ES2257769T3 - Metodo para la preparacion de vacunas multivalentes. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende: a) toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa en forma purificada, b) toxoide tetánico, c) toxoide diftérico, d) virus de la polio inactivado, e) un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, f) un antígeno de superficie de hepatitis B, y g) una sal de aluminio, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas: (1) preparar una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio a temperatura ambiente; (2) añadir sucesivamente toxoide diftérico y toxoide tetánico a la suspensión de gel; (3) añadir toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa, cada uno adsorbido separadamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (2), seguido de al menos 30 minutos de agitación y reposo adicional durante una noche; (4) añadir a la mezcla obtenida en (3) tampones carbonato en medio 199 y ajustar el pH aproximadamente de 7, 0 a 7, 2; (5) introducir virus de la polio inactivado en la mezcla obtenida en (4) y ajustar después el pH a un valor en el intervalo de 6, 8 a 7, 0; (6) añadir antígeno de superficie de hepatitis B, adsorbido previamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (5), seguido de al menos 30 minutos de agitación; y (7) añadir una disolución de un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, preparado previamente en tampón fosfato y un tampón de Tris-sacarosa, a la mezcla obtenida en (6), seguido de al menos 30 minutos de agitación.

Description

Método para la preparación de vacunas multivalentes.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades infecciosas siguen siendo una amenaza para la salud humana a pesar de décadas de investigación de vacunas. Las vacunas de combinación que proporcionan protección contra múltiples patógenos son muy deseables para minimizar el número de inmunizaciones necesarias para conferir protección contra múltiples patógenos. El bien documentado fenómeno de la competición antigénica complica el desarrollo de vacunas multicomponentes. Competición antigénica designa la observación de que administrar múltiples antígenos a menudo da como resultado una respuesta reducida a ciertos antígenos respecto a la respuesta inmune observada cuando dichos antígenos se administran individualmente.

Los múltiples patógenos contra los que las vacunas de la presente invención proporcionan protección se discuten en el contexto de las enfermedades que causan y los antígenos de los patógenos que pueden utilizarse en la formulación de la presente invención.

La tos ferina o pertussis es una grave infección del tracto respiratorio superior altamente contagiosa causada por Bordetella pertussis. La Organización Mundial de la Salud estima que hay 60 millones de casos de pertussis al año y 0,5 a 1 millón de muertes asociadas (ref. 1. A lo largo de esta memoria descriptiva, se refieren diversas referencias entre paréntesis para describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Se encuentra una información bibliográfica completa para cada cita al final de la memoria descriptiva, inmediatamente después de las reivindicaciones. Las descripciones de estas referencias se incorporan a la presente memoria como referencia en la presente descripción). En poblaciones no vacunadas, se ha observado una elevada tasa de incidencia de pertussis del orden del 80% en niños de menos de 5 años de edad (ref. 2). Aunque se considera generalmente que pertussis es una enfermedad de la niñez, hay evidencias crecientes de enfermedad clínica y asintomática en adolescentes y adultos (ref. 3, 4 y 5).

La introducción de vacunas de células enteras compuestas por organismos B. pertussis inactivados química y térmicamente en los años 1940 fue responsable de la drástica reducción de la incidencia de tos ferina causada por B. pertussis. Las tasas de eficacia para vacunas de células enteras se han estimado de hasta un 95%, dependiendo de la definición de caso (ref. 6). Aunque la infección por B. pertussis confiere inmunidad de por vida, existen evidencias crecientes de la disminución de la protección después de inmunización con vacunas de célula entera (ref. 3). Varios informes que citan una relación entre la vacunación con pertussis de célula entera, la reactogenicidad y efectos secundarios graves condujeron a una reducción de la aceptación de la vacuna y a una consiguiente epidemia renovada (ref. 7). Más recientemente, se han desarrollado vacunas pertussis de componentes definidos.

Antígenos para vacunas pertussis definidas

Se han desarrollado diversas vacunas pertussis acelulares e incluyen antígenos de Bordetella pertussis, toxina pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), la proteína de membrana externa de 69 kDa (pertactina) y aglutinógenos fimbriales. PT y FHA están incluidas en las formulaciones de la presente invención, y se describen con más detalle a continuación.

Toxina pertussis

La toxina pertussis es una exotoxina que es un miembro de la familia A/B de toxinas bacterianas con actividad ADP-ribosiltransferasa (ref. 8). El resto A de estas toxinas exhibe la actividad ADP-ribosiltransferasa y el resto B media la unión de la toxina a los receptores de célula huésped y la translocación de A a su sitio de acción. La PT facilita también la adherencia de B. pertussis a células epiteliales ciliadas (ref. 9) y desempeña también un papel en la invasión de macrófagos por B. pertussis (ref. 10).

Todas las vacunas pertussis acelulares tienen incluidas PT, que se ha propuesto como factor de virulencia principal y antígeno protector (ref. 11, 12). La infección natural por B. pertussis genera tanto respuestas humorales como mediadas por célula ante PT (ref. 13 a 17). Los bebés tienen anticuerpos anti-PT derivados por vía transplacental (ref. 16, 18), y el calostro humano que contiene anticuerpos anti-PT fue eficaz en la protección pasiva de ratones contra infección por aerosol (ref. 19). Se ha demostrado una respuesta inmune mediada por célula (IMC) ante subunidades de PT después de inmunización con una vacuna acelular (ref. 20) y se ha generado una respuesta IMC ante PT después de vacunación de célula entera (ref. 13). La PT inactivada químicamente en vacunas de célula entera o de componentes es protectora en modelos animales y en seres humanos (ref. 21). Además, los anticuerpos monoclonales específicos de la subunidad S1 protegen contra la infección por B. pertussis (ref. 22 y 23).

Los efectos patofisiológicos principales de la PT son debidos a su actividad ADP-ribosiltransferasa. La PT cataliza la transferencia de ADP-ribosa desde NAD a la proteína de unión a nucleótido de guanina Gi, desestabilizando así el sistema regulador de adenilato ciclasa celular (ref. 24). La PT evita también la migración de macrófagos y linfocitos a sitios de inflamación e interfiere con la fagocitosis mediada por neutrófilos y la muerte de bacterias (ref. 25). Se han utilizado una serie de ensayos in vitro e in vivo para evaluar la actividad enzimática de S1 y/o PT, incluyendo la
ADP-ribosilación de transducina bovina (ref. 26), el ensayo de aglomeración de células de ovario de hámster chino (CHO) (ref. 27), la sensibilización a histamina (ref. 28), la leucocitosis y la NAD-glicohidrolasa. Cuando se exponen a PT, las células CHO desarrollan una morfología aglomerada característica. Este fenómeno es dependiente de la unión de PT y la posterior translocación y actividad ADP-ribosiltransferasa de S1, y por tanto el ensayo de aglomeración de células CHO se utiliza ampliamente para ensayar la integridad y toxicidad de holotoxinas PT.

La PT debe destoxificarse antes de su inclusión en una formulación de vacuna. Se han descrito varias técnicas de destoxificación química, incluyendo inactivación con formalina (ref. 46), glutaraldehído (ref. 52), peróxido de hidrógeno (ref. 53) y tetranitrometano (ref. 54). Como alternativa, pueden utilizarse cepas mutantes de B. pertussis o células huésped recombinantes que expresan PT destoxificada genéticamente para preparar PT inactiva enzimáticamente que retiene la actividad inmunológica.

Hemaglutinina filamentosa

La hemaglutinina filamentosa es un gran (220 kDa) polipéptido no tóxico que media la unión de B. pertussis a células ciliadas del tracto respiratorio superior durante la colonización bacteriana (ref. 9, 29). La infección natural induce anticuerpos anti-FHA e inmunidad mediada por célula (ref. 13, 15, 17, 30 y 31). Los anticuerpos anti-FHA se encuentran en el calostro humano y se transmiten también por vía transplacental (ref. 17, 18 y 19). La vacunación con vacunas pertussis de célula entera o acelulares genera anticuerpos anti-FHA, y las vacunas acelulares que contienen FHA inducen también una respuesta IMC ante FHA (ref. 20, 32). La FHA es un antígeno protector en un modelo de infección respiratoria en ratón después de inmunización activa o pasiva (ref. 33. 34). Sin embargo, la FHA sola no protege en el ensayo de potencia de infección intracerebral en ratón (ref. 28).

Vacunas pertussis acelulares

La primera vacuna pertussis acelular desarrollada fue la vacuna PT + FHA de dos componentes (JNIH 6) de Sato y col. (ref. 46). Esta vacuna se preparó mediante copurificación de antígenos de PT y FHA a partir del sobrenadante de cultivo de la cepa Tohama de B. pertussis, seguido de formación de toxoide con formalina. Se han utilizado exitosamente vacunas acelulares de diversos fabricantes y de diversas composiciones para inmunizar niños japoneses contra la tos ferina desde 1981, dando como resultado un drástico descenso de la incidencia de la enfermedad (ref. 47). La vacuna JNIH 6 y la vacuna toxoide PT monocomponente (JNIH 7) se ensayaron en un gran ensayo clínico en Suecia en 1986. Los resultados iniciales indicaron una menor eficacia que la eficacia reseñada de una vacuna de célula entera, pero los estudios de seguimiento han mostrado que es más eficaz contra la enfermedad más benigna diagnosticada mediante procedimientos serológicos (ref. 48, 49, 50, 51). Sin embargo, hubo evidencias de reversión a la toxicidad de PT inactivada con formalina en estas vacunas. Se encontró también que estas vacunas protegían contra la enfermedad en lugar de contra la infección.

Se están evaluando actualmente una serie de nuevas vacunas pertussis acelulares que incluyen combinaciones de PT, FHA y/o proteína de membrana externa de 69 kDa (pertactina) y/o aglutinógenos fimbriales.

Tétanos

El tétanos es una infección aguda causada por Clostridium tetani. La enfermedad se caracteriza por contracciones musculares graves dolorosas, acompañadas por hipersensibilidad, hiperreflexia y estimulación autonómica aumentada de la(s) parte(s) del cuerpo afectada(s). Estímulos moderados pueden causar espasmos musculares reflejos graves. Puede estar presente fiebre debida a espasmos musculares extremos. El tétanos puede ser generalizado, implicando la cara, cuello, abdomen y tronco, o localizado a una parte del cuerpo específica (sitio de lesión). La implicación del músculo masetero de la cara da como resultado trismus o mandíbula encajada, que da lugar a la expresión facial clásica conocida como "risa sardónica" (ref. 78).

C. tetani existe en forma de un organismo no patogénico en el intestino de seres humanos y animales. El organismo se encuentra también en suelo contaminado con heces y puede sobrevivir durante años en forma de esporas infecciosas (ref. 79).

El tétanos es el resultado del crecimiento anaeróbico de C. tetani y la producción de neurotoxina en heridas contaminadas. La infección está causada por la introducción de materiales contaminados por organismos o esporas en el tejido. El escenario más común es infección mediante una herida penetrante. Sin embargo, en muchos casos no es obtenible historial de heridas. La presencia de tejido necrótico o isquémico facilita el crecimiento del bacilo (ref. 78).

La prevención de la infección es mediante vacunación y mediante un buen cuidado de las heridas, incluyendo limpieza cuidadosa y desbridado de tejidos desvitalizados. A los individuos con heridas contaminadas y los que no han seguido la serie de vacunación deberían administrarse tanto vacuna del tétanos como inmunoglobulina tetánica.

El tratamiento del síndrome es principalmente de apoyo y puede incluir apoyo respiratorio, administración de antitoxina tetánica y cuidadosa limpieza de las heridas infectadas. A pesar de la atención médica moderna, las tasas de mortalidad siguen siendo del orden de 30 a 90% (ref. 79). Esto es particularmente cierto en los ancianos. La infección natural no produce siempre inmunidad para infección posterior.

La prevención de la infección mediante vacunación es el procedimiento más eficaz de controlar la enfermedad. Desde la introducción de la vacunación universal, el tétanos se ha vuelto extremadamente raro en los países desarrollados. Aparecen casos casi exclusivamente en individuos que no completaron su serie de vacunaciones o que no han recibido dosis de recuerdo apropiadas. Los individuos deberían recibir una dosis de recuerdo cada diez años.

Difteria

La difteria es una infección aguda causada por la bacteria Corynebacterium diphteriae. El sitio de infección principal es el tracto respiratorio superior (nariz, faringe, laringe y tráquea) (ref. 80). La lesión característica, un resultado de la citotoxina bacteriana, son parches de seudomembrana grisácea rodeados de inflamación. Ésta está acompañada por linfadenopatía cervical, hinchazón y edema de la garganta. En los casos graves, la hinchazón puede progresar hasta el punto de obstrucción (difteria laríngea). Otras complicaciones incluyen miocarditis, efectos en el sistema nervioso central (neuropatías craneal, motora y sensorial tales como parálisis ascendente) y trombocitopenia. Otras membranas mucosas pueden afectarse menos frecuentemente. La presentación clínica puede variar desde infección asintomática a multisistemática fulminante y muerte (ref. 79). Las infecciones cutáneas y de heridas por difteria son comunes en los trópicos, y se han reseñado frecuentemente en la población indigente de EE.UU. La única reserva de C. diphteriae es el hombre (ref. 79).

Puede hacerse un diagnóstico especulativo por la observación clínica de las lesiones características, pero debería confirmarse mediante examen bacteriano de las lesiones. Si existe una fuerte sospecha clínica de difteria, el tratamiento debería iniciarse inmediatamente con antibióticos (penicilina o eritromicina) y antitoxina de difteria, incluso si el diagnóstico no está confirmado. La mortalidad aumenta cuanto más se espere después del inicio de los síntomas clínicos (ref. 80). La tasa de mortalidad de casos se encuentra en el intervalo de 5 a 10% a pesar de la atención médica actual (ref. 79), y aparece principalmente en los muy jóvenes y en los ancianos. La infección natural no siempre produce inmunidad para infección posterior (ref. 80).

La transmisión es mediante contacto directo con secreciones o descargas de un individuo afectado. Los individuos son contagiosos mientras se observen bacterias en las secreciones. Esto puede durar hasta cuatro semanas después de la infección. La transmisión puede aparecer también con fómites infectados (ref. 79). Se recomienda el aislamiento estricto de los casos.

Raramente, los individuos pueden convertirse en portadores y propagar organismos hasta seis meses después de la infección. Los portadores no inmunizados deberían vacunarse rápidamente con la serie completa. El tratamiento con anticuerpos elimina la portabilidad e infecciosidad de los casos en 4 días (ref. 80).

Poliomielitis

Tanto las vacunas inactivada (IPV) como atenuada viva (OPV) del virus de la polio han sido eficaces para controlar la poliomielitis en todo el mundo. Actualmente está autorizada en Europa y Canadá una vacuna DPT-IPV combinada y ha mostrado ser segura y eficaz en millones de niños en todo el mundo.

Haemophilus influenzae de tipo b

Antes de la disponibilidad de vacunas eficaces, Haemophilus influenzae de tipo b (Hib) era una causa importante de infecciones portadas por sangre de meningitis invasiva en niños pequeños y era la causa principal de meningitis en los primeros 2 años de vida (ref. 81). Aproximadamente un 10% de las víctimas de meningitis por Haemophilus influenzae mueren a pesar de la atención médica. Las secuelas permanentes son comunes en los supervivientes. La inmunización contra Haemophilus influenzae empezó en Canadá a 1987 con una vacuna de polisacáridos (poliribosa-ribitol-fosfato [PRP]). Se consiguió una inmunogenicidad mejorada en niños de 18 meses de edad y mayores con la introducción en 1988 de una vacuna constituida por PRP conjugado con toxoide diftérico (PRP-D). Desde 1992, la inmunización infantil ha sido posible con la autorización de vacunas conjugadas de PRP inmunogénicas en niños de menos de 1 año de edad (PRP conjugado con toxoide tetánico o PRP-T). El uso de estas vacunas conjugadas de Haemophilus influenzae se ha asociado a un drástico descenso de la incidencia de infección por Haemophilus invasiva en Canadá y otros lugares (ref. 82). Dos estudios clínicos canadienses que implicaron casi 900 niños en la Columbia Británica y Alberta demostraron que la PRP-T liofilizada puede reconstituirse con DPT (COMBIPACK) (ref. 83) o con DPT-Polio Adsorbed (PENTA™) (ref. 84) además de con el diluyente salino habitual. Estudios clínicos que han implicado a más de 100.000 niños en todo el mundo han demostrado la eficacia de la PRP-T liofilizada (ActHib™). Mas de un 90% consiguen niveles anti-PRP que se considera que son protectores (\geq0,15 \mug/ml) después de 3 dosis de PRP-T empezando a los 2 meses o después de una sola dosis de PRP-T administrada después de los 12 meses de edad. La proporción que consigue niveles indicativos de protección a largo plazo (>1,0 \mug/ml) varía de 70 a 100%, dependiendo del estudio. Se han vendido millones de dosis de PRP-T en los Estados Unidos, Canadá y Europa desde 1992. Los casos de irrupción de infección invasiva por Haemophilus después de vacunación con PRP-T son raros, y pueden estar asociados a enfermedades tales como inmunodeficiencia (ref. 85).

Vacunas de combinación

Aunque hay muchos beneficios reales y potenciales de las vacunas que combinan antígenos para conferir protección contra múltiples patógenos, estas combinaciones pueden tener un efecto perjudicial sobre la inmunogenicidad de los componentes individuales. Las combinaciones de toxoides diftérico y tetánico con vacuna pertussis de célula entera (DTP) han estado disponibles durante más de 50 años y la respuesta de anticuerpo a la combinación es superior a la de los componentes individuales, quizás como resultado del efecto coadyuvante de la vacuna pertussis de célula entera. Las combinaciones de DTP que incluyen también vacuna del virus de la polio inactivado están autorizadas en muchas jurisdicciones, aunque la respuesta de anticuerpo a los antígenos de pertussis puede reducirse por esta combinación (ref. 69 a 71). El efecto de combinar vacunas DTP con vacuna conjugada Hib ha sido variable. Los estudios con una DTP francesa y PRPT demostraron una seguridad similar pero una respuesta de anticuerpo reducida ante PRP (ref. 72 a 73), mientras que los estudios con una DTP canadiense y PRPT no mostraron efecto sobre la respuesta de PRP sino menos aglutinógenos de pertussis y una sensibilización aumentada del sitio de inyección en el grupo de inmunización combinada (ref. 74, 75).

Se están poniendo a disposición ahora datos sobre el efecto de combinar vacunas acelulares de pertussis/difteria/
tétanos (APDT) con vacuna conjugada de Hib. En bebés de dos meses de edad administrados con tres dosis de una vacuna acelular de pertussis-difteria-tétanos combinada con una vacuna conjugada de Hib, la respuesta de anticuerpo ante PRP fue significativamente menor que en el grupo administrado con inyecciones separadas el mismo día (ref. 76). Se reseñaron resultados similares con otra vacuna acelular de pertussis-difteria-tétanos combinada con PRPT administrada para las primeras tres dosis (ref. 77).

En contraposición con otros estudios reseñados, los niños inmunizados con la vacuna combinada tenían una respuesta de anticuerpo superior ante PRP, difteria y varios de los antígenos de pertussis cuando se comparaban con niños administrados con PRP en una visita separada. Una combinación líquida de difteria, tétanos, pertussis (DTP) y Haemophilus influenzae de tipo b (PRP-T) era segura y al menos tan inmunogénica como la preparación liofilizada que corresponde a la reconstitución de Hib con DTP (ref. 86). Puede haber varias razones para la inmunogenicidad equivalente o mejor para estas vacunas cuando se administran en forma de una inyección combinada en lugar de la inmunogenicidad reducida reseñada con otros productos. Todas las vacunas acelulares de pertussis son distintas en su contenido antigénico, procedimiento de formación de toxoide, coadyuvante o conservante. Sin embargo, se ha reseñado una inmunogenicidad aumentada con vacunas acelulares de pertussis que contienen PT, FHA y 69K (ref. 77) y que contienen PT, FHA, 69K y fimbrias (ref. 76).

La vacuna APDT de cinco componentes se encontró que tenía una eficacia protectora del 85% (IC del 95%, 81/89) en un ensayo clínico de fase III completado recientemente en Suecia bajo los auspicios de los Institutos Nacionales de la Salud (ref. 78).

Más recientemente, el documento WO 98/00167 describe una composición inmunogénica multivalente que combina vacunas acelulares de pertussis/difteria/tétanos (APDT) con vacuna conjugada de Hib y vacuna de la polio. Esta composición inmunogénica multivalente puede comprender adicionalmente una sal de aluminio como coadyu-
vante.

Las composiciones inmunogénicas multivalentes se preparan mezclando simplemente las preparaciones antigénicas individuales en presencia de coadyuvante. El documento WO 98/00167 se tendrá en cuenta según el A.54(3) OEP.

El documento WO 93/24148 describe composiciones inmunogénicas multivalentes que contienen todas ellas el componente de antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg). Estas composiciones multivalentes se preparan mezclando HBsAg adsorbido sobre fosfato de aluminio con uno o más antígenos adsorbidos sobre hidróxido (o fosfato) de aluminio.

Las vacunas de combinación disponibles comercialmente en la actualidad pueden no contener formulaciones apropiadas de antígenos apropiados en formas inmunogénicas apropiadas para conseguir el nivel deseado de eficacia en una población humana susceptible.

Sería deseable proporcionar vacunas de combinación eficaces que comprendieran componentes acelulares de pertussis junto con cantidades relativas seleccionadas de antígenos seleccionados tales como toxoide tetánico, toxoide diftérico, conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, virus de la polio y/o Ag de superficie de hepatitis B. Sería altamente deseable desarrollar una vacuna multivalente contra enfermedades causadas por infección por Bordetella pertussis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium tetanus, Haemophilus influenzae, virus de la polio y virus de la hepatitis B. Sin embargo, para que dichas vacunas de combinación sean eficaces para conseguir el criterio de seroprotección para cada componente antigénico individual, deben superarse retos significativos en forma de competición antigénica y fenómenos de interferencia. La presente invención supera las limitaciones de la técnica anterior y resuelve el problema de competición antigénica e interferencia proporcionando formulaciones de hasta nueve antígenos separados diseñadas para desencadenar seroprotección para hasta seis enfermedades infecciosas
diferentes.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida hacia vacunas de combinación o multivalentes que contienen una pluralidad de componentes de vacuna adecuados para la prevención, mejora o tratamiento de múltiples estados patológicos que satisfacen el criterio de seroprotección para cada uno de dichos componentes de vacuna, y a procedimientos de uso de los mismos. Según la invención, se proporciona una composición inmunogénica multivalente para conferir protección a un huésped contra la enfermedad causada por infección por Bordetella pertussis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium tetanus, virus de la polio, virus de la hepatitis B y Haemophilus influenzae.

Según una realización del objeto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende:

a)

toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa en forma purificada,

b)

toxoide tetánico,

c)

toxoide diftérico,

d)

virus de la polio inactivado,

e)

un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B,

f)

un antígeno de superficie de hepatitis B, y

g)

una sal de aluminio,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(1)

preparar una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio a temperatura ambiente;

(2)

añadir sucesivamente toxoide diftérico y toxoide tetánico a la suspensión de gel;

(3)

añadir toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa, cada uno adsorbido separadamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (2), seguido de al menos 30 minutos de agitación y reposo adicional durante una noche;

(4)

añadir a la mezcla obtenida en (3) tampones carbonato en medio 199 y ajustar el pH aproximadamente de 7,0 a 7,2;

(5)

introducir virus de la polio inactivado en la mezcla obtenida en (4) y ajustar después el pH a un valor en el intervalo de 6,8 a 7,0;

(6)

añadir antígeno de superficie de hepatitis B, adsorbido previamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (5), seguido de al menos 30 minutos de agitación; y

(7)

añadir una disolución de un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, preparado previamente en tampón fosfato y un tampón de Tris-sacarosa, a la mezcla obtenida en (6), seguido de al menos 30 minutos de agitación.

Según una realización adicional del objeto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende:

(a)

toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa en forma purificada,

(b)

toxoide tetánico,

(c)

toxoide diftérico,

(d)

virus de la polio inactivado,

(e)

un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B,

(f)

un antígeno de superficie de hepatitis B, y

(g)

una sal de aluminio,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(1)

preparar una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio a temperatura ambiente;

(2)

añadir toxoide diftérico y toxoide tetánico a la suspensión de gel;

\newpage

(3)

añadir toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa, cada uno adsorbido separadamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (2), seguido de al menos 30 minutos de agitación y reposo adicional durante una noche;

(4)

añadir a la mezcla obtenida en (3) tampones carbonato en medio 199 y ajustar el pH aproximadamente de 7,0 a 7,2;

(5)

introducir virus de la polio inactivado en la mezcla obtenida en (4) y ajustar después el pH a un valor en el intervalo de 6,8 a 7,0;

(6)

añadir una disolución de un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, preparado en un tampón fosfato y un tampón Tris-sacarosa a la mezcla obtenida en (5), seguido de al menos 30 minutos de agitación.

Las composiciones de vacuna obtenidas mediante dichos procedimientos pueden contener aproximadamente de 5 a aproximadamente 30 \mug de toxoide de pertussis, aproximadamente de 5 a aproximadamente 30 \mug de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente de 5 a aproximadamente 50 LF de toxoide diftérico, aproximadamente de 5 a aproximadamente 50 LF de toxoide tetánico, aproximadamente de 5 a aproximadamente 20 \mug de conjugado de Hib y aproximadamente de 1 a aproximadamente 10 \mug de HBsAg, todos en combinación con IPV.

El virus de la polio inactivado empleado en la composición inmunogénica de la invención comprende generalmente una mezcla de virus de la polio inactivados de tipos, 1, 2 y 3. En una formulación, dichas mezclas de tipos de virus de la polio inactivados puede comprender:

de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades de antígeno de virus de la polio de tipo 1;

de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 unidades de antígeno de virus de la polio de tipo 2; y

de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 unidades de antígeno de virus de la polio de tipo 3 en una dosis humana sencilla.

La molécula conjugada puede comprender un conjugado de proteína vehículo adecuada, por ejemplo, toxoide tetánico o toxoide diftérico, y poliribosa-ribitol-fosfato (PRP) de Haemophilus influenzae de tipo B. En una formulación preferida, el conjugado se emplea en forma de aproximadamente 10 \mug de PRP conjugado con aproximadamente 20 \mug de toxoide tetánico.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de inmunización de un huésped contra múltiples enfermedades, que comprende administrar al huésped, que puede ser un ser humano, una cantidad inmunoeficaz de la composición inmunogénica o vacuna proporcionada en la presente memoria.

Las ventajas de la presente invención incluyen una vacuna multivalente que puede conferir protección contra un intervalo de enfermedades comunes de manera segura y eficaz. La capacidad de proporcionar una sola vacunación contra múltiples enfermedades sin interferencia entre las respuestas imunogénicas ante los diversos inmunógenos es beneficiosa.

El uso de la vacuna multivalente de la presente invención reducirá el número de inyecciones y visitas de vacunación necesarias para inmunización. Esto será especialmente útil y ventajoso para inmunización infantil.

Descripción detallada de la invención

La toxina pertussis (PT) (incluyendo análogos detoxificados genéticamente de los mismos como se describen, por ejemplo, en Klein y col., patente U.S. nº 5.085.862) puede producirse mediante varios procedimientos. Por ejemplo, la PT puede aislarse a partir del sobrenadante de cultivo de una cepa de B. pertussis utilizando procedimientos convencionales tales como los descritos por Sakura (ref. 55). La PT se aísla absorbiendo primero el sobrenadante de cultivo sobre una columna que contiene la matriz de gel de tinte-ligando Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). La PT se eluye de esta columna mediante cloruro de sodio de elevada salinidad tal como cloruro de magnesio 0,75 M, y, después de retirar la sal, se pasa a través de una columna de matriz de afinidad de fetuína-Sepharose compuesta por fetuína ligada a Sepharose activada con bromuro de cianógeno. La PT se eluye de la columna de fetuína utilizando sal de magnesio 4 M.

Como alternativa, puede utilizarse el procedimiento de Irons y col. (ref. 56). El sobrenadante de cultivo se absorbe sobre una columna de Sepharose 4B activada con CNBr a la que se ha unido covalentemente primero haptoglobina. La PT se une al adsorbente a un pH 6,5 y se eluye de la columna utilizando tampón Tris 0,1 M/NaCl 0,5 M mediante un cambio por etapas a un pH 10,0.

Como alternativa, puede utilizarse el procedimiento descrito en la patente de U.S. nº 4.705.686 concedida a Scott y col. el 10 de noviembre de 1987, e incorporada a la presente memoria como referencia. En este procedimiento, se pasan sobrenadantes de cultivo o extractos celulares de B. pertussis a través de una columna de una resina de intercambio aniónico de suficiente capacidad para adsorber endotoxina, pero que permite que los antígenos de Bordetella fluyan a su través o se separen de otro modo de la endotoxina.

Como alternativa, la PT puede purificarse utilizando cromatografía en Perlite, como se describe en la patente EP nº 336.736.

Desintoxificación de PT

La PT se destoxifica para retirar las actividades indeseadas que podrían causar reacciones secundarias de la vacuna final. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de procedimientos de destoxificación química convencional tales como tratamiento con formaldehído, peróxido de hidrógeno, tetranitrometano o glutaraldehído.

Por ejemplo, la PT puede destoxificarse con glutaraldehído utilizando una modificación del procedimiento descrito en Munoz y col. (ref. 57). En este proceso de destoxificación, se incuba la PT purificada en una disolución que contiene disolución salina tamponada con fosfato 0,01 M. La disolución se prepara 0,05 M con glutaraldehído y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas, y después se hace 0,02 M con L-lisina. Se incuba adicionalmente la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente y después se dializa durante dos días frente a PBS 0,01 M. En una realización particular, puede utilizarse el proceso de destoxificación de la patente EP nº 336.736. Brevemente, la PT puede destoxificarse con glutaraldehído de la siguiente manera:

Se diluye PT purificada con fosfato de potasio 75 mM a un pH 8,0 que contiene cloruro de sodio 0,22 M con un volumen igual de glicerol a concentraciones de proteína de aproximadamente 50 a 400 \mug/ml. Se calienta la disolución a 37ºC y se destoxifica mediante la adición de glutaraldehído a una concentración final de 0,5% (p/v). Se mantiene la mezcla a 37ºC durante 4 horas y después se añade ácido aspártico (1,5 M) a una concentración final de 0,25 M. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora y después se diafiltra con 10 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM a un pH 8,0 que contiene cloruro de sodio 0,15 M y glicerol 5 t para reducir el glicerol y para retirar el glutaraldehído. El toxoide de PT se esteriliza por filtración a través de una membrana de 0,2 \mum.

Si se utilizan técnicas recombinantes para preparar una molécula de PT mutante que muestra poca o ninguna toxicidad, para uso como molécula toxoide, la destoxificación química no es necesaria.

Purificación de FHA

La FHA puede purificarse a partir del sobrenadante de cultivo esencialmente como se describe por Cowell y col. (ref. 58). Pueden utilizarse promotores de crecimiento, tales como beta-ciclodextrinas metiladas, para aumentar el rendimiento de la FHA en los sobrenadantes de cultivo. El sobrenadante de cultivo se aplica a una columna de hidroxiapatita. Se adsorbe la FHA sobre la columna, pero no la PT. Se lava a fondo la columna con Triton X-100 para retirar la endotoxina. Se eluye después la FHA utilizando NaCl 0,5 M en fosfato de sodio 0,1 M y, si es necesario, se pasa a través de una columna de fetuína-Sepharose para retirar la PT residual. La purificación adicional puede implicar el paso a través de una columna de Sepharose CL-6B.

Como alternativa, la FHA puede purificarse utilizando anticuerpos monoclonales contra el antígeno, estando fijados los anticuerpos a una columna de afinidad activada por CNBr (ref. 59).

Como alternativa, la FHA puede purificarse utilizando cromatografía en Perlite como se describe en la patente EP 336.736 anteriormente citada.

Vacunas PT + FHA

Dicha vacuna podría prepararse como se describe en las patentes EP 242.301 y EP 242.302.

Antígenos de Hib

Dichos antígenos pueden estar basados en el polisacárido capsular (PRP) conjugado con una proteína vehículo. El polímero es un polímero de ribosa, ribitol y fosfato. Típicamente, la proteína vehículo es un toxoide diftérico o tetánico o una membrana externa de N. meningitidis. Dichos conjugados se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes EP 161.188, EP 208.375, EP 477.508, US 4.365.170 o US 4.673.574.

Dichos conjugados polisacáridos pueden prepararse mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida como se describe, por ejemplo, en WO 93/15760 o en las patentes citadas en el párrafo anterior.

Si uno de los antígenos de Hib seleccionados para la composición es un conjugado de toxoide tetánico polisacárido capsular (PRP-T es un ejemplo), y si se utiliza una sal de aluminio (hidróxido de aluminio es un ejemplo) en la composición, el conjugado de toxoide tetánico polisacárido capsular es menos estable y menos inmunogénico que sin la sal de aluminio. En dichos casos, estos problemas de estabilidad e inmunogenicidad pueden resolverse utilizando la tecnología descrita en la patente WO 96/37222. Brevemente, consiste en añadir aniones a las sales de aluminio. Dichos aniones pueden ser fosfatos o citratos. Los fosfatos pueden proporcionarse por un fosfato monopotásico o disolución de fosfato disódico. Pueden utilizarse también como aniones una combinación de fosfatos y carbonatos (carbonato de sodio, bicarbonato de sodio).

Vacuna del virus de la polio

El componente del virus de la polio de la combinación puede ser la vacuna de la polio inactivada de Salk.

Formulaciones de vacuna multivalente seleccionadas

En realizaciones seleccionadas, la invención proporciona vacunas con las siguientes características, todas las cuales pueden administrarse mediante inyección intramuscular:

Una formulación comprende una combinación de componente de vacuna pertussis combinado con toxoides diftérico y tetánico, virus de la polio inactivado, conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B y Ag de superficie de hepatitis B, y se denomina DTacP-IPV-PRP-T-HBsAg líquida completa.

Cada dosis humana de 0,5 ml de DtacP-IPV-PRP-T-HBsAg líquida completa se formuló para contener aproximadamente:

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25 \mug

toxoide de pertussis (PT)

25 \mug

hemaglutinina filamentosa (FHA)

30 LF

toxoide diftérico

10 LF

toxoide tetánico

40 D

unidades antigénicas de virus de la polio de tipo 1

8 D

unidades antigénicas de virus de la polio de tipo 2

32 D

unidades antigénicas de virus de la polio de tipo 3

10 \mug

polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B unido covalentemente a

20 \mug

proteína tetánica

5 \mug

Ag de superficie de hepatitis B

20 \mumol

fosfatos

5 \mumol

carbonatos

0,125 ml

tampón Tris 50 mM que comprende sacarosa al 42,5%

0,306 mg

sales de aluminio.

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Otra formulación, que se designa en la presente memoria como "DTaP-IPV-PRP-T/HBsAg" o el "formato de cámara dual" comprende una mezcla de antígenos en disolución en la cámara proximal de una jeringuilla de dos compartimentos; los componentes restantes están dispuestos en la cámara distal de la jeringuilla de dos compartimentos. La composición resultante es la misma que se dispone anteriormente en la presente memoria, con la diferencia de que las sales de aluminio están presentes en una cantidad de 0,356 mg.

Uso de vacuna

Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden administrarse por vía parenteral, mediante inyección subcutánea o intramuscular. Las preparaciones inmunogénicas y vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en cantidades tales que sean terapéuticamente eficaces, inmunogénicas y protectoras. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se ha de tratar incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo de sintetizar anticuerpos y, si es necesario, de producir una respuesta inmune mediada por células.

Los regímenes adecuados para administración inicial y dosis de recuerdo son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. La dosificación puede depender también de la vía de administración y variará según el tamaño del huésped. La imunogenicidad puede mejorarse significativamente si los antígenos se coadministran con coadyuvantes, utilizados habitualmente en forma de disolución de 0,005 a 0,5%. Los coadyuvantes potencian la inmunogenicidad de un antígeno, pero no son necesariamente inmunogénicos por sí mismos.

Los coadyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración, produciendo un efecto depósito que facilita una liberación lenta y sostenida de antígeno a las células del sistema inmune. Los coadyuvantes pueden atraer también células del sistema inmune a un depósito de antígeno y estimular dichas células para desencadenar respuestas inmunes.

Los agentes inmunoestimulatorios o coadyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunes de huésped ante, por ejemplo, vacunas. Los coadyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, son normalmente los componentes de las bacterias muertas o atenuadas utilizados como vacunas. Los coadyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están típicamente ligados no covalentemente a antígenos, y se formulan para potenciar las respuestas inmunes del huésped. Por tanto, se han identificado coadyuvantes que potencian la respuesta inmune ante antígenos suministrados por vía parenteral. Sin embargo, algunos de estos coadyuvantes son tóxicos y pueden causar efectos secundarios indeseables, haciéndolos inadecuados para uso en seres humanos y en muchos animales. Es más, sólo se utilizan rutinariamente hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio (designados colectivamente como alúmina) como coadyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia de la alúmina en el aumento de las respuestas de anticuerpo ante toxoides diftérico y tetánico está bien establecida.

Los procedimientos de bioquímica de proteínas, fermentación e inmunología utilizados pero no descritos explícitamente en esta descripción y estos ejemplos se reseñan ampliamente en la bibliografía científica, y se encuentran dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Ejemplo 1 Preparación de la formulación de DTacP-IPV-PRB-T-HBsAg líquida completa

Una formulación preferida de una composición de vacuna de la presente invención comprende una suspensión líquida de una cantidad inmunoeficaz de hasta nueve antígenos separados, seleccionados para desencadenar protección contra hasta seis agentes infecciosos. Esta formulación, en la que están presentes todos dichos antígenos en disolución para una administración conveniente a un huésped humano, se designa como "DtacP-IPV-PRP-T-HBs líquida completa" o "líquida completa" abreviado. El procedimiento preferido de fabricación de la formulación líquida completa de la presente invención es como sigue.

Se prepara una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio mezclando a temperatura ambiente con agua de pureza farmacéutica. Se hacen después adiciones sucesivas de toxoide diftérico (DT) y toxoide tetánico (TT) a la suspensión de gel. El orden de adición de estos componentes no es crítico, pero la disolución se agita preferiblemente durante al menos 30 minutos y después se deja asentar al menos durante 30 minutos tras la adición de cada componente antigénico individual. Se adsorben el toxoide de pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) separadamente cada uno sobre sales de aluminio y se concentran si es necesario. Se añaden estos componentes a la mezcla anterior, se agitan durante al menos 30 minutos y se dejan asentar durante toda una noche.

En este punto, se añaden tampones carbonato en Medio 199, preferiblemente a través de un filtro de 0,2 \mum, y se añade NaOH (2,5 M) o ácido acético (10%) según sea necesario para ajustar el pH a aproximadamente de 7 a 7,2.

A continuación, se introduce IPV a una concentración apropiada con agua de pureza farmacéutica y se introduce en la mezcla, preferiblemente a través de un filtro de 0,2 \mum. Se ajusta después el pH a un valor en el intervalo de 6,8 a 7.

A continuación, se añade HBsAg, que se ha adsorbido previamente sobre sales de aluminio, y se agita durante al menos 30 minutos.

Se añaden tampón fosfato, tampón Tris-sacarosa y agua para inyecciones a disolución concentrada de conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B (Hib).

Finalmente, se añade la disolución de Hib tamponada a los otros componentes de vacuna, preferiblemente a un filtro de 0,22 \mum, y se agita durante al menos 30 minutos.

La suspensión resultante obtenida generalmente a partir del proceso indicado anteriormente se designa como el producto bruto líquido completo. Este producto bruto se utiliza después para preparar las dosis individuales de 0,5 ml para uso en estudios clínicos y procedimientos de vacunación. Los expertos en la técnica apreciarán que los órdenes de adición de los componentes individuales, los tampones utilizados para diluir los componentes individuales, los procedimientos de adición y mezclado, los ácidos y bases utilizados para ajustar el pH y las condiciones de mezclado pueden modificarse sin desviarse del espíritu de la invención reivindicado en la presente memoria.

Ejemplo 2 Preparación de formulación de DtacP-IPV-PRP-T/HBsAg en cámara dual

Otra formulación de una composición de vacuna de la presente invención comprende una suspensión líquida de una cantidad inmunoeficaz de hasta ocho antígenos separados, seleccionados para desencadenar protección contra hasta cinco agentes infecciosos que están presentes en una primera cámara proximal de una jeringuilla by-pass de 1 ml y una cantidad inmunoeficaz de otro antígeno, seleccionado para desencadenar protección contra un agente infeccioso adicional, que está presente en una segunda cámara distal de dicha jeringuilla by-pass. Esta formulación, en la cual todos los antígenos están presentes en solución y en la cual ciertos de dichos antígenos están dispuestos en la cámara distal de una jeringuilla by-pass y el(los) antígenos(s) restante(s) está(n) dispuesto(s) en la cámara distal de una jeringuilla by-pass designada "DtacP-IPV-PRP-T-Hbs de cámara dual" o "cámara dual" abreviado.

Un procedimiento de fabricación de la formulación de cámara dual de la presente invención conlleva una modificación menor del procedimiento de fabricación proporcionado para el producto bruto líquido completo del ejemplo 1. Todas las etapas dispuestas para la fabricación del producto bruto líquido completo son iguales, excepto porque se omite la etapa en la cual se añade el HBsAg a la mezcla. La solución resultante se designa producto bruto DtacP-IPV-PRP-T. Se disponen 0,5 ml del producto bruto DtacP-IPV-PRP-T en la cámara distal de una jeringuilla by-pass de 1,0 cm^{3}. Se disponen 0,5 ml de una dosis inmunoeficaz de HBsAg, que se habían adsorbido anteriormente sobre sales de aluminio, en la cámara proximal de dicha jeringuilla by-pass.

Ejemplo 3 Ensayos clínicos

Se realizaron ensayos clínicos en seres humanos como se describe en la presente memoria para establecer la seguridad, no reactogenicidad y utilidad de las composiciones de vacuna multivalente de la presente invención. En particular, se registraron las reacciones adversas (como se muestran, por ejemplo, en las Tablas 1 y 2 siguientes) y se determinaron las respuestas inmunes ante cada uno de los antígenos contenidos en las vacunas (como se muestra, por ejemplo, en las Tablas 3-5 siguientes). Se analizaron cada una de las formulaciones líquida completa y de cámara dual en un estudio abierto no comparativo aleatorizado.

Se inscribieron 350 bebés en un estudio aleatorizado de dos brazos para recibir un total de cuatro (4) inyecciones de vacuna. Se dividieron los bebés en dos grupos iguales. El primer grupo (grupo 1) recibió la vacuna multivalente en el formato líquido completo. El segundo grupo (grupo 2) recibió la vacuna multivalente en el formato de cámara dual. (Como se describe en la presente memoria, la formulación "de cámara dual" implica el uso de un antígeno de superficie de hepatitis B adsorbido sobre una sal de aluminio (HBsAg) en la cámara proximal de la jeringuilla, con los componentes restantes de la vacuna presentes en una solución tamponada en la cámara distal de la jeringuilla).

El programa de vacunación comprendía una inyección intramuscular administrada a los dos (2), tres (3) y cuatro (4) meses de edad y una inyección final en algún lugar entre los 12 y 14 meses de edad. Se administraron las vacunas mediante inyección intramuscular, perpendicular a la superficie de la piel, en el lado anterolateral del muslo. Se tomaron muestras de sangre para la valoración de anticuerpo inmediatamente antes de la vacunación y un mes después de la dosis 3.

Se controlaron los eventos adversos durante un mes después de cada inmunización y se registró la reacción local en el lugar de inyección durante tres (3) días después de cada inyección. No se reseñó ningún evento adverso relacionado con la vacuna durante el periodo completo de estudio.

Las reacciones locales fueron escasas y transitorias y las vacunas fueron bien toleradas.

Se comparó la respuesta de IgG ante cada componente de las vacunas multivalentes mediante análisis serológicos estándar en los cuales se compararon los valores de anticuerpo después de la dosis 3 con las valoraciones de preinmunización. Para la mayor parte, no hubo diferencias significativas en los resultados obtenidos mediante inmunización con la formulación líquida completa comparada con la formulación en cámara dual. Ambas vacunas proporcionan una respuesta inmune excelente y seroprotectora ante cada antígeno de su composición. Estos resultados se muestran en su totalidad, en una base de componente por componente, en las Tablas 3(a)-(e) que siguen y los resultados finales, en términos de seroprotección, se proporcionan en la Tabla 4 siguiente.

En la Tabla 3, se utilizan las siguientes abreviaturas convencionales: n = el número de sujetos evaluados. GMT = valoración media geométrica e IC = intervalo de confianza alrededor de cada valor de GMT, determinado mediante metodología estadística estándar.

En la Tabla 4, los criterios de seroprotección corresponden a la referencia admitida habitualmente por la comunidad de vacunología para cada componente en términos de respuesta de anticuerpo esperada obtenida después de una inmunización primaria constituida por tres dosis administradas con 1 a 2 meses de separación o después de una inmunización de recuerdo administrada aproximadamente un año después de la primera inmunización. El criterio para inmunoprotección para los antígenos de PT y FHA es un aumento de 4 veces entre las valoraciones antes y después de la serie primaria y las variaciones después de la cuarta dosis. SPR es la tasa de seroprotección y corresponde al porcentaje de sujetos que satisfacen el criterio de respuesta. GMT tiene el mismo significado que en la Tabla 3.

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TABLA 3(a) Respuesta de anticuerpo de HBsAg por grupo de vacuna

1

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TABLA 3(b) Respuestas de anticuerpo de PT y FHA (EIA) por grupo de vacuna

2

TABLA 3(c) Respuestas de anticuerpo de tétanos y difteria

3

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TABLA 3(d) Respuesta de anticuerpo neutralizante del virus de la poliomielitis de tipo 1, 2 y 3

4

TABLA 3(e) Respuesta de anticuerpo de PRP

5

TABLA 4 Seroprotección para la formulación líquida completa

Antígeno	Criterios para seroprotección	n	% de sujetos protegidos
PRP	%\geq 0,15 \mug/ml	152	92,1
HBsAg	%>10 mUI/ml	151	92,7
DT	%>0,01 UI/ml	144	99,3
TT	%>0,01 UI/ml	147	100
Polio de tipo 1	% de valor> 5 (neut.)	152	100
Polio de tipo 2	% de valor> 5 (neut.)	152	100
Polio de tipo 3	% de valor> 5 (neut.)	152	100
PT (UE/ml)	% de valor\geq aumento de 4 veces	146	87,0
FHA (UE/ml)	% de valor\geq aumento de 4 veces	145	87,6

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Los resultados de seguridad e inmunogenicidad obtenidos un mes después de las series primarias de 2, 3, 4 meses demuestran la utilidad de las vacunas multivalentes de la presente invención. Para los antígenos de D, T e IPV, las respuestas inmunes fueron excelentes. Para los componentes acelulares de pertussis, más del 87% de estos bebés mostraron un aumento de cuatro veces en términos de anticuerpos anti-PT y anti-FHA.

Se demostró una buena respuesta inmune para PRP al nivel de 0,15 \mug, así como para hepatitis B, con un 92% de seroprotección para ambos. Estos resultados se muestran en las Tablas 3 y 4 anteriores.

Resultados de la vacunación de recuerdo

Se comparó la respuesta de IgG ante cada componente de las vacunas multivalentes ensayadas mediante análisis serológico estándar, en el que se compararon las valoraciones de anticuerpo después de la dosis de recuerdo final administrada a los 12-14 meses con las valoraciones antes del recuerdo (después de la dosis 3). Estos resultados se muestran en su totalidad, en una base de componente por componente, en las Tablas 5(a)-(e) que siguen y los resultados finales, en términos de seroprotección, se proporcionan en la Tabla 6 siguiente. Todas las abreviaturas en las siguientes tablas son como se definen anteriormente para las Tablas 3(a)-(e) y 4 anteriores.

TABLA 5(a) Respuesta de recuerdo de anticuerpo de HBsAg

6

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TABLA 5(b) Respuestas de recuerdo de anticuerpo de pertussis (PT y FHA)

7

TABLA 5(c) Respuestas de recuerdo de anticuerpo de tétanos y difteria

8

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TABLA 5(d) Respuesta de recuerdo de anticuerpo de virus de la poliomielitis 1, 2 y 3

9

TABLA 5(e) Respuesta de recuerdo de anticuerpo de PRP

10

TABLA 6 Seroprotección para la formulación líquida completa

Componentes	Criterio para seroprotección	Después de		Después de
		dosis 3		dosis 4
		SPR(%)	GMT	SPR(%)	GMT
PRF	% 0,15 \mug/ml	91,7	1,5	100,0	28,6
HBs	%^{3} 10 mUI/ml	91,6	142,0	98,5	1458,0
Difteria	%^{3} 0,01 UI/ml	99,0	0,2	100,0	1,2
Tétanos	%^{3} 0,01 UI/ml	100,0	0,7	100,0	7,1
Polio 1	% val.^{3} 5 (neut.)	100,0	254,0	100,0	3113,0
Polio 2	% val.^{3} 5 (neut.)	100,0	115,0	100,0	2496,0
Polio 3	% val.^{3} 5 (neut.)	100,0	290,0	100,0	3938,0
PT	% elevac. de 4 veces (UE/ml)	88,3	53,3	69,4	87,7
FHA	% elevac. de 4 veces (UE/ml)	87,7	97,7	69,2	149,0

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Para todos los antígenos, se observó un efecto de recuerdo excelente inducido por la cuarta dosis, confirmando la presencia de una excelente memoria inmune inducida por esta serie primaria acelerada de 2-3-4 meses. Estos resultados se muestran en las Tablas 5 y 6 anteriores.

Las composiciones de la invención proporcionan seroprotección contra cada enfermedad.

Resumen de la descripción

Anteriormente se ha descrito claramente la preparación de numerosas vacunas multivalentes. Extensos ensayos clínicos descritos anteriormente demuestran claramente que las composiciones inmunológicas multivalentes de la presente invención son seguras y eficaces para conferir protección contra una amplia variedad de patógenos.

Estos resultados son sorprendentes, en la medida de que puede haberse esperado que las mezclas de numerosos componentes de vacuna contribuyeran a los bien reconocidos fenómenos de competición antigénica o interferencia, con lo que ciertos componentes de vacuna que serían capaces de conferir seroprotección cuando se introducen individualmente en un huésped inmunocompetente, se vuelven menos eficaces cuando se introducen en combinación con otros antígenos. Por tanto, las vacunas de la presente invención simplifican el proceso de inmunización y minimizan en gran medida el número de inmunizaciones separadas necesarias para proteger a pacientes pediátricos de infección por Bordetella pertussis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium tetanae, Haemophilus influenzae, virus de la polio y virus de la hepatitis B.

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86. Amir, J. y col., Vaccine, 1997, 15: 149.

Claims (2)

1. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende:

a)

toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa en forma purificada,

b)

toxoide tetánico,

c)

toxoide diftérico,

d)

virus de la polio inactivado,

e)

un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B,

f)

un antígeno de superficie de hepatitis B, y

g)

una sal de aluminio,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(1)

preparar una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio a temperatura ambiente;

(2)

añadir sucesivamente toxoide diftérico y toxoide tetánico a la suspensión de gel;

(3)

añadir toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa, cada uno adsorbido separadamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (2), seguido de al menos 30 minutos de agitación y reposo adicional durante una noche;

(4)

añadir a la mezcla obtenida en (3) tampones carbonato en medio 199 y ajustar el pH aproximadamente de 7,0 a 7,2;

(5)

introducir virus de la polio inactivado en la mezcla obtenida en (4) y ajustar después el pH a un valor en el intervalo de 6,8 a 7,0;

(6)

añadir antígeno de superficie de hepatitis B, adsorbido previamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (5), seguido de al menos 30 minutos de agitación; y

(7)

añadir una disolución de un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B, preparado previamente en tampón fosfato y un tampón de Tris-sacarosa, a la mezcla obtenida en (6), seguido de al menos 30 minutos de agitación.

2. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende:

(a)

toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa en forma purificada,

(b)

toxoide tetánico,

(c)

toxoide diftérico,

(d)

virus de la polio inactivado,

(e)

un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B,

(f)

un antígeno de superficie de hepatitis B, y

(g)

una sal de aluminio,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(1)

preparar una suspensión acidificada de gel de hidróxido de aluminio a temperatura ambiente;

(2)

añadir toxoide diftérico y toxoide tetánico a la suspensión de gel;

(3)

añadir toxoide de pertussis y hemaglutinina filamentosa, cada uno adsorbido separadamente sobre sales de aluminio, a la mezcla obtenida en (2), seguido por al menos 30 minutos de agitación y un reposo adicional durante una noche;

(4)

añadir a la mezcla obtenida en (3) tampones carbonato en medio 199 y ajustar el pH aproximadamente de 7,0 a 7,2;

(5)

introducir virus de la polio inactivado en la mezcla obtenida en (4) y ajustar después el pH a un valor en el intervalo de 6,8 a 7,0;

(6)

añadir una disolución de un conjugado polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B preparado en un tampón fosfato y un tampón Tris-sacarosa a la mezcla obtenida en (5), seguido de al menos 30 minutos de agitación;

(7)

disponer 0,5 ml de la mezcla obtenida en (6) en la cámara distal de una jeringuilla by-pass de 1 ml; y

(8)

añadir 0,5 ml del antígeno de superficie de hepatitis B, previamente adsorbido sobre sales de aluminio, a la cámara proximal de la jeringuilla by-pass utilizada en la etapa (7).