ES2273391T3 - Composicion de vacuna para administracion a una superficie mucosal. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA EL USO DE UN ANTIGENO QUE ES UNA SUBSTANCIA MUCOSAL E INMUNOGENICAMENTE ACTIVA QUE COMPRENDE EL FRAGMENTO 50KD C DE LA TOXINA DEL TETANOS, UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DEL MISMO O UN DERIVADO DEL MISMO FORMADO POR LA ELIMINACION, SUSTITUCION O INSERCION DE UN AMINOACIDO PARA LA FABRICACION DE UNA COMPOSICION DE VACUNA PARA SU ADMINISTRACION A UNA SUPERFICIE MUCOSAL PARA INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE EN LA SUPERFICIE MUCOSAL CONTRA LA INFECCION DEL TETANOS. LA COMPOSICION DE LA VACUNA CONTIENE PREFERIBLEMENTE LA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERIOR P.69 DEL B. PERTUSIS, Y HEMOGLUTIUINA FILAMENTOSA DEL B. PERTUSIS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA COMPOSICIONES DE VACUNAS PER SE Y UN PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DEL TETANOS Y OPCIONALMENTE DE LA TOS FERINA QUE UTILIZA LAS COMPOSICIONES DE LA VACUNA.
Description
Composición de vacuna para administración a una
superficie mucosal.
La presente invención se refiere a la inducción,
en un mamífero, de una respuesta inmune hacia un antígeno o hacia
una mezcla de antígenos mediante la administración del antígeno o de
la mezcla de antígenos a una superficie mucosal del mamífero.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a la inoculación de un mamífero tal como un humano contra
las infecciones por tétanos y B. pertussis.
Ha sido desde hace tiempo la práctica de los
médicos el inmunizar a los niños humanos frente a una variedad de
enfermedades comunes por medio de vacunas mixtas que están dirigidas
contra una pluralidad de enfermedades. Por ejemplo, composiciones de
vacunas de múltiples componentes dirigidas contra la difteria, el
tétanos y la tosferina han estado disponibles durante un número de
años considerable. Tales vacunas han sido administradas hasta ahora
mediante inyección. Las ventajas de las vacunas de múltiples
componentes son fácilmente obvias en cuanto a que el paciente
(normalmente un niño) es sometido a un número mucho más pequeño de
inyecciones potencialmente dolorosas de lo que hubiera sido el caso
de otro modo.
La mayoría de enfermedades infecciosas se
inician por contacto con una superficie mucosal. El agente
infectante puede permanecer sobre o en las membranas mucosas durante
el curso de la infección o puede penetrar en el organismo y
localizarse en otros lugares. La importancia de las membranas
mucosas en la primera línea de defensa frente a las enfermedades
infecciosas puede ser deducida del hecho de que el 90% de los
linfocitos del organismo está bajo tales superficies. Sería
ventajosa la estimulación de las superficies mucosales mediante
inmunización a fin de que respondan vigorosamente y controlen
eficazmente a los organismos patógenos con los que se encuentren.
Desafortunadamente, los regímenes de inmunización tradicionales son
ineficaces para producir respuestas mucosales. Los sistemas inmunes
sistémico y local (mucosal) parecen estar compartimentalizados y, en
general, no se afectan mutuamente; esto es, la inmunización
parenteral con vacunas no vivas estimula débilmente las respuestas
inmunes mucosales, si es que lo hace. La inmunización mucosal (oral
o intranasal) puede producir anticuerpos séricos pero ésta es
normalmente menos eficaz que la inmunización parenteral. Los
inmunocitos de las diferentes membranas mucosas forman una amplia
red de intercomunicación, denominada sistema inmune mucosal común,
de tal manera que la inmunización tópica de una superficie (por
ejemplo del tracto gastrointestinal) puede dar lugar a una respuesta
inmune en esa superficie y también en superficies distantes tal como
el tracto respiratorio.
EP-A-0209281
sugiere que composiciones de vacuna que incluyen una proteína o
péptido de la toxina tetánica pueden ser administradas oralmente,
pero los Ejemplos de este documento se refieren únicamente a la
administración mediante inyección.
La Solicitud Internacional
WO-A-9015871 describe un proceso
para la producción del Fragmento C de la toxina tetánica y describe
también que una composición de vacuna conteniendo el Fragmento C
puede ser administrada inter alia oralmente o
parenteralmente, pero sólo se ejemplifica específicamente la
administración mediante inyección.
S.N. Chatfield y col., Vaccine, Vol. 10, Número
1, 1992, pp. 53.60, describen la construcción y la utilización como
vacuna de una forma mutante de Salmonella que incorpora en su
cromosoma un gen para el fragmento de 50 kD no tóxico de la toxina
tetánica. Aunque se menciona la administración oral de la vacuna,
una vez más no se proporcionan datos experimentales.
Fairweather y col., Infection and Immunity, Mayo
1990, pp. 1323-1326, describen la administración
oral de una cepa de Salmonella que incorpora un gen para el
Fragmento C de la toxina tetánica. Se describe también la
administración del Fragmento C de la toxina tetánica por vía
subcutánea, pero no se hace referencia a la administración oral del
Fragmento C per se, ni a la administración del Fragmento C
por vía intranasal.
EP-A-462534
describe vacunas anti-pertussis acelulares que
comprenden un doble mutante de la toxina de pertussis, hemaglutinina
filamentosa y la proteína de 69 kD, sólos o en combinación con la
anatoxina diftérica y tetánica. Sin embargo, no se hace referencia
en el documento a la administración oral de las composiciones de
vacunas, ni tampoco hay ninguna referencia a la administración
intranasal.
WO-A-9013313
describe una combinación sinérgica de FHA y del antígeno de 69 kD de
B. pertussis y sugiere que tales vacunas pueden ser
administradas oralmente, pero en este documento no hay ejemplos de
la administración oral de tales antígenos. Además, no hay ninguna
descripción de administración intranasal.
JP-A-63002932
describe genéricamente la administración de péptidos por vía
intranasal en combinación con un intensificador de la absorción
especificado.
Manclark y Shahin (solicitud de Patente de
EE.UU. número 07/532.327, registrada el 6.5.90 - disponible a través
del US Department of Commerce, National Technical Information
Service, Springfield, VA 22161, EE.UU.) - han descrito la
administración intranasal e intraduodenal de hemaglutinina
filamentosa (FHA) obtenida de Bordetella pertussis y han
ilustrado que la FHA es un inmunógeno mucosal eficaz. Manclark y
Shahin especularon en USSN 07/532.327 que la proteína de la membrana
externa de 69 kD (P.69) de B. pertussis sería también un
inmunógeno mucosal eficaz, pero no presentaron datos experimentales
para demostrar que éste era el caso.
El hecho de que existan muy pocas vacunas
mucosales disponibles comercialmente indica que hay problemas con el
desarrollo de tales vacunas. Muchos antígenos solubles no vivos,
particularmente los utilizados tradicionalmente por los inmunólogos,
tales como ovoalbúmina (OVA) o Hemocianina de la Lapa Ojo de
Cerradura (KLH), son malos inmunógenos mucosales. Son necesarias
dosis grandes de tales antígenos para inducir alguna respuesta, pero
las dosis grandes pueden causar también tolerancia en el individuo a
una exposición parenteral posterior al antígeno, una condición
conocida como tolerancia oral. Se ha encontrado que algunos
componentes microbianos tales como la toxina colérica (CT) o la
toxina lábil al calor (LT) de E. coli o las porciones de
unión no tóxicas de estas toxinas (CT-B y
LT-B) son potentes inmunógenos mucosales que
producen potentes anticuerpos secretados y circulantes, pero no se
ha elucidado totalmente todavía la razón por la cual tales moléculas
son buenos inmunógenos mucosales. Una propiedad que puede ser
importante es la capacidad de estas moléculas para unirse a las
células epiteliales mucosales a través de ciertos receptores de
superficie, aunque se ha encontrado en estudios realizados por otros
autores que no existe necesariamente una correlación entre la
capacidad de un antígeno para unirse a células eucarióticas y su
inmunogenicidad mucosal.
Por tanto, hasta donde nosotros sabemos, no hay
actualmente ninguna forma de predecir con certeza si un antígeno
dado poseerá buena inmunogenicidad mucosal.
Nosotros hemos encontrado ahora que ciertas
moléculas son excelentes inmunógenos mucosales y tales componentes
pueden ser utilizados en el desarrollo de una vacuna administrada
mucosalmente (intranasalmente u oralmente) contra las enfermedades
de la tosferina y el tétanos. En particular, hemos encontrado que la
proteína de la membrana externa P.69 (P.69 - conocida también como
pertactina) de B. pertussis y la porción de 50 kD
inmunogénica no tóxica de la toxina tetánica (Fragmento C) de C.
tetanii son muy inmunogénicas cuando son administradas
intranasalmente. El Fragmento C y P.69 fueron producidos mediante la
tecnología del ADN recombinante. El Fragmento C y la P.69
recombinantes producidos a partir de E. coli y levadura han
demostrado ser inmunogénicos y protectores en ratones, ver M.
Roberts y col., Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and
protection of mice against Bordetella pertussis infection;
Vaccine 10, 43 (1992); y ver también N.F. Fairweather y col.,
Infection and Immunity, 55, 2541
(1987).
(1987).
En un primer aspecto, la invención proporciona
la utilización de un antígeno acelular inmunogénicamente activo
mucosalmente que comprende el Fragmento C de 50 kD de la toxina
tetánica, un fragmento inmunogénico del mismo o un derivado del
mismo formado mediante deleción, sustitución o inserción de
aminoácidos, para la producción de una composición de vacuna
acelular para ser administrada a una superficie mucosal con el fin
de inducir una respuesta inmune en la superficie mucosal contra la
infección tetánica.
En una realización particular de la invención,
se proporciona la utilización de una mezcla de antígenos para la
producción de una composición de vacuna para su administración a una
superficie mucosal con el fin de inducir una respuesta inmune en la
superficie mucosal contra cada uno de dichos antígenos,
comprendiendo la mezcla de antígenos:
(a) una sustancia inmunogénicamente activa
mucosalmente que comprende el Fragmento C de 50 kD de la toxina
tetánica, un fragmento inmunogénico del mismo o un derivado del
mismo formado por deleción, sustitución o inserción de aminoácidos;
y
(b) una sustancia inmunogénicamente activa
mucosalmente que comprende la proteína de la membrana externa P.69
de B. pertussis; un fragmento inmunogénico de la misma o un
derivado de la misma formado por deleción, sustitución o inserción
de aminoácidos.
En una realización preferida, la invención
proporciona la utilización de una mezcla de antígenos como los
definidos anteriormente en la presente, pero donde dicha mezcla
comprende además de (a) y (b):
(c) una sustancia inmunogénicamente activa
mucosalmente que comprende hemaglutinina filamentosa de B.
pertussis, un fragmento inmunogénico de la misma o un derivado
de la misma formado por deleción, sustitución o inserción de
aminoácidos.
Las composiciones para administración mucosal
pueden ser formuladas, por ejemplo, para administración a una o más
de las siguientes mucosas: oral, gastrointestinal y respiratoria
(por ejemplo nasal y bronquial).
Cuando la composición está destinada para ser
administrada a la mucosa respiratoria (por ejemplo nasal o
bronquial), típicamente es formulada como una solución acuosa para
ser administrada como un aerosol o como gotas nasales, o bien como
un polvo seco para, por ejemplo, inhalación.
Las composiciones para administración como gotas
nasales pueden contener uno o más excipientes del tipo incluido
normalmente en tales composiciones, por ejemplo conservantes,
agentes para ajustar la viscosidad, agentes para ajustar la
tonicidad, agentes tamponantes, etc.
Las preparaciones antigénicas pueden consistir
en composiciones destinadas a administrar la mezcla de antígenos a
las superficies mucosales del tracto gastrointestinal. Se prefiere
que tales composiciones sean proporcionadas con un medio para
impedir la degradación de los antígenos por los jugos gástricos. Por
ejemplo, las composiciones pueden consistir en cápsulas, por ejemplo
microcápsulas, en las cuales los antígenos están retenidos en una
matriz o revestimiento protector formado a partir de un polímero
protector apropiado tal como poli (glicólido), poli
(láctido-co-glicólido), almidón
poliacrílico o revestimientos dependientes del pH tales como los
poliacrilatos o el ftalato de hidroxipropilmetil celulosa.
Los antígenos pueden consistir en el Fragmento C
de la toxina tetánica per se, la proteína P.69 per se
o la hemaglutinina de B. pertussis per se. O bien pueden
consistir en una molécula más grande conteniendo uno o más de los
antígenos anteriores, fragmentos inmunogénicamente activos de los
mismos o derivados formados por deleción, sustitución e inserción de
aminoácidos, siempre que la molécula más grande sea
inmunogénicamente activa cuando sea administrada directamente a la
mucosa.
El antígeno o la mezcla de antígenos son
típicamente seleccionados de tal forma que no sean tóxicos para un
receptor de los mismos a la concentraciones empleadas para producir
una respuesta inmune.
En una realización, dos o más de los antígenos
que forman la mezcla pueden estar presentes en una única molécula.
Tal molécula puede ser preparada mediante métodos recombinantes a
través de la preparación de una construcción de ADN que contenga
genes que codifiquen dos o más de los antígenos y la expresión en un
huésped adecuado de acuerdo con métodos conocidos.
Las sustancias antigénicas individuales pueden
actuar cada una también como vehículos de uno o más de los demás
antígenos. Por ejemplo, un antígeno tal como la proteína de la
membrana externa P.69 o el Fragmento C, puede ser acoplado a otro
antígeno y ejemplos de tales "otros" antígenos incluyen el
antígeno de Haemophilus del grupo B y el antígeno
polisacarídico meningocócico.
Con el fin de incrementar la inmunogenicidad
mucosal de la mezcla de antígenos o de cualquier antígeno componente
de la misma o de fragmentos inmunogénicos apropiados de los mismos,
pueden ser incorporados a vehículos apropiados, por ejemplo a
virosomas. La inmunogenicidad puede ser también incrementada
mediante la incorporación a la vacuna de adyuvantes mucosales
apropiados tal como la toxina colérica o la toxina lábil al calor de
E. coli, variantes de las mismas genéticamente destoxificadas
o sus subunidades de unión (B).
La composición de vacuna puede contener
opcionalmente otra porción inmunogénicamente activa mucosalmente de
la molécula de la toxina tetánica. Además, la vacuna mixta puede
contener uno o más antígenos inmunogénicamente activos mucosalmente
adicionales.
En una realización, la composición de vacuna
puede contener, además de formas inmunogénicas no tóxicas de la
toxina tetánica y de antígenos de pertussis, formas inmunogénicas no
tóxicas de la toxina diftérica y formas inmunogénicas del
polisacárido de Haemophilus influenzae del grupo B (HiB),
proporcionando de este modo una vacuna mucosal contra la
difteria-tétanos-pertussis (DTP) o
una vacuna DTPHiB.
La proteína de la membrana externa P.69 de B.
pertussis es una proteína de peso molecular 61 kD
aproximadamente; ver A.J. Makoff y col., "Protective surface
antigen P.69 of Bordetella pertussis: its characteristics and
very high level expression in Escherichia coli",
Bio-Technology, 8, 1030 (1990).
Puede ser preparada y aislada de acuerdo con el
método descrito en P. Novotny y col.: The Journal of Infectious
Diseases, 164, 114 (1991), o material recombinante preparado a
partir de E. coli por el método dado en el artículo de A.J.
Makoff y col., referido anteriormente. Puede unirse a células
eucarióticas.
La hemaglutinina filamentosa de B.
pertussis purificada contiene normalmente polipéptidos de
diferente peso molecular que varían de 98-220 kD, y
puede ser aislada y purificada de sobrenadantes del cultivo celular
de B. pertussis, según está descrito por ejemplo en el
artículo de P. Novotny y col. referido anteriormente. La
hemaglutinina filamentosa es capaz de unirse a células eucarióticas
y producir la hemoaglutinación de eritrocitos de carnero.
El Fragmento C de la toxina tetánica es un
péptido de peso molecular 50 kD aproximadamente que puede ser
aislado y purificado a partir de E. coli mediante el método
descrito en A.J. Makoff y col., Bio/Technology, 7, 1043 (1989). El
Fragmento C se caracteriza por su capacidad para unirse a las
células eucarióticas que poseen el trisialogangliósido G_{T}16 y
por su capacidad para producir protección en ratones frente a un
desafío letal con la toxina tetánica.
Las moléculas antigénicas utilizadas en la
presente invención pueden ser preparadas mediante aislamiento y
purificación de los organismos en los que existen de manera natural
o pueden ser preparadas mediante técnicas recombinantes y expresadas
en un huésped adecuado tal como E. coli de una manera
conocida. Cuando son preparadas mediante un método recombinante o
mediante síntesis, pueden producirse una o más inserciones,
deleciones, inversiones o sustituciones de los aminoácidos que
constituyen el péptido.
Cada uno de los antígenos anteriormente
mencionados es utilizado preferiblemente en estado sustancialmente
puro. La cantidad de la mezcla de antígenos administrada dependerá,
en parte, de la pureza de los antígenos individuales. Por tanto,
para una forma sustancialmente pura de la proteína de la membrana
externa P.69, una dosis dentro del rango de 1-100
microgramos/dosis aproximadamente sería administrada típicamente a
un humano, dependiendo la cantidad real de la inmunogenicidad de la
preparación en humanos cuando es aplicada a superficies
mucosales.
Para una forma sustancialmente pura de la
hemaglutinina filamentosa de B. pertussis y del Fragmento C
de 50 kD de la toxina tetánica, un rango de dosis típico sería del
orden del dado anteriormente con respecto a la proteína P.69. En un
régimen de inmunización típico que emplee las preparaciones
antigénicas de la presente invención, la vacuna puede ser
administrada en varias dosis (por ejemplo, 1-4),
conteniendo cada dosis 1-100 microgramos de cada
antígeno. El régimen de inmunización puede implicar una inmunización
simplemente por vía mucosal o mediante una combinación de
inmunización mucosal y parenteral. La dosificación dependerá en
general de la inmunogenicidad de los diferentes antígenos cuando son
aplicados al tracto respiratorio o gastrointestinal de humanos.
La invención será ilustrada a continuación con
mayor detalle mediante referencia las realizaciones específicas
descritas en los ejemplos siguientes.
Los ejemplos están destinados a ser únicamente
ilustrativos de la invención y no tienen la intención de limitar su
ámbito de ninguna manera.
La Figura 1 ilustra el crecimiento de B.
pertussis en los pulmones de ratones inmunizados
intranasalmente. Los ratones fueron inmunizados intranasalmente con
dos dosis de antígeno el día 0 y el día 29 y posteriormente
desafiados con B. pertussis en aerosol 14 días más tarde (día
43). Los recuentos representan las medias de 4 pares de pulmones
\pm ESM.
La Figura 2 ilustra la respuesta inmune local en
los pulmones de ratones en respuesta a la inmunización y el desafío
intranasal. Se purificaron linfocitos de los pulmones de grupos de
ratones después de inmunización intranasal y desafío con aerosol y
se determinó el número de células que secretaban anticuerpos hacia
el antígeno inmunizante mediante el ensayo ELISPOT. Los recuentos
representan la respuesta de linfocitos agrupados de 4 ratones.
La Figura 3 ilustra la respuesta de anticuerpos
primaria hacia los antígenos de pertussis en los pulmones de
ratones después de un desafío con aerosol. Los linfocitos
procedentes de los pulmones extraídos 10 días después del desafío
con aerosol fueron analizados para determinar la producción de
anticuerpos contra P.69 o FHA. Los ratones inmunizados con un
antígeno fueron analizados frente al otro antígeno. Los recuentos
representan la respuesta de linfocitos agrupados procedentes de
grupos de 4 ratones.
Se inmunizaron ratones con 12 \mug de P.69,
FHA u OVA el día 1 y el día 29. Los ratones fueron posteriormente
desafiados con Bordetella pertussis en aerosol el día 43 (14
días después de la inmunización de refuerzo). Los pulmones fueron
extraídos de grupos de ratones en periodos después del desafío, se
homogeneizaron y se realizaron recuentos de bacterias viables con el
fin de determinar el crecimiento de B. pertussis en el tracto
respiratorio. Los resultados están mostrados en la Figura 1. El
número de bacterias aumentó en los pulmones de los ratones control
(OVA) durante los primeros siete días. En contraste, en los animales
inmunizados con P.69 y FHA el número de bacterias disminuyó durante
este periodo y en el punto de tiempo del día 7 los niveles de
bacterias en los pulmones de los ratones inmunizados eran únicamente
del 1-4% de los del grupo control. Hacia el día 14
las bacterias había casi desaparecido de los pulmones de los ratones
inmunizados pero estaban todavía presentes en un número elevado en
los ratones inmunizados con OVA.
La respuesta inmune local en los pulmones de los
ratones fue analizada haciendo un recuento de las células que
secretaban anticuerpos contra FHA, P.69 u OVA entre los linfocitos
aislados de los pulmones de los ratones mediante "ELISPOT".
Había un número bajo de células secretoras de anticuerpos (ASC) que
producían anticuerpos contra los antígenos inmunizantes después de
la segunda (Figura 2). Después del desafío mediante aerosol de las
ASC en los pulmones de los ratones inmunizados con FHA o con P.69,
pero no con OVA, aumentaron en varios órdenes de magnitud (Figura
2). Se detectaron células secretoras de anticuerpos de los isotipos
IgG, IgA e IgM.
El incremento de ASC después del desafío
mediante aerosol puede representar una respuesta primaria a los
antígenos presentes en los organismos del desafío o un refuerzo de
la respuesta en los ratones inmunizados. Con el fin de ver cuál de
estas opciones era la correcta, linfocitos de pulmón fueron
sometidos a selección frente a antígenos con los que los ratones no
habían tenido contacto hasta el desafío (los ratones inmunizados con
FHA fueron analizados frente a P.69, etc.). Como puede observarse en
la Figura 3, las respuestas fueron similares en todos los ratones y
las comparaciones con el mismo punto de tiempo (d23) en la Figura 1
muestran que las inmunizaciones intranasales previas incrementan la
respuesta varias veces.
\newpage
La respuesta sérica fue estudiada utilizando
ELISA y los resultados están mostrados en la Tabla 1 siguiente:
Título de
anticuerpos^{a}
| Días después de la inmunización | ||||||
| 8 | 20 | 24 | ||||
| Grupo | FHA | P.69 | FHA | P.69 | FHA | P.69 |
| FHA | <50 | <50 | 400 | 100 | 1600 | 100 |
| P.69 | <50 | <50 | <50 | 200 | 200 | 400 |
| OVA | <50 | <50 | <50 | <50 | 100 | 200 |
| ^{a} Determinado mediante ELISA | ||||||
| ^{b} Ratones desafiados con aerosol el d14 |
No había anticuerpos detectables contra FHA ni
contra P.69 antes del desafío con aerosol (d8). No había anticuerpos
anti-OVA en el suero de los ratones inmunizados con
OVA (datos no mostrados). Después del desafío (>d14), la
respuesta anti-FHA mostró un gran incremento en los
ratones inmunizados con FHA. Este incremento era específico, la
respuesta anti-P.69 no aumentaba de manera
proporcional en estos ratones. Hubo un pequeño aumento del título de
anti-P.69 en los ratones inmunizados con P.69 en
comparación con los ratones inmunizados con FHA o P.69. Esto
demostraba que la exposición respiratoria previa a FHA y,
posiblemente, a P.69 podía estimular a los ratones para producir una
respuesta sérica amnéstica después del contacto con el patógeno.
Grupos de 10 ratones fueron inmunizados
intranasalmente con una o dos dosis de 20 \mug de Fragmento C o de
OVA como control. Veintiocho días después de la última inmunización,
los ratones fueron desafiados con 500 DL_{50} de la toxina
tetánica y se monitorizó su supervivencia durante 4 días; los
resultados están mostrados en la Tabla 2 siguiente. La supervivencia
se incrementó en los ratones que recibieron 1 ó 2 dosis del
Fragmento C en comparación con los ratones control. Todos los
ratones control estaban muertos el día después del desafío. La
protección se incrementó enormemente por la administración de 2
dosis de Fragmento C; hacia el día 4 después del desafío, el 80% de
los ratones del grupo de 2 dosis estaban todavía vivos en
comparación con el 10% de los ratones que recibieron una única
dosis.
| Grupo | Dosis | Nº de | Supervivencia después del desafío | |||
| Ratones | ||||||
| Día | ||||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | |||
| 1. Fragmento C | 20 \mug | 10 | 3 | 3 | 2 | 1 |
| 2. Fragmento C | 2 x 20 \mug | 10 | 10 | 8 | 8 | 8 |
| 3. OVA | 2 x 20 \mug | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Los ratones que recibieron 2 dosis de Fragmento
C tenían un título sérico medio de anti-Fragmento C
mayor de 200 antes del desafío.
P.69 fue sintetizada intracelularmente en E.
coli y purificada según está descrito en A.J. Makoff y col.,
Bio/
Technology, 8, 1030 (1990). La FHA fue proporcionada por SKB bajo un acuerdo de intercambio de reactivos. El Fragmento C fue producido a partir de E. coli como en A.J. Makoff y col., Bio/Technology, 7, 1043 (1989). Los antígenos fueron diluidos en PBS inmediatamente antes de la inmunización.
Technology, 8, 1030 (1990). La FHA fue proporcionada por SKB bajo un acuerdo de intercambio de reactivos. El Fragmento C fue producido a partir de E. coli como en A.J. Makoff y col., Bio/Technology, 7, 1043 (1989). Los antígenos fueron diluidos en PBS inmediatamente antes de la inmunización.
Ratones BALB/c adultos (6-8
semanas) fueron anestesiados con metatano. Se añadieron 30 \mul de
solución del antígeno a las narinas externas de los ratones (15
\mul/narina) a medida que recuperaban la conciencia. El antígeno
se hizo entrar en el tracto respiratorio por inhalación.
Los ratones fueron colocados en jaulas sobre un
carrusel rotatorio en una cámara de exposición de plástico según
está descrito en P. Novotny y col., Development for Biological
Standards, 61, 27 9 1985). Se preparó una suspensión bacteriana en
PBS a partir de cultivos de 2 a 3 días de edad de B.
pertussis BBC26 cultivados en placas de agar sangre CW. Los
ratones fueron expuestos a un aerosol (generado a partir de la
suspensión bacteriana) de 2 x 10^{9} unidades formadoras de
colonias (UFC) en PBS mediante un tubo con una boquilla de Turret
operado por un compresor de flujo elevado CR60 System 22
(Medic-Aid, Pagham, West Susssex, R.U.) que producía
un vapor muy fino a un flujo dinámico de 8,5 litros/minuto. El vapor
generado fue conducido a través de una cámara mediante una bomba de
vacío a un pase de 12 l de aire por mezcla de vapor por minuto
aproximadamente, que mantenía una humedad relativa del 70% en la
cámara. La exposición al aerosol duró 30 minutos, dejando
posteriormente un periodo de 10 minutos para que la cámara se
vaciara.
El curso de la infección fue determinado
mediante la realización de recuentos de bacterias viables en los
pulmones. Grupos de cuatro ratones fueron retirados a intervalos y
sacrificados mediante dislocación cervical, y sus pulmones fueron
extraídos asépticamente y homogeneizados en un homogeneizador de
Potter-Elvehjem con 2 ml de PBS. Diluciones del
homogenado fueron depositadas sobre placas de agar sangre de
Cohen-Wheeler (CW) y se determinó el número de UFC
para cada conjunto de pulmones.
Los ratones fueron desafiados con 500 DL_{50}
de toxina tetánica subcutáneamente y se observaron regularmente
durante 5 días.
Los anticuerpos séricos
anti-P.69, anti-FHA y
anti-Fragmento C fueron medidos utilizando un ensayo
sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA). El antígeno (50
\mul; 1 g/ml en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2) fue
absorbido en placas de microvaloración de 96 pocillos (EIA
"Costar" NBL, Northumbria, R.U.) mediante incubación a 4ºC
durante una noche. Los pocillos fueron aspirados y lavados tres
veces con PBS que contenía un 0,05% (v/v) de Tween 20
(PBS-T; Sigma) y posteriormente bloqueados con un 3%
(p/v) de seroalbúmina bovina (BSA; Sigma) en PBS. Después de lavar,
se añadieron 50 \mul por pocillo del suero de ensayo diluido
apropiadamente en PBS-T-BSA 0,1%.
Después de incubación a 37ºC durante 2 horas, los pocillos fueron
lavados e incubados a temperatura ambiente con 50 \mul de sustrato
(clorhidrato de O-fenilendiamina al 0,04%; Sigma)
disuelto en tampón citrato fosfato (pH 5,0 [citrato 24 mM, hidrógeno
fosfato disódico 64 mM] conteniendo 40 \mul de peróxido de
hidrógeno). La reacción fue finalizada por la adición de 50 \mul
de ácido sulfúrico 1 M. Las placas fueron leídas en un lector de
ELISA Titertek Multiscan MCC a 492 nm.
El título fue expresado como el recíproco de la
dilución más alta del suero de ensayo que daba una absorbancia que
era el doble de la del suero presangría diluido de manera similar.
Los valores de absorbancia inferiores a 0,1 fueron desechados.
La producción de anticuerpos locales en el
pulmón murino fue determinada utilizando la técnica ELISPOT. Se
aislaron linfocitos de los pulmones murinos según sigue: Los
pulmones fueron lavados brevemente en PBS para eliminar las trazas
de sangre y posteriormente fueron troceados finamente con una hoja
de bisturí. Se añadió 1 ml de PBS conteniendo MgCl_{2} 10 mM, 0,5
U/ml de colagenasa A (Boehringer Mannheim, Lewes, R.U.) y 0,25 mg/ml
de ADNasa 1 (Boehringer) para cada par de pulmones y se incubó a
37ºC con agitación suave durante 45 minutos. La mezcla fue
posteriormente pasada a través de una rejilla de calibre 40. Los
grumos fueron presionados a través de la rejilla con el émbolo de
una jeringa de 5 ml. La suspensión celular se colocó en un tubo de
centrífuga y se dejó reposar durante varios minutos para permitir la
sedimentación de los desechos celulares grandes. Se retiró el
sobrenadante y las células fueron aglutinadas y lavadas varias
veces. Los glóbulos rojos y las células no viables fueron eliminados
mediante centrifugación en un gradiente de
Ficol-Isopaque (LSM, Flow Laboratories Ltd, Herts,
R.U.). Después de lavar, se determinó la viabilidad celular mediante
la exclusión de Azul Trypan. Las células fueron finalmente
suspendidas en medio completo RPMI 1640 (10% de suero de ternera
fetal, 100 UI/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina,
L-glutamina 2 mM; Flow).
El ensayo de ELISPOT fue realizado según sigue:
Brevemente, placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Costar)
fueron revestidas durante una noche con P.69, FHA u OVA (0,5 ml de 1
g/ml en PBS). Después de lavar y bloquear se añadieron a los
pocillos volúmenes de 0,5 ml de diluciones de la suspensión de
linfocitos en RPMI 1640 completo y se incubaron a 37ºC/10% de
CO_{2} durante 3 horas. Después de lavar, se añadieron
secuencialmente anti-IgG, A o M de ratón producido
en cabra (1/1000, Sigma) y anti-IgG de cabra
producida en conejo-fosfatasa alcalina (1/1000,
Sigma). Finalmente, se añadió la solución de sustrato (0,5 \mul de
1 mg/ml de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP) en tampón
2-amino-2-metil-1,3-propanodiol
(AMP), Sigma) y las placas fueron incubadas hasta que se hicieron
visibles manchas azules bajo microscopía de bajo aumento.
Claims (6)
1. La utilización de un antígeno acelular
(referido de aquí en adelante como "(a)"), que es una sustancia
inmunogénicamente activa mucosalmente que comprende el Fragmento C
de 50 kD de la toxina tetánica, un fragmento inmunogénico del mismo
o un derivado del mismo formado por deleción, sustitución o
inserción de aminoácidos, para la producción de una composición de
vacuna acelular para administración a una superficie mucosal con el
fin de inducir una respuesta inmune en la superficie mucosal contra
la infección tetánica.
2. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la composición de vacuna comprende
además: (b) una sustancia inmunogénicamente activa mucosalmente que
comprende la proteína de la membrana externa P.69 de B.
pertussis; un fragmento inmunogénico de la misma o un derivado
de la misma formado por deleción, sustitución o inserción de
aminoácidos.
3. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en la que la composición
de vacuna comprende además: (c) una sustancia inmunogénicamente
activa mucosalmente que comprende la hemaglutinina filamentosa de
B. pertussis, un fragmento inmunogénico de la misma o un
derivado de la misma formado por deleción, sustitución o inserción
de aminoácidos.
4. La utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición de vacuna es
para administración a la mucosa respiratoria (por ejemplo nasal o
bronquial) o a la mucosa gastrointestinal.
5. La utilización de acuerdo con cualquiera de
los reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición de vacuna
comprende además un antígeno o antígenos inmunogénicamente activos
mucosalmente adicionales y opcionalmente una forma inmunogénica no
tóxica de la toxina tetánica.
6. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que el antígeno o los antígenos adicionales
son seleccionados entre una forma mucosalmente inmunogénica no
tóxica de la toxina diftérica y el polisacárido de Heamophilus
influenzae del grupo B.
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