期間僅有一例死亡，因此不評估死亡率。 對照組中之肺侵犯平均百分比為37.9% (表2)，此與使用2型毒株NADC-20針對此PRRSV攻毒模型之預期病理學(範圍為30%至50%，L. Kesl，Veterinary Resources, Inc., 個人通信)一致。可得出結論，PRRS病毒攻毒足以評估疫苗毒株候選者。 平均肺損傷評分呈現於表2中。除了含有PRRSV EU樣(即1型PRRSV)毒株SD 03-15之疫苗以外，所有實驗性疫苗與對照組相比降低(P＜0.05)肺損傷。值得注意地，毒株SD 95-10、SD 11-21及ND 99-14誘導高度保護，使得肺侵犯極低(分別2.7%、1.0%及1.6%)。毒株SD 95-47及MN 05-68亦表現良好，而毒株SD 04-89及SD 02-10可接受。每一疫苗對對照組之緩和分率顯示於表3中。該等結果指示，與對照組中之豬相比，接種減毒PRRSV毒株SD 95-10 (T04)、SD 11-21 (T05)及ND 99-14 (T08)之豬具有至少90%之機率具有較不嚴重之肺損傷。 表2. 平均肺損傷評分。

¹ 未轉換之平均值。² 逆轉換平均值。 *相對於T01，顯著性差異，P ＜ 0.05。 表3. 肺損傷評分。

¹ 緩和分率意指接種者(T02-T09)之肺損傷嚴重度將小於未接種者(T01)之肺損傷之機率之相對增加。 來自鼻分泌物之由qtRT-PCR枚舉之PRRSV之幾何平均值呈現於表4中，作為病毒剝落之指示。除了接種毒株SD 02-10之豬以外，在第35天在所有接種組之鼻拭子中均檢測到疫苗病毒。接種毒株SD 03-15、SD 95-10及SD 95-47之豬之基因體拷貝/mL在統計學上大於對照組之豬(P＜0.05)，其平均值分別為277個、337個及7個基因體拷貝/mL。在第35天攻毒後，所有組在第38天、第42天、第45天及第49天(分別在攻毒後3天、7天、10天及14天(DPC))剝落一些病毒。接種毒株SD 95-10、SD 95-47及ND 99-14之豬在攻毒後所有時間點之剝落程度均低於對照(P＜0.05)。至10及14 DPC，除了毒株SD 04-89及SD 03-15以外，與對照相比，所有疫苗毒株均誘導剝落降低(P＜0.05)。 表4. 鼻拭子中PRRSV基因體拷貝/mL之幾何平均值。

*在當天內相對於T01，顯著性差異，P ＜ 0.05。 來自血清之藉由qtRT-PCR枚舉之PRRSV之幾何平均值(基因體拷貝/mL)呈現於表5中。在第35天所有接種組具有可歸因於接種之一些可量測病毒血症，但接種SD 04-89及SD 11-21之組之程度與對照無統計學差異(P ＞0.05)，該等為陰性。在第35天攻毒後，所有組在3、7、10及14 DPC具有病毒血症。接種毒株SD 95-10及ND 99-14之豬在攻毒後所有時間點之病毒血症之程度均低於對照(P ＜ 0.05)。除了毒株SD 04-89及SD 03-15以外，直至10及14 DPC，與對照相比，所有疫苗毒株均誘導病毒血症降低(P ＜ 0.05)。 表5. 血清中PRRSV基因體拷貝/mL之幾何平均值。

*在當天內相對於T01，顯著性差異，P ＜ 0.05。 藉由量測幾何平均螢光灶中和(FFN)效價測定血清轉化，如表6中所顯示。對照動物保持血清陰性直至第35天(攻毒日)，至第42天(7 DPC)開始血清轉化且至第49天(14 DPC)已發生血清轉化。除了SD 03-15以外，所有接種組至接種後第14天均已發生血清轉化。在第28天、第35天及第42天，所有接種組中之幾何平均效價超過(P＜0.05)對照之幾何平均效價，且在第49天類似於或小於對照之幾何平均效價。接種組中之峰值FFN效價反應發生在第35天及第42天。毒株SD 95-10、SD 11-21、SD 95-47及ND 99-14似乎引發最強之血清學反應。 表6. 螢光灶中和(FFN)效價之幾何平均值。

*在當天內相對於T01，顯著性差異，P ＜ 0.05。 最小均方平均體重包括於表7中。第0天體重在分析中用作共變量。在攻毒之日(第35天)，分別接種毒株SD 03-15、SD 95-10、ND 99-14及MN 05-68之四個組之平均體重低於對照之平均體重(P＜0.05)。所有其他組之平均體重類似於對照組之平均體重(P＞0.05)。在屍體剖檢之日(第49天)即在14 DPC，接種SD 11-21、SD 95-47及ND 99-14毒株之三個組之平均體重超過對照之平均體重(P＜0.05)。所有其他組之體重類似於對照之體重(P＞0.05)。 表7. 最小均方平均體重(lbs)。

*在當天內相對於T01，顯著性差異，P ＜ 0.05。 收集每一動物之總和臨床評分(呼吸+抑鬱+身體條件)之平均值並對每一組進行平均。在攻毒後直至7天，任何組中之臨床徵象均不明顯。在第42天及第43天，在一些疫苗組中臨床徵象明顯，但其平均評分與對照之平均評分無差異(P ＜ 0.05)。自第44天至第49天，除了接種SD 04-89及SD 02-10毒株之組在第44天以外，所有疫苗組之總和評分低於對照(P ＜ 0.05)。 總之，在病毒攻毒模型中已成功評估八種減毒PRRSV疫苗毒株。除了EU樣毒株SD 03-15以外，所有毒株均引發一些保護免於毒性NADC-20 2型PRRSV之攻毒。四種毒株SD 11-21、SD 95-10、SD 95-47及ND 99-14賦予最大保護，如藉由肺損傷及病毒血症之較高降低所展示。 實例3 本研究之目的係評估在生長期豬中用兩種不同毒性PRRSV 2型毒株攻毒後四種實驗性PRRSV疫苗之交叉保護效能。效能係藉由肺損傷及病毒血症之程度來評估。研究係在Veterinary Resources, Inc. (VRI), Cambridge, Iowa之BSL-2實驗室中進行。研究設計呈現於表8中。 表8. 研究設計。

¹ 螢光灶單位(FFU)。² 安慰劑對照動物接受磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 進行健康觀察或採集樣品之研究人員對於治療項目及分配至治療組之豬不知情。利用一百(100)隻大約3週齡之雜交母豬及閹公豬用於本研究，該等豬藉由病毒中和測試(FFN)對PRSSV為血清陰性並評估為健康良好。豬係來自Wilson Prairie View Farms, Burlington, Wisconsin。在第-1天，將豬分配至治療及畜欄，並按治療組容納在呈三個BSL-2阻隔室之畜欄內。在每一室內，藉由空畜欄或通道及堅固畜欄隔離物將四個接種組分開，以防止任何直接接觸及廢物污染至其他畜欄中。豬可以自由攝取含有藥物(CTC/DENAGARD®抗生素)之標準商業起始膳食(NRC, 2012)。豬可以自由取得清潔飲用水。 從抵達研究地點時起，直至攻毒前一天為止(第-3天直至第34天)，每天一次進行一般健康觀察。在第35-49天，對所有豬個別評估抑鬱、身體條件及呼吸窘迫，並對每一臨床徵象進行評分。 在斷乳及裝運至VRI之前，每一隻豬用單一劑量之VITAL E-500 (維生素E)、單一劑量之EXCEDE®抗生素(頭孢噻呋(ceftiofur)結晶，Zoetis Animal Health)治療，並用INGELVAC CIRCOFLEX®疫苗(Boehringer Ingelheim Vetmedica)接種。另外，在第13天或第14天向所有豬投與單一劑量之EXCEDE®抗生素。 將展現臨床疾病或損傷跡象之任何豬自研究移除。相關樣品提交至愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室(Iowa State University Veterinary Diagnostics Laboratory (VDL))用於診斷評估。記錄攻毒後自研究移除動物之日期、原因及處置。統計分析中不包括自研究移除之豬所收集之數據。 所有候選PRRSV毒株均在MARC-145細胞上傳代83次。測定四(4)種疫苗之每一者之效價。在Benchmark生物實驗室(Lincoln, Nebraska)成功地根據USDA 9 CFR要求完成無菌測試。疫苗係如實例2中製備。 在第0天對入選研究中之100隻豬之每一者進行接種。豬在頸部右側以0.5 mL肌內劑量注射其指定之治療。在注射後一小時內，由研究人員檢查每一隻豬之任何不良事件。 接種後階段係自第1天直至第35天。在第-1天、第14天、第28天及第35天採集血液樣品用於使用螢光灶中和(FFN)測試之PRRSV血清抗體測定。對於FFN分析而言，將血清之兩倍稀釋液(1:4至1:512)各自與含有100個灶形成單位(FFU)之測試PRRSV毒株(MN-184)之等體積培養基混合。將混合物在37℃下培育1 h，且然後添加至96孔組織培養板中之MARC-145細胞之鋪滿培養物。約1天之後，將板在80% (v/v)於水中之丙酮中固定，並藉由與螢光異硫氰酸鹽結合(FITC)之抗N-蛋白質單株抗體SDOW17一起培育來檢測受感染細胞(灶)。血清中和FFN效價表示為與血清對照相比使灶形成降低約90%之最高稀釋度之倒數。在第-1天、第14天及第35天採集血液樣品用於測定PRRSV病毒血症。在第-1天、第14天及第35天採集鼻拭子以評估病毒剝落。在第-1天及在第35天攻毒之前，使用經檢定砝碼校準之天平進行體重量測(lb)。 MN-184 PRRSV攻毒毒株(自愛荷華州立大學VDL獲得)係在2001年自明尼蘇達州(Minnesota)南部經歷嚴重繁殖疾病及母豬死亡之豬群分離。KS-11 PRRSV攻毒毒株(自堪薩斯州立大學(Kansas State University) VDL獲得)係在2011年自堪薩斯東北部經歷嚴重繁殖疾病之豬群分離。在第35天，藉由在即將攻毒之前解凍MN-184及KS-11之冷凍等分試樣來製備攻毒材料。攻毒材料呈即用形式，不需要稀釋。將每一接種物(MN-184及KS-11)之樣品提交至ISUVDL用於效價測定。MN-184及KS-11毒株在第0天之效價經測定分別為4.2 × 10⁵ 及6.7 × 10³ TCID₅₀ /ml。使用3 mL非魯爾鎖注射器鼻內遞送2 mL劑量，每個鼻孔大約1 mL。 攻毒後階段係自第35天至第49天。在第35至49天針對抑鬱、身體條件及呼吸窘迫個別地評估所有豬，並對每一臨床徵象進行評分。在此相同時間段期間亦使用校準溫度計記錄直腸溫度(°F)。在第42天及第49天採集血液樣品用於PRRSV中和抗體測定(FFN)。在第38天、第42天、第45天及第49天採集血液樣品用於測定PRRSV病毒血症。在第38天、第42天、第45天及第49天採集評估病毒剝落之鼻拭子。在第49天屍體剖檢時使用經檢定砝碼校準之天平獲得體重量測值(lb)。在第49天，對動物進行人道安樂死並將肺切除，且由對治療不知情之研究調查者進行評分。肉眼並觸診檢查7個肺葉中之每一者由PRRSV所致之肉眼可見特徵性損傷。每一肺葉中損傷/實變之量評分為肺葉之0%與100%之間之實際值。將每一肺葉之評分輸入加權公式中以計算具有損傷之肺之百分比。 根據實例2中給出之公式及程序計算具有損傷之總肺之百分比。 使用適於重複量測之方法(MIXED程序)統計學上分析直腸溫度、抑鬱評分、呼吸評分及身體條件評分(第35天至第49天)。將每一動物一天內之臨床評分進行總和。如上文所述針對個別評分統計學上分析總和評分。 測定以下時期之平均日增重(ADWG)：第-1天至第35天；第-1天至第49天；及第35天至第49天。使用ANOVA (MIXED程序)分析每一時期之平均日增重(ADWG)。治療作為固定效應包括於模型中且包括區塊作為隨機效應。若治療之主要效應顯著，則藉由使用未調整之α = 0.05將每一接種組與對照進行比較來評估治療效應。 在第28天一隻豬(T09)死於疑似豬鏈球菌感染。兩隻豬(一隻來自T03且另一隻來自T09)因與支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica )有關之支氣管肺炎而自研究移除。無不良事件歸因於疫苗。 用MN-184攻毒之對照組中之肺損傷之平均百分比為52.4%，此與此PRRSV攻毒毒株之預期病理學一致。用KS-11攻毒之對照組中之肺損傷之平均百分比為22.5%。此PRRSV毒株先前並未用作攻毒材料，因此預期之肺病理學程度未知。本研究中所達成之程度認為足以評估疫苗候選者。 對於與PRRSV有關疾病之預防，攻毒後肺損傷及病毒血症係主要結果變量。若接種組之平均肺損傷評分及病毒血症程度顯著小於對照組(P ＜ 0.05)，則認為疫苗有效。 平均肺損傷評分(逆轉換平均值)顯示於表9中。當用MN-184攻毒時，與未接種之對照豬相比，所有接種豬之肺損傷顯著更少(P ＜ 0.05)。當與未接種之對照豬相比時，用KS-11毒株攻毒且接種SD 95-10、SD 11-21及ND 99-14毒株之豬之肺損傷顯著更少(P ＜ 0.05)。用MN 05-68毒株接種且用KS-11毒株攻毒之豬之肺損傷與未接種之對照豬類似(P ＞ 0.05)。 藉由自未轉換數據計算緩和分率及相關95%信賴區間來評估接種對肺損傷評分之效應。如表10中所顯示，緩和分率在-0.06至0.98範圍內。對於用MN 05-68毒株接種及用KS-11毒株攻毒之豬，95%信賴區間包括0，此指示接種對肺損傷評分無效應。無論何種攻毒毒株，所有其他疫苗均指示接種對減少肺損傷評分之效應。 表9. 平均肺評分-肺侵犯之百分比。

¹ 未轉換之平均值。² 逆轉換平均值。 *在攻毒毒株內相對於對照，顯著性差異，P ＜ 0.05。 表10. 肺損傷評分。

¹ 緩和分率意指接種者(T02-T05、T07-T10)之肺損傷嚴重度將小於未接種者(T01、T06)之肺損傷之機率之相對增加。 關於鼻剝落數據之分析結果匯總於表11中。與攻毒對照相比，接種組之治療與時間交互作用高度顯著(P ＜ 0.0001)。在第14天，在所有疫苗組中均檢測到疫苗病毒剝落。至第35天，僅在MN-184攻毒室中接種MN 05-68毒株之豬以大於對照豬(P ＜ 0.05)之程度剝落疫苗病毒。 在用MN-184毒株攻毒時，在每一攻毒後時間點(第38天、第42天、第45天及第49天)，接種ND 99-14毒株之豬與對照豬相比剝落降低(P ＜ 0.05)。在第42天、第45天及第49天，接種SD 95-10及MN 05-68毒株之豬與對照豬相比顯示剝落顯著降低(P ＜ 0.05)。與對照豬相比，接種SD 11-21毒株之豬在第38天具有較高之剝落，但在第42天、第45天及第49天剝落較低(P ＜ 0.05)。 在用KS-11毒株攻毒時，在第38天、第42天及第45天，與對照豬相比時，接種SD 95-10及ND 99-14毒株之豬鼻剝落降低(P ＜ 0.05)。在第38天、第42天及第49天，當與對照豬相比時，接種SD 11-21毒株之豬展示顯著更少之鼻剝落。與對照豬相比時，接種MN 05-68毒株之豬在第38天之剝落降低(P ＜ 0.05)，但在第42天、第45天及第49天兩個治療組無差異(P ＞ 0.05)。 表11. 鼻拭子中PRRSV基因體拷貝/mL之幾何平均值。

*在攻毒毒株內相對於對照，顯著性差異，P ＜ 0.05。 關於病毒血症之分析結果匯總於表12中。與攻毒對照相比，接種組之治療與時間交互作用高度顯著(P ＜ 0.0001)。如所預計，由於疫苗病毒之存在，在接種後第14天及第35天，所有接種組與其各別對照組相比具有更高之病毒血症程度(P ＜ 0.05)。 表12. 血清中PRRSV基因體拷貝/mL之幾何平均值。

*在攻毒毒株內相對於對照，顯著性差異，P ＜ 0.05。 在用MN-184毒株攻毒時，在攻毒後每一時間點(第38天、第42天、第45天及第49天)，當與對照組相比時，所有接種組之病毒血症程度較低(P ＜ 0.05)。在用KS-11毒株攻毒時，在攻毒後每一時間點(第38天、第42天、第45天及第49天)，接種SD 95-10及ND 99-14毒株之豬之病毒血症程度較低(P ＜ 0.05)。在第38天、第42天及第49天，當與對照豬相比時，接種MN 05-68毒株之豬之病毒血症程度較低(P ＜ 0.05)，且在第38天及第49天，當與對照豬相比時，接種SD 11-21毒株之豬之病毒血症程度降低(P ＜ 0.05)。 血清學之分析結果匯總於表13中。與攻毒對照相比，接種組之治療與時間交互作用高度顯著(P ＜ 0.0001)。在第-1天接種之前，所有豬均為血清陰性。無論何種攻毒毒株，在接種SD 95-10及ND 99-14毒株之豬中均檢測到病毒中和抗體，該等病毒中和抗體在第28天開始且在整個研究持續時間期間保持存在。在第28天、第35天、第42天及第49天，與對照豬相比，在接種SD 95-10及ND 99-14毒株之豬中病毒中和抗體較高(P ＜ 0.05)。 表13. 螢光灶中和(FFN)效價之幾何平均值。

*在攻毒毒株內相對於對照，顯著性差異，P ＜ 0.05。 在用MN-184毒株攻毒時，接種SD 11-21毒株之豬中在第42天之前未出現病毒中和抗體且直至第49天依然如此。病毒中和抗體在兩個時間點均高於對照豬(P ＜ 0.05)。接種MN 05-68毒株之豬在第49天之前不具有可檢測之病毒中和抗體含量，然而，含量大於對照組中豬之含量(P ＜ 0.05)。 在用KS-11毒株攻毒時，接種SD 11-21及MN 05-68毒株之豬在第49天之前不具有可檢測之病毒中和抗體含量，但與對照豬相比，兩種疫苗毒株之含量較大(P ＜ 0.05)。 在整個研究持續時間期間，在對照組之任一者中均未檢測到病毒中和抗體。此並不意外，此乃因在暴露後28-35天之前通常檢測不到病毒中和抗體。 如上文所述進行直腸溫度及總和臨床評分(呼吸+抑鬱+身體條件)之分析。兩個攻毒組均觀察到高度顯著(P ＜ 0.0005)之治療與時間交互作用。 在用MN-184毒株攻毒時，在攻毒後大約6天(第41天)開始，與對照豬相比，接種SD 95-10、ND 99-14及MN 05-68毒株之豬具有始終較低之體溫及臨床評分(P ＜ 0.05)。在攻毒後大約8天(第43天)開始，與對照豬相比，接種SD 11-21毒株之豬具有始終較低之體溫(P ＜ 0.05)及較少之臨床徵象(P ＜ 0.05)。在接種SD 95-10、ND 99-14及MN 05-68毒株之豬中，早在攻毒後兩天即注意到體溫顯著降低(P ＜ 0.05)。 在用KS-11毒株攻毒時，在攻毒後9天(第44天)開始，當與對照豬相比時，接種四種疫苗毒株之任一者之豬之臨床評分顯著降低(P ＜ 0.05)且仍具有較少(P ＜ 0.05)之臨床徵象直至研究完成。在攻毒後大約6天開始，在SD 95-10、SD 11-21及ND 99-14組中體溫降低(P ＜ 0.05)。在第37天及第46天，當與對照豬相比時，僅接種MN 05-68毒株之豬之體溫較低(P ＜ 0.05)。 體重增加數據之分析顯示於表14中，作為按時期之體重增加之最小均方平均值給出。在第35-49天之攻毒後時期期間，存在關於體重增加之疫苗效應。此產生持續自第-1天至第49天之整個治療時期之疫苗效應。在攻毒前時期(第-1天至第35天)期間，各組間無體重增加差異(P ＞ 0.05)。對於MN-184及KS-11二者之攻毒，在攻毒後時期(第35-49天)期間，無論何種疫苗毒株，所有接種組當與對照豬相比時均改良(P ＜ 0.05) ADWG。在MN-184攻毒室中，與對照豬相比，利用SD 95-10、ND 99-14及MN 05-68毒株接種改良(P ＜ 0.05)整體ADWG (第-1至49天)。在接種SD 11-21且用MN-184攻毒之豬中，與對照豬相比，整體ADWG無差異(P ＞ 0.05)。在KS-11攻毒室中，與對照豬相比，利用所有毒株接種改良(P ＜ 0.05)整體ADWG (第-1天至第49天)。 表14. 最小均方平均體重增加(lb)。

*在攻毒毒株內相對於對照，顯著性差異，P ＜ 0.05。 總之，所有接種組均具有病毒血症且在接種後14及35天剝落疫苗病毒。 在用MN-184毒株攻毒時，在攻毒後時期期間，所有疫苗均降低(P ＜ 0.05)肺損傷、病毒血症、鼻剝落、臨床徵象及直腸溫度。另外，在攻毒後時期期間，所有疫苗均改良(P ＜ 0.05) ADWG。 在用KS-11毒株攻毒時，在攻毒後時期期間，接種SD 95-10、SD 11-21及ND 99-14毒株之豬之肺損傷、病毒血症、鼻剝落、臨床徵象及直腸溫度降低(P ＜ 0.05)。另外，在攻毒後時期期間，所有疫苗毒株均顯著改良(P ＜ 0.05) ADWG。 在用兩種PRRSV毒株攻毒時，4種疫苗毒株中之三者有效降低肺損傷及病毒血症。SD 95-10、SD 11-21及ND 99-14毒株有效對抗兩種攻毒毒株。MN 05-68毒株僅在MN-184攻毒時有效降低肺損傷，且在用KS-11毒株攻毒之豬中未降低肺損傷。 實例4 本研究之目的係製備豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)毒株ND 99-14之種原病毒株(MSV)。此毒種將用於PRRSV疫苗開發。 PRRSV ND 99-14毒株已藉由在MARC-145細胞中傳代83次(P83)且包括兩輪噬菌斑純化及一輪蔗糖梯度純化來改造，然後如實例1中所闡述進行初始表徵及定序。ND 99-14毒株進一步藉由在於補充有5%胎牛血清(FBS；Sigma Aldrich)及50 μg慶大黴素(gentamicin)/mL (Life Technologies)之生長培養基OPTI-MEM® I (Life Technologies)中之MARC-145細胞中傳代12次(P95)來減毒，且在補充有2% FBS而無慶大黴素之相同生長培養基中再進行5次傳代。使用第100代(P100) PRRSV ND 99-14作為前種原病毒株(Pre-MSV)。 使用以下程序來測定PRRSV MSV ND 99-14之效價。於96孔板中將MARC-145細胞以0.75-1.5×10⁴ 個細胞之密度接種於100 μL之生長培養基(補充有5% FBS及50 μg/mL慶大黴素之OPTI-MEM® I培養基)中。將細胞在37±2℃及5±1% CO₂ 培育器中培育48-72小時，直至細胞超過95%鋪滿為止。在滴定當天，自96孔板去除所有培養基並替換為100 μL新鮮生長培養基。 用稀釋劑(OPTI-MEM® I培養基，50 μg/mL慶大黴素)製備MSV之10倍連續稀釋液，並與僅由稀釋劑組成之陰性對照一起轉移至如上文所製備之板上之相應孔中。將滴定板用5±1% CO₂ 培育器在37±2℃下培育4天。在培育時期結束時，使用倒置顯微鏡觀察每一板在每一樣品孔中病毒誘導之細胞病變效應(CPE)之存在。使用裡德-明奇(Reed-Muench)方法計算50%組織培養感染劑量(TCID₅₀ )並將效價記錄為log₁₀ TCID₅₀ /mL。PRRSV MSV ND 99-14之平均效價為3.50 log₁₀ TCID₅₀ /mL。在MSV製備過程中效價無可分辨差異。 PRRS ND 99-14 MLV毒株已指示為「種原病毒株(MSV)」，且已在以下條件下寄存：確保在本專利申請案之待決期間，可由專利及商標事務專員(the Commissioner of Patents and Trademarks)根據37 C.F.R. §1.14及35 U.S.C. §122確定有權者獲取培養物。在提交本申請案之對應案或其子申請案之國家，根據外國專利法之要求可獲得寄存物。然而，應理解，寄存物之可獲得性不構成實踐本發明之許可，該實踐將侵害由政府行為授予之專利權。本發明培養物寄存物將根據布達佩斯微生物寄存條約(Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms)之規定儲存並可由公眾獲得，即，將在最近一次請求提供寄存物之樣品後至少5年之時期盡一切必要小心地儲存，且在任何情形下，在寄存日期後至少30 (三十)年之時期或可造成公開該寄存培養物之任何專利之可實施期，使其存活且不受污染。寄存者承擔下述責任：由於寄存物之條件，當寄存機構不能應請求提供樣品時，更換寄存物。在揭示本發明培養物寄存物之專利授權後，將不可撤銷地去除對於其之公眾可獲得性之所有限制。根據布達佩斯條約之條款，PRRSV MSV ND 99-14之寄存物於2015年12月2日進入位於10801 University Blvd., Manassas, Va., 20110-2209, USA之美國典型培養實驗室之專利寄存處(Patent Depository of the American Type Culture Laboratory)之永久保藏，隨後由儲存庫為其分配登錄號ATCC PTA-122675。 實例5 本研究之目的係使用次世代定序來建立遺傳一致性、獲得共有序列並評估存在於PRRSV毒株ND 99-14第84代及第100代製備物(二者均在實例4中闡述)內之基因體變體(亞種群)。 使用大量同步定序(MP-Sep)系統之序列表徵係包含若干個步驟之標準程序，該等步驟包括：自病毒製備物提取核酸、cDNA文庫合成及定量、藉由PCR進行純系擴增及DNA文庫之富集及藉由Roche/454次世代定序平臺進行文庫定序。使用合成定序來同時測定cDNA文庫中片段之核苷酸順序。使用所得片段之生物資訊學分析藉由將每一數據集映射至參考序列來進行基因體鑑別及表徵。在藉由BioReliance之此分析中所使用之參考序列係由實例1中所揭示之PRRSV ND 99-14第83代(P83)之全長序列(SEQ ID NO:4)組成。 PRRSV ND 99-14基因體之定序產生P84及P100樣品二者之完整基因體覆蓋。P84及P100之完整共有基因體可分別參見SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11。cDNA共有序列亦利用基因庫進行寄存。處於P84之PRRS毒株ND 99-14之cDNA共有序列已分配基因庫登錄號KU131567 (SEQ. ID. NO:10)。指定為SEQ. ID. NO:10之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GTTGTTGGCT CTATGTCGTG ACATTTGTAT AGTCAGGAGC TGCGACCATT 61 GGTACAGCCC AAAACTTGCT GCGCGGGAAC GCCCTTCCGT GACAGCCTTC TTCAGGGGAG 121 TTTAGGGGTC TATCCCTAGC ACCTTGCTTC CGGAGTTGCA CTGCTTTACG GTCTCTCCAC 181 CCCTTTAACC ATGTCTGGGA TACTTGATCG GTGCACGTGT ACCCCCAATG CCAGGGTGTT 241 TGTGGCGGAG GGCCAAGTCT ACTGCACACG ATGTCTCAGT GCACGGTCTC TCCTTCCTTT 301 GAATCTCCAA GTTTCTGAGC TTGGGGTGCT GGGCTTATTT TATAGGCCCG AAGAGCCGCT 361 CCGGTGGACG TTGCCACGTG CATTCCCCAC TGTCGAGTGC TCCCCCGCCG GGGCCTGCTG 421 GCTTTCTGCG ATTTTTCCAA TTGCACGAAT GACCAGTGGA AACCTGAACT TTCAACAAAG 481 AATAGTGCGG GTCGCAGCTG AGCTCTACAG AGCCGGTCAG CTCACCCCCG TAGTCTTGAA 541 GAATCTACAG GTTTATGAAC GGGGTTGCCG TTGGTACCCC ATCGTTGGAC CTGTTCCTGG 601 AGTGGCTGTT TATGCCAATT CCTTACACGT GAGTGACAAA CCTTTCCCGG GAGCAACTCA 661 TGTGTTAACC AACCTACCGC TCCCGCAGAG GCCCAAGCCT GAAGACTTTT GCCCCTTTGA 721 GTGTGCTATG GCTGACGTCT ATGACATTGG TCATGACGCT GTCATGTATG TGGCCGGAGG 781 GAGAGTCTCC TGGGCCCCTC GTGGCGGGGA CAAAGGAAAA TTTGAAATAG TTCCCAAGGA 841 GTTGAAGTTG ATTGCGAATC GACTCCACAT TTCCTTCCCG CCCCACCACG CAGTGGACAT 901 GTCCAAGTTT GCCTTTATAA GCCCTGGGAG TGGTGTTTCC ATGCGGGTCG AGTACCAACA 961 TGGCTGTCTC CCCGCTGATA CTGTCCCTGA AGGAAACTGT TGGTGGCGCT TGTTTGACTT 1021 GCTTCCACCG GAAGTTCAGA ACAAAGAGAT TCGCCATGCT AACCAACTCG GCTATCAGAC 1081 CAAGCATGGT GTCGCTGGCA AGTACCTACA GCGGAGGCTG CAAGTTAATG GACTCCGAGC 1141 AGTAACTGAC GCGAATGGAC CTATCGTCAT ACAGTATTTT TGTGATAGGG AAAGCTGGAT 1201 CCGCCACTTA AGACTGGTAG AAGAACCTAG CCTCCCTGGG TTTGAGGACC TCCTCAGAAT 1261 AAGAGTTGAG CCCAATACGT TGCCATTGGT TGGCGAGGAT GAGAAAATCT TCCGATTTGG 1321 CAATCACAAA TGGTACGGTG CTGGAAAGAG GGCAAGGAAA GCACGCTTTG GTGCGGCTGC 1381 CACGGTCGCT CACCGCGCTT TGCCCGCTCA CGAAACCCAG CAGGCCAAGA AGCACGAAGT 1441 TACCAGCGCC AACAGGGCTG AGCATCTCGA GCACTATTCC CCGCCTACCG ACGGGAACTG 1501 TGGTTGGCAC TGCGTTTCCG CCATTGTCAA CCGGATTGTG AATTCCAAAT TTGAAACCAC 1561 CCTTCCCGAG AGAGTGAGAC CTTTAGATGA CTGGGCTACT GACGAGGATC TTGTGAATAC 1621 TATCCAAATC CTCAGGCTCC CTGCGGCCTT GGACAGGAAC GGTGCTTGTG TCGGCGCCAA 1681 GTACGTGCTC AAGCTGGAAG GTGTGCACTG GACAGTCTCT GTGGCCCCTG GGATGACCCC 1741 TTCTCTGCTC CCCCTTGAAT GTGTTCAGGG CTGTTGTGAG CATAAGAGCG GTCTTGGTCC 1801 CCCAGATGTG GCTGAAGTTT CCGGATTTGA CCCTGCCTGC CTTAACCGAC TGGCTGAGGT 1861 AATGCACTTG CCTAGTTGTG TCATCCCAGC TGCTCTGGCT GAAATGTCCG ACGACCCCAA 1921 TCGCCCGGCT TCCCCAGTCA CCACTGTGTG GACTATTTCG CAATTCTTTG CCCATTATAG 1981 AGGAGGAGAG CACCCTGATC AGGTGTGCTT AGGGAAAATC ATCAGCCTTT GTCAGGTGAT 2041 TGAGGAATGC TGTTGTTCCC AGAACAAAAC CAACCGGGCC ACCCCGGAAG AGGTCGCGGC 2101 AAAAATTGAC CAGTACCTCC GTGATGCAGC AAGCCTTGGA GAATGCTTAG CCAAGCTTGA 2161 GAGGGCTCGC CCGCCGAGCG CGATGGACAC CTCCTTTGAT TGGAATGTTG TGCTTCCTGG 2221 GGTTGAGGCG GCGAACCAGA CGACCAAACA GCTCCATGTC AACCAGCACC GTGCTTCGGT 2281 TCCTGCCATG ACTCAGGAGC CTTTGGACAA AGACTCGGTC CCTTTGACCG CCTTCTCGCT 2341 GTCTAATTGC TACTACCCTG CACAAGGTGA CGAGGTTCGT CACCGTGAGA GGCTGATCTC 2401 CGTGCTCTCT AAGTTGGAGG AGGTTGTTCG TGAGGAATAT GGGCTCACGC CAACTGGATC 2461 TGGCCCGCGA CCCGCACTGC CGAACGGGCT CGACGAGCTC AAAGACCAGA TGGAAGAGGA 2521 TCTGTTGAAA CTGGTCAACG CCCAGGCAAC TTCAGAAATG ATGGCCCGGG CAGCTGAGCA 2581 GGTTGATCTA AAAGTTTGGG TCAAAAATTA CCCACGGTGG ACACCGCCAC CCCCTCCACC 2641 AAGAGTTCAG CCTCGAAAAA CAAAGTCTGC TAAGAGCCTG CCAGAGAACA AGCCTGTCCC 2701 TGCTCCGCGC AGGAAAGTCA GATCTGATTG TGGCAGCCCG ACTTTGAGGG GCAACAATGT 2761 TCCTAACGGT TGGGAAGACT TGGCCGTTGG TGGTCCTCTT GATCTTTCGA CACCATCCGA 2821 GCCGATGACA CCTCTGAGTG AGCCTGCACT TATGCCCGTG TTGCAACATA TTTCTGGACC 2881 AGTGACGCCT TTGAGCGTGC CGGCCCCTAT TCCTGCACCG CGTAAAGCTG TGTCCCGACC 2941 GATGGCGCCC TCGAGTGAGC CAATTTTTGT GTCTGCACCG CGGCAAAAAT TTCAGCAGGT 3001 GGAAGAAGCA AATCTGGCGG CAACAACGCT GACATACCAG GACGAACCTA TAGATCTGTC 3061 AGCATCCTCA CAGACTGAAT ATGAGGCTCC TTCCCTAGCA CCACTGCAGA ACATAGGTAC 3121 TCTGGAGGTG GGGGGGCAAG AAGCTGAGGA AATTCTGAGT GAAACCTCGG ATATACCGAA 3181 TGACATCAAC CCTGTGCCTG TATCATCAAG CAGCTCCTTG TCAAGCGTTA AGATCACACG 3241 CCCAAGACAC TCAGCTCAAG CCATCATCGA CTCGGGCGGG CCCTGCAGTG GGCATCTCCA 3301 AAGGGAGAAA GAAGCGTGCC TCCGCATCAT GCGTGAGGCT TGTGATGCGA CTAAGCTTAG 3361 TGACCCTGCC ACGCAGGAAT GGCTTTCTCG CATGTGGGAT AGGGTGGACA TGCTGACTTG 3421 GCGCAACACG TCTGCTTTCC AGGCGTTTCG CATCTTAGAC GGCAGGCTTG AGTTTCTTCC 3481 AAAGATGATA CTCGAGACGC CGCCGCCCTA CCCGTGTGGG TTTGTGATGC TGCCTCACAC 3541 CCCTGCACCT TCCGTGAGTG CAGAGAGCGA CCTTACCATC GGTTCAGTCG CCACTGAAGA 3601 TATTCCACGC ATCCTCGGGA AAATAGAAAA CACCAGTGAG ATGATCAACC AGGGACCCTT 3661 GGCATCCTCT GAGGAAAAAC CGGCATACAA CCAACCCGCT AAGGACTCCC TGATATCGTC 3721 GCGGGGGTTT GACGAGAGCA CAGCAGCTCC GTCCGCAGGT ACGGGTGGCG CCGGCTTGTT 3781 TACTGATTTG CCACCTTCAG ACGGTGTAGA TGCGGACGGG GGGGGGCCGC TGCAGACGGT 3841 GAAAAAGAAC GCTGAAAGGC TCCTCGACCG ATTGAGCCGT CAGGTTTTTA ACCTCGTCTC 3901 CCATCTCCCT GTTTTCCTCT CACACCTCTT CAAATCTGAC AGTGGTTATT CTCCGGGTGA 3961 TTGGGGTTTT GCAGCTTTTA CTCTATTTTG CCTCTTTTTA TGTTACAGCT ACCCATTCTT 4021 TGGTTTCGCT CCCCTTTTGG GTGTGTTTTC TGGGTCTTCT CGGCGCGTGC GCATGGGGGT 4081 TTTTGGCTGC TGGTTGGCTT TTGCTGTTGG TTTGTTCAAG CCTGTGTCCG ACCCAGTCGG 4141 CACTGCTTGT GAGTTTGATT CGCCAGAGTG TAGGAATGTC CTTCATTCTT TTGAGCTTCT 4201 CAAACCTTGG GACCCTGTTC GCAGCCTTGT TGTGGGCCCC GTCGGTCTCG GTCTTGCCAT 4261 TCTTGGCAGG TTACTGGGCG GGGCACGCTA CATCTGGCAT TTTCTGCTTA GGCTTGGCAT 4321 TGTTACAGAC TGTATCCTGG CTGGAGCTTA TGTGCTTTCT CAAGGTAGGT GTAAAAAGTG 4381 CTGGGGATCT TGCATAAGAA CAGCTCCTAA TGAGATTGCC TTTAACGTGT TCCCTTTTAC 4441 ACGTGCGACT AGGTCGTCAC TCATCGACCT GTGCAATCGG TTTTGTGCGC CAAAGGGCAT 4501 GGACCCTATT CTCCTCGCCA CTGGGTGGCG TGGGTGCTGG ACCGGCCGAA GCCCCATTGA 4561 ACAACCCTCT GAAAAACCCA TCGCGTTTGC CCAGTTGGAC GAAAAGAGGA TTACGGCCAG 4621 GACCGTGGTC GCCCAGCCTT ATGACCCCAA CCAAGCCGTA AAGTGCTTGC GGGTGTTACA 4681 GGCGGGCGGG GCGATGGTGG CTGAGGCAGT CCCAAAAGTG GTCAAAGTTT CCGCTATTCC 4741 ATTCCGAGCC CCCTTTTTTC CCACCGGAGT GAAAGTTGAC CCTGAGTGTA GGATCGTGGT 4801 TGACCCCGAC ACTTTTACTA CAGCCCTCCG GTCCGGCTAT TCCACCACAA ACCTCGTTCT 4861 TGGTGTGGGG GACTTTGCCC AGCTGAATGG ATTAAAAATC AGGCAAATTT CCAAGCCTTC 4921 GGGAGGAGGC CCGCACCTCA TTGCTGCCCT ACATGTTGCC TGCTCGATGG CGTTGCACAT 4981 GCTTGCTGGG GTTTATGTAA CTGCAGTGGG GTCTTGCGGT ACCGGCACCA ACGATCCGTG 5041 GTGCACCAAC CCGTTTGCCG TCCCTGGCTA CGGGCCTGGT ACTCTTTGCA CGTCCAGATT 5101 GTGCATCTCC CAACATGGCC TTACCCTGCC CTTGACAGCA CTTGTGGCAG GATTCGGTCT 5161 TCAGGAAATT GCCTTGGTTG TTTTGATTTT CGTTTCCATC GGAGGCATGG CTCACAGGTT 5221 GAGTTGCAAG GCTGACATGC TGTGCGTTTT ACTTGCAATC GCCAGCTATG TTTGGGTGCC 5281 CCTTACCTGG TTTCTTTGTG TGTTTCCTTG CTGGTTGCGC TGGTTCTCTT TGCATCCCCT 5341 CACCATCCTA TGGTTGGTGT TTTTCTTGAT TTCTGTAAAT GTGCCTTCGG GAATCTTGGC 5401 TGTGGTGTTG TTAGTTTCTC TTTGGCTCTT AGGTCGTTAC ACTAATGTTG CTGGTCTTGT 5461 CACCCCATAT GACATTCATC ATCACACCAG TGGCCCCCGA GGTGTTGCCG CCTTGGCTAC 5521 TGCACCGGAT GGGACCTACT TGGCCGCCGT TCGCCGTGCT GCGTTGACCG GTCGTACCAT 5581 GCTGTTTACC CCGTCTCAGC TTGGGTCCCT TCTTGAGGGT GCTTTCAGAA CTCAAAAGCC 5641 CTCACTGAAC ACCGTCAATG TGGTCGGATC CTCTATGGGC TCCGGCGGGG TGTTCACCAT 5701 CGACGGGAAA ATTAAGTGCG TAACAGCCGC ACATGTCCTT ACGGGTAATT CAGCTAGGGT 5761 TTCCGGGGTC GGCTTCAACC AAATGCTTGA TTTTGATGTG AAAGGGGACT TCGCCATAGC 5821 TGATTGCCCG AATTGGCAAG GAGCTGCCCC CAAGACCCAA TTCTGCGAGG ATGGATGGAC 5881 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CTTGCGATAC TTTGCCGAAG GGAAGTTGAG GGAAGGGGTG TCGCAGTCCT GCGGGATGAA 6781 TCACGAGTCA CTGACTGGTG CCCTCGCTAT GAGACTCAAT GACGAAGACT TGGACTTCCT 6841 TACGAAATGG ACTGATTTTA AGTGCTTTGT TTCTGCGTCC AACATGAGGA ATGCAGCGGG 6901 CCAATTCATC GAGGCTGCCT ATGCAAAAGC ACTTAGAATT GAGCTTGCCC AGTTAGTACA 6961 GGTTGATAAG GTTCGAGGTA CTTTGGCCAA ACTTGAAGCC TTTGCTGATA CCGTGGCACC 7021 CCAGCTCTCG CCCGGTGACA TTGTTGTTGC TCTTGGCCAC ACGCCTGTTG GCAGTATCTT 7081 CGACCTAAAG GTTGGCAGTA CCAAGCATAC CCTCCAGGCC ATTGAGACCA GAGTCCTTGC 7141 CGGGTCCAAA ATGACCGTGG CGCGTGTCGT TGATCCAACC CCCACGCCCC CACCCGCACC 7201 CGTGCCCATC CCCCTCCCAC CGAAAGTCCT GGAGAACGGC CCCAACGCCT GGGGGGATGA 7261 GGACCGGTTG AATAAGAGGA AGAGACGCAG GATGGAAGCC GTCGGCATCT TTGTTATGGG 7321 TGGGAAGAAG TACCAAAAAT TTTGGGACAA GAATTCCGGT GATGTGTTTT ACGAGGAGGT 7381 CCATGATAAC ACAGATGCGT GGGAGTGCCT CAGAGTTGGT GACCCTGCCG ACTTTGACCC 7441 TGAGAAGGGA ACTCTGTGTG GGCATACTAC CATTGAAGAC AAGGCTTATA ATGTCTACAC 7501 CTCCCCATCT GGCAGGAAGT TCCTGGTCCC CGTCAACCCA GAGAGCGGAA GAGCCCAATG 7561 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GTGCACCAAC CCGTTTGCCG TCCCTGGCTA CGGGCCTGGT ACTCTTTGCA CGTCCAGATT 5101 GTGCATCTCC CAACATGGCC TTACCCTGCC CTTGACAGCA CTTGTGGCAG GATTCGGTCT 5161 TCAGGAAATT GCCTTGGTTG TTTTGATTTT CGTTTCCATC GGAGGCATGG CTCACAGGTT 5221 GAGTTGCAAG GCTGACATGC TGTGCGTTTT ACTTGCAATC GCCAGCTATG TTTGGGTGCC 5281 CCTTACCTGG TTTCTTTGTG TGTTTCCTTG CTGGTTGCGC TGGTTCTCTT TGCATCCCCT 5341 CACCATCCTA TGGTTGGTGT TTTTCTTGAT TTCTGTAAAT GTGCCTTCGG GAATCTTGGC 5401 TGTGGTGTTG TTAGTTTCTC TTTGGCTCTT AGGTCGTTAC ACTAATGTTG CTGGTCTTGT 5461 CACCCCATAT GACATTCATC ATCACACCAG TGGCCCCCGA GGTGTTGCCG CCTTGGCTAC 5521 TGCACCGGAT GGGACCTACT TGGCCGCCGT TCGCCGTGCT GCGTTGACCG GTCGTACCAT 5581 GCTGTTTACC CCGTCTCAGC TTGGGTCCCT TCTTGAGGGT GCTTTCAGAA CTCAAAAGCC 5641 CTCACTGAAC ACCGTCAATG TGGTCGGATC CTCTATGGGC TCCGGCGGGG TGTTCACCAT 5701 CGACGGGAAA ATTAAGTGCG TAACAGCCGC ACATGTCCTT ACGGGTAATT CAGCTAGGGT 5761 TTCCGGGGTC GGCTTCAACC AAATGCTTGA TTTTGATGTG AAAGGGGACT TCGCCATAGC 5821 TGATTGCCCG AATTGGCAAG GAGCTGCCCC CAAGACCCAA TTCTGCGAGG ATGGATGGAC 5881 TGGCCGTGCC TATTGGCTGA CATCCTCTGG AGTCGAACCC GGTGTCATTG GGAATGGATT 5941 CGCCTTCTGC TTCACCGCGT GCGGCGATTC TGGATCCCCG GTGATTACCG AAGCCGGTGA 6001 GCTTGTCGGC GTTCACACAG GATCAAACAA ACAAGGAGGA GGCATAGTCA CACGCCCCTC 6061 AGGCCAGTTT TGTAATGTGG CGCCCATCAA GCTGAGCGAA TTGAGTGAAT TCTTCGCTGG 6121 ACCTAAGGTC CCGCTCGGTG ATGTGAAGAT TGGCAGCCAC ATAATTAAAG ACGTATGCGA 6181 GGTACCTTCA GATCTTTGCG CCTTGCTCGC TGCCAAACCC GAACTGGAAG GAGGCCTCTC 6241 CACCGTCCAA CTTCTGTGTG TGTTTTTCCT CCTGTGGAGA ATGATGGGAC ATGCCTGGAC 6301 GCCCTTGGTT GCTGTGGGGT TTTTTATCTT GAATGAGGTT CTCCCAGCTG TCCTGGTCCG 6361 GAGTGTCTTC TCCTTTGGTA TGTTTGTGCT ATCTTGGCTT ACACCATGGT CTGCGCAAGT 6421 CCTGATGATC AGGCTTCTAA CAGCAGCTCT TAACAGGAAC AGGGGGTCAC TCGCCTTCTA 6481 CAGCCTCGGT GCAGTGACCG GATTTATCGC AGATCTTGCA GCAACTCAGG GGCATCCGCT 6541 GCAGGCAGTG ATGAACTTAA GCACCTATGC CTTCCTGCCT CGGATGATGG TTGTGACCTC 6601 ACCAGTCCCA GTGCTTGCTT GTGGTGTTGT GCACCTCCTT GCCATAATTT TGTACCTGTT 6661 TAAGCACCGT TGCCTGCATT ATGTCCTTGT TGGCGATGGA GTGTTCTCTA AAGCCTTCTT 6721 CTTGCGATAC TTTGCCGAAG GGAAGTTGAG GGAAGGGGTG TCGCAGTCCT GCGGGATGAA 6781 TCACGAGTCA CTGACTGGTG CCCTCGCTAT GAGACTCAAT GACGAAGACT TGGACTTCCT 6841 TACGAAATGG ACTGATTTTA AGTGCTTTGT TTCTGCGTCC AACATGAGGA ATGCAGCGGG 6901 CCAATTCATC GAGGCTGCCT ATGCAAAAGC ACTTAGAATT GAGCTTGCCC AGTTAGTACA 6961 GGTTGATAAG GTTCGAGGTA CTTTGGCCAA ACTTGAAGCC TTTGCTGATA CCGTGGCACC 7021 CCAGCTCTCG CCCGGTGACA TTGTTGTTGC TCTTGGCCAC ACGCCTGTTG GCAGTATCTT 7081 CGACCTAAAG GTTGGCAGTA CCAAGCATAC CCTCCAGGCC ATTGAGACCA GAGTCCTTGC 7141 CGGGTCCAAA ATGACCGTGG CGCGTGTCGT TGATCCAACC CCCACGCCCC CACCCGCACC 7201 CGTGCCCATC CCCCTCCCAC CGAAAGTCCT GGAGAACGGC CCCAACGCCT GGGGGGATGA 7261 GGACCGGTTG AATAAGAGGA AGAGACGCAG GATGGAAGCC GTCGGCATCT TTGTTATGGG 7321 TGGGAAGAAG TACCAAAAAT TTTGGGACAA GAATTCCGGT GATGTGTTTT ACGAGGAGGT 7381 CCATGATAAC ACAGATGCGT GGGAGTGCCT CAGAGTTGGT GACCCTGCCG ACTTTGACCC 7441 TGAGAAGGGA ACTCTGTGTG GGCATACTAC CATTGAAGAC AAGGCTTATA ATGTCTACAC 7501 CTCCCCATCT GGCAGGAAGT TCCTGGTCCC CGTCAACCCA GAGAGCGGAA GAGCCCAATG 7561 GGAAGCTGCA AAGCTTTCCG TAGAGCAGGC CCTTAGCATG ATGAATGTCG ACGGTGAGCT 7621 GACAGCCAAA GAACTGGAGA AACTGAAAAG AATAATTGAC AAACTCCAGG GCCTAACTAA 7681 GGAGCAGTGT TTAAACTGCT AGCCGCCAGC GGCTTGACCC GCTGTGGTCG CGGCGGCTTG 7741 GTTGTTACTG AGACAGCGGT GAAAATAGTT AAATTTCACA ACCGGACCTT CACCCTAGGA 7801 CCTGTGAATT TAAAAGTGGC CAGTGAGGTT GAGCTAAAAG ACGCAGTCGA GCATAACCAA 7861 CACCCGGTTG CAAGACCGGT TGATGGTGGT GTTGTGCTCC TGCGCTCCGC AGTTCCTTCG 7921 CTTATAGACG TCTTGATCTC TGGCGCTGAT GCATCTCCTA AGTTACTCGC CCACCACGGG 7981 CCGGGAAACA CTGGGATCGA TGGTTCGCTT TGGGATTTTG AGGCCGAGGC CACCAAAGAG 8041 GAAATTGCAC TCAGTGCGCA AATAATACAG GCTTGTGACA TTAGGCGCGG CGACGCACCC 8101 GAAATTGGTC TTCCTTATAA GCTGCACCCT GTTAGGGGCA ACCCTGAGCG GGTAAAAGGG 8161 GTTTTACAGA ATACAAGGTT TGGAGACATA CCTTATAAAA CCCCCAGTGA CACTGGGAGC 8221 CCAGTGCACG CGGCTGCCTG CCTCACGCCC AATGCCACTC CGGTGACTGA CGGTCGTTCC 8281 GTCTTGGCTA CGACCATGCC CTCCGGTTTT GAGTTGTATG TACCGACCAT TCCAGCGTCT 8341 GTCCTTGATT ATCTTGATTC CAGGCCTGAT TGCCCCAAAC AGTTGACAGA GCACGGCTGT 8401 GAGGATGCCG CATTAAGAGA CCTCTCCAAG TATGACTTGT CCACCCAAGG CTTTGTCTTG 8461 CCTGGAGTTC TTCGCCTTGT GCGTAAGTAC CTGTTTGCTC ATGTGGGTAA GTGCCCGCCT 8521 ATTCATCGGC CTTCCACTTA CCCTGCCAAG AATTCCATGG CTGGAATAAA TGGGAACAGG 8581 TTTCCAACCA AGGACATTCA GAGCGTCCCT GAAATCGACG TTTTGTGCGC ACAGGCCGTG 8641 CGAGAAAACT GGCAAACTGT TACTCCTTGT ACCCTCAAGA AGCAGTATTG CGGGAAGAAG 8701 AAGACTAGGA CAATACTCGG CACTAATAAC TTCATTGCGC TGGCCCACCG GGCAGCATTG 8761 AGTGGTGTCA CCCAGGGCTT CATGAAAAAA GCGTTTAACT CGCCCATCGC ACTCGGGAAA 8821 AACAAATTCA AGGAGCTGCA GACTCCGGTC TTGGGCAGAT GTCTTGAAGC TGACCTTGCA 8881 TCCTGTGACC GATCCACACC CGCAATTGTC CGCTGGTTTG CCGCCAATCT TCTTTATGAA 8941 CTTGCCTGTG CTGAGGAGCA TATACCATCG TACGTGTTGA ACTGCTGCCA CGACTTACTG 9001 GTCACGCAGT CCGGCGCGGT GACTAAGAGA GGTGGCCTAT CGTCTGGCGA CCCGATTACT 9061 TCTGTATCAA ACACCATTTA CAGCTTGGTG ATATATGCAC AGCACATGGT ACTCAGTTAT 9121 TTTAAAAGTG GTCACCCCCA TGGCCTTCTG TTTCTACAAG ACCAGCTAAA GTTTGAGGAC 9181 ATGCTCAAGG TTCAGCCCCT GATCGTCTAT TCGGACGACC TCGTGCTGTA CGCCGAGTCT 9241 CCCACCATGC CAAACTACCA CTGGTGGGTT GAACATCTGA ACCTGATGCT GGGTTTTCAG 9301 ACGGACCCAA AGAAGACAGC TATAACAGAC TCGCCATCAT TTTTGGGTTG TAGGATAATA 9361 AATGGACGCC AGTTAGTCCC CAACCGTGAC AGGATCCTCG CGGCCCTCGC CTACCATATG 9421 AAGGCAAACA ATGTTTCTGA ATACTACGCC TCGGCGGCTG CAATACTCAT GGACAGTTGT 9481 GCTTGTTTGG AGTACGATCC TGAGTGGTTT GAAGAGCTCG TGGTTGGGAT GGCGCAGTGC 9541 GCCCGCAAGG ACGGCTACAG TTTTCCTGGC CCGCCGTTCT TCTTGTCCAT GTGGGAAAAA 9601 CTCAGGTCCA ATCATGAGGG GAAGAAGTCT AGAATGTGCG GGTACTGTGG GGCCCCAGCT 9661 CCGTATGCCA CTGCCTGTGG CCTTGATGTT TGTATTTATC ACACCCACTT CCACCAGCAT 9721 TGTCCAGTCA TAATCTGGTG TGGCCATCCG GCGGGTTCTG GCTCTTGTAG TGAGTGCAAA 9781 CCCCCCCTAG GGAAAGGCAC AAGCCCTCTA GATGTGGTGT TAGAACAAGT CCCGTACAAG 9841 CCTCCACGAA CTGTAATCAT GCATGTGGAG CAGGGTCTCA CCCCTCTTGA CCCAGGCAGA 9901 TACCAGACTC GCCGCGGATT AGTCTCCGTT AGGCGTGGCA TCAGGGGAAA CGAAATCGAC 9961 CTACCAGACG GTGATTATGC TAGTACCGCC TTGCTCCCCA CTTGTAAAGA TATCAACATG 10021 GTCGCTGTCG CTTCCAATGT GTTGCGCAGC AGGTTCATCA TCGGTCCACC CGGTGCTGGT 10081 AAAACATACT GGCTCCTTCA ACAGGTCCAG GATGGTGATG TCATTTACAC GCCAACTCAT 10141 CAGACCATGC TTGACATGAT CAAGGCTTTG GGGACGTGCC GGTTCAACGC CCCAGCAGGC 10201 ACAACGCTGC AATTCCCTGC TCCCTCCCGT ACCGGCCCGT GGGTTCGCAT CCTGGCCGGC 10261 GGTTGGTGTC CTGGCAAGAA TTCCTTCCTG GATGAAGCAG CGTATTGTAA TCACCTTGAT 10321 GTCTTGAGGC TTCTTAGCAA AACTACCCTC ACCTGTCTGG GAGATTTCAA ACAACTCCAC 10381 CCAGTGGGTT TTGATTCTCA TTGCTATGTT TTTGACATCA TGCCTCAGAC TCAACTGAAG 10441 ACCATCTGGA GGTTTGGACA GAATATCTGT GATGCCATTC AGCCAGATTA CAGGGACAAA 10501 CTTGTGTCCA TGGTCAACAC AACCCGTGTA ACCTACGTGG AAAGACCTGT CAAGCATGGG 10561 CAGGTCCTCA CCCCTTACCA CAGGGACCGA GAGGACGGCG CCATCACAAT TGACTCCAGT 10621 CAAGGCGCCA CATTTGATGT GGTTACATTG CATTTGCCCA CTAAAGATTC ACTCAACAGG 10681 CAAAGAGCCC TTGTTGCTAT CACCAGGGCG AGACATGCTA TCTTTGTGTA TGACCCACAT 10741 AGGCAACTGC AGAGCATGTT TGATCTTCCT GCAAAAGGCA CACCCGTCAA CCTTGCCGTG 10801 CACCGTGACG AGCAGCTGAT CGTACTAGAT AGAAATAACA AAGAGTGCAC GGTTGCTCAG 10861 GCTCTAGGCA ATGGGGACAA ATTCAGGGCC ACAGACAAGC GCGTTGTAGA TTCTCTCCGC 10921 GCCATTTGTG CAGATCTTGA AGGGTCGAGC TCCCCGCTCC CCAAGGTCGC ACATAACTTG 10981 GGATTTTATT TCTCACCTGA TTTGACACAG TTTGCTAAAC TCCCGGCAGA ACTTGCACCC 11041 CACTGGCCCG TGGTGACAAC CCAGAACAAT GAAAAGTGGC CAGACAGGCT GGTTGCCAGC 11101 CTCCGCCCTA TCCATAAATA TAGCCGCGCA TGCATTGGAG CCGGCTATAT GGTGGGCCCT 11161 TCGGTGTTTC TAGGCACCCC TGGGGTTGTG TCATACTATC TCACAAAATT TGTTAAGGGG 11221 GAGGCTCAGG TGCTTCCGGA GACAGTCTTC AGCACCGGCC GAATTGAGGT AGATTGCCGG 11281 GAGTATCTTG ATGATCGGGA ACGAGAAGTT GCTGAGTCCC TCCCACATGC CTTCATTGGC 11341 GACGTCAAAG GCACTACCGT TGGGGGATGT CACCATGTCA CCTCTAAATA CCTTCCGCGC 11401 TTCCTTCCTA AGGAATCAGT TGCGGTGGTT GGGGTTTCGA GCCCCGGGAA AGCCGCAAAA 11461 GCAGTCTGCA CATTAACAGA TGTGTATCTC CCAGACCTTG AAGTTTACCT CCACCCAGAG 11521 ACCCAATCCA AGTGCTGGAA AATAATGTTG GACTTCAAGG AAGTCCGACT GATGGTCTGG 11581 AAAGACAAAA CGGCCTATTT TCAACTTGAA GGCCGCCATT TCACCTGGTA TCAGCTTGCA 11641 AGCTATGCCT CGTACATCCG AGTTCCTGTT AACTCTACGG TGTATTTGGA CCCCTGCATG 11701 GGCCCTGCCC TTTGCAACAG AAGAGTTGTC GGGTCCACTC ATTGGGGGGC TGACCTCGCA 11761 GTCACCCCTT ATGATTATGG TGCCAAAATC ATTCTGTCTA GTGCATACCA TGGTGAAATG 11821 CCTCCTGGGT ACAAAATCCT GGCGTGCGCG GAGTTCTCGC TTGACGACCC AGTGAGGTAC 11881 AAACACACCT GGGGGTTTGA ATCGGACACA GCGTATCTGT ACGAGTTCAC CGGAAACGGT 11941 GAGGACTGGG AGGATTACAA TGACGCATTT CGTGCGCGCC AGAAAGGGAA AATTTATAAG 12001 GCCACTGCCA CCAGCATGAG GTTTCATTTT CCCCCGGGCC CCATCATTGA ACCAACTTTA 12061 GGCCTGAACT GAAATGAGAT GGGGGCTATG CAAAGCCTTT TCTACAAAAT TGGCCAACTT 12121 TTTGTGGATG CTTTCACGGA ATTTTTGGTG TCCATTGTTG ATATCATCAT ATTTTTGGCC 12181 ATTTTGTTTG GCTTCACCAT CGCCGGTTGG CTGGTGGTCT TCTGCATCCG ATTGGTTTGC 12241 TCCGCGGTAC TCCGTGCGCG CCCTACCATT CACCCTGAGC AATTACAGAA GATCCTATGA 12301 GGCCTTTCTT TCTCAGTGCC GGGTGGACAT TCCCACCTGG GGAACCAAAC ATCCCTTGGG 12361 GATACTTTGG CACCATAAGG TGTCAACCCT GATTGATGAA ATGGTGTCGC GTCGAATGTA 12421 CCGCATCATG GAAAAATCAG GACAGGCTGC CTGGAAACAG GTTGTGAGCG AGGCTACGCT 12481 GTCTCGCATC AGTGGTTTGG ATGTGGTGGC TCATTTTCAGCATCTTGCCG CCATTGAAGC 12541 CGAGACCTGT AAATATTTGG CCTCTCGGAT GCCCATGCTA CACAACCTGC GCATGACAGG 12601 GTCAAATGTA ACCATAGTGT ATAATAGTAC TTTGAATCAG GTGTTAGCAA TCTTCCCGAC 12661 CTCTGAATCC CGGCCAAAGC TTCATGATTT TCAACAATGG TTAATAACTG TACATTCCTC 12721 CATATTTTCC TCCGTTGTGG CTTCCTGTAC TCTTTTTGTT GTGCTGTGGT TGCGAATTCC 12781 AATGCTACGT ACTGTTTTTG GTTTCCACTG GTTAGGGGCA ATTTTTCTTT CGAACTCACA 12841 GTGAATTACA CGGTGTGCCC ACCTTGCCTC ACCCGGCAAG CAGCCGCTGA GATCTACGAA 12901 CCCGGCAGGT CTCTTTGGTG CAGGATAGGG CATGATCGAT GTAGCGAGGA CGATCATGAC 12961 GAACTAGGGT TCTTGGTTCC GCCTGGCCTC TCCAGCGAAG GCCACTTGAC CAGTGTTTAC 13021 GCCTGGTTGG CGTTCCTGTC CTTCAGCTAT ACAGCCCAGT TCCATCCCGA GATATTTGGG 13081 ATAGGGAATG TGAGTAAAAT TTATGTTGAC ATCAAGCACC AATTCATCTG CGCCGAACAC 13141 GACGGGCAGA ACGCCACCCT GCCTCGCCAT GACAACATTT CAGCCGTGTT TCAGACCTAC 13201 TACCAACATC AGGTCGATGG CGGCAATTGG TTTCACCTGG AATGGCTGCG CCCCTTCTTT 13261 TCCTCTTGGT TGGTTTTAAA TGTTTCGTGG TTTCTCAGGC GTTCGCCTGC AAGCCATGTT 13321 TCAGTTCGAG TCTTTCAGAC ATCAAAACCA ACACCACCGC AGCACCAAAT TTTGTTGTCC 13381 TCCAGGACAT CAGCTGCCTT AGGCATGGCG ACCCGTCCTC TCCGGCGATT CGCAAAAGCT 13441 CTCAGTGCCG CACGGCGATA GGAACACCCG TGTATATCAC CATCACAGCC AATGTGACAG 13501 ATGAGAATTA TTTACATTCT TCTGATCTCC TCATGCTTTC TTCTTGCCTT TTCTATGCTT 13561 CTGAGATGAG TGAAAAGGGG TTCAAGGTGG TATTCGGCAA TGTGTCAGGC ATCGTGGCTG 13621 TGTGTGTCAA CTTTACCAGT TACGTCCAAC ATGTCAAGGA GTTTACCCAA CGCTCCTTGG 13681 TGGTCGAGCA TGTGCGACTG CTTCATTTCA TGACACCTGA AACCATGAGG TGGGCAACCG 13741 TTTTAGCCTG TCTTTTTGCC ATTCTGTTGG CAATTTGAAT GTTTAAGTAT GTTGGGGAAA 13801 TGCTTGACCG CGGGCTGTTG CTCGCCGTTG CTTTTTTTGT GGTGTATCGT GCCGTCTTGC 13861 TTTGTTGCGC CCGTCAACGT CGACGGGAAC GACAGCTCAA AGTTACAGCT GATTTACAAC 13921 TTGACGCTAT GTGAGCTGAA TGGCACAGAT TGGCTGGCTG GTAGATTTGA CTGGGCAGTG 13981 GAGTGTTTTG TCATTTTTCC CGTGTTGACT CACATTGTCT CCTATGGTGC CCTCACTACT 14041 AGCCATTTCC TTGACACAGT CGGTCTGGTC ACTGTGTCTG CCGCCGGGTT CCTTCATGAA 14101 CGGTATGTTT TGAGTAGCAT CTACGCGGTC TGTGCCCTGG CTGCGTTGAT TTGCTTCGTC 14161 ATTAGGCTTG CGAAGAACTG CATGTCCTGG CGCTACTCGT GTACCAGATA TACCAACTTC 14221 CTTTTGGACA CCAAGGGGAG ACTCTATCGT TGGCGATCGC CCGTCATCAT AGAGAAAAAG 14281 GGTAAAGTTG AGGTTGAAGG TCATTTGATC GACCTCAAAA GAGTTGTGCT TGATGGTTCC 14341 GTGGCAACCC CTATAACCAA AATTTCAGCG GAACAATGGG GTCGTCCTTA GATGACTTCT 14401 GCCATGATAG CACGGCTCCA CAAAAGGTGC TTTTGGCGTT TTCCATTACC TATACACCAG 14461 TGATGATATA TGCCCTAAAG GTAAGTCGCG GCCGACTGCT AGGGCTTTTG CACCTTTTGA 14521 TCTTTCTGAA CTGTGCTTTC ACCTTCGGGT ATATGACATT CACGCACTTT CAGAGTACAA 14581 ACAAGGTCGC GCTCACTATG GGAGCAGTAG TTGCACTCCT TTGGGGGGTG TACTCAGCCA 14641 TAGAAACCTG GAAATTCATC ACCTCCAGAT GCCGTTTGTG CTTGCTAGGC CGCAAGTACA 14701 TTCTGGCCCC TGCCCACCAC GTTGAGAGTG CCGCAGGCTT TCATCCGATT GCGGCAAATG 14761 ATAACCACGC ATTTGTCGTC CGGCGTCCCG GTTCCACTAC GGTCAACGGC ACATTGGTCC 14821 CCGGGTTGAA AAGCCTCGTG TTGGGTGGCA GAAAAGCTGT CAAACAGGGA GTGGTAAACC 14881 TTGTTAAATA TGCCAAGTAA CAACGGCAGG CAGCAGAAAA AAAGAAAGGG GGATGGCCAG 14941 CCAGTCAATC AGCTGTGTCA GATGCTGGGT AAAATTATTG CCCAGCAAAA TCAGTCCAGG 15001 GGCAAGGGAC CGGGAAAGAA AAATAACAAG AAAAACCCGG AGAAGCCCCA TTTTCCTCTA 15061 GCGACTGAAG ATGATGTCAG ACATCACTTT ACCCCGAGTG AGCGACAATT GTGTCTGTCG 15121 TCAATCCAGA CTGCCTTCAA TCAGGGCGCT GGAACTTGTA CCCTGTCAGA TTCAGGCAGG 15181 ATAAGTTACA CTGTGGAGTT TAGTTTGCCG ACGCATCACA CTGTGCGCCT GATCCGCGCT 15241 ACAGCATCAC CCTCAGCATG ATGAGCTGGC ATTCCTGGGT ATCCCAGTGT TTGAATTGGA 15301 AGAATGTGTG GTGAATGGCA CTGATTGACA TTGTGCTTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG 15361 GCGACCGTGT GGGAGTAGAA TTTAATTGGC GAGAACCACG CGGCCGAAAT TAAAAAAAAA 15421 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 熟習此項技術者將認識到，每一基因體共有序列之聚腺苷尾可在長度上與上文所報告之序列不同。 亦進行變體鑑別以確定兩代病毒種群中核苷酸變化之數量及頻率。表15顯示與參考序列相比，P84及P100中發現7個核苷酸變化。總體而言，變體位置在各代間係一致的，唯P84中存在2個P100中不存在之核苷酸變化。此外，每一變體之頻率在各代間類似且在相對較低之頻率下檢測出，表明在ND 99-14之P84及P100二者中均發現類似亞種群。 表15. PRRSV ND 99-14序列變體。

ND=未檢測出。 實例6 本研究之目的係製備豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)毒株SD 11-21之種原病毒株(MSV)。此種子將用於PRRSV疫苗開發。 PRRSV SD 11-21毒株已藉由在MARC-145細胞中傳代83次(P83)且包括兩輪噬菌斑純化及一輪蔗糖梯度純化來改造，然後如實例1中所闡述進行初始表徵及定序。SD 11-21毒株進一步藉由在於補充有5%胎牛血清(FBS；Sigma Aldrich)及50 μg慶大黴素/mL (Life Technologies)之生長培養基Opti-MEM® I (Life Technologies)中之MARC-145細胞中傳代12次(P95)來減毒，且在補充有2% FBS而無慶大黴素之相同生長培養基中再進行5次傳代。使用第100代(P100) PRRSV SD 11-21來製備前種原病毒株(Pre-MSV)。 使用以下程序來測定PRRSV MSV SD 11-21之效價。於96孔板中將MARC-145細胞以0.75-1.5×10⁴ 個細胞之密度接種於100 μL之生長培養基(補充有5% FBS及50 μg/mL慶大黴素之OPTI-MEM® I培養基)中。將細胞在37±2℃及5±1% CO₂ 培育器中培育48-72小時，直至細胞超過95%鋪滿為止。在滴定當天，自96孔板去除所有培養基並替換為100 μL新鮮生長培養基。 用稀釋劑(OPTI-MEM® I培養基，50 μg/mL慶大黴素)製備MSV之10倍連續稀釋液，並與僅由稀釋劑組成之陰性對照一起轉移至如上文所製備之板上之相應孔中。將滴定板用5±1% CO₂ 培育器在37±2℃下培育4天。在培育時期結束時，使用倒置顯微鏡觀察每一板在每一樣品孔中病毒誘導之細胞病變效應(CPE)之存在。使用裡德-明奇方法計算50%組織培養感染劑量(TCID₅₀ )並將效價記錄為log₁₀ TCID₅₀ /mL。PRRSV MSV SD 11-21之平均效價為3.25 log₁₀ TCID₅₀ /mL。在MSV製備過程中效價無可分辨之差異。 PRRS SD 11-21 MLV毒株已指示為「種原病毒株(MSV)」，且已在以下條件下寄存：確保在本專利申請案之待決期間，可由專利及商標事物專員根據37 C.F.R. §1.14及35 U.S.C. §122確定有權者獲取培養物。在提交本申請案之對應案或其子申請案之國家，根據外國專利法之要求可獲得寄存物。然而，應理解，寄存物之可獲得性不構成實踐本發明之許可，該實踐將侵害由政府行為授予之專利權。本發明培養物寄存物將根據布達佩斯微生物寄存條約之規定儲存並可由公眾獲得，即，將在最近一次請求提供寄存物之樣品後至少5年之時期盡一切必要小心地儲存，且在任何情形下，在寄存日期後至少30 (三十)年之時期或可造成公開該寄存培養物之任何專利之可實施期，使其存活且不受污染。寄存者承擔下述責任：由於寄存物之條件，當寄存機構不能應請求提供樣品時，更換寄存物。在揭示本發明培養物寄存物之專利授權後，將不可撤銷地去除對於其之公眾可獲得性之所有限制。根據布達佩斯條約之條款，PRRSV MSV SD 11-21之寄存物於2015年12月2日進入位於10801 University Blvd., Manassas, Va., 20110-2209, USA之美國典型培養實驗室之專利寄存處之永久保藏，隨後由儲存庫為其分配登錄號ATCC PTA-122674。 實例7 本研究之目的係使用次世代定序來建立遺傳一致性、獲得共有序列並評估存在於PRRSV毒株SD 11-21第84代及第100代製備物(二者均在實例6中闡述)內之基因體變體(亞種群)。 使用大量同步定序(MP-Sep)系統之序列表徵係包含若干個步驟之標準程序，該等步驟包括：自病毒製備物提取核酸、cDNA文庫合成及定量、藉由PCR進行純系擴增及DNA文庫之富集及藉由Roche/454次世代定序平臺進行文庫定序。使用合成定序來同時測定cDNA文庫中片段之核苷酸順序。使用所得片段之生物資訊學分析藉由將每一數據集映射至參考序列來進行基因體鑑別及表徵。在藉由BioReliance之此分析中所使用之參考序列係由實例1中所揭示之PRRSV SD 11-21第83代(P83)之全長序列(SEQ ID NO:9)組成。 PRRSV SD 11-21基因體之定序產生P84及P100樣品二者之完整基因體覆蓋。P84及P100之完整共有基因體可分別參見SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13。cDNA共有序列亦利用基因庫進行寄存。處於P84之PRRS毒株SD 11-21之cDNA共有序列已分配基因庫登錄號KU131566 (SEQ. ID. NO:12)。指定為SEQ. ID. NO:12之cDNA共有序列係： 1 ATGACGTATA GGTGTTTGCT TTATGCCGCG GCATTTGTAT TGTCAGGAGC TGTGACCACT 61 GGCACAGCCC GAAACTTGCT GCACAGAAAC ACCCTTCTGT GACAGCCTCC TTCAGGGGAG 121 TTTAGGGGTT TCTCCCTAAC GCCCTGCTTC CGGAGTTGCA CTGCTTTACG GTCTCTCCAT 181 CCTTTTAACC ATGTCTGGGA TTCTTGATCG GTGCACGTGC ACCCCCAATG CCAGGGTGTT 241 TGTGGCAGAG GGCCAAGTCT ACTGCACACG ATGTCTCAGT GCACGGTCCC TCCTTCCCCT 301 AAATCTCCAA GTTTCTGAGC TTGGGGTACT TGGTTTATTC TACAGGCCCG AAGAGCCATT 361 ACGGTGGACG TTGCCACACG CATTCCCCAC TGTCGAGTGT GCTCCTGCTG GCGCTTGTTG 421 GCTTTCTGCA ATTTTTCCAA TTGCGCGAAT GACCAGTGGA AACCTGAATT TCCAGCAAAG 481 GCTGGTACGT GTCGCAGCCG AGCTTTACAG AGCCGGCCAG CTCACCCCTA CAAGCCTGAA 541 AACCTTACAG GTCTATGAAA GGGGTTGCCG TTGGTACCCC ATTGTTGGAC CTGTTCCTGG 601 AGTGGCCGTT TACGCCAACT CCCTACATGT GAGTGACAAA CCCTTCCCAG GAGCGACTCA 661 CGTGCTGACC AACTTACCAC TCCCGCAGAG ACCAAAATCT GAAGATTTCT GCCCCTTCGA 721 GTGCGCCACG GCCGCCGTCT ATGACATCGG CCATGACGCC GTCATGTATG TAACCGAGGA 781 AAAGGTTTCC TGGGCTCCTC GTGGCGGGGA TAAAGGGAAA TTTGAGACTG TTCCTGAGGG 841 GTTGAAGTTG ACTGCGGAAC GACTCTACAC CTCCTTCCCG CCTCACCATG CGGTGGACAT 901 GTCCCTTTTC ATCTTCACAG ACCTTGAGTG CGGCGCTTCC ATGCGGGTCG AACGCCAATA 961 TGGTTGCCTC TCTGCTGGCA CTGTCCCTGA AGGCAACTGC TGGTGGAGTC TGTTTGGCTC 1021 GCTTTCGTTA GAAGCTCAGT ATAAAGAAAT CCGCTACGCC GCCCAATTTG GCTATCAGAC 1081 CAAACATGGC GTTACTGGCA AGTACCTGCA GCGGAGGCTG CAAATTAATG GTCTCCGAGC 1141 AGTGGTTGAC CCGAATGGGC CTCTTGTCGT ACAGTATTTC TCCGTTAAGG AGAGCTGGAT 1201 GCGCCACGTG AGACTGGCGG AAGAGCCAGG CTATCCTGGG TTTGAGGATC TCCTCAGGAT 1261 AAGAGTCGAG CCCAACACGT TGCCTTTGTC CAACAAGGAC GAGAAAATCT TCCGTTTCGG 1321 CGGTTACAAG TGGTACGGTG CTGGGCGGAG GGCAAGGAGA ACACGTGCAA GAGCAGTCAC 1381 CGCAGTTGCT AGTCATGCTC CGCCCGCTCG TGGGGCCCAG CAGGCCGAGA AGCACGAAGT 1441 TGCTAGTGCC AACAAGACTG AGCTCCTTAC GCACTACTCC CCACCTGCTG AAGGGAATTG 1501 CGGCTGGCAC TGCATCTCCG CCATCATGAA CCGGATGGTGCATTCCAAGT TTGAAACCGC 1561 CCTTTCCGAA AGAGTGAGAT CCCCGGAAGA CTGGGCGACT GATGAGGATC TTGTGAATAC 1621 TATTCAAATC CTCAGGCTCC CTGCGGCCTT AGACAGGAAC GGCGCCTGTA AAAACGCCAA 1681 GTACATCCTT AAGCTGGAAG GTGAGCACTG GACTGTTTCA GTGACCCCCG GAATGCCCCC 1741 CTCTTCACTT CCTCTTGAAT GCGTTCAGGG TTGTTGCGAG CATAAGGGCA ATTTTGACTC 1801 TCAAAACGCG GTCGGTTTCT TTGGGTTCGA CCCTGCCAGC CTTGACCGAC TCGCTGGGGT 1861 AATGCATCTG CCCAGCAGCG CCATCCCTGC CGCCCTGGCC GAGTTGTCTG GTGAACTTGA 1921 TTGTTCAACT CCCCCGGCCA CCACTGTGTG GACTACCTTG CAGTTTTATG CTCGTCTTGG 1981 TGGGGGGGAG CATCCTGATC AAGAGTGCTT GAGAAAAATC ATCAGCCTCT GTGAGGTGCT 2041 CGGGAGTTGC TGCTGTTCTC AGAGTAGGGT CAACCGGGTC ACCCCGGAAG AGGTCGCAGC 2101 AAAGATTGAC CTGTATCTTC GTGACGCAGC GAGTCTTGAA GAGTGCTTGG CTAGGCTTGA 2161 GAAAGCTCGC CCGCCAAGCA TGCTGGACAC CTCCTTTGAC TGGGATGTTG TACTCCCTGG 2221 TGTTGGGACG GCTGCTCGGG CAGCAGAACT ACCCCCCACC GATGAGTGTC GCGCTCTAGT 2281 CACTGCTGTG GCCCAAAGGC CTTCGCCGAA AGTTCAGCCT CGAAAGGCGG GGTCTGTTAA 2341 GAGTCTACCA GAGATCAGGC CTGTCCCTGC CCCACGCAGG AAGGTTAAGT CTAGTTGTGG 2401 TGATCTGGCC CCGTTGGGCG GCAATTTCCC TGATAGCTGG GAAGATTTGG CTGGTGGCTC 2461 CCTTAATCTC CAGATCTTAC CTGAGCCGGT GGCACAATCC TTTGAACCTG TGCCTGTCCC 2521 TGCACCGCGC AAGACTGCGC CTCGATTAGT GTCGTCATCA TTGGCGTCGA CCCCCGTACC 2581 TACACCACGA TGTGGGTTTC GGCAGTTTGA GGGAATGAAT TTGACAGCTG TGACCCTAGC 2641 ATGCCAGGAT GAGTCCCTCA ATTTGTCTGC ATCCTCGCAG ACTGAATATG AGGCTTCTCC 2701 TTTGGCATTG CAGCAGGGTG AGGATGTCCT TGCGGTGGGG GGACGAGAAG CCGAAGAAGT 2761 CCTGAGCGGA ATCTCGGGAA TGTCAGGTGG CATTAGATTA GCGCCCGCAT CATCAAGTAG 2821 CTCCTTGTCA AGCGTGGAGA TCACACGCCC GAAGTACTCA GCTCAAGCCA TCATTGACTC 2881 AGGTGGACCC TGTTGCGGGC ACCTTCAAGA GGTGAAAGAG AAATACCTTA ATGTCATGCG 2941 TGAGGCATGT GATGCGACTA AGCTCGATGA CCCTGCCACG CAAGAATGGC TCTCTCGCAT 3001 GTGGGAGAGG GTAGACATGC TAACCTGGCG CAACACGTCC ATCTTTCAAG CGCCTTTTAC 3061 CTTAGCTGAC AAGTTTAAGT CCCTCCCGAA GATGATACTC GAAACGCCGC CACCCTACCC 3121 TTGCGGGTTT GTGATGATGC CCCGCACGCC CGCACCTTCT GTGGGTGCGG AAAGCGACAT 3181 CACCGTTGGT TCAGTTGCTA CTGAAGATGT CCCGCGTATA CTCGGGGAGG TGGGAGATGT 3241 TGGCAAGATG ACCGGCCAGG AACCCTTAGA ATCCTTCGCA GATGAACTGG CAGATGACCA 3301 ACCTGCTAGG GAGTCCCGAA CACAAGCTCC TCCTGCAAGC ACAGGTAGCG CTGGTTTAGT 3361 TTTGGATTCT GGAGGGTCGC TGGGGCTCAC TGACCTGCCG CTCCCAAACA ATATAGACGC 3421 GGGCGGGAAA GGACCGTTTC ACGCGGTCAA GAAAAAAGCT GTAGGGTGCT TTGACCAACT 3481 GAGCCGCCGG GTTTTTGACA TCGTCTCCCA TCTCCCTGTT TTTTTTTCAC GCCTTTTCGC 3541 GCCCGGTGGT TTTTACTCTT CGGGTGACTG GAGTTTTGCA GCTTTTACTT TATTGTGTCT 3601 CTTTTTATGT TACAGTTATC CGGCCTTTGG TTTTGCTCCC CTCGTGGGTG TATTTTCTGG 3661 GTCTTCTCGG CGCGTGCGCA TGGGGGTTTT TGGCTGCTGG CTGGCTTTTG CTGTTGGTTT 3721 GTTCAAGCCT GCACCCGACC CAGTCGGTGC TGCTTGTGAG TTTGACTCGC CAGAGTGTAG 3781 AGACATCCTT CATTCTTTTG AGCTCCTGCA ACCTTGGGAC CCTGTTCGCA GCCTTGTGGT 3841 GGGCCCCGTC GGTCTCGGCC TTGCCATTTT TGGCAGGTTA CTGGGCGGGG CACGCTACGT 3901 CTGGCTGCTT TTGCTTAGGC TTGGCATCGT TTCAGACTGT ATCCTGGCTG GAGCCTATGT 3961 GCTTTCGCAA GGCAGGTGTA AAAAGTGTTG GGGATCTTGT ATAAGAACAG CCCCCAGTGA 4021 AGTTGCCTTC AATGTGTTTC CCTTTACACG CGCAACTAGA TCGTCACTTG TCAACCTGTG 4081 CGACCGGTTC TGTGCACCCA AGGGCATGGA CCCCATCTTC CTTGCCACAG GATGGCGCGG 4141 ATGCTGGTCC GGCCAGAGCC CCATTGAGCA ACCCTCTGAA AAACCCATAG CGTTCGCCCA 4201 GTTGGACGAA AAGAAAATCA CGGCTAGGAC TGTGGTTGCC CAGCCTTATG ACCCCAACCA 4261 AGCTGTGAAG TGCCTGCGAG TCCTCCAGGC GGGTGGAGCG ATGGTAGCCG AGGCAGTTCC 4321 AAAAGTAGTC AAAGTTTCTG CTGTCCCGTT TCGAGCCCCT TTTTTTCCTG CCGGAGTGAA 4381 AGTTGACCCT GAATGCAGGG TCGTGGTTGA CCCTGACACC TTTACAACCG CTCTCCGGAC 4441 CGGCTACTCC ACCACAAACC TCATTCTTGG TGTTGGGGAC TTTGCCCAGC TGAATGGGTT 4501 GAAGATCAGA CAAATTTCCA AGTCCCCAGG AGGGGGCCCT CACCTCATGG CGGCTTTACA 4561 TGTTGCTTGC TCGATGACTT TGCACATGCT TGTTGGGATT TATGTCACCA TGGTGGGTTC 4621 TTGTGGCTCT GGCACTAACG ATCCGTGGTG CACTAACCCG TTTGCCGTCC CTGTCTATGG 4681 GCCTGGCTCT CTCTGCACGT CCAGGTTGTG CATTTCCCAG CGTGGCCTGA CCCTGCCCTT 4741 AACAGCGCTT GTGGCAGGGT TTGGCGTTCA GGAAATCGCT TTGGTTGTTT TAATCTTTGT 4801 CTCCATCGGG GGTATGGCCC ACAGGTTGAG TTGCAAGGCT GACGTGCTGT GTATCCTGCT 4861 TGCTATTGTC AGCTATGTTT GGCCACCCCT TACCTGGTTG CTTTGTGTGT TTCCTTGCTG 4921 GTTGCGCTGG TTTTCTTTAC ATCCCCTTAC TATTCTATGG TTAGTGTTTT TCTTGATTTC 4981 TGTAAATACG CCCTCGGGAA TCTTGGCCTT GGTCCTGTTA ATCTCTCTTT GGCTCCTTGG 5041 TCGCTATACC AATGTTGCCG GCCTTGTCAC CCCTTATGAC ATTCACCATT ACACCAACGG 5101 CCCTCGCGGC GTTGCCGCCT TGGCCACTGC CCCGGATGGG ACCTACCTGG CTGCTGTCCG 5161 CCGTGCTGCG TTGACTGGCC GTACCATGCT GTTCACCCCG TCCCAACTTG GCTCGCTCCT 5221 TGAGGGCGCT TTTAGAACCC AAAAGCCTTC ACTGAACACT GTCAATGTAG TTGGGTCCTC 5281 CATGGGCTCC GGCGGGGTGT TCACCATTGA TGGGAAGATC AAATGTGTGA CCGCTGCTCA 5341 TGTCCTCACG GGTAACTCTG CCAGGGTTTC CGGGGTTGGC TTCAATCAAA TGTTGGACTT 5401 TGATGTTAAA GGGGATTTTG CCATAGCCGA TTGTCCGAAT TGGCAAGGAG TCGCCCCCAA 5461 GTCCCGGTTC TGCAAGGATG ATTGGACTGG CCGTGCTTAT TGGCTCACGT CCTCCGGCGT 5521 CGAACCCGGC GTCATTGGGC AAGGATTCGC CTTTTGTTTC ACCGCGTGCG GCGATTCCGG 5581 GTCCCCAGTG ATCACCGAGG CCGGGGAGCT TGTCGGTGTC CACACGGGAT CAAACAAACA 5641 AGGAGGAGGC ATTGTTACGC GCCCTTCAGG CCGGTTTTGT AATGTGACAC CCACCAAATT 5701 AAGTGAATTG AGTGAATTCT TCGCTGGACC TAGGGTCCCG CTTGGTGACG TGAAGGTTGG 5761 CAATCACATA ATCAAAGATA TAAATGAGGT GCCCTCAGAT CTCTGCGCCT TACTCGCTGC 5821 CAAACCCGAA TTGGAAGGAG GCCTCTCCAC CGTTCAACTT CTGTGCGTGT TTTTTCTCCT 5881 ATGGAGAATG ATGGGACATG CCTGGACACC CTTGGTTGCC GTTGGTTTTT TCATCTTGAA 5941 TGAAGTTCTC CCAGCAGTCC TGGTCCGGAG TGTCTTCTCC TTTGGAATGT TCGCACTGTC 6001 TTGGTTCACG CCGTGGTCTG CACAAATTCT AATGATCAGG CTCTTGACAG CAGCCCTAAA 6061 CAGAAACAGA TCGTCACTTG CCTTTTACAG CCTGGGCGCA CTAACCGGTT TTGTTGCAGA 6121 TCTTGCAACC AATCAGGGGT ATTTATTGCA CGCGGTCATG AATGTGAGCA CCTATGCATT 6181 CCTGCCTCGT GCAATGGCCG TGACCTCACC AGTCCCAATA GTTGCGTGTG GCGTTGTGCA 6241 CTTGCTTGCC ATCATTCTGT ACTTGTTCAA GTACCGTAGC CTGCATGCCG TCCTGGTCGG 6301 CGATGGTGCG TTTTCCGCGG CTTTCTTCTT GCGATACTTT GCGGAGGGAA AGTTGAGGGA 6361 AGGGGTGTCG CAGTCTTGCG GCATGAATCA TGAGTCACTA ACCGGTGCCC TCGCCATGAA 6421 ACTCAGCGAC GAAGACTTGG ACTTCCTCAC AAAATTGACT GATTTTAAGT GCTTTGTTTC 6481 TGCATCCAAC ATGAGGAATG CGGCGGGTCA ATTTATAGAG GCCGCCTACG CCAAAGCACT 6541 GAGGGTGGAA CTTGCCCAGT TGGTTCAAGT CGATAAAGTT CGAGGTGTCC TGGCCAAACT 6601 TGAAGCTTTC GCTGACACCG TGGCGCCTCA ACTTTCACCC GGTGACATTG TTGTCGCCCT 6661 TGGACACACA CCTGTCGGCA GCATTTTTGA CCTGAAGGTC GGCAATGTTA AGCACACTCT 6721 CCAGTCCATT GAGACCAGAA CCCTTGCCGG GTCTAAAATG ACTGTGGCGC GCGTCGTAGA 6781 CCCAACCCCC ACACCCCCGC CCGCACCTGT GCCCATTTCC CTCCCACCAA AGGTTTTGGA 6841 GAACGGTCCC AACGCCTGGG GGGATGAGAA CGGTTTGAAC AAAAAAAAGC GGCGCAAGAT 6901 GGAGGCCGTT GGCATTTACG TTATGGGCGG GAAAAAGTAT CAAAAATTTT GGGATAAGAA 6961 TTCTGGTGAT GTGTTCTATG AAGAAGTCCA CGACAACACA GACGCGTGGG AATGCCTCAG 7021 AGTTGACAAC CCTGCCGACT TGGATCCTGA GAGGGGAACC TTGTGTGGAC ACACCACCAT 7081 AGACAACAGG CCTTACCATG TTTATGCTTC TCCGTCTGGT AGGAAGTTTC TAGTCCCTGT 7141 CAACCCGGAG AGCGGAAAAG CTCAGTGGGA AGCTGCTAAG CTTTCTTTAG ATCAGGCCCT 7201 CAGTATGATG AATGTCGACG GCGAACTGAC CGCCAAAGAA GTGGAAAAAT TGAAGAGAAT 7261 AATTGACAAA CTCCAGGGCC TGACTAAGGA GCAGTGTTTA AACTGCTAGC CGCCAGCGGC 7321 TTGACCCGCT GTGGTCGCGG CGGCTTGGTT GTTACTGAGA CAGCGGTAAA GATAGTCAGG 7381 TTCCACAACC GGACCTTTAC CCTAGGGCCT GTGAATTTGA AAGTAGCTAG CGAAGTTGAG 7441 TTGAAGGACG CGGTCGAGCA CGGCCAACAC CCGGTCGCGA TACCAGCCGA TGGTGGCGTC 7501 GTGCTCCTGC GTTCCGCTGT TCCTTCGCTT ATAGACGTCC TGATCTCCGG TGCTGACGCA 7561 TCCCCCAGGT TGCTCGCCCG TCACGGACCG GGAAATACTG GGGTCAATGG CGCGCTTTGG 7621 GATTTTGAGT CTGAAGCTAC CAAAGAGGAA GTAGCACTTA GTGCGCAAAT AATACAGGCC 7681 TGTGACATTA GACGCGGCGA TGCACCTGAG ATTGGCCTTC CTTACAAGTT GTACCCTGTT 7741 AGGGGCAACC CTGAACGGGC AAGAGGGGTT CTAATGAACA CAAGATTTGG AGACATACCT 7801 TACAAGACCC CCAGCGACAC CGGGAGCCCG GTGCACGCGG CCGCCTGCCT TACGCCCAAC 7861 GCCACTCCAG TAACTGATGG GCGCTCCATC CTGGCCACGA CCATGCCCTC CGGGTTTGAA 7921 CTATATGTGC CGACCATTCC AGCGTCTGTC CTTGATTACC TTGACTCCAG ACCAGACTGT 7981 CCTAAACAGT TGACTGAGCA CGGGTGTGAA GATGCCGCGT TGAAGGACCT TTCTAAATAT 8041 GACCTGTCCA CCCAAGGCTT TGTGTTACCT GGAGTTCTAC GCCTCGTGCG AAAATATCTG 8101 TTTGCTCATG TAGGTAAGTG CCCGCCTGTC CACCGGCCCT CTACCTATCC TGCCAAGAAC 8161 TCCATGGCCG GAATAAATGG GAACAGGTTC CCAACCAAGG ATATTCAAAG CATCCCTGAG 8221 ATCGACGTTT TGTGTGCACA AGCTGTGCGA GAAAACTGGC AAACTGTTAC ACCCTGCACT 8281 CTTAAGAAGC AGTATTGCGG TAAAAAGAAG ACCAGGACCA TACTTGGCAC CAACAACTTC 8341 GTTGCGCTGG CCCACCGGGC GGCGCTGAGT GGTGTCACCC AGGGTTTCAT GAAGAAGGCG 8401 TTTAACTCAC CCATCGCCCT TGGGAAAAAT AAATTTAAGG AGCTACAGAC TCCAGTCTTG 8461 GGTAGGTGTC TTGAGGCTGA TCTCGCTTCC TGCGATCGAT CCACGCCTGC AATCGTTCGC 8521 TGGTTTGCCG CCAACCTTCT TTATGAACTT GCCTGTGCTG AGGAGCATTT ACCGTCGTAC 8581 GTGCTGAACT GTTGTCACGA CCTATTGGTC ACGCAGTCCG GCGCAGTGAC TAAGAGAGGT 8641 GGCCTGTCGT CCGGTGACCC AATCACCTCT GTGTCCAACA CCATTTATAG CTTGGTGATC 8701 TATGCACAGC ATATGGTGCT TAGTTACTTC AAAAGTGGTC ACCCCCATGG CCTTCTGTTT 8761 TTACAAGACC AGCTAAAGTT TGAAGACATG CTCAAAGTTC AACCCCTAAT CGTCTATTCG 8821 GACGACCTCG TGTTGTATGC CGAGTCTCCC ACCATGCCAA ACTATCACTG GTGGGTTGAA 8881 CACCTGAATT TGATGTTGGG ATTTCAGACG GACCCAAAGA AGACTGCAAT AACAGACTCA 8941 CCTTCATTCC TAGGTTGTAG AATAATAAAT GGCCGCCAGTTAGTACCCAA CCGTGACAGA 9001 ATTCTCGCGG CCCTTGCCTA TCACATGAAG GCGAGTAATG TTTCTGAGTA CTACGCCTCC 9061 GCAGCCGCAA TACTCATGGA CAGTTGTGCT TGTCTAGAGT ATGATCCTGA GTGGTTTGAA 9121 GAACTTGTGG TTGGAATGGC GCAGTGCGCC CGTAAGGACG GCTATAGTTT CCCCGGCCCG 9181 CCGTTCTTCT TGTCCATGTG GGAAAAGCTC AGGTCAAATT ATGAGGGGAA GAAGTTGAGA 9241 GTGTGTGGTT ATTGCGGAGC TTCAGCCCCG TATGCTACTG CCTGTGGCCT TGACGTTTGT 9301 GTTTACCACA CCCACTTTCA CCAGCATTGT CCAGTCATAA TATGGTGTGG CCACCCGGCG 9361 GGTTCTGGGT CCTGCGATGA GTGCAAATCC CCTACAGGGA AGGGTACAAG CCCTCTGGAT 9421 GAGGTCTTAA GACAAGTCCC TTATAAGCCT CCACGGACTA TTCTTATGCA TGTGGAGCAG 9481 GGCCTCACCC CCCTTGACCC AGGCAGATAC CAGACCCGCC GTGGGTTGGT TGCTGTCAGG 9541 CGCGGGATAA GGGGAAATGA AGTTGACCTG CCAGATGGTG ATTATGCCAG TACTGCCCTA 9601 CTCCCCACCT GCAAAGACAT AGACATGGTT GCTGTGGCCT CCAATGTGTT GCGCAGTAGG 9661 TTCATCATCG GCCCACCTGG CGCAGGGAAA ACACACTGGC TTCTTCAACA GGTTCAGGAT 9721 AGTGATGTCA TTTACACGCC AACCCATCAG ACCATGCTTG ACATGATCAA GGCTTTGGGG 9781 ACGTGCCGGT TCAATGTCCC GGCAGGCACA ACGCTGCAAT TCCCTGCCCC CTCCCGTACC 9841 GGCCCGTGGG TTCGCATCCT TGCCGGCGGT TGGTGTCCAG GTAAGAATTC CTTCCTGGAT 9901 GAAGCAGCGT ATTGCAATCA CCTTGACGTC TTGAGGCTTC TCAGCAAAAC TACCCTCACC 9961 TGTCTGGGGG ATTTCAAACA ACTCCACCCG GTGGGTTTTG ATTCTCATTG CTATGTTTTT 10021 GATATCATGC CTCAGACTCA ACTGAAGACC ATCTGGAGGT TTGGACAGAA TATCTGTGAC 10081 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GCCATTCAGC CAGATTACAG GGACAAACTC GTGTCCATGG TCAACACAAC CCGTGTAACC 10141 TATGTGGAAA GACCTGTCAA GTATGGGCAA GTCCTCACCC CCTACCACAG AGACCGAGAG 10201 GATGGTGCTA TCACTATTGA CTCCAGTCAA GGCGCCACAT TTGATGTGGT CACATTGCAT 10261 TTGCCCACTA AAGATTCACT CAACAGGCAA AGAGCCCTTG TTGCTATCAC CAGGGCAAGG 10321 CATGCAATCT TTGTGTATGA CCCACACAGG CAACTGCAGA GCATGTTTCG TCTTCCTGCA 10381 AAAGGCACAC CTGTCAACCT TGCCGTGCAC CGTGACGAGC AGCTCATCGT ATTAGATAGA 10441 AATAACAAAG AGTGCACGGT TGTTCAGGCT TTAGGCAATG GGGACAAATT CAGGGCCAGT 10501 GACAAGCGCG TTGTAGATTC TCTTCGCGCC ATTTGTGCAG ATCTTGAAGG GTCGAGCTCC 10561 CCGCTCCCCA AGGTCGCACA CAACTTGGGA TTTTATTTCT CACCTGATTT GACACAGTTT 10621 GCTAAACTCC CGGCGGAACT TGCACCCCAC TGGCCCGTGG TGACAACTCA GAACAACGAA 10681 AATTGGCCAG ACCGGCTGGT TGCTAGCCTC CGCCCTATCC ACAAATATAG CCGCGCGTGC 10741 ATCGGAGCCG GCTATATGGT GGGCCCCTCA GTGTTTCTAG GCACTCCTGG GGTTGTGTCA 10801 TACTATCTCA CACAATTTGT CAAAGGGGAG GCTCAGGTGC TTCCGGAGAC GGTCTTCAGC 10861 ACCGGCCGAA TTGAGGTAGA TTGTCGAGAG TATCTTGATG ATCGGGAACG AGAAGTTGCT 10921 GAGTCCCTCC CACATGCCTT TATTGGCGAC GTCAAAGGCA CTACCGTTGG GGGATGTCAC 10981 CATGTCACTT CTAAATATCT CCCACGCTTC CTTCCCAAGG AATCAGTTGC GGTGGTTGGG 11041 GTTTCAAGCC CCGGGAAAGC CGCAAAAGCA GTTTGCACAT TAACAGATGT GTACCTCCCA 11101 GATCTTGAGG CTTACCTCCA TCCAGAGACC CAGTCTAAGT GCTGGAAAGT GATGTTGGAC 11161 TTCAAGGAAG TTCGACTGAT GGTCTGGAGA GATAAGACGG CCTACTTTCA ACTTGAAGGC 11221 CGCCATTTCA CCTGGTACCA GCTTGCAAGT TATGCCTCGT ACATCCGAGT TCCCGTTAAC 11281 TCTACGGTGT ACCTGGACCC CTGTATGGGC CCTGCCCTTT GCAACAGAAG AGTCGTTGGG 11341 TCTGCACATT GGGGAGCTGA CCTTGCAGTT ACCCCTTATG ATTATGGTGC CAAAATCATT 11401 CTGTCTAGTG CGCACCATGG TGAAATGCCT CCTGGGTACA GAATTCTAGC GTGCGCGGAG 11461 TTCTCGCTTG ATGACCCAGT GAGGTACAAA CACACTTGGG GGTTTGAATC GGATACAGCG 11521 TATCTGTACG AGTTCACCGG AAACGGTGAG GACTGGGAGG ATTACAATGA TGCGTTTCGT 11581 GCACGCCAGA AAGGGAAAAT TTATAAGGCC ACTGCCACCA GCATGAGATT TCATTTTCCC 11641 CCGGGTCCTG CCATTGAACC AACATTGGGC CTGAACTGAA ATGAAATGGG GGCTGTGCAG 11701 AGCCTTTTCG ACAAAATTTG CCAACTTTTT GTGGATGCTT TCACGGAATT TTTGGTGTCC 11761 ATTGTTGATA TCATCATATT TTTGGCCATT TTGTTTGGCT TCACCATCGC AGGCTGGCTG 11821 GTTGTCTTCT GTATCCGACT GGTTTGCTCC ACGGTACTCC GTGCGCGCTC TACCATTCAC 11881 CCTGAGCAAT TACAGAAGAT CCTATGAGGC CTTCCTTTCC CAGTGCCAAG TGGACATTCC 11941 CGCCTGGGGA ACTAAGCATC CCTTGGGGGT GCTTTGGCAC CACAAGGTGT CAACTCTGAT 12001 TGATGAAATG GTGTCGCGTC GAATGTACCG CATCATGGAA AAAGCAGGAC AGGCTGCCTG 12061 GAAACAGGTT GTGAGCGAAG CTACATTGTC TCGCATAAGT GGCTTGGATG TGGTGGCTCA 12121 TTTTCAGCAT CTTGCTGCCA TTGAAGCCGA GACTTGCAAA TATTTGGCCT CTCGGCTGCC 12181 CATGCTACAC AACCTAGTCA TGTCAGGGTC GAATGTAACC ATAGTGTATA ATAGCACTTT 12241 GGGTCAAGTG TTTGCCATTT TCCCAACCCC TGGTTCCCGG CCAAAACTTT CTGATTTTCA 12301 ACAATGGCTC ATAGCTGTGC ATTCTTCCAT ATTTTCTTCT GTTGCGGCTT CTTGTACTCT 12361 TTTTGTTGTG CTGTGGCTGC GAATTCCAAT ACTACGTACT GTTTTTGGTT TCCGCTGGTT 12421 AGGGGCAACT TTTCTTTCGA ACTCACAGTG AATTACACGG TGTGCCCACC CTGCCTCACC 12481 CGGCAAGCAG CCGCTGAGAT CTACGAACAC AGCGGGTCTC TTTGGTGCAG GATAGGGCAT 12541 GACCGATGTA GCCAGAGTGA TCATGACGAA CTAGGGTTCT TGGTTCCACC TGGCCTTTCC 12601 AGCGAGGGCC ACTTGACCAG TGTTTACGCC TGGCTGGCGT TCTTGTCTTT CAGCTACACA 12661 GCCCAGTTCC ACCCCGAGAT ATTTGGAATA GGGAATGTGA GTAGAGTTTA TGTTGACGTC 12721 ACTCACCAAC TCATCTGCGC CGAACACGAC GGGCAGAACA CCACCCTGCG TCGCCATGAC 12781 AATATCTCAG CCGTGTTTCA GACCTATTAC CAACATCAGG TCGATGGCGG CAATTGGTTT 12841 CACCTAGAAT GGCTGCGTCC CTTCTTTTCC TCTTGGCTGG TTTTGAATGT CTCGTGGTTT 12901 CTCAGGCGTT CGCCTGCAAA CCGTGTTTCA GTTCGAGTCT TTCAGACATC AAAACCAACA 12961 CCACCGCAGC TGCAGGCTTT GCTGTCCTCC AAGACATCAG CTGTCTTAGG CATGGCTACT 13021 CGTCCATTGA GGCGATTCGC AAAAGCCGTC AATGCCGCAC GGCGATAGGA ACGCCCGTGT 13081 ACATCACTGT CACGGCCAAT GTAACAGATG AGAATTACTT GCATTCCTCT GATCTCCTCA 13141 TGCTTTCCTC TTGCCTCTTC TATGCTTCTG AGATGAGTGA AAAGGGATTC AATGTGGTCT 13201 TCGGCAACGT GTCAGGCATT GTGGCTGTGT GTGTCAACTT TACCAGCTAT GTCCAACATG 13261 TTAAGGAGTT TACTCAGCGC TCTTTGGTGG TCGACCACGT GCGACTGCTT CATTTCATGA 13321 CACCTGCGAC CATGAGGTGG GCAACAGTTT TAGCCTGTCT TTTCGCCATC TTGTTGGCGA 13381 TTTGAATGTT TAAGTATGTT GGGGAAATGC TTGACCGCGG GCTACTGCTC GCAATTGCTT 13441 TTTTTCTGGT GTATCGTGCC GTTCTGTTTT GCTGCGCTCG TCAACGCCGC CAGCAACAGC 13501 AGCTCCCATT TACAGTTGAT TTATAACCTG ACGATATGCG AGCTGAATGG CACAGATTGG 13561 TTGAATCAAA AGTTTGATTG GGCAGTGGAG ACTTTTGTCA TTTTTCCTGT GTTGACCCAC 13621 ATTGTCTCCT ACGGTGCCCT TACCACCAGC CATTTCCTTG ACACGGCCGG CCTAATCACT 13681 GTGTCTACCG CCGGATATTA CCATGGGCGG TATGTGTTGA GTAGCATCTA CGCCGTCTTT 13741 GCCCTGGCTG CGTTGATTTG TTTTGTCATT AGGTTGACAA AAAACTGTAT GTCCTGGCGC 13801 TACTCATGTA CCAGATATAC CAACTTTCTT CTGGACACCA AAGGCAATCT CTATCGTTGG 13861 CGGTCACCCG TCGTTATAGA GAGAAGGGGT AAAGTTGAGG TTGGAGACCA CCTAATCGAC 13921 CTCAAAAGAG TTGTGCTTGA TGGTTCCGCG GCAACCCCTA TAACCAAGAT TTCAGCGGAA 13981 CAATGGGGTC GTCCCTAGAC GACTTCTGCA ATGACAGCAC AGCTGCACAA AAGGTGCTTT 14041 TGGCGTTTTC CATCACCTAT ACGCCAATAA TGATATATGC CCTGAAGGTA AGTCGCGGCC 14101 GACTGTTAGG GCTTTTGCAT CTTTTAATTT TCTTGAATTG TGCTTTCACC TTCGGGTACA 14161 TGACATTTGT TCATTTTCAG AGTACAAACA AGGTCGCGCT CACTATGGGA GCAGTTGTTG 14221 CACTCCTTTG GGGGGTGTAC TCAGCCATAG AAACCTGGAA ATTCATCACT TCCAGATGCC 14281 GTTTGTGCTT GCTAGGCCGC AGGTACATTC TGGCCCCTGC CCACCACGTT GAAAGTGCCG 14341 CGGGCTTTCA TCCGATTGCG GCAAGTGATA ACCACGCATT TGTCGTCCGG CGTCCCGGCT 14401 CCACTACTGT TAACGGCACA TTGGTGCCCG GGTTGAAAAG CCTCGTGTTG GGTGGCAGAA 14461 AAGCTGTTAA GCGGGGAGTG GTAAACCTCG TTAAATATGC CAAATAACAA CGGCAGGCAG 14521 CAAAAAAATA AGAAGGGGAG TGGCCAGCCA GTCAATCAGC TGTGCCAAAT GCTGGGCAAG 14581 ATCATCGCCC AGCAAAATCA GTCCAGAGGC AAGGGACCGG GTAAGAAAAA TAAGAAGAGA 14641 AACCCGGAGA AGCCCCATTT TCCTCTTGCG ACCGAAGATG ACGTCAGGCA TCACTTCACC 14701 CCCAGTGAAC GGCAATTGTG TCTGTCGTCG ATCCAGACTG CCTTCAACCA GGGCGCTGGA 14761 ACTTGCACCC TGTCAGATTC AGGGAGGATA AGTTACACTG TGGAGTTTAG TTTGCCGACG 14821 CACCACACTG TGCGCCTTAT TCGCGCCACA GCATCACCTC CATCGTGATG GGCTTACATT 14881 CTTGGAGCTC CTCAGTTTCA CAATTGGAAG AATGTGTGGT GAATGGCACT GATTGGCACT 14941 GTGCCTCTAA GTCACCTATT CAATTAGGGC GACCGTGTGG GGGTTTAGTT TAATTGGCGA 15001 GAACCACGCG GCCGAAATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 熟習此項技術者將認識到，每一基因體共有序列之聚腺苷尾可在長度上與上文所報告之序列不同。 已進行變體鑑別以確定兩代病毒種群中核苷酸變化之數量及頻率。表16顯示與參考序列相比，P84及P100中發現11個核苷酸變化。11個變體位置中之6個在各代間係一致的，唯P100中存在5個P84中不存在之核苷酸變化。該等變化表明，在病毒自84至100之傳代期間產生不到大約一半之亞種群變體。 表16. PRRSV SD 11-21序列變體。

ND=未檢測出。 實例8 本研究之目的係在接種-攻毒研究中評估經實驗性改造之活PRRSV疫苗之劑量反應及免疫啟動(OOI)。評估疫苗之其降低肺損傷、肺及血液中之病毒負荷及臨床徵象之能力。本研究係在Veterinary Resources, Inc., Cambridge, Iowa之BSL-2實驗室中進行，使用如實例2及3中所闡述之類似程序及條件。實驗室分析係在愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室(Ames, Iowa)進行，如實例2及3中所闡述。有八十(80)隻對PRRSV為血清陰性之臨床上健康之14或15日齡之斷乳豬入選本研究。將豬隨機分配至四個治療組之一(n=20隻/組)。治療組包括以安慰劑匹配之對照組及三個PRRSV疫苗劑量組(2.7、4.1或5.1 log₁₀ TCID₅₀ /mL)。 在第0天，豬之頸部右側肌內(1.0 mL)接受其各別疫苗或安慰劑。疫苗調配成包括SD 11-21 PRRSV毒株、穩定劑及防腐劑(慶大黴素)。使用OPTI-MEM^® I減血清培養基作為摻和稀釋劑。使用在處於最高傳代度(MCS+20)之種原細胞株(MCS)上生長之處於計畫用於生產之最高傳代度(MSV+5)之種原病毒株(MSV)來製備疫苗。藉由感染MARC-145細胞來測定每一疫苗之中值組織培養感染劑量(TCID₅₀ )。接種後觀察到沒有局部或全身性不良反應。與安慰劑對照組相比，在接種後第2天，所有疫苗組中觀察到直腸溫度之短暫上升，但仍保持在正常生理範圍內，且此後未觀察到。 在接種後第28天，用4 mL (1 mL/鼻孔及2 mL IM)之PRRSV毒株NADC-20 (第3代)，以3.98 × 10⁴ TCID₅₀ /mL攻毒所有豬。安慰劑組中肺損傷侵犯之平均百分比為54%。本研究中所達成之程度認為足以評估疫苗候選物。 肺損傷評分之統計學分析之結果匯總於表17及18中。治療之主要效應在統計學上顯著(P ＜ 0.0001)。所有劑量組中接種豬之肺損傷評分顯著低於對照組豬(P＜0.05) (表17)。線性及二次對比則沒有統計學顯著性。緩和分率提供於表18中。與組T01 (安慰劑)相比，組T02 (2.7 logs)、T03 (4.1 logs)及T04 (5.1 logs)之緩和分率具顯著性。接種T02、T03及T04使接種動物比未接種對照組動物減少肺損傷之機率分別提高0.9200、0.9450及0.9789。 表17. 平均肺損傷評分¹

¹ 反正弦轉換肺侵犯百分比。² 未轉換之平均值。³ 逆轉換平均值。 *T01對T02、T03或T04，顯著性差異，P ＜ 0.05。 表18.緩和分率-肺損傷評分

在第42天，自所切除之肺無菌地獲得BAL流體。將BAL流體之等分試樣提交至ISUVDL用於qRT-PCR分析PRRSV核酸之存在。結果匯總於表19中。當與對照豬相比時，所有三個劑量組中之接種豬肺中之病毒負荷顯著更低(P＜0.05)。治療之主要效應顯著(P＜0.0001)。 表19. BAL流體中PRRSV基因體拷貝/mL之幾何平均值

*T01對T02、T03或T04差異顯著(P ＜ 0.05)。¹ 未轉換之平均值。² 逆轉換平均值。 在第-1天、第28天(攻毒之前)及第42天自所有研究動物採集血液樣品用於測定PRRSV抗體含量及PRRSV病毒血症。藉由ELISA及qRT-PCR方法分別測定血清學及病毒血症。如藉由ELISA抗體效價所測定，在第-1天所有豬為血清陰性。在第28天及第42天兩天，所有接種組中之ELISA值顯著高於安慰劑組中之值(P＜0.05)。 在第-1天，無豬對於病毒血症為陽性。在攻毒時(第28天)，安慰劑對照組中之所有豬為陰性，而組T02、T03及T04中由於存在疫苗病毒，95%、75%及89%之豬為陽性。所有組中之所有豬在第42天攻毒後為陽性，但接種組(T02、T03及T04)中之值顯著低於安慰劑對照組(T01)中之值(P＜0.05)。 在攻毒日(第28天)及屍體剖檢日(第42天)對所有研究動物個別地進行稱重(磅)並記錄其重量。測定以下時期之平均日增重(ADWG)：接種前一天至攻毒日(第-1天至第28天)；接種前一天至屍體剖檢日(第-1天至第42天)；及攻毒日至屍體剖檢日(第28天至第42天)。在攻毒之前(第-1天至第28天)，治療之主要效應不顯著(P=0.2304)。在攻毒時期(第28天至第42天)期間及整個42天研究時期，治療之主要效應顯著(P＜0.0001)。對於該兩段時期之每一者而言，接種組中之豬增重多於安慰劑對照組中之彼等豬(P＜0.05)。 在攻毒後每日評估所有動物之抑鬱、身體條件及呼吸窘迫達14天(第28-42天)，並對每一臨床徵象進行評分。按時間匯總抑鬱評分、呼吸評分及身體條件評分。亦將每一動物一天內之臨床評分進行總和。在第8天，T02及T04中之值顯著低於安慰劑對照組(T01)中之值(P＜0.05)。在第9天，T02中之值顯著低於T01中之值(P＜0.05)。在第10-14天，所有接種組(T02、T03及T04)中之值顯著低於T01中之值(P＜0.05)。劑量對於臨床徵象無效應。 總之，疫苗之所有劑量量在降低(P＜0.05)肺損傷、肺中之病毒負荷、病毒血症及臨床徵象方面均有效。未觀察到對任何劑量量下疫苗之局部或全身性不良反應。疫苗效能之衍生益處在於與對照動物相比平均日增重顯著改良(P＜0.05)。因此，在早在14-15日齡接種之豬中，可達成28天免疫啟動(OOI)。 作為總結，表20列示各種PRRS病毒疫苗毒株及其共有基因體cDNA序列之參考。 表20. PRRS病毒疫苗毒株。

實例9 本研究之目的係展示豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)疫苗之種原病毒株(MSV) SD 11-21 X+1 (豬中經改造之活病毒)缺乏毒力回復。 經由四次單獨逆傳代入選總計八十(80)隻臨床上健康之14-15日齡之斷乳豬，該等豬藉由RT-qPCR為PRRSV血清陰性及PRRSV陰性。每一逆傳代含有20隻豬，其中對照組中10隻豬且研究性獸醫產品(Investigational Veterinary Product，IVP)組中10隻豬。在D-2或D-1，將豬隨機分配至治療組。在逆傳代1 (BP)中，IVP係由SD 11-21 MSV X+1組成。在BP 2-4中，IVP係由自先前逆傳代中豬之支氣管-肺泡灌洗(BAL)流體分離之PRRSV組成。對照產物為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。若動物出現以下情況，則視其臨床上受PRRSV感染：展現發燒及PRRSV感染典型之臨床徵象；基於診斷報告因PRRSV死亡或移除；或具有可歸因於PRRSV之肉眼可見肺損傷。 PRRSV SD 11-21 MSV之效價為3.3 log₁₀ TCID₅₀ (796-70-23Sep14)。產生MSV X+1以達成典型疫苗劑量之效價度，包括過量。為產生X+1，用PRRSV種原病毒株(MSV) SD 11-21 (796-70-23Sep14)感染鋪滿之MARC-145細胞，並在觀察到超過95%之細胞病變效應(CPE)時，收穫PRRSV SD 11-21 X+1。 在第0天，鼻內投與IVP組中之豬1.0 ml之IVP (IN；0.5 ml/鼻孔)。每天觀察豬之臨床徵象(抑鬱、呼吸及身體條件)及發燒，在BP 1-3中為14天且在BP 4中為21天。在BP 1-3中於D14對豬進行安樂死且在BP 4中於D21進行安樂死。將肺切除，並評估肉眼可見肺損傷之存在。採集支氣管-肺泡灌洗(BAL)流體並藉由RT-qPCR分析PRRSV，並進行病毒分離。(表21)。使用EZ-PRRSV MPX 4.0 RT-PCR套組(Tetracore)進行RT-qPCR。用蔗糖墊濃縮藉由RT-qPCR對於PRRSV呈陽性之BAL流體併合併。在投與下一組動物之前藉由RT-qPCR測試合併材料之PRRSV，並藉由細胞病變效應(CPE)測定效價。在逆傳代後不能在動物中分離病毒則認為MSV穩定且沒有回復至毒力。將來自最後逆傳代之藉由RT-qPCR測試為陽性之合併BAL流體中存在之PRRSV與最初MSV X+1中之PRRSV在表型及基因型二者上進行比較。使用PRRSV特異性抗體藉由IFA測試進行表型比較，並藉由比較ORF5基因之基因體定序來進行基因型比較。 MSV X+1之病毒效價為8.2 log₁₀ TCID₅₀ /ml。每一病毒之中值組織培養感染劑量(TCID₅₀ )係藉由以下來測定：用病毒之10倍連續稀釋液感染MARC-145細胞並將受感染之細胞培育4天。在培育期結束時，檢查每一感染存在或不存在病毒誘導之細胞病變效應(CPE)並評分為陽性或陰性。然後使用用於TCID₅₀ 計算之裡德-明奇方法將所收集之數據用於計算病毒之效價並報告為log₁₀ TCID₅₀ /ml。MSV X+1之功效超過產物之預期靶定釋放劑量。在BP 2及3中所投與材料之病毒效價分別為2.1 log₁₀ TCID₅₀ /ml及2.6 log₁₀ TCID₅₀ /ml。在BP 4中所投與材料對於CPE為陰性。關於臨床感染PRRSV之豬之病例定義，在四次逆傳代中之任一者中投與IVP之豬均不呈陽性。另外，來自最後陽性逆傳代之合併BAL流體之病毒顯示與MSV X+1表型上類似，且當比較ORF5基因時，與MSV X+1基因型匹配。 本研究展示投與14-15日齡豬之豬繁殖與呼吸綜合症病毒疫苗之種原病毒株SD 11-21 X+1 (經改造之活病毒)缺乏毒力回復並證實其之遺傳穩定性。 表21. 藉由逆傳代之BAL流體病毒分離結果

NA-不適用；所有個別BAL流體均藉由PCR及免疫螢光二者測試，因此未產生彙集物。 實例10 本發明之目的係評估豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) SD 11-21種原病毒株(MSV)之剝落及自接種動物至前哨動物之傳播。二十(20)隻藉由RT-qPCR對PRRSV為血清陰性及PRRSV陰性之臨床上健康之14日齡斷乳豬入選。在D-1，對豬進行身體檢查，並隨機分配至前哨/對照組或PRRSV SD 11-21 MSV X+1治療組。如實例9中產生PRRSV SD 11-21 MSV X+1。以4隻豬/畜欄將豬容納在畜欄中，其中每一畜欄含有兩隻豬/治療組。 在D0，以1.0 ml肌內(IM)在頸部右側接種MSV X+1治療組中之豬，而前哨豬不處理。在D-1、D3、D5、D7、D10、D14、D17及D21採集鼻拭子及血清樣品並藉由RT-qPCR測試PRRSV。在D21，對豬進行人道安樂死並將肺切除。無菌地採集支氣管-肺泡灌洗(BAL)流體並藉由RT-qPCR測試PRRSV。另外，自肺、脾、扁桃腺、胸腺及右及左氣管支氣管淋巴結採集組織樣品並藉由RT-qPCR測試PRRSV。若組織樣品藉由RT-qPCR測試為PRRSV陽性，則使用ORF5區藉由基因體定序並與MSV X+1之ORF5區進行比較來測試樣品身份。在D-1及D21收集體重。 在21天研究時期期間，十分之九之接種豬(90%)具有至少一個鼻拭子為PRRSV陽性。在21天研究時期結束時，一些豬(4/9)仍剝落疫苗。自D3-D21，所有接種豬具病毒血症。另外，在D21，藉由RT-qPCR，來自接種豬之所有BAL流體及組織樣品為PRRSV陽性。自組織樣品分離之RNA之核苷酸序列顯示99.67-100%之與MSV X+1之相似性，指示豬中存在之唯一病毒源自疫苗病毒。十分之一之前哨豬(10%)視為疫苗病毒陽性。在21天取樣時期期間，單一鼻拭子為陽性。在前哨豬之任一者中，藉由RT-qPCR無血清樣品、BAL流體樣品或組織樣品測試出PRRSV陽性。 在投與後，MSV X+1自接種動物剝落至少21天。MSV X+1自接種動物至前哨動物之傳播有限，此乃因在單一陽性鼻拭子以外，前哨動物之任一者中未檢測出疫苗病毒。 實例11 本發明之目的係評估含有2型PRRSV毒株(SD 11-21)之經實驗性改造之活PRRSV疫苗以4.45 log₁₀ TCID₅₀ /mL在投與PRRSV血清陰性之14日齡仔豬隨後用當代毒性2型PRRSV毒株(NC-174)攻毒時之效能。NC-174 PRRS病毒係自豬場(Harrells, North Carolina)中經歷呼吸症狀之9週齡豬之血清樣品分離。來自該農場之詳細症狀觀察為厭食症、嗜睡、呼吸過度、呼吸困難、15%發病率及5%死亡率。評估疫苗之其降低肺損傷、肺及血液中之病毒負荷及臨床徵象之能力。 四十(40)隻對PRRSV為血清陰性之臨床上健康之14日齡之斷乳豬入選本研究。按體重減少對豬進行排序並隨機指派至兩個治療組中之一者(n=20隻/組)。治療組包括實驗性疫苗組及安慰劑匹配之對照組。按治療組容納豬直至攻毒之時以防止因疫苗病毒之剝落之暴露。在攻毒時，將豬混合使得畜欄中有兩隻來自每一治療組之豬。 在第0天，豬在頸部右側肌內(1.0 mL)接受疫苗或安慰劑。在第-1天、第28天、第35天及第42天採集血液樣品，並藉由ELISA測試血清PRRSV抗體含量並藉由定量PCR (qRT-PCR)測試病毒負荷。在第28天，用4 mL (1 mL/鼻孔及2 mL IM)之PRRSV毒株NC-174 (譜系1，第3代)以1.3 × 10⁶ TCID₅₀ /mL攻毒所有豬。自第28天至第42天每天記錄表示呼吸窘迫、抑鬱及身體條件之臨床評分。在第-1天、第28天及第42天將豬進行稱重以評估增重。在第42天對豬進行安樂死，將肺切除並測定肺損傷之程度。在第42天採集支氣管-肺泡灌洗(BAL)流體並藉由qRT-PCR測試PRRSV。 接種後未觀察到局部或全身性不良反應。實驗性疫苗有效降低(P＜0.05)肺損傷百分比(對照中45.9%對接種者中4.0%)、肺中之病毒負荷(減少95%)、病毒血症(在攻毒後14天)及臨床徵象。肺損傷數據之緩和分率評估指示接種使接種動物之肺損傷將少於未接種之對照動物之機率增加0.9368。 疫苗效能之衍生益處在於在14天之攻毒時期期間，與對照動物相比平均日增重顯著改良(P＜0.05) (0.43對0.25 kg/天)。 總之，將含有毒株SD 11-21之實驗性PRRSV疫苗作為單一1.0 mL劑量投與未經任何處理(naïve)之14日齡豬安全且有效對抗當代PRRSV野外毒株NC-174之攻毒。 實例12 本發明之目的係證實含有2型PRRSV毒株(SD 11-21)之經實驗性改造之活PRRSV疫苗以4.45 log₁₀ TCID₅₀ /mL在投與PRRSV血清陰性之14日齡仔豬隨後用毒性2型PRRSV毒株(NADC-20)攻毒時，免疫性之持續時間為最少26週(182天)。評估疫苗之其降低肺損傷、肺及血液中之病毒負荷及臨床徵象之能力。六十四(64)隻對PRRSV為血清陰性之臨床上健康之14日齡斷乳豬入選本研究。豬由墊料阻斷並隨機分配至兩個治療組中之一者(n=32隻/組)。治療組包括實驗性疫苗組(T02)及安慰劑匹配之對照組(T01)。按治療組容納豬直至攻毒之時以防止因疫苗病毒之剝落之暴露。在攻毒時，將豬混合使得畜欄中有兩隻來自每一治療組之豬。 在第0天，豬在頸部右側肌內(1.0 mL)接受疫苗或安慰劑。在第-1天、第28天、第112天、第168天、第181天、第189天及第196天採集血液樣品，並藉由ELISA測試血清PRRSV抗體含量並藉由定量PCR (qRT-PCR)測試病毒負荷。在第182天，用10 mL (4 mL/鼻孔及2 mL IM)之PRRSV毒株NADC-20以10^6.7 TCID₅₀ /mL攻毒所有豬。自第182天至第196天每天記錄表示呼吸窘迫、抑鬱及身體條件之臨床評分。在第196天(攻毒後14天)對豬進行安樂死，將肺切除並測定肺損傷之程度。採集支氣管-肺泡灌洗(BAL)流體並藉由qRT-PCR測試PRRSV。 實驗性疫苗有效降低(P＜0.05)肺損傷百分比(對照中12.3%對接種者中1.1%)。肺損傷數據之緩和分率評估指示接種使接種動物之肺損傷將少於未接種之對照動物之機率增加0.6566。 來自本研究之結果證實將含有毒株SD 11-21之實驗性PRRSV疫苗作為單一1.0 mL劑量投與未經任何處理之14日齡豬有效對抗26週後給出之毒性PRRSV之攻毒。 序列表 ＜160＞NUMBER OF SEQ ID NOS:13 ＜210＞ SEQ ID NO 1 ＜211＞LENGTH: 15386 ＜212＞ TYPE: DNA ＜213＞人工序列 ＜400＞ 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat agtcaggagc tgcgaccatt 60 ggtacagccc aaaacttgct gcacggaaac gcccttccgt gacagccctc ttcaggggag 120 tttaggggtc tatccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccaa 180 ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240 catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcctct 300 gaatctccaa gttcccgagc ttggagtgct gggcctattt tacaggcccg aagagccgct 360 ccggtggacg ttgccacgtg catcattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcttgctg 420 gctttctgcg atcttcccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag 480 aatggtgcgg gtcgctgccg agatttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa 540 ggctctacaa gtttatgaac ggggttgccg ctggtacccc attgtcggac ctgtccctgg 600 agtggccgtt ttcgccaact ccctacatgt gagtgacaaa ccttttccgg gagcaactca 660 tgtgttaacc aatctaccgc tcccgcagag gcccaagcct gaagactttt gcccttttga 720 gtgtgctatg gctgacatct atgacatcgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccggaga 780 gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa tttgaaaatg ttcccaagga 840 gttgaagttg attgcgaacc gactccacat ctccttcccg ccccaccacg tagtggacat 900 gtccaagttt accttcatag cccccgggag tggtgtctcc atgcgggttg agtgccaaca 960 cggctgcctc cccgctgata ctgttcctga aggaaactgc tggtggcgct tgttcgactc 1020 gctcccgccg gaagtccagc acaaagaaat tcgctatgct aaccaatttg gttatcaaac 1080 caagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaacg gtctccgagc 1140 agtgaccgac gtacatggac ctatcgtcat acagtacttc tctgttaagg agagttggat 1200 ccgccacttc aggctggcgg aagaacctag cctccctggg ttcgaagacc tcctcagaat 1260 tagggttgag cccaatacat caccactggc tggcgaggat gggaagatct tccggtttgg 1320 cagtcacaag tggtacggtg ctggaaggag agcaaggaaa gcacgttctg gtgcgaccac 1380 catggtcgct catcgcgctt tgtccgctcg tgaaacccag caggcaaaga aggacgaggg 1440 tgccgacgct aacaaggctg agcatctcaa gcactactct ccgcccgccg aagggaactg 1500 tggttggcac tgtatttccg ccatcgccaa ccggatgata aattccaaat ttgaaactac 1560 ccttcccgaa agagtaaggc ctctggatga ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatac 1620 catccaaatc ctcaggctcc ccgcggcctt ggataggaac ggtgcttgta gtagcgccaa 1680 gtacgtgctt aagctggaag gtgtgcattg gactgtctct gtgacccctg ggatgtcccc 1740 ttccttgctc ccccttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gttttggctc 1800 cccagatgcg gtcgaagttt ccggatttga ccctgcctgc cttgaccgac tggctgaggt 1860 aatgcacttg cctagcagtg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgactccaa 1920 tcgtccggct tccccggtca acactgtgtg gactgtttcg caattctatg cccgtcatac 1980 aggaggaaat catcctgacc aggtgtgctt agagcagatc attaatctct gtcaggttat 2040 tgaggtttgt tgctgccatc aaaacaaaac caaccgggcc accccggaag aggtcgcggc 2100 aaagattgat cagtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttga ccaggcttga 2160 gagggtttgc ccgccgagcg ctgcggacac ctcctttgat tggaatgttg tgctccctgg 2220 ggttgaggct gcaactcaga caaccaaaca gccccacgtc aaccagtgct gcgctctggt 2280 tcctgtcgtg actcaagagc ctttggacaa agactcggtc cctctgaccg ccttctcgct 2340 gtccaattgc tactaccctg cacaaggtga agaggttcgt caccgtgaga gactaaactc 2400 cgtactctcg aagttggagg gggctgttcg tgaggaatat gggctcacgc caactgaacc 2460 tggcctgcaa cccgcactac cgaacgggct cgacgaactt aaagaccgga tggaggagga 2520 tctgctgaaa ctagtcaacg ctcaggcaac ttcagaaatg atggcctggg cagccgagca 2580 gattgattta aaagcttggg tcaaaaacta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc 2640 aagagctcag cctcggaaaa cgaagtctgt taagagcttg ccagggaaca agcctatccc 2700 tgctccacgc aggaaggtca gatctgattt gactgttaat ggcccccttg atctttcgac 2760 accatccgag ccgatgacac ccctgagtga gcctgcactt atgcccgcgt tgcaacatat 2820 ttctaggcca gtgacatctt tgagtgagcc ggtcccagtt cctgcaccgc gtagagctgt 2880 gtcccgaccg gtgacgccct tgagtgggcc aacttttgag tttgcgccgc gacacaaatt 2940 tcagcaggtg ggagaagtga atctggcggc aacaacgctg acgcaccagg acgaacctct 3000 agatttgtct gcatcctcac agactgaata tgaggcttct cccctagtac caccgcagaa 3060 catgggtatc ctgggggtgg gggggcaaga ggctgaagaa gttctgagtg aaatctcgga 3120 tatactgagt gacattaacc ctgcacctgt gtcattaagc agctccctgt caagtgttaa 3180 gatcacacgc ccaaaatact cagctcaagc catcattgac tcgggcgggc cctgcagtgg 3240 gcatctccga agggaaaaag aagcatgcct cagcgtcatg cgtgaggctt gtgatgcggc 3300 taaacttagc gaccctgcca cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggata gggttgacat 3360 gctgacctgg cgcaataagt ctgcttacca ggcgtttcgc atcttggatg gcaggtttga 3420 gtttctccca aagatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgggt ttgtgatgct 3480 gcctcacacg cctgcacctt ccgtgagtgc agagagtgac cttaccattg gttcagtcgc 3540 cactgaagat gttccacgca tcctcgggaa aatagaaaac gccggcgagg tgcccaacca 3600 ggggctctcg gcatcctccg gggaagaacc gatgtatgac caacctgcca aagactcccg 3660 gatgtcgtcg cgggggtttg acgagagcat aacggctccg tccgtaggta caggtggcgc 3720 tgacttactc actgatttgc caccttcagg tggtgtggat gtggacgggg gggggccgtt 3780 acggacggta agaaagaaaa ttgaaaggct cttcgaccaa tttagccgtc aggtttttaa 3840 cctcgtctcc catctccctg ttttcttctc acacctcttc aaacctgaca gtggttattc 3900 tccgggtgat tggggttttg cagctttcac tctactttgc ctctttttgt gttatagcta 3960 cccattcttt ggcttcgctc ccctcttggg tgtattttct gggtcttctc ggagggtgcg 4020 catgggggtt tttggctgct ggttggcttt tgctgttggc ctgttcaagc ctgtgtccga 4080 cccagtcggc actgcttgtg aatttgactc gccagagtgt aggaacgtcc ttcattcttt 4140 tgagcttctc aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg caggtctcgg 4200 tcttgccatt cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctac atctggcatt ttttgcttag 4260 gcttggcatt gttgcagatt gtgtcttggc tggagcttat gtgctttctc aaggtaggtg 4320 taaaaagtgc tggggatctt gtataagaac tgctcctaat gaaatcgcct tcaacgtgtt 4380 ccctttcacg cgtgcgacca ggtcgtcact catcgacctg tgcgaccggt ttcgtgcgcc 4440 aaaaggcatg gaccctgttt tcctcgctac tgggtggcgc gggtgctgga ccggtcaaag 4500 tcccattgag caaccctctg aaaaacccat cgcgttcgcc cagttggatg aaaagaggat 4560 cacggctaga actgtggtcg ctcagcctta tgatcctaac caagccgtaa agtgcttgcg 4620 ggtgctacag gcgggtgggg cgatggtggc cgaggcagtc ccaaaagtgg tcaaggtttc 4680 cgctattcca ttccgagccc ccttttttcc caccggagtg aaggttgatc ctgagtgcag 4740 gatcgtggtc gaccccgaca cttttactac agctctccgg tctggttact ccaccacaaa 4800 cctcgtcctt ggtgtggggg actttgccca attgaatgga ttgaaaatca ggcaaatttc 4860 caagccttcg ggaggaggcc cacacctcat tgctgccctg catgttgcgt gctctatggc 4920 gttgcacatg cttgctgggg tttatgtaac tgcagtgggg tcttgcggta ccggcaccaa 4980 cgatccgtgg tgcactaacc cattcgccgt ccctggctac ggacctggct ctctctgcac 5040 gtccagattg tgcatctccc aacatggcct caccctgccc ttgacagcac ttgtggcagg 5100 attcggtctt caggaaattg ccttagtcgt tttgattttc gtttccatcg gaggcatggc 5160 tcataggttg agttgtaagg ctgacatgct gtgcatctta cttgcaatcg ccagctatgt 5220 ttgggtaccc cttacctggt tgctctgtgt gtttccttgc tggttgcgct ggttcacttt 5280 gcaccctctc accatcctat ggttggtgtt tttcctgatt tctgtaaata tgccttcggg 5340 aatcttggcc atggtgttat tggttgctct ttggctttta ggccgttata ctaatgttgt 5400 tggtcttgtt accccctatg atattcacca ttacaccagt ggcccccgcg gtgtagccgc 5460 cttggccacc gcaccagatg ggacttactt ggccgctgtc cgccgcgctg cgttgactgg 5520 ccgcaccgtg ctgtttaccc cgtctcagct tgggtccctt cttgagggcg ctttcaggac 5580 tcgaaagccc tcattgaaca ccgtcaatgt ggtcgggtcc tccatgggct ctggcggagt 5640 gttcactatc gacgggaaaa tcaagtgcgt gactgccgca catgtcctta cgggtaattc 5700 agccagggtt tccggggtcg gcttcaatca aatgcttgac tttaatgtaa agggggactt 5760 cgccatagct gattgcccga attggcaagg ggctgctccc aagacccaat tctgcgagga 5820 tggatggact ggtcgtgcct attggctgac atcctctggt gtcgaacccg gtatcattgg 5880 gaatggattt gccttctgct tcaccgcgtg cggcgattct ggatccccag tgattaccga 5940 agccggtgag cttgtcggcg ttcacacagg atcgaacaaa caaggaggag gcattgtcac 6000 gcgcccctcg ggccagtttt gtaatgtggc gcccatcaag ctgagcgaat tgagtgaatt 6060 cttcgctgga cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtt ggcagccaca taattaaaga 6120 catatgcgag gtaccttcag acctttgcgc cttgcttgct gccaaacccg aactggaagg 6180 aggcctctct accgtccaac ttctgtgtgt gtttttcctc ctgtggagaa tgatggggca 6240 tgcctggacg cccttggttg ctgtggggtt ttttatcttg aatgaggtcc tcccagctgt 6300 cctggtccgg agtgttttct cctttggaat gtttgtgcta tcttggctca cgccatggtc 6360 tgcgcaagtt ctgatgatca ggcttctaac agcagctctt aacaggaaca gattttcact 6420 cgccttttac agccttggtg cagcgaccgg ttttgtcgca gatctggcga caactcaagg 6480 gcatccgttg caggcagtaa tgaatttaag tacctatgcc ttcctgcctc ggatgatggt 6540 tgtgacatca ccagtcccag tgattgcgtg tggtgttgtg cacctccttg ccataatttt 6600 gtacttgttc aagtaccgtt gcctgcacaa tgtccttgtt ggcgacggag cgttctctgc 6660 ggcttttttc ttgcgatact ttgccgaggg aaagttgaga gaaggggtgt cgcagtcctg 6720 cgggatgaat cacgagtcac tgactggagc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt 6780 ggacttcctt acgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt tctgcttcca 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acatcactgt cacggccaat gtaacagatg agaattactt gcattcctct gatctcctca 13140 tgctttcctc ttgcctcttc tatgcttctg agatgagtga aaagggattc aatgtggtct 13200 tcggcaacgt gtcaggcatt gtggctgtgt gtgtcaactt taccagctat gtccaacatg 13260 ttaaggagtt tactcagcgc tctttggtgg tcgaccacgt gcgactgctt catttcatga 13320 cacctgcgac catgaggtgg gcaacagttt tagcctgtct tttcgccatc ttgttggcga 13380 tttgaatgtt taagtatgtt ggggaaatgc ttgaccgcgg gctactgctc gcaattgctt 13440 tttttctggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgcgctcg tcaacgccgc cagcaacagc 13500 agctcccatt tacagttgat ttataacctg acgatatgcg agctgaatgg cacagattgg 13560 ttgaatcaaa agtttgattg ggcagtggag acttttgtca tttttcctgt gttgacccac 13620 attgtctcct acggtgccct taccaccagc catttccttg acacggccgg cctaatcact 13680 gtgtctaccg ccggatatta ccatgggcgg tatgtgttga gtagcatcta cgccgtcttt 13740 gccctggctg cgttgatttg ttttgtcatt aggttgacaa aaaactgtat gtcctggcgc 13800 tactcatgta ccagatatac caactttctt ctggacacca aaggcaatct ctatcgttgg 13860 cggtcacccg tcgttataga gagaaggggt aaagttgagg ttggagacca cctaatcgac 13920 ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgcg gcaaccccta taaccaagat ttcagcggaa 13980 caatggggtc gtccctagac gacttctgca atgacagcac agctgcacaa aaggtgcttt 14040 tggcgttttc catcacctat acgccaataa tgatatatgc cctgaaggta agtcgcggcc 14100 gactgttagg gcttttgcat cttttaattt tcttgaattg tgctttcacc ttcgggtaca 14160 tgacatttgt tcattttcag agtacaaaca aggtcgcgct cactatggga gcagttgttg 14220 cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa attcatcact tccagatgcc 14280 gtttgtgctt gctaggccgc aggtacattc tggcccctgc ccaccacgtt gaaagtgccg 14340 cgggctttca tccgattgcg gcaagtgata accacgcatt tgtcgtccgg cgtcccggct 14400 ccactactgt taacggcaca ttggtgcccg ggttgaaaag cctcgtgttg ggtggcagaa 14460 aagctgttaa gcggggagtg gtaaacctcg ttaaatatgc caaataacaa cggcaggcag 14520 caaaaaaata agaaggggag tggccagcca gtcaatcagc tgtgccaaat gctgggcaag 14580 atcatcgccc agcaaaatca gtccagaggc aagggaccgg gtaagaaaaa taagaagaga 14640 aacccggaga agccccattt tcctcttgcg accgaagatg acgtcaggca tcacttcacc 14700 cccagtgaac ggcaattgtg tctgtcgtcg atccagactg ccttcaacca gggcgctgga 14760 acttgcaccc tgtcagattc agggaggata agttacactg tggagtttag tttgccgacg 14820 caccacactg tgcgccttat tcgcgccaca gcatcacctc catcgtgatg ggcttacatt 14880 cttggagctc ctcagtttca caattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattggcact 14940 gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg gggtttagtt taattggcga 15000 gaaccacgcg gccgaaatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 15047

圖 1. 2型PRRSV ORF5核苷酸序列之系統發生分析。圖 2. 2型PRRSV nsp1核苷酸序列之系統發生分析。圖 3. 2型PRRSV nsp2 OTU結構域核苷酸序列之系統發生分析。圖 4. 不同PRRSV野外分離株對IFN-阿爾法(IFN-alpha，IFN-α)表現之刺激的變化。圖 5. 不同野外PRRSV分離株之去ISG化分析。

<110> 美商益農美國公司(ELANCO US INC.)

<120> 豬繁殖與呼吸綜合症疫苗病毒

<140> TW107140450

<141> 2017-02-07

<150> 62/296658

<151> 2016-02-18

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15386

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 15444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

<210> 3

<211> 15013

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 15444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 15413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 15078

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 14885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 15434

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 15047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 15444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 15444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 15047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 15047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

Claims (11)

1. 一種經改造之豬繁殖與呼吸綜合症(PRRS)活病毒株，其中該PRRS病毒株之共有互補DNA序列與選自以下之群之序列至少98%一致：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11。
2. 如請求項1之經改造之PRRS活病毒株，其中該PRRS病毒株在組織培養細胞中傳代至少80次。
3. 如請求項1之經改造之PRRS活病毒株，其中該PRRS病毒株在組織培養細胞中傳代100次。
4. 一種免疫原性組合物，其包含經改造之PRRS活病毒株，其具有與選自以下之群之序列至少98%一致之共有互補DNA序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11；及醫藥上可接受之賦形劑、穩定劑、增溶劑或稀釋劑。
5. 如請求項4之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
6. 一種如請求項1至3中任一項之經改造之PRRS活病毒株之用途，其用於製造用於治療PRRS之醫藥品。
7. 一種包含如請求項1至3中任一項之經改造之PRRS活病毒株之疫苗， 其用於治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之症狀。
8. 一種包含如請求項1至3中任一項之經改造之PRRS活病毒株之疫苗，其用於治療或預防豬動物中由2型PRRS病毒感染所引起之症狀。
9. 一種如請求項4或5之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於治療或預防豬動物中豬繁殖與呼吸綜合症之症狀之醫藥品。
10. 如請求項9之用途，其中該PRRS病毒感染係由與該免疫原性組合物中之經改造之PRRS活病毒株異源之毒性2型PRRS病毒引起。
11. 一種如請求項4或5之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於治療或預防豬動物中由2型PRRS病毒感染所引起之症狀之醫藥品。

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