CN115634288A - 一种犬冠状病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种犬冠状病毒弱毒株及其应用。所述的犬冠状病毒弱毒株为CCV14，保藏号为CGMCC NO:18507。一种犬冠状病毒弱毒株在制备治疗和/或预防犬冠状病毒所致疾病的药物中的应用。本发明提供的CV14株对犬不致病，具有良好的免疫原性，对犬冠状病毒强毒攻击可以提供很好的免疫保护力。本弱毒株可制成单苗或联苗，可有效预防由犬冠状病毒所致疾病，还可应用于制备治疗、诊断或检测犬冠状病毒所致疾病试剂或试剂盒。本发明犬冠状病毒弱毒疫苗株具有遗传性稳定，免疫持久，免疫效果好，安全可靠、保存期长等优点。

Description

一种犬冠状病毒弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种犬冠状病毒弱毒株及其应用。本发明还涉及犬冠状病毒弱毒株在制备预防由犬冠状病毒所致疾病的药物中的用途，以及该弱毒株在制备治疗、诊断或检测犬冠状病毒所致疾病中的应用。

背景技术

犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCV)引起的犬病毒性传染病。犬冠状病毒属冠状病毒科冠状病毒属成员。病毒具有冠状病毒的确一般形态特征，呈圆形或椭圆形，长径80～120nm，宽径为75～80nm，有囊膜，囊膜表面有花瓣状纤突，长约20nm。核衣壳呈螺旋状。犬冠状病毒基因组为单股 RNA病毒，RNA在复制时采用独特的套式转录，因基因组的错配率和重组率都很高，从而导致冠状病毒的变异株多。

犬冠状病毒可感染所有品种和各种年龄的犬(以幼犬受害严重)，是犬的一种多发性、急性胃肠道传染病，传染源主是病犬，传播途径主要是通过污染的饲料、饮水，经消化道感染。该病发病急、传染快、病程短、死亡率高，常与犬细小病毒或轮状病毒混合感染，使病情加剧，因急性腹泻和呕吐而脱水迅速死亡。临床上主要表现为频繁地呕吐、腹泻、沉郁、厌食，是危害养狗业的重要病毒性传染病。近年对犬冠状病毒的研究发现其宿主范围较广，除犬外，猫、猪、狼、大熊猫、狐狸等均可感染。CCV既可单独感染，也可与犬细小病毒、腺病毒、轮状病毒等病原混合感染或继发感染，与其它病原混合感染时，临床症状表现严重，死亡率会明显增高。犬冠状病毒病呈世界性分布和流行，冠状病毒也是犬传染性呼吸道综合症的重要病原。因此，对犬冠状病毒病的预防具有重要意义。

对于本病尚无特效疗法，防制本病最有效措施是定期接种犬冠状病毒疫苗。目前预防本病主要是犬冠状病毒灭活疫苗，尚无弱毒疫苗应用。犬冠状病毒弱毒疫苗的研制对于本病的预防更为方便、有效，更有利于犬病毒病弱毒疫苗联苗的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬冠状病毒弱毒株及其应用、犬冠状病毒弱毒株在制备预防由犬冠状病毒所致疾病的药物中的用途以及该弱毒株在制备治疗、诊断或检测犬冠状病毒所致疾病中的应用

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种犬冠状病毒弱毒株，所述的犬冠状病毒弱毒株为CCV14，保藏号为CGMCC NO:18507；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年9月18日。

在一种具体实施方式中，所述的犬冠状病毒弱毒株的获取方法如下：犬冠状病毒强毒株经分离、鉴定后，将犬冠状病毒株接种CRFK细胞，连续传代至 100代后，获得犬冠状病毒弱毒株CCV14。

第二方面，本发明提供一种犬冠状病毒弱毒株在制备治疗和/或预防犬冠状病毒所致疾病的药物中的应用。

在一种具体实施方式中，所述药物包括疫苗。

在一种具体实施方式中，所述的疫苗包括犬冠状病毒弱毒株CCV14与其它病原体联合制备的多联苗。

进一步的，所述的其它病原体包括犬冠状病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、钩端螺旋体中的任意一种或多种。

第三方面，本发明提供一种犬冠状病毒弱毒疫苗，所述的疫苗包括权利要求1所述的犬冠状病毒弱毒株CCV14及药学上可接受的佐剂。

在一种具体实施方式中，所述犬冠状病毒弱毒疫苗以含有犬冠状病毒弱毒株CCV14的病毒液形式加入；

进一步的，所述含有犬冠状病毒弱毒株CCV14的病毒液通过以下方法制备：犬冠状病毒种按5％比例接种于CRFK单层细胞，37℃培养96h～120h，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液。

在一种具体实施方式中，所述犬冠状病毒弱毒疫苗适用于各种品种、各种年龄的犬；可选地，所述犬冠状病毒弱毒疫苗也适用于怀孕犬。

第四方面，本发明提供一种多联疫苗，所述的多联疫苗包括权利要求1所述的犬冠状病毒弱毒株CCV14、其它病原体及药学上可接受的佐剂。

第五方面，本发明提供一种犬冠状病毒弱毒株在制备诊断或检测犬冠状病毒所致疾病的试剂中的应用。

本发明提供的犬冠状病毒弱毒株制备的活疫苗具有遗传性稳定，免疫持久，效果好，安全可靠、保存期长等优点，与现有上市产品灭活疫苗相比，具有免疫产生期更早，免疫持续期更长。

本发明提供的犬冠状病毒弱毒株使用范围广泛，可应用于制备治疗、诊断或检测犬冠状病毒所致疾病试剂或试剂盒，还可应用于制备活疫苗单苗或联苗等。

与现有技术相比，本发明提供的犬冠状病毒弱毒株的优点在于：

(1)其培养毒价高，每毫升稳定在10^6.0TCID₅₀以上。

(2)其免疫剂量低，最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，使用10^4.0TCID₅₀即可达到好的免疫效果。

(3)其可用于各种品种、各种年龄的犬，也可用于怀孕犬。

(4)其使用安全，超剂量注射(注射10倍免疫剂量)仍然对犬安全。

(5)其生产工艺简单，用CRFK细胞培养即可，对设备要求不高，适合于工业化大规模生产。

(6)其遗传性状稳定，经细胞传100代后病毒未出现变异、病毒毒力和毒价均未发生任何改变、也无毒力返强、对犬无致病作用。

(7)既可单独制成疫苗、也可以与其它病原体制成联苗。

附图说明

图1为犬冠状病毒CCV14株RT-PCR扩增的电泳鉴定结果。

图中M为DL2000Marker，1为CCV阳性对照，2为CCV14株，3为阴性对照。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种犬冠状病毒弱毒株，其为犬冠状病毒强毒株传代致弱的弱毒株(CCV14株)。

犬冠状病毒强毒株的分离与鉴定：取疑似犬冠状发病犬粪便，接种MDCK 细胞(犬肾细胞)分离病毒，经过病毒形态学观察、病毒含量测定、生物学特性、分子生物学特性、RT-PCR鉴定、序列分析、纯净性检验和动物回归试验，确定分离株为犬冠状病毒强毒株。

犬冠状病毒传代致弱：将犬冠状病毒株接种异源传代细胞CRFK(猫肾细胞)，连续传代至100代，测定不同代次病毒液对犬的致病性和免疫原性，结果经 CRFK细胞传代后对犬的致病力逐渐减弱，传代至第60代后对犬毒力明显减弱，传至第80代后对犬已没有致病力。测定第80、100代病毒对犬的免疫原性表明，对犬免疫原性较好，免疫犬后用强毒攻击5/5保护。毒力返强试验表明，用100 代病毒液接种犬，用犬体传代5代，接种犬均无犬冠状病毒临床症状，未出现毒力返强，并将其命名为犬冠状病毒弱毒株(CCV14株)。

本发明将所涉及犬冠状病毒弱毒株(CCV14株)提交专利认可机构保藏，微生物保藏号为：CGMCC NO:18507；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供的犬冠状病毒弱毒株制备的活疫苗具有遗传性稳定，免疫持久，效果好，安全可靠、保存期长等优点，与现有上市产品灭活疫苗相比，具有免疫产生期更早，免疫持续期更长。

本发明提供一种上述犬冠状病毒弱毒株在制备治疗、预防犬冠状病毒所致疾病的药物中的应用。

在一种可能的实现方式中，所述药物包括疫苗；可选地，所述疫苗包括：犬冠状病毒弱毒疫苗、犬冠状病毒弱毒株与其它病原体联合制备的多联苗。

在一种可能的实现方式中，其它病原体选自以下的一种或多种：犬冠状病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒。

本发明提供一种犬冠状病毒弱毒疫苗，其包括上述犬冠状病毒弱毒株及药学上可接受的辅料。

在一种可能的实现方式中，犬冠状病毒弱毒株以含有犬冠状病毒弱毒株的病毒液形式加入，所述含有犬冠状病毒弱毒株的病毒液通过以下方法制备：犬冠状病毒弱毒毒种按5％比例接种于CRFK单层细胞，37℃培养96h～120h，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液。

在一种可能的实现方式中，所述犬冠状病毒弱毒疫苗在免疫后，可产生较高的抗体水平，强毒攻击可达100％(5/5)的保护，免疫期1年以上。

在一种可能的实现方式中，用冻干保护剂制备冻干苗，4℃条件下可保存2 年以上。

在一种可能的实现方式中，所述犬冠状病毒弱毒疫苗适用于各种品种、各种年龄的犬；所述犬冠状病毒弱毒疫苗也适用于怀孕犬。

本发明弱毒株使用范围广泛，例如，可应用于制备治疗、诊断或检测犬冠状病毒所致疾病试剂或试剂盒，还可应用于制备活疫苗单苗或联苗等。

本发明提供一种多联疫苗，其包括上述犬冠状病毒弱毒株、其它病原体及药学上可接受的辅料。

本是提供一种上述犬冠状弱毒株株在制备诊断或检测犬冠状病毒所致疾病的试剂中的应用。

实施例1

犬冠状病毒强毒株CCV株的分离与鉴定

试验用犬购自犬冠状病毒抗原、抗体阴性或抗体≤1:2的比格犬。

病毒分离培养自北京一宠物医院疑似犬冠状病毒发病犬粪便，经处理后接种MDCK细胞,盲传至第5代，细胞出现犬冠状病毒特有的融合性细胞病变，接毒细胞胞浆内颗粒变性，融合成合胞体。

RT-PCR鉴定

采用S基因引物进行扩增。

引物序列：CCV F1：5’-CCATTAATAGTGAACTGTTAGG-3’；

CCV F2：5’-CTAAATGTTCTGTACTATTGAACGCC-3’。

扩增片段大小为485bp。

犬冠状病毒S基因扩增RT-PCR反应条件：

基因组提取：按EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书操作。

PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性50S，53℃退火45S，72℃延伸45S， 35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶成像仪观察。结果分离株扩增到特异目的片段(图1)。

序列测序：取PCR扩增鉴定的产物，经北京生工公司进行序列测定，将测定的基因序列(犬冠状病毒S基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)与GenBank 中其它CCV相同S基因序列进行比较分析。用DNASTAR.Lasergene软件分析其同源性。序列测定分析结果表明CCV基因与GenBank中的强毒ab105373.1， jf682842.1，mn163039.1，kr265185.1株S基因序列同源性为96～99％。表明所分离的毒株为CCV强毒株。

动物回归试验：将分离株CCV病毒液接种犬5只，每只犬口服第5代培养液20.0ml，同时设对照犬5只。接种后隔离饲养，逐日观察临床症状。接种组5 只犬均出现厌食，呕吐，排黄白色水样便等典型犬冠状病毒病临床症状。对照犬均健活。结果表明所分离的犬冠状病毒为犬冠状病毒强毒株。

纯净性检验：按照现行《中国兽药典》进行检验，分离株无菌生长，无支原体和外源病毒污染。

实施例2

犬冠状病毒传代致弱

冠状病毒培养：用异源细胞系CRFK细胞(猫肾传代细胞)培养，将分离的 CCV毒接入单层CRFK，37℃作用1h后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液， 37℃静置培养，接毒后96～120h内，可呈现典型的细胞融合性病变。

犬冠状病毒代：将犬冠状病毒接入单层CRFK细胞，37℃作用1h后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，37℃培养96～120h，待出现典型融合性细胞病变达到80％左右后冻融收获病毒液，记为F1代。再将所收的毒液以5％的接入 CRFK细胞单层，如此连续传代驯化，每传10代进行一次毒价测定，如此连续传代至F100代。

病毒传代毒价测定：将犬冠状病毒接入单层CRFK细胞进行传代，每传10 代进行一次毒价测定。结果从传代10代后病毒毒价均稳定在10^6.0TCID₅₀/mL以上。结果见表1。

表1病毒传代毒价测定(TCID₅₀/mL)

传代代次	5	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
												病毒毒介	10<sup>5.5</sup>	10<sup>6.0</sup>	10<sup>6.33</sup>	10<sup>6.5</sup>	10<sup>6.33</sup>	10<sup>6.67</sup>	10<sup>6.50</sup>	10<sup>6.67</sup>	10<sup>6.33</sup>	10<sup>6.50</sup>	10<sup>6.33</sup>

病毒传代对犬毒力检验：选用CCV易感幼犬25只，分为5组，每组5只。第1～4组分别用传代40代、60代、80代和100代培养液，每只犬肌肉注射5mL、口服10mL，第5组的5只犬不接种作对照。隔离饲养14d，每天进行体温、呼吸、精神、食欲、粪便性状等临床观察，于接种后的第14天扑杀，作病理解剖学与组织学检查。结果表明经CRFK细胞传第40代时毒力减弱，传第60代后对犬均明显减弱，传第80代后对犬均无致病性。结果见表2。

表2病毒传代后不同代次对犬毒力检验

传代代次	试验犬数	发病数	发病率
				40	5	5	80％(4/5)
60	5	3	20％(1/5)
				80	5	0	0
100	5	0	0
				对照犬	5	0	0

犬体传代返强试验：取病毒传代F100代病毒液接种2月龄易感犬2只，每犬肌肉注射5mL和口服接种10mL，隔离饲养观察7天，每天观察精神，食欲、体温与粪便等性状和剖解变化。于第7天扑杀，观察记录有无病理变化，取两犬的粪便各30g，共60g，混合后用Hank’s液制成1:10乳剂，经8000rmin离心沉淀10min，再以此物接种2月龄易感犬2只，每只犬口服接种30ml，如此用2 月龄易感犬2只，连续传5代。

犬体传代返强试验结果：病毒经CRFK细胞传100代，接种2月龄易感犬，连传5代后，各代次所有试验犬的精神，食欲，体温、运动和粪便均正常，无犬冠状病毒病临床症状，剖检均无可见病理变化。结果表明CCV毒株经CRFK 细胞传100代后对犬安全、无致病性，无毒力返强。结果见表3。

表3CCV F100代毒犬体传代毒力返强试验结果

遗传稳定性试验：取F100代培养毒经犬体传代第5代的犬粪便制成1:10 乳剂，离心取上清，用CRFK细胞回收病毒，并用CRFK细胞再连续传代20代至120代，进行传代毒的免疫原性试验。

犬免疫原性试验：选用CCV易感幼犬20只，分为4组，每组5只，1～3 组分离用F80、F100、F120代病毒液稀释成10^5.0TCID₅₀/ml，分离接种5只犬， 1ml/只，同时设对照犬5只，免疫后21日对所有犬用犬冠状病毒强毒100ID₅₀攻毒，攻毒后临床观察21日。结果表明免疫组犬均5/5保护，对照组犬5/5发病。结果见表4。

表4病毒传代后不同代次对犬免疫原性试验

传代代次	试验犬数	攻毒剂量	发病数	保护率
					80	5	100ID<sub>50</sub>	0	100％(5/5)
100	5	100ID<sub>50</sub>	0	100％(5/5)
					120	5	100ID<sub>50</sub>	0	100％(5/5)
对照组	5	100ID<sub>50</sub>	5	0％(0/5)

纯净性检验：取F100代病毒液按照现行《中国兽药典》进行检验，结果无细菌、无支原体和外源病毒污染。

菌种保藏：根据免疫原性及致病性试验结果表明，犬冠状病毒接种CRFK 细胞连续传代至F120代，对犬无致病性，且对犬免疫原性良好，并确定F90～F110 代次作为犬冠状病毒弱毒疫苗株毒种，命名为犬冠状病毒弱毒CCV14株，微生物保藏号为：CGMCC No.18507。

实施例3

犬冠状弱毒活疫苗的制备

犬冠状病毒CCV14株抗原的制备：犬冠状病毒CCV14株毒种F100代按5％比例接种CRFK单层细胞，37℃培养，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液，病毒含量应≥10^6.0TCID₅₀/ml，纯净性检验合格后可用于犬冠状病毒活疫苗的制备。

犬冠状活疫苗的制备和检验：将犬冠状病毒抗原与适宜冻干保护剂(蔗糖明胶冻干保护剂)按照5:1的体积比混匀后，定量分装疫苗瓶中冻干，病毒含量＞ 10^5.0TCID₅₀/头份，剩余水分、真空度、无菌、支原体、外源病毒检验合格即为合格疫苗。

实施例4

试验用疫苗制备及检验

疫苗制备：按照实施例方法3制备3批犬冠状病毒活疫苗(CCV14株)，批号分别为201801、201802、201803。

实施例5

犬冠状病毒活疫苗(CCV14株)安全试验

验动物：实验用犬为2月龄CCV抗原、抗体阴性或抗体≤2的健康犬易感犬的健康犬。CCV14株疫苗，批号：201801。

一次单剂量不同途经注射安全试验

对2月龄犬安全性试验：选择CCV抗原、抗体阴性或抗体≤2的健康犬易感犬10只，随机分成2组，每组5只，1组用犬冠状病毒活疫苗(CCV14株)颈部肌肉注射1个免疫剂量，另一组犬注射生理盐水作为对照。注射后观察21天，观察所有犬局部反应及精神、食欲、体温、粪便等临床症状。结果表明疫苗注射后对犬无刺激和任何不良反应轻，表明对犬安全。

单剂量重复注射安全试验

择CCV抗原、抗体阴性或抗体≤2的2月龄易感犬10只，随机分成2组，每组5只，用犬冠状病毒活疫苗(CCV14株)颈部肌肉1个免疫剂量，间隔14天重复注射一次，连续注射3次。另5只犬注射生理盐水作为对照。三次注射后观察21天，观察所有犬局部反应及精神、食欲、体温、粪便等临床症状。结果所有犬经三次注射后均未出现任何不良临床反应，表明三次单剂量重复注射对犬安全，无任何不良反应。

超剂量注射安全试验

选择CCV抗原、抗体阴性或抗体≤2的2月龄易感犬10只，随机分成2组，每组5只，5只犬中的每一只均用犬冠状病毒活疫苗(CCV14株)颈部肌肉注射 10个免疫剂量(10×10^5.0TCID₅₀)，另5只犬注射生理盐水作为对照。注射后观察 21天，观察犬局部反应及精神、食欲、体温、粪便等临床症状。结果：注射疫苗犬仅在注射部位有轻微红肿症状，经过2～3天后消失，未出现任何其它不良临床反应，无过敏、应激等全身反应，对犬安全，无明显的不良反应。

对怀孕犬安全性试验

用怀孕母犬10只，随机分成2组，每组5只犬。5只犬均于产前30天左右颈部肌肉注射犬冠状病毒活疫苗CCV14株，每只注射10个免疫剂量 (10^6.0TCID₅₀)；另一对照组犬注射生理盐水作为对照。注射后观察母犬的临床变化至分娩，包括有无早产、流产、死胎、弱胎等情况以及仔犬的成活、生长发育等。结果：所有犬均正常分娩发育，无流产和死胎，仔犬均成活、生长发育正常。表明该疫苗10个免疫剂量注射怀孕母犬安全。

实验结论：犬冠状病毒活疫苗CCV14株经CRFK传代100代，其病毒毒价稳定在10^6.0TCID₅₀/mL以上；用10倍免疫剂量接种2月龄易感犬和怀孕犬，对犬安全、无致病性。

实施例6

犬冠状病毒活疫苗CCV14株免疫试验

犬冠状病毒活疫苗CCV14株疫苗最小免疫量和最低血清SN抗体保护价测定。

30只犬冠状病毒抗原、抗体阴性或抗体≤2的健康2月龄犬20只，分为4 组，每组5只犬，第1、2、3组每犬分别接种犬冠状活疫苗CCV14株细胞毒 10^5.0TCID₅₀、10^4.0TCID₅₀、10^3.0TCID₅₀，第4组犬注射细胞培养液作为对照，分组隔离饲养。于接种的当天和第21天各采血测定每只犬的SN抗体效价，并于接种后21天用CCV强毒100ID₅₀对所有犬肌肉注射攻毒，攻毒后逐日观察21 天。以能保护80％试验犬的最低用量为最小免疫量，以能使试验犬攻毒保护最低的SN抗体值为其最低SN抗体保护价，并以此分析和确定疫苗的免疫期、免疫间隔时间及免疫后血清SN抗体效价与攻毒保护的相关性。

试验结果表明，接种10^5.0TCID₅₀和10^4.0TCID₅₀的CCV14弱毒株可使犬获得100％(5/5)的免疫保护；接种10^3.0TCID₅₀可使犬获得80％(4/5)的免疫保护；最低SN抗体保护值为l:51。因此，根据结果确定：CCV-14弱毒株的最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，最低SN抗体保护效价为1:51。为了使免疫更可靠，规定疫苗免疫剂量为10^5.0TCID₅₀，根据疫苗免疫犬后血清中和抗体SN值检测结果表明，其SN抗体与攻毒保护呈正相关，SN抗体最低保护效价为1:51。因此可以用检测疫苗免疫犬后血清中SN抗体值来代替攻毒保护的检验方法。结果见表5。

表5CCV-14株疫苗最小免疫量和最低血清SN抗体保护效价测定

与CDV、CPV、CAV2、CPIV弱毒免疫互扰试验

选取CDV、CPV、CAV2、CPIV、CCV易感仔犬各30只，分为5组，每组 6只。第1，2，3，4、5组分别接种1个免疫剂量的CDV、CPV、CAV2、CPIV、 CCV弱毒疫苗，第6组接种5种弱毒培养物各1个免疫剂量的联合疫苗。于接种的第14天分别采血测CDV、CPV、CAV2、CPIV、CCV的SN抗体效价，以分析其相互干扰作用。

CDV、CPV、CAV2、CPIV弱毒免疫互扰试验结果见6所示。五联弱毒免疫的5只犬在免疫14d后CDV、CPV、CAV2、CPIV、CCV的SN抗体效价与各弱毒单独免疫的SN抗体平均效价，无显著差异，说明该弱毒与CDV、CPV、 CAV2、CPIV弱毒疫苗之间无明显的相互免疫干扰作用。

表6与CDV、CPV、CAV2、CPIV弱毒免疫互扰试验结果

表中，＊为5只犬SN抗体效价几何平均值。

免疫期试验：取40只犬冠状病毒抗原、抗体阴性或抗体≤1:2的健康2月龄犬，随机分为6组，用3批犬冠状活疫苗CCV14株分别颈部肌肉注射免疫犬各10只，每只犬1ml(1头份)，连续免疫3次，每次间隔21d，同时设不接种对照犬10只，分别于免疫后90d、180d、270d、360d、420d各采血，分离血清，检测犬冠状病毒中和抗体效价。结果：并于免疫后420d用CCV强毒进行攻毒保护试验，以能维持最低抗体保护价的最长时间即为其免疫期，并以此确定犬冠状活疫苗CCV14株的免疫期。

试验结果：3批犬冠状活疫苗免疫后，不同时间采血测定SN抗体价结果表明，3次免疫后至420d时的SN抗体效价均保持在最低保护效价1:51以上，于免疫420d时，用CCV强毒攻毒，攻毒后观察21d，对照组犬5只均表现为CCV 临床症状，免疫组10只犬均正常，无CCV临床症状。

实验结论：用犬冠状活疫苗CCV14株接种犬后抗体检测表明，犬冠状活疫苗CCV14株最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，最低SN抗体保护值为51，SN抗体保护效价与攻毒之间成正相关，因此，检测犬CCV14弱毒株免疫效果可用检测免疫后犬血清SN抗体代替攻毒保护检验方法。试验结果表明犬冠状活疫苗CCV14株的免疫原较好，免疫期可达420天。为了确保免疫效果，确定免疫期为360天(1年)。

实施例7

犬冠状活疫苗的保存期试验

试验用疫苗按照实施例方法3制备3批犬冠状活疫苗CCV14株，批号分别为201801、201802、201803。

3批犬冠状病毒活疫苗CCV14株置于2～8℃保存，于6个月、12个月、18 个月取样，进行性状、真空度、剩余水分含量、病毒含量检测。结果表明3批犬冠状活疫苗置于2～8℃保存18个月，性状、真空度、剩余水分均合格，病毒含量均不低于10^4.0TCID₅₀/头份。

免疫攻毒：保存18个月的3批犬冠状活疫苗颈部肌肉接种2月龄健康犬5 只，1头份/只，同时设对照犬5只，免疫后21日对进行攻毒，对照组犬5/5发病，免疫组犬4/5保护。

实验结论：犬冠状活疫苗CCV14株2～8℃保存18个月，为了保证疫苗免疫效果，确定疫苗在2～8℃保存，保存期为12个月。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Seq ID No.1序列表信息

序列表

<110>北京生泰尔科技股份有限公司

<120>一种犬冠状病毒弱毒株及其应用

<141>2022-05-24

<160>1

<170>SIPOSequenceListing1.0

<210>1

<211>485

<212>DNA

<213>Caninecoronavirus

<400>1

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Claims (10)

1.一种犬冠状病毒弱毒株，其特征在于：所述的犬冠状病毒弱毒株为CCV14，保藏号为CGMCC NO:18507。

2.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒弱毒株，其特征在于，所述的犬冠状病毒弱毒株的获取方法包括：犬冠状病毒强毒株经分离、鉴定后，将犬冠状病毒株接种CRFK细胞，连续传代至100代后，获得犬冠状病毒弱毒株CCV14。

3.一种犬冠状病毒弱毒株在制备治疗和/或预防犬冠状病毒所致疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物包括疫苗。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的疫苗包括犬冠状病毒弱毒株CCV14与其它病原体联合制备的多联苗；

所述的其它病原体包括犬冠状病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、钩端螺旋体中的任意一种或多种。

6.一种犬冠状病毒弱毒疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括权利要求1所述的犬冠状病毒弱毒株CCV14及药学上可接受的佐剂。

7.根据权利要求6所述的一种犬冠状病毒弱毒疫苗，其特征在于：所述犬冠状病毒弱毒疫苗以含有犬冠状病毒弱毒株CCV14的病毒液形式加入；

所述含有犬冠状病毒弱毒株CCV14的病毒液通过以下方法制备：犬冠状病毒种按5％比例接种于CRFK单层细胞，37℃培养96h～120h，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液。

8.根据权利要求6所述的一种犬冠状病毒弱毒疫苗，其特征在于：所述犬冠状病毒弱毒疫苗适用于各种品种、各种年龄的犬；可选地，所述犬冠状病毒弱毒疫苗也适用于怀孕犬。

9.一种多联疫苗，其特征在于：所述的多联疫苗包括权利要求1所述的犬冠状病毒弱毒株CCV14、其它病原体及药学上可接受的佐剂。

10.一种犬冠状病毒弱毒株在制备诊断或检测犬冠状病毒所致疾病的试剂中的应用。

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