RU2285539C2 - Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями - Google Patents

Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Download PDF

Info

Publication number
RU2285539C2
RU2285539C2 RU2004103997/13A RU2004103997A RU2285539C2 RU 2285539 C2 RU2285539 C2 RU 2285539C2 RU 2004103997/13 A RU2004103997/13 A RU 2004103997/13A RU 2004103997 A RU2004103997 A RU 2004103997A RU 2285539 C2 RU2285539 C2 RU 2285539C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
brucellosis
molecular
vaccine
entheropathogenic
bacteria
Prior art date
Application number
RU2004103997/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2004103997A (ru
Inventor
Сергей Бронеславович Ставицкий (RU)
Сергей Бронеславович Ставицкий
Анатолий Николаевич Носков (RU)
Анатолий Николаевич Носков
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР"
Priority to RU2004103997/13A priority Critical patent/RU2285539C2/ru
Publication of RU2004103997A publication Critical patent/RU2004103997A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2285539C2 publication Critical patent/RU2285539C2/ru

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложена молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями. Вакцина содержит белок внешних мембран бруцелл, конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используются В-субъединицы термолабильного энтеротоксина E. coli. Предложенная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл и энтеропатогенных E. coli и V. cholera. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 3 табл.

Description

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам конструирования вакцины и ее применения для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera и другими.
Уровень техники
Для профилактики бруцеллеза в настоящее время используются живые вакцины на основе аттенуированных штаммов Brucella abortus 82, 82рп и 75/79 в России, Brucella abortus RB51 и S19 в США [1-4]. Живые бактериальные вакцины являются эффективным инструментом для создания защитного иммунитета против внутриклеточных паразитов, но в случае с бруцеллами такие вакцины не обеспечивают достаточного уровня защиты. Все перечисленные вакцины не обеспечивают 100% защиту животных от бруцеллеза. Кроме того, они не безопасны для человека и при вакцинации могут провоцировать развитие инфекционного процесса. Практическое использование этих вакцин показало, что вакцинация во многих случаях приводит к развитию вялотекущей бруцеллезной инфекции с разнообразными осложнениями аллергенного характера.
Известна также вакцина на основе инактивированных нагреванием при 80°С клеток бруцелл штамма 45/20 и разрушенных ультразвуком [4]. Антигенная субстанция осаждается 10% трихлоруксусной кислотой и лиофильно высушивается. Данная вакцина требует двукратного введения и обладает высокореактогенными свойствами.
Другим известным препаратом является вакцина на основе белково-полисахаридного комплекса, выделенного химическим путем из клеток бруцелл [5]. Основным недостатком этого препарата является неизвестный состав и отсутствие возможности введения стандартизации различных партий.
Для профилактики диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera, используется иммунизация животных препаратами, содержащими В-субъединицы термолабильного или холерного токсина.
Настоящее изобретение позволяет решить такие задачи, как высокая стандартизация препарата на основе точного химического состава вакцины, дозируемость и возможность введения различными способами (внутримышечно, подкожно, интраназально и перорально), при этом достигается следующий результат: при двукратном подкожном введении создает напряженный и длительный (не менее одного года) иммунитет у привитых животных, эффективный против экспериментального заражения бруцеллами за счет индукции специфических цитотоксических лимфоцитов [6].
Сущность изобретения
Сущностью изобретения - это молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза на основе белка внешних мембран бруцелл с молекулярным весом и аминокислотной последовательностью
MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGY GWNKAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVK QGFEGSLGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLT DNILGRVEYRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF, [1]
конъюгированного с молекулярным носителем, в качестве которого были использованы В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.
Рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии. Культуры штаммов E. coli BL21, продуцентов белков, выращивали на L-бульоне с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) до OD600=0,6-0,8 и индуцировали экспрессию рекомбинантных белков с помощью 1-2 mM изопропил-D-тиогалактопиранозила (ИПТГ). Через три часа после культивирования с индуктором бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 минут и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (3 раза по 30 секунд с минутным интервалом при мощности 150 Вт) в присутствии ингибитора протеаз PMSF. После удаления центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут клеточного дебриса супернатант наносили на колонку сефарозой, к которой ковалентно были присоединены антитела против В-субъединиц термолабильного токсина. Связанный белок элюировали 3М гуанидинхлорида. Очищенный препарат рекомбинантных белков обессоливали на колонке с биогелем Р6, уравновешенным Na-фосфатным буферным раствором рН 7,2 и хранили при температуре 4°С.
Пример. Профилактическую эффективность разработанного препарата изучали на мышиной модели бруцеллеза. В качестве модели экспериментального бруцеллеза использовали мышей линии СВА, инфицированных дозой в 104 КОЕ (колонеобразующих единиц) штамма Brucella abortus SI9. Через 7-10 дней высевы из селезенки демонстрировали инфицированность на уровне 105,5-6 КОЕ. Животным (в каждой группе по 10) вводили препарат рекомбинантных белков в дозах от 100 нг до 5 мкг подкожно в объеме 0,1 мл. Через месяц проводили повторную иммунизацию. Через 6 месяцев после последней иммунизации животным внутрибрюшинно в дозе 104 КОЕ вводили культуру Brucella abortus SI9, выращенную на чашках с эритрит-агаром, в объеме 0,5 мл. Вскрытие проводили на 7-10 сутки после заражения. Селезенку взвешивали и помещали в стерильную ступку, тщательно растирали пестиком до получения однородной массы. В ступку с гомогенатом вносили 5 мл стерильного Na-фосфатного буфера с 0,2% Tween-80, дополнительно гомогенизировали и титровали шагом 1:10. Из каждого разведения производили посев в объеме 0,1 мл на чашки с эритрит-агаром с добавлением полимиксина. Предварительный учет результатов проводили через 5 суток, окончательный учет - через 10 суток.
Таблица 1.
Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных подкожно различными дозами препарата.
Препарат Высеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах
102 КОЕ 104 KOE
Контроль 1 (физиологический р-р)- 3,67±0,52 5,94±0,81
Контроль 2 (A201-258-BLT, 5 3,34±0,65 5,88±0,87
omp25-A201-258-BLT, 100 нг 2,11±0,53 4,15±0,75
omp25-A201-258-BLT, 500 нг 0 2,81±0,33
omp25-A201-258-BLT, 1 мкг 0 2,03±0,41
omp25-A201-258-BLT, 5 мкг 0 1,48±0,45
Таблица 2.
Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных перорально различными дозами препарата.
Препарат Высеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах
102 KOE 104 KOE
Контроль 1 (физиологический р-р) 3,81±0,61 6,43±0,84
Контроль 2 (A201-258-BLT, 5 3,74±0,59 6,80±0,89
omp25-A201-258-BLT, 100 нг 2,93±0,67 5,75±0,63
omp25-A201-258-BLT, 500 нг 1,96±0,73 4,81±0,57
omp25-A201-258-BLT, 1 мкг 0,98±0,76 2,99±0,48
omp25-A201-258-BLT, 5 мкг 0 1,87±0,42
Таблица 3.
Титр антител против В-субъединиц термолабильного энтертоксина у животных, иммунизированных подкожно и перорально различными дозами препарата.
Препарат Титр антител против В-субъединиц у животных
подкожно перораль
Контроль 1 (физиологический р-р) 0 0
Контроль 2 (A201-258-BLT, 5 мкг) 1/1280 1/640
omp25-A201-258-BLT, 100 нг 1/160 1/160
omp25-A201-258-BLT, 500 нг 1/320 1/320
omp25-A201-258-BLT, 1 мкг 1/1280 1/640
omp25-A201-258-BLT, 5 мкг 1/1280 1/640
Таким образом, разработанная молекулярная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл: двукратное введение молекулярной вакцины подкожно в дозе от 500 нг до 5 мкг эффективно и статистически достоверно снижает инфицированность более чем в 1000 раз при инфицирующей дозе 104 КОЕ и демонстрирует отсутствие высеваемости при инфицирующей дозе 102 КОЕ, при пероральном введении отсутствие высеваемости бруцелл наблюдается только при высокой дозе в 5 мкг и значительное более чем в 600 раз снижение инфицированности при высокой дозе инфицирования. При обоих способах вакцинации рекомбинантными препаратами титр антител против В-субъединицы термолабильного энтеротоксина достигал тех же значений, что и против нативных В-субъединиц (1/1280 при дозе в 5 мкг).
Источники информации
1. Сухая живая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма №19, ГОСТ 1859-73.
2. Патент Франции №2479000, кл. F 61 K 39/10, 1983.
3. Авторское свидетельство СССР №467933, кл. F 61 K 39/08, опубл. 1975.
4. Ветеринарные препараты. Справочник /Сост. Ю.Ф.Борисевич, Л.В.Кириллов./ Под ред. Д.Ф.Осидзе. М.: Колос, 1981, с.178-180.
5. Изучение иммуногенной активности искусственных бруцеллезных антигенов. /Петров Р.В. и др./ - ЖМЭИ №7, 1988, с.39-42.
6. Induction of specific cytotoxic lymphocytes in mice vaccinated with Brucella abortus RB51. /He Y, Vemulapalli R, Zeytun A, Schurig GG./ Infect Immun. 2001. 69(9), p.5502-5508.
7. Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene /Cloeckaert A, Verger JM, Grayon М, Zygmunt MS, Grepinet O./ Infect Immun. 1996 Jun; 64(6): 2047-55.

Claims (1)

  1. Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями (E. Coli, V. Cholera и другие), отличающаяся тем, что в качестве специфического начала используется белок внешних мембран бруцелл с молекулярной массой 25 kDa и аминокислотной последовательностью
    MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGYGWN KAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVKQGFEGS LGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLTDNILGRVE YRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF,
    конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используются В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.
RU2004103997/13A 2004-02-13 2004-02-13 Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями RU2285539C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004103997/13A RU2285539C2 (ru) 2004-02-13 2004-02-13 Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004103997/13A RU2285539C2 (ru) 2004-02-13 2004-02-13 Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2004103997A RU2004103997A (ru) 2005-07-27
RU2285539C2 true RU2285539C2 (ru) 2006-10-20

Family

ID=35843153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004103997/13A RU2285539C2 (ru) 2004-02-13 2004-02-13 Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2285539C2 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLOECKAERT A. et.al., «Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene», Infect Immun. 1996 Jun; 64(6): 2047-55. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004103997A (ru) 2005-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5830009B2 (ja) Staphylococcusaureusに対して免疫化するための組成物
ES2273391T3 (es) Composicion de vacuna para administracion a una superficie mucosal.
ES2257769T3 (es) Metodo para la preparacion de vacunas multivalentes.
KR101818901B1 (ko) 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물
WO2005049076A1 (es) Polisacáridos capsulares de neisseria meningitidis como inmunopotenciadores mucosales y formulaciones resultantes
JP2005511662A (ja) アジュバント化された抗原性髄膜炎菌性組成物
Frandoloso et al. Proof of concept for prevention of natural colonization by oral needle-free administration of a microparticle vaccine
BR112021008646A2 (pt) uma vacina para proteção contra streptococcus suis
Matsumoto et al. Efficacies of alkaline protease, elastase and exotoxin A toxoid vaccines against gut-derived Pseudomonas aeruginosa sepsis in mice
Schadich et al. Role of Salmonella Typhi Vi antigen and secretory systems on immune response
Prygiel et al. Diphtheria–tetanus–pertussis vaccine: past, current & future
JP2020529408A (ja) ストレプトコッカス・スイスに対する防御のためのワクチン
JPS6133010B2 (ru)
US5429818A (en) Non-capsulated mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae useful as vaccines
JPH05508407A (ja) パスツレラ・ムルトシダのトキソイドワクチン
CN100410276C (zh) 多肽
RU2285539C2 (ru) Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями
JP5963674B2 (ja) Asワクチンとして使用するための黄色ブドウ球菌divi1b
ES2655421T3 (es) Vacuna contra la peste
AU761394B2 (en) Superoxide dismutase as a vaccine antigen
US20100015181A1 (en) Vaccine formulation
RU2285538C2 (ru) Молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза
JP2010516279A (ja) 表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答を誘導するためのポリペプチド
JPH11240844A (ja) 肺炎球菌抗原の経口投与
JP7349366B2 (ja) クロストリジウム類毒素を含むワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20070214