ES2228175T3 - Vacuna multivalente polio t.d. contra al menos la difteria, la poliomielitis y el tetanos. - Google Patents

Abstract

Una vacuna de recuerdo que comprende: - menos de 11, 2 mg por ml de una sal de aluminio, expresada con respecto al ion Al3+, - antígenos inmunógenos que proceden al menos del poliovirus, de Corynebacterium diphteriae y de Clostridium tetani, y - una cantidad de anatoxina diftérica utilizada como ántígeno inmunógeno de Corynebacterium diphteriae comprendida entre 4-116 Lf.

Description

Vacuna multivalente polio T.D. contra al menos la difteria, la poliomielitis y el tétanos.

La presente invención se refiere a una nueva vacuna multivalente contra al menos la difteria, la poliomielitis y el tétanos, destinada a emplearse como vacuna de recuerdo en una persona que ya ha sido vacunada o sensibilizada una primera vez.

Estado de la técnica

La difteria es una enfermedad producida por Corynebacterium diphteriae. La transmisión es esencialmente directa por las vías respiratorias. Las manifestaciones clínicas de la forma respiratoria revelan dos mecanismos. La proliferación de bacterias al nivel de la puerta de entrada determina la sintomatología local, habitualmente faríngea (angina pseudo-membranosa) a veces laríngea (garrotillo). La difusión de la exotoxina de ciertas cepas es responsable de angina maligna y/o de complicaciones viscerales (polineuritis, miocarditis, síndrome maligno de Marfan). Numerosos estudios serológicos, realizados recientemente en la mayor parte de los países desarrollados, han mostrado que, según la edad, el sexo y la historia epidemiológica o vacunal local, 20 a 80% de los habitantes no están todavía hoy día correctamente inmunizados; y que los sujetos de más de 50 años y los pacientes femeninos son particularmente vulnerables (Rappuoli et al., Vaccine 11, 576-577, 1993. Simonsen et al., Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand, 95, 225-231, 1987. Wirz et al., Vaccine, 13, 771-773, 1995). Esta vulnerabilidad se ha revelado los últimos 20 años por el resurgimiento, a veces dramático de la difteria en los países desarrollados (Galazka et al., Eur. J. Epidemiol, 11, 107-117, 1995).

El tétanos es debido a Clostridium tetani. La forma esporulada, esencialmente telúrica, se introduce por efracción en el organismo (herida, picadura, quemadura o llaga de menor entidad), dando lugar a la forma vegetativa. Esta forma segrega una endotoxina, la tetanospasmina. La lisis bacteriana provoca su difusión. El neurótropo, la toxina determina la sintomatología, es decir un trismus (contracción tetánica) inaugural y contracciones musculares. Sin tratamiento, la evolución es fatal por asfixia o síncope. La vacunación por anatoxina sigue siendo la única forma de detener la infección. La inmunidad adquirida por una primera vacunación disminuye con el tiempo y necesita vacunaciones de recuerdo. La ausencia, o la pérdida con la edad, de la inmunidad se ha apreciado en la población americana después de varios decenios por varias encuestas serológicas (Hilton et al., Ann. Intern. Med., 115, 32-33, 1991). En Europa, las encuestas serológicas han dado resultados equivalentes (Kjeldsen et al., Scand. J. Infect. Dis., 20, 177-185, 1988). Parece pues claro que numerosos adultos, particularmente los mayores de 50 años y las mujeres se han convertido casi siempre en vulnerables al tétanos y necesitan una vacunación por anatoxina.

La poliomielitis es debida al poliovirus, que pertenece al grupo de los enterovirus. Existen tres serotipos, denominados tipo 1, tipo 2 y tipo 3. La transmisión es esencialmente fecal-oral, directa o indirecta, y a veces oral-oral. El virus está dotado de un tropismo intestinal, muscular, meníngeo y nervioso. La infección es por lo general no evidente o borrosa. Esta "infección de poliomielitis" es inmunizante, pero su inmunidad crece entre los tipos y es contagiosa durante varias semanas. Excepcionalmente provoca (1%_{o} a 1% de infecciones según la edad y el tipo) de las formas meníngeas o paralíticas (parálisis facial aguda). Esta "enfermedad poliomielítica" siempre es grave porque no existe tratamiento curativo etiológico. Cuando no es mortal por asfixia (2 a 10% según la edad y el tipo) va seguida de secuelas musculares o ventilatorias invalidantes. Los intercambios humanos, siempre más numerosos, entre los países endémicos y los países indemnes a la poliomielitis, exponen estos últimos a riesgo de importación y de reintroducción de cepas silvestres. Estos últimos años, a pesar de un nivel elevado de cobertura vacunal, y de una muy débil incidencia global de la enfermedad, casos importados y epidemias han aparecido en Europa, en América del Norte y en Oriente Medio (OMS, Relevé Epidémiologique Hebdomadaire, 29, 220-221, 1996). Esperando una eliminación de la enfermedad, los numerosos intercambios humanos entre los países de la endemia y los países indemnes que tienen el riesgo puede provocar en cualquier región del mundo catástrofes debidas a cepas silvestres importadas. Con el fin de reducir al mínimo la propagación de la enfermedad durante las infecciones de este tipo, interesa que todos los países, comprendidos aquellos donde más de algún caso de poliomielitis aguda no ha sido señalado, mantengan por tanto un nivel elevado de cobertura vacunal en toda su población.

Puesta a punto por Ramon en los años 1930, las vacunas diftéricas y tetánicas son a base de anatoxinas. Pueden obtenerse por la acción destoxificante del formaldehído sobre un concentrado del cultivo de Corynebacterium diphteriae o de Clostridium tetani, después de purificación. Sus actividades inmunizantes respectivas se aprecian in vitro e in vivo. Un ensayo de floculación mide la cantidad de anatoxina expresada en unidad de floculación (Lf) por dosis (Lyng et al., J. Biol. Stand., 15, 27-37, 1987; J. Lyng, Biologicals, 18, 11-17, 1990).

La anatoxina tetánica a veces se administra sola. Sin embargo, esta anatoxina está históricamente siempre combinada, al menos con la anatoxina diftérica. En general, la primera vacunación tetánica y diftérica se efectúa en el curso del primer año de vida en 3 dosis (OMS, WHO/EP/GEN, 95,3, 1993). Según los países, una dosis de recuerdo se administra en el curso del segundo año y/o entre 4 y 10 años. A veces, una vacunación de recuerdo se efectúa igualmente entre los 11 y 18 años. Además, la OMS recomienda, desde 1987 vacunar por anatoxina tetánica mujeres en edad de procrear en los países en desarrollo, por 3 dosis de primera vacuna y después una dosis de recuerdo 1 y 5 años después.

La cantidad de anatoxina tetánica (T) por dosis vacunal varía según los países de 5 a 20 Lf para una dosis de 0,5 ml en la primera vacunación o en la vacunación de recuerdo. La Farmacopea Europea recomienda una actividad de al menos 20 UI.

La cantidad de anatoxina diftérica (D) por dosis vacunal más ampliamente y más antiguamente administrada es la que existen las combinaciones de primeras vacunas pediátricas: varía de 12 a 50 Lf para una dosis de 0,5 ml (Galazka et al., Vaccine, 14, 845-857, 1996).

Para una vacunación de recuerdo, la reducción de la cantidad de anatoxina diftérica (d) se mantiene bastante generalizada. La cantidad es generalmente del orden de 1/10 de la cantidad pediátrica. Está por tanto fijada en 2 Lf para una dosis de 0,5 ml en Estados Unidos y en Canadá, y está recomendada como vacunación de recuerdo a partir de la edad de 7 años (Edsall et at., Am. J. Hyg, 53, 283-295, 1951). En Europa, la cantidad de anatoxina y la edad inferior de administración cambian según los países. La cantidad no está fijada por la razón de que la única condición impuesta por la Farmacopea Europea no se refiere a la cantidad sino a la actividad: debe ser al menos de 2 UI por dosis de 0,5 ml.

Para las vacunas de recuerdo destinadas a una población adulta, la anatoxina diftérica está generalmente combinada también con la anatoxina tetánica. Se sabe que esta combinación reduce un poco la tolerancia de la anatoxina tetánica sola (Palmer et al., Br. Med. J., 286, 624-626, 1983). En los Estados Unidos, se han analizado recientemente las relaciones de eventos indeseables asociados a las vacunas T y Td administradas a sujetos de más de 7 años (Haber et al., ICAAC, 1996). La vacuna Td ha expuesto al receptor más que la vacuna T a una reacción local, una disnea, una pérdida de conocimiento o una convulsión.

En lo que concierne a la poliomielitis, se han puesto a punto dos vacunas en los años 1950: la vacuna inyectable (VPI), inactivada por formaldehído, desarrollada por Salk (Plotkin et al., E.A. Vaccines, ed. Raven Press, 1994), y la vacuna oral (VPO), viva atenuada, desarrollada por Sabin (Plotkin et al., supra). La VPI ha permitido en todos los países eliminar la poliomielitis, tanto la silvestre como la post-vacunal (Murdin et al., Vaccine, 14, 735-746, 1996). El modo de producción y la composición de la VPI varía según los países. Los tres tipos de polivirus se cultivan así sobre una línea celular continua VERO, después se purifican y se inactivan por formaldehído. Su actividad inmunizante respectiva se aprecia in vitro e in vivo. Un ensayo ELISA mide el contenido en antígeno viral, expresado en unidades internacionales: la OMS recomienda dosis de 0,5 ml 40 UI, 8 UI y 32 UI (tales como se determinan según el método sigmoidal) respectivamente para los antígenos D de los tipos 1, 2 y 3.

La VPI ofrece dos ventajas farmacéuticas: es estable y no necesita una logística particular. A veces puede estar combinada con otros antígenos.

La vacunación simultánea durante la infancia contra la poliomielitis, el tétanos y la difteria es una práctica corriente desde hace años en el mundo entero, incluso desde hace decenios en la mayor parte de los países desarrollados. Esta práctica ha contribuido fuertemente a la reducción considerable del número de casos y de muertes debidas a estas tres enfermedades. Sin embargo, dichas enfermedades no han desaparecido. En los países desarrollados, en los cuales sobreviene, son tanto más graves cuanto más tardías son. Ahora bien la inmunidad adquirida por vacunación se atenúa con el tiempo. Puesto que no se benefician de un mantenimiento natural de esta inmunidad, los adolescentes y los adultos de estos países llegan a ser vulnerables. El mantenimiento de la cobertura vacunal contra cada una de estas tres enfermedades a lo largo de la vida es, por tanto, una obligación epidemiológica.

Por tanto, existe la necesidad de una nueva vacuna contra al menos la difteria, la poliomielitis y el tétanos, utilizable como vacuna de recuerdo, que estaría destinada a prolongar una protección contra el tétanos, la poliomielitis y la difteria, conferida inicialmente durante una primera vacunación o sensibilización, y que minimizaría a esta población de los efectos indeseables inducidos por las vacunas existentes.

Las vacunas pediátricas inyectables en género TDPolio (T: anatoxina tetánica; D: dosis clásica de anatoxina diftérica; Polio: poliovirus inactivados de los tipos 1, 2 y 3), por ejemplo la vacuna D.T.Polio® (PMsv S.A., Francia) no pueden satisfacer esta necesidad. En efecto, estos tipos de vacunas se utilizan principalmente en la primera vacunación pediátrica. Están desprovistas de sales de aluminio. Contienen cantidades demasiado importantes de anatoxina diftérica, del orden de 100 Lf/ml, por ejemplo. Y además desencadenan reacciones indeseables en el adulto (Björkholm et al., Eur. J. Clin. Microb., 6, 637-640, 1987).

Tampoco se puede considerar simplemente modificar una vacuna TDPolio existente con el fin de minimizar los efectos indeseables de ella sobre una población vacunada por primera vez. En efecto, un objetivo de elección sería por ejemplo reducir la cantidad de anatoxina diftérica en la vacuna. En este caso, no se consideraría retener las cantidades de anatoxina utilizadas clásicamente en una vacuna Td (que es la única referencia actual), del orden de al menos, por ejemplo 4 Lf por ml, más bien que emplear más, probablemente, por ejemplo más de 20 Lf/ml. En efecto, en una vacuna Td clásica la anatoxina diftérica está siempre aditivada con una sal de aluminio, lo que refuerza su inmunogenicidad. En una vacuna TDPolio, el hecho de no tener coadyuvante implica reforzar la dosis de anatoxina con respecto a la utilizada en una vacuna Td.

Por las mismas razones, la simple combinación de una vacuna existente del género Td inyectable, por ejemplo, Vaccinol® o Td-Pur® (Chiron-Behring GmBH, Alemania) o la vacuna Diftavax® (PMsv S.A., Francia), con una vacuna clásica contra la poliomielitis (PMsv, Francia), ya no podría tampoco conducir a una solución satisfactoria. En efecto, la elección de cada constituyente en tal vacuna, así como su dosis son determinantes para la obtención de una respuesta inmune óptima y una minimización de los efectos indeseables.

Así por ejemplo si se añaden nuevos antígenos (Polio) a una vacuna Td, la cantidad de sales de aluminio es entonces susceptible de ser insuficiente para desempeñar un papel adyuvante óptimo. La inmunogenicidad de tal vacuna tendrá el riesgo de estar así reducida. Por el contrario, si se quiere paliar este problema aumentando la cantidad de sales de aluminio se correrá el riesgo paralelamente de agravar las reacciones indeseables asociadas a estas sales (1,2 a 3 mg por ml de las vacunas Td; Gupta et al., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995).

Incluso si se añaden nuevos antígenos (Polio) a una vacuna Td, se disminuye también la carga relativa de cada antígeno T o d. La inmunogenicidad de tal vacuna tendrá el riesgo de ser así también reducida. Por el contrario si se quiere paliar este problema aumentando la dosis de cada antígeno, principalmente el de la anatoxina diftérica, paralelamente se tendrá el riesgo de agravar las reacciones indeseables asociadas a esta anatoxina (Björkholm et al., Eur. J. Clin. Microb., 6, 637-640, 1987).

La elección de cada constituyente de la vacuna del tipo TdPolio, así como su dosis, son pues difíciles de determinar y no pueden deducirse fácilmente de las vacunas existentes.

No existe todavía una combinación vacunal, apropiada para una utilización como vacuna de recuerdo en adultos o adolescentes contra la difteria, el tétanos, la poliomielitis y la tosferina, incluso también contra la hepatitis A y/o la hepatitis B.

La presente invención pretende por tanto proporcionar una vacuna que tenga al menos la combinación de base TDPolio, que, al mismo tiempo que se distingue de las vacunas TDPolio, Td y Polio precedentes, presenta una inmunogenicidad comparable a la de éstas y además minimice sus efectos indeseables. La vacuna según la invención es utilizable en vacunación de recuerdo.

Compendio de la invención

A este efecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende:

-

menos de 1,2 mg por ml de sal de aluminio expresada con respecto al ion Al^{3+},

-

antígenos inmunógenos procedentes al menos de poliovirus, de Corynebacterium diphteriae y de Clostridium tetani, y

-

una cantidad de anatoxina diftérica utilizada como antígeno inmunógeno de Corynebacterium diphteriae comprendida entre 4-16 Lf por ml.

La vacuna según la presente invención es utilizable en la primera vacunación y como vacuna de recuerdo en una población vacunada primeramente o sensibilizada. La firma solicitante ha puesto de manifiesto que la vacuna, tal como se define anteriormente es particularmente bien apropiada para una utilización como vacuna de recuerdo.

La firma solicitante ha puesto de manifiesto de un modo sorprendente que la vacuna tal como se define anteriormente, permite minimizar los efectos reactógenos y/o alérgicos inducidos por los antígenos constitutivos.

Según otro objeto, la presente invención se refiere a un método de vacunación contra al menos el poliovirus, Corynebacterium diphteriae y Clostridium tetani que comprende la administración de una vacuna tal como la definida anteriormente.

Finalmente, la invención se refiere igualmente a un kit farmacéutico que comprende al menos 2 dosis inyectables de una vacuna según la presente invención.

Descripción detallada de la invención

En el contexto de la presente invención, se entiende por la expresión "una población primeramente vacunada o sensibilizada" personas adultas, adolescentes o juveniles que ya han sido vacunadas contra al menos el poliovirus, Corynebacterium diphteriae y/o Clostridium tetani o personas que ya han estado en contacto con al menos uno de los poliovirus gérmenes, Corynebacterium diphteriae y Clostridium tetani; la población preferida está constituida por los adolescentes y los adultos, y más particularmente las personas ancianas.

De preferencia, los antígenos de Corynebacterium diphteriae y Clostridium tetani tienen por origen sus toxinas, que son destoxificadas por formaldehído y después purificadas. Las técnicas de destoxificación y de purificación de estas toxinas son bien conocidas desde hace decenios y están descritas por Leong et al., Science, 220, 815-517, 1983; Ramon G., Ann. Inst. Pasteur, 38, 1-105, 1924; Raynaud et al., Ann. Inst. Pasteur, 96, 60-71, 1959; o por Bizzini et al., Eur. J. Biochem., 17, 100-105, 1970, por ejemplo. Los análogos destoxificados que pueden producirse por ingeniería genética están igualmente comprendidos en el alcance de la presente invención.

Además, los antígenos del poliovirus pueden estar constituidos simplemente por uno o varios tipos de poliovirus inactivados (véase más adelante) y por antígenos inmunógenos purificados de poliovirus tales como los descritos por Delpeyroux et al., 70, 1065-73, 1988 ; EP323861 (Pasteur Institut); EP86707 (Pasteur Institut); o por ejemplo en la patente europea EP-65924 (Pasteur Institut).

Para obtener poliovirus inactivados, se puede cultivarlos después en líneas celulares VERO, purificarlos, y destoxificarlos después, por ejemplo con formaldehído. Las técnicas de cultivo y de destoxificación del poliovirus son bien conocidas desde hace decenios y están descritas en, por ejemplo WO9800167 (Connaught); Dulbecco, Nature, 376, p. 216, 1995 ; Cohen, Acta Leiden, 56, 65-83, 1987, y por Salk, Dev Biol Stand., 47, 247-55, 1981.

Preferentemente, se utilizan los poliovirus inactivados de los tipos 1 (cepa MAHONEY), 2 (cepas MEF 1) y 3 (cepa Saukett).

La cantidad de anatoxina diftérica utilizada por dosis vacunal como antígeno inmunógeno de Corynebacterium diphteriae debe estar comprendida, por ejemplo entre 4 y 16 Lf por ml, de preferencia 6-14 Lf, principalmente del orden de 10 Lf por ml. Esta cantidad permite asegurar una inmunogenicidad óptima, al mismo tiempo que se minimizan los efectos indeseables, como, por ejemplo, las reacciones reactógenas o alérgicas a los antígenos.

También la cantidad de anatoxina tetánica por dosis vacunal como antígeno inmunógeno de Clostridium tetani está comprendida entre, por ejemplo, 6 y 30 Lf por ml, de preferencia 8-20 Lf, principalmente del orden de 10 Lf por dosis. Esta cantidad permite asegurar una inmunogenicidad óptima al mismo tiempo que se minimizan los efectos indeseables.

Para medir la cantidad de anatoxina diftérica o tetánica (Lf), se utiliza el ensayo de floculación descrito por Lyng (J. Biol Stand., 15, 27-37, 1987; o Biologicals, 18, 11-17, 1990) o la OMS (Manual for the production and the control of vaccines, BLG/UNDP/77.1 y BLG/UNDP/77.2), teniendo en cuenta sin embargo que se refiere a la pureza de la anatoxina utilizada a 1500-1800 Lf por mg de nitrógeno para la difteria, o 1000-1300 Lf por mg de nitrógeno para el tétanos.

Como indicación, en la mayor parte de las producciones, la pureza de la anatoxina diftérica purificada es generalmente del orden de 1700-1800 Lf por mg de nitrógeno (fuente interna). Además, para la anatoxina tetánica, esta pureza es del orden de 1200-1400 Lf (fuente interna).

En lo que concierne a los poliovirus inactivados utilizados como antígenos inmunógenos, una dosis vacunal según la invención puede comprender, por ejemplo 60-120 UI/ml de antígeno D del poliovirus tipo 1, 8-30 UI/ml de antígeno D del poliovirus tipo 2 y/o 16-80 UI/ml de antígeno D del poliovirus tipo 3. Las Unidades Internacionales se determinan según el método sigmoidal.

En un modo de aplicación particular de la presente invención la vacuna según la invención puede comprender, por ejemplo, además de la combinación de base TdPolio descrita anteriormente, 0,1 a 60 \mug/ml de antígenos purificados de B. pertussis, de preferencia anatoxina de B. pertussis (PT) y F-HA; 0,1 a 40 \mug/ml del antígeno HBs de la hepatitis B; y/o 0,1 a 40 \mug/ml del virus de la hepatitis A inactivado o un antígeno de éste.

La toxina de Bordetella pertussis, comprendidos los análogos destoxificados producidos por ingeniería genética, puede ser producida de diferentes modos. Por ejemplo, se puede cultivar una cepa de B. pertussis según los métodos tradicionales (Sekura et al., J. Biol. Chem., 258, 14647-14651, 1993), se puede aislar la anatoxina absorbiendo el medio de cultivo sobre una columna Affi-Gel Blue® (Bio-Rad Lab, US), y después eluyendo con una solución rica en sales (por ejemplo 0,75 M de cloruro de magnesio), después de haber quitado las sales, se puede incluso adsorber a continuación este eluato sobre una columna de afinidad fetuína-Sépharose (constituida por fetuína unida a bromuro de cianógeno) y después eluir con una solución 4 M de una sal de magnesio. La toxina de B. pertussis puede a continuación ser destoxificada con ayuda de glutaraldehído según un método modificado de Munoz et al. (Infect. Immun., 33, 820-826, 1981) como se describe en la solicitud de patente PCT/EP97/05378 (PMsv). Numerosos otros métodos están todavía a la disposición del experto, como los de Irons et al (Biochem. Biophys. Acta, 580, 175-185, 1979), o los descritos en las patentes de Estados Unidos 4.705.686 y EP-336736.

La F-HA puede purificarse a partir de un líquido sobrenadante de cultivo esencialmente por el procedimiento descrito por Cowell et al (Infect. and Immun., 41, 1, 313-320, 1983). Promotores del crecimiento, tales como beta-ciclodextrinas metiladas pueden utilizarse para aumentar el rendimiento en F-HA en el líquido sobrenadante. Dicho líquido sobrenadante de cultivo se carga sobre una columna de hidroxilapatito. La F-HA se adsorbe sobre la columna pero no la PT. La columna se lava ampliamente con Triton X-100 para suprimir la endotoxina. La F-HA se eluye a continuación por utilización de NaCl 0,5 M en fosfato de sodio 0,1 M y, si es necesario, se hace pasar por una columna de fetuína-Sepharose para eliminar la PT residual. Una purificación suplementaria puede comprender el paso a través de una columna de Sépharose CL-6B. Una alternativa puede comprender la purificación de la F-HA por utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno, en la cual los anticuerpos están fijados a una columna de afinidad activada por CNBr. La F-HA igualmente puede purificarse por utilización de una cromatografía sobre perlita, como la que se describe en la patente EP336736.

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Un método apropiado para la purificación de la F-HA se describe igualmente en el ejemplo 3 de la patente EP-0242302. En el marco de la presente invención, la F-HA se prepara según este método.

Se puede producir una suspensión del antígeno de la hepatitis B según el método descrito en la patente EP-273811 (Pasteur Vaccins) en la cual se producen partículas antigénicas de la superficie del virus de la hepatitis B por expresión a partir de un cultivo de células CHO transfectadas por un plásmido que lleva el gen HBsAg con el fin de liberar las partículas de superficie antigénicas en el medio de cultivo. Otras técnicas son bien conocidas por los expertos, tales como las descritas en por ejemplo las patentes EP-864649, UE-56711 o IE-48665.

También se puede producir un virus de la hepatitis A inactivado según el protocolo de Flehmig et al. (Viral Hepatitis and Liver Disease, 87-90, 1988; J. Med. Virol., 22, 7-16, 1987). Otras técnicas son bien conocidas por el experto, tales como las descritas, por ejemplo, por Wang et al., Vaccine, 13, 835-40, 1995; Shevtsova et al., Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol., 2, 55-90, 1995; Richtmann et al., J Med Virol., 48, 147-50,1996; EP199480; IE48399 ; o en IE50191.

La vacuna según la invención comprende uno o varios adyuvantes elegidos entre los adyuvantes reconocidos como tales), principalmente las sales de aluminio, como los fosfatos e hidróxidos de aluminio; N-a cetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)] (véase Sanchez-Pescador et al., J. Immu., 141, 1720-1727, 1988); las moléculas derivadas de Quillaja saponaria, como el Stimulon® (Aquila, US); el Iscoms® (CSL ltd, US); cualesquiera moléculas a base de colesterol y análogos, como la DC Chol® (Targeted Genetics); el glicolípido Bay R1005® (Bayers, DE); los antígenos de Leishmania brasiliensis como LeIF (nombre técnico) disponible de Corixa Corp. (US), los polímeros de la familia de los polifosfazenos como el Adjumer (nombre técnico) disponible del "Virus Research Institute", (US. La vacuna según la presente invención contiene, por ejemplo, menos de 1,2 mg/ml, de preferencia, 0,70 mg/ml de sal de aluminio, expresada con relación al ion Al^{3+}.

Se debe observar que con respecto a las vacunas TDPolio clásicas como la DT. Polio® (PMsv, Francia), la presente invención propone por primera vez la adición de un adyuvante, y principalmente una sal de aluminio, como por ejemplo hidróxido de aluminio.

Contra todo pronóstico, la vacuna según la presente invención puede comprender una sal de aluminio en menor concentración que las encontradas en todas las vacunas Td clásicas como la Td-Pur® o Diftavax®, en tanto que se habría podido estimar necesario aumentar la carga después de la adición de los poliovirus inactivados. Una vacuna según la presente invención comprende menos de 1,2 mg/ml de una sal de aluminio, de preferencia menos de 0,8 mg/ml. La cantidad de sal de aluminio se expresa siempre con respecto al ion de aluminio (Al^{3+}); lo que corresponde al único método utilizable en el campo de las vacunas. Todas las cantidades de sal de aluminio a las cuales se hace referencia en la presente solicitud se expresan, por tanto, de esta manera.

Una vacuna según la presente invención puede comprender otros constituyentes, como agentes conservantes, tales como, por ejemplo, 2-fenoxietanol y/o formaldehído etc.

Las diferentes formulaciones mencionadas pueden ser una de las descritas anteriormente, por ejemplo, principalmente las que comprenden otros antígenos procedentes de Bordetella pertussis, de la hepatitis A o de la hepatitis B.

La vacuna según la invención puede presentarse en forma de una suspensión inyectable débilmente opalescente debido a la presencia de una sal de aluminio insoluble. La dosis vacunal es de preferencia del orden de 0,5 ml, contenida en una jeringa de vidrio prerrellena. La administración se efectúa por una vía subcutánea o por vía intramuscular, de preferencia por vía intramuscular por ejemplo en uno de los músculos deltoides.

En un modo de aplicación particular de la presente utilización, varias dosis de vacunas están destinadas a ser inyectadas separadamente en un mismo sujeto en un intervalo de tiempo comprendido entre 10 días y 3 meses, de modo que se favorece una reacción inmunitaria óptima, y de modo que se minimizan los efectos reactógenos y/o alérgicos de estos antígenos. Para una primera vacunación, la vacuna es de preferencia administrada a razón de 3 dosis, siendo administradas las 2 primeras dosis a un intervalo de 1 a 2 meses, y siendo separada la tercera dosis de la segunda inyección por un intervalo de 6 a 12 meses. Para una vacunación de recuerdo utilizable sobre una población ya primeramente vacunada o sensibilizada, la vacuna según la presente invención se administra a razón de 1 dosis, o de 2 dosis separadas al menos 1 mes.

La vacuna según la presente invención puede ventajosamente utilizarse en una vacunación de recuerdo en la cual la primera vacunación se ha realizado con ayuda de una vacuna oral contra la poliomielitis.

Se utiliza, tanto como primera vacunación como en una vacunación de recuerdo de preferencia una dosis de 0,5 ml que comprende 4 a 16 Lf/ml de anatoxina diftérica, de preferencia 10 Lf/ml; 6 a 30 Lf/ml de anatoxina tetánica, de preferencia 20 Lf/ml y respectivamente y de preferencia 40 UI, 8 UI y 32 UI (método sigmoidal) de los antígenos D del poliovirus de tipo 1, 2 y 3. La cantidad de sal de aluminio presente es de preferencia de 0,70 mg/ml expresada con respecto al ion Al^{3+}.

La vacuna según la presente invención permite disminuir los efectos indeseables inducidos por las vacunas TDPolio y Td existentes cuando son inyectadas. Se puede, por tanto, observar una disminución de las reacciones locales como, por ejemplo un entumecimiento de los miembros, sudores, fiebre, dolores asociados a coloraciones rojas, nódulos, enduraciones y/o esquimosis, y una disminución de las disneas, pérdidas de conocimiento o convulsiones. Estas reacciones se pueden clasificar entre las reacciones alérgicas, incluso reactógenas, a los antígenos y/o a un cierto número de otros compuestos de la vacuna, tal como la sal de aluminio. La firma solicitante ha demostrado así que la vacuna según la presente invención es particularmente apropiada para una vacunación de recuerdo, principalmente en sujetos adultos.

La presente invención se describe con más detalle en los ejemplos siguientes. Los porcentajes se dan en peso salvo indicación en contrario. Sin embargo, ni qué decir tiene que estos ejemplos se dan sólo a título de ilustración del objeto de la invención y no constituyen en ningún modo una limitación.

Ejemplo 1 Inmunogenicidad de TdPolio con diferentes dosis de anatoxina diftérica

Se prepara anatoxina diftérica (d) cultivando la cepa IM 1514 N3S en un medio IMD durante 15 a 18 horas a 36ºC, centrifugando el medio, clarificándolo, y concentrándolo por ultrafiltración, destoxificándolo a 37ºC durante 4 semanas en presencia de 6/1000 de formalina, y después purificando la toxina hasta alcanzar una pureza del orden de 1700 Lf por mg de nitrógeno.

Paralelamente se prepara la anatoxina tetánica (T) cultivando la cepa Harvard Nº49205 IM 1472C en un medio Massachusetts a 35ºC durante 4 días añadiéndole NaCl y citrato de sodio, centrifugando el medio, concentrándolo por ultrafiltración, destoxificándolo durante 2 semanas a 35ºC en presencia de 5,5/1000 de formalina y 5 g/l de bicarbonato de sodio, y después purificando la toxina hasta alcanzar una pureza del orden de 1200 Lf por mg de nitrógeno.

También, se preparan los poliovirus inactivados tipos 1 (cepa MAHONEY), 2 (cepas MEF 1) y 3 (cepa Saukett), según el método Salk.

A continuación se mezclan los 5 antígenos inmunógenos anteriores con hidróxido de aluminio, 2-fenoxietanol, formaldehído, medio 199 de Hanks exento de rojo de fenol y agua. Para hacer esto, se esteriliza el gel de aluminio en presencia de agua, se ajusta el pH entre 5,6 y 6, se añaden secuencialmente ADP (2 u 8 Lf/dosis) y el ATP (100 Lf/dosis), el medio 199 de Hanks, se ajusta el pH a 6-6,9, se añaden los tres tipos de poliovirus, y luego se añade el 2-fenoxietanol y el formaldehído y eventualmente se ajusta el pH entre 6,8 y 7.

El producto final de 0,5 ml servirá de vacuna TdPolio, y contiene como mínimo 2 UI de anatoxina diftérica, como mínimo 20 UI de anatoxina tetánica purificada, 40 UI, 8 UI y 32 UI de antígeno D (valores tales como los medidos por el método sigmoidal) respectivamente para los poliovirus inactivados del tipo 1, 2 y 3, 0,35 mg de hidróxido de aluminio expresado con relación al ion aluminio Al^{3+}, 2,5 \mul de 2-fenoxietanol, 12,5 \mug de formaldehído; estando el resto constituido por medio 199 de Hanks exento de rojo de fenol y de agua.

Un estudio de fase I, tuvo como principal objetivo validar la tolerancia clínica y biológica de la primera administración de una vacuna TdPolio adsorbida. Con este fin, se reclutaron 31 adultos voluntarios sanos. Se utilizaron tres lotes de vacuna de 0,5 ml cada uno. No diferían más que en la cantidad de anatoxina diftérica purificada descrita anteriormente: 2 Lf, 5 Lf y 8 Lf por dosis. Se atribuyeron secuencialmente a razón de 10 sujetos por lote. Cada sujeto se vacunó con una dosis de un lote inyectada en un músculo deltoide.

No se ha informado de ninguna reacción general en los grupos vacunados por los lotes con 2, 5 y 8 Lf. Se ha informado de al menos una reacción local en el curso de la primera semana en 8 sujetos del grupo vacunado por el lote con 2 Lf de ADP, en 6 sujetos del grupo vacunado por el lote con 5 Lf de ADP y en 8 sujetos del grupo vacunado por el lote con 8 Lf de ADP, se trataba siempre de dolores, asociados a algunas manchas rojas, nódulos, induraciones y/o esquimosis. Todas las reacciones desaparecieron sin tratamiento y no se modificó la vida ordinaria de estos sujetos. Ninguna reacción duró más de la primera semana. No se declaró por los investigadores ningún acontecimiento grave indeseable.

Este estudio ha tenido también como objetivo secundario evaluar la inmunogenicidad de tres primeros lotes de vacuna adsorbida. Los resultados muestran que la respuesta inmune a cinco antígenos ha sido excelente para los tres lotes. A pesar de títulos iniciales elevados debidos a un joven de los sujetos y de vacunaciones recientes, se obtuvo un efecto de recuerdo para cada antígeno.

Ejemplo 2 Inmunogenicidad en el joven adulto

La inmunogenicidad y la inocuidad de una vacuna TdPolio se determinó mediante un ensayo clínico en 508 jóvenes adultos.

Para cada sujeto, se inyectó en el músculo deltoide izquierdo una dosis de 0,5 ml de una vacuna Td (Diftavax®) o TdPolio, y se inyectó en el músculo deltoide derecho una dosis de 0,5 ml de vacuna contra la poliomielitis (VPI® PMsv) o un placebo. Una dosis de vacuna adsorbida Td contiene la anatoxina tetánica (actividad \geq20 UI), de anatoxina diftérica (actividad \geq2 UI), hidróxido de aluminio (\leq 1,25 mg). La vacuna VPI contiene los antígenos de los poliovirus del tipo 1 (40 UI), 2 (8 UI) y 3 (32 UI). El placebo tiene la misma composición que la VPI con la diferencia de que no contiene antígenos D. La vacuna TdPolio tiene la misma composición que la descrita en el ejemplo 1 (5 Lf de ADP por dosis).

Los anticuerpos anti-difteria, tétanos y poliomielitis se determinan a partir de los sueros de sujetos por el ensayo ELISA.

Los resultados muestran que antes de la vacunación casi todos los sujetos eran seropositivos en lo que concierne al ADP (99,2% tienen un título \geq 0,01 UI/ml: protección posible; y 92,6% tienen un título \geq 0,1 UI/ml: protección asegurada). Un mes después de la vacunación con la TdPolio, 99,6% de los sujetos tenían un título de anticuerpos \geq 0,1 UI/ml y 82,4% un título \geq 1 UI/ml (protección a largo plazo). En total, 17,4% de los sujetos habían presentado una seroconversión.

Además, la mayoría de los sujetos eran seropositivos en lo que concierne a la anatoxina tetánica (99,6% tenía un título \geq 0,01 UI/ml: protección posible; y 98,4% tenía un título \geq 0,1 UI/ml: protección asegurada). Un mes después de la vacunación con la TdPolio, 100% de los sujetos tenían un título de anticuerpos \geq 0,1 ml, y 99,2% tenía un título \geq 1 UI/ml (protección a largo plazo). En total, 25,2% de los sujetos habían presentado una seroconversión.

En lo que concierte a una protección contra la poliomielitis la mayoría de los sujetos eran seropositivos en lo que concierne a los tres tipos de poliovirus. En total, 99,2% de los sujetos tenían un titulo de anticuerpos \geq 5 para el tipo 1, 100% para el tipo 2 y 97,6% para el tipo 3. Un mes después de la vacunación con la TdPolio, 100% de los sujetos tenían un título \geq 5 para todos los tipos de poliovirus con un título mínimo de 120 para el tipo 1, 160 para el tipo 2 y 80 para el tipo 3. En total, 63,1% de los sujetos que ya tenía un título elevado de anticuerpos presentan una seroconversión.

Cuando se comparan los resultados obtenidos con la TdPolio y los obtenidos combinando las vacunas de referencia Td y VPI®, se obtiene una respuesta equivalente en anticuerpos.

Ejemplo 3 Inocuidad y tolerabilidad en el joven adulto

La inocuidad y la tolerabilidad de una vacuna TdPolio se determinaron entre 1742 jóvenes adultos. Cada uno de estos sujetos recibió una dosis de 0,5 ml inyectada en el músculo deltoide izquierdo de la vacuna presentada en el ejemplo 1 (ADP: 5 Lf por dosis). Los efectos se evaluaron 15 minutos después de la vacunación. Los efectos locales, regionales y sistémicos se evaluaron durante el mes siguiente a la vacunación.

El efecto inmediato común es la aparición de una mancha roja en el punto de la inyección (0,34% de los sujetos) y dolor (0,11%).

Los efectos comunes locales durante el mes siguiente a la vacunación son los siguientes para el 66% de los sujetos: dolor (64,41%), enrojecimiento en el punto de inyección (9,13%), y nódulos subcutáneos (3,33%). Estos efectos indeseables aparecían los 3 primeros días después de la vacunación y duraban 2 a 3 días. 0,86% de los sujetos también informaron de acontecimientos de edema, inflamación, migraña, entumecimiento del brazo, contracciones involuntarias de los músculos y una parestesia.

Los efectos comunes sistémicos durante el mes siguiente de la vacunación son los siguientes para el 18% de los sujetos: malestar de cabeza (10,5%), nauseas o vómitos (2,75%), y enfermedades (2,41%). No se describió ningún suceso de urticaria o de dermatosis generalizada. Estos sucesos aparecían los 3 primeros días después de la vacunación y duraban 2 a 3 días. Sólo el 0,23% de los sujetos tenía una temperatura que sobrepasaba \geq 40ºC durante los 3 primeros días después de la vacunación.

Ejemplo 4 Inocuidad y tolerabilidad de la TdPolio frente a la Td + Polio en personas jóvenes

La vacuna de la TdPolio descrita en el ejemplo 2 muestra una excelente tolerabilidad en el curso del ensayo en 508 jóvenes adultos (ejemplo 2). Los resultados son por otra parte comparables a los obtenidos en el curso del ensayo descrito en el ejemplo 3.

Realizando la sustracción del porcentaje de los efectos que han tenido al menos un signo local o regional en el sitio de inyección del placebo (14,8%) de los observados en el sitio de inyección de la vacuna Polio (36,5%), añadiendo después este porcentaje al observado en el sitio de inyecciones de la vacuna Td (66,7%), se observa una diferencia de aproximadamente 8% sobre la aparición de sucesos indeseables (88,4% frente a 80,5%). La vacuna TdPolio es pues mejor tolerada que la administración simultánea de las vacunas existentes.

Ejemplo 5 Inmunogenicidad en personas de más de 40 años

La inmunogenicidad y la inocuidad de una vacuna TdPolio se determinaron durante un ensayo clínico en 113 sujetos de más de 40 años (40 a 78 años). Todos los sujetos habían recibido una primera vacunación (3 dosis durante un año) contra la difteria, el tétanos y la poliomielitis, remontándose la última vacunación respectivamente a los 32 años (15 años mínimo, 28 años (10 años mínimo) y 28 años (10 años mínimo).

Los sujetos recibieron una inyección de una dosis de 0,5 ml de la TdPolio descrita en el ejemplo 1 (ADP 5 Lf por dosis) en el músculo deltoide derecho, y 28 días más tarde una segunda inyección en el músculo izquierdo. Los anticuerpos anti-difteria, tétanos y poliomielitis se evaluaron a partir de los sueros de los sujetos por el ensayo ELISA.

Los resultados muestran que solamente 50% de los sujetos estaban protegidos inicialmente contra el tétanos, poniendo así de manifiesto la declinación de la inmunidad. 83% de los sujetos eran inicialmente seropositivos contra los poliovirus tipos 1, 2 y 3. El día 28 después de la primera vacunación, la proporción de sujetos protegidos contra la difteria, el tétanos y el poliovirus de los tipos 1,2 y 3 había ascendido a 80,5%, 97,3% y 100%, respectivamente. En el día 56 después de la administración de la segunda dosis, la proporción de sujetos protegidos contra la difteria, el tétanos y el poliovirus de los tipos 1, 2 y 3 había ascendido a 93,7%, 100% y 100%, respectivamente.

Ejemplo 6 Inocuidad y tolerabilidad de la TdPolio frente a la Td + Polio en personas de más de 40 años

Se evaluaron la inocuidad y la tolerabilidad de la vacuna TdPolio descrita en el ejemplo 5. Los resultados muestran un perfil de tolerabilidad similar al obtenido con la asociación Td + Polio. La vacuna TdPolio inducía sin embargo menos sucesos indeseables graves (menos del 1,8 por 1000 inyecciones).

Ejemplo 7 Vacuna de recuerdo para adultos d.T.Polio. PT.F-HA

Se prepara una suspensión vacunal de 0,5 ml con o sin conservante, constituida por 5 Lf de anatoxina diftérica (que tiene una pureza de 1700 Lf por mg de nitrógeno), 5 Lf de anatoxina tetánica (que tenía una pureza de 1200 Lf por mg de nitrógeno), 40 UI, 8 UI y 32 UI de antígeno D (valores tales como se determinan por el método sigmoidal) respectivamente para los poliovirus inactivados del tipo 1, 2 y 3; 6 \mug/ml de anatoxina purificada (PT) y 6 \mug/ml de F-HA de Bordetella pertussis, 0,35 mg de hidróxido de aluminio, y estando el resto constituido por medio 199 de Hanks exento de rojo de fenol y de agua.

Se puede también añadir como conservante 2,5 \mul de 2-fenoxietanol y 12,5 \mug de formaldehído.

Las anatoxinas diféricas y tetánica, así como los poliovirus inactivados se prepararon como se describen en el Ejemplo 1.

La anatoxina de B. pertussis se prepara según el método de Sekura et al. (J. Biol. Chem., 258, 14647-14651, 1993), destoxificada según protocolo modificado de Munoz et al. (Infect. Immun., 33, 820-826, 1981), y después se preadsorben sobre un gel de aluminio. La F-HA de B. pertussis se prepara por el método descrito en el ejemplo 3 de la patente EP-0242302 después de ser preadsorbida sobre una sal de aluminio.

A continuación se mezclan los antígenos inmunógenos anteriores con hidróxido de aluminio, agua y según el caso con los conservantes. Para hacer esto, se esteriliza el gel de aluminio en presencia de agua, se ajusta el pH entre 5,6 y 6, se añaden secuencialmente DDP, ATP y la PT y la F-HA de B. pertussis, se ajusta el pH a 6,8-7, se añade el medio 199 de Hanks y los tres tipos de poliovirus, y después si es necesario, se añade el 2-fenoxietanol y el formaldehído.

Ejemplo 8 Vacuna de recuerdo para adulto d.T.Polio.PT.F-HA.HBs

Se prepara una suspensión vacunal de 0,5 ml, sin conservante, constituida por 5 Lf de anatoxina diftérica (que tenía una pureza de 1700 Lf por mg de nitrógeno), 5 Lf de anatoxina tetánica (que tenía una pureza de 1200 Lf por mg de nitrógeno), 40 UI, 8 UI y 32 UI de antígeno D respectivamente para los poliovirus inactivados del tipo 1, 2 y 3; 6 \mug/ml de anatoxina purificada (PT) de Bordetella pertussis, 6 \mug/ml de F-HA de B. pertussis, 5 \mug/ml de antígeno HBs de la hepatitis B, 0,35 mg de hidróxido de aluminio, y estando el resto constituido por medio 199 de Hanks exento de rojo de fenol y de agua.

Las anatoxinas diftérica y tetánica, así como los poliovirus inactivados se prepararon como se describe en el ejemplo 1. La PT y la F-HA de B. pertussis se prepararon como se describe en el ejemplo 7.

El antígeno HBs se preparó según el método descrito en la patente EP-273811 (Pasteur Vaccins). Se estabiliza por una preadsorción sobre un gel de aluminio.

Se mezclan a continuación los antígenos inmunógenos anteriores con el hidróxido de aluminio y agua. Para hacer esto, se esteriliza el gel de aluminio en presencia de agua, se ajusta el pH entre 5,6 y 6, se añade secuencialmente ADP, ATP y PT y la F-HA de B. pertussis, se ajusta el pH a 6,8-7, se añade el medio 199 de Hanks y los tres tipos de poliovirus, se ajusta el pH a 6,8 si es necesario, y se añade el HBs.

Ejemplo 9 Vacuna de recuerdo para adultos d.T.Polio.Pt.F-HA.HBs.HA

Se prepara una suspensión vacunal de 0,5 ml, sin conservante, constituida por 5 Lf de anatoxina diftérica (que tiene una pureza de 1700 Lf por mg de nitrógeno), 5 Lf de anatoxina tetánica (que tiene una pureza de 1200 Lf por mg de nitrógeno), 40 UI, 8 UI y 32 UI de antígeno D respectivamente para los poliovirus inactivados del tipo 1, 2 y 3; 6 \mug/ml de anatoxina purificada (PT) de Bordetella pertussis, 6 \mug/ml de F-HA de B. pertussis, 5 \mug/ml de antígeno HBs de la hepatitis B, 5 \mug/ml del virus de la hepatitis A inactivado, 0,35 mg de hidróxido de aluminio y estando el resto constituido por medio 199 de Hanks exento de rojo de fenol y de agua.

Las anatoxinas diftérica y tetánica, así como los poliovirus inactivados se prepararon como se describe en el ejemplo 1. La PT y la F-HA de B. pertussis se prepararon como se describe en el ejemplo 7. El antígeno HBs se prepara como se describe en el ejemplo 8.

El virus inactivado de la hepatitis A se prepara según el método de Flehmig et al. (supra).

A continuación se mezclan los antígenos inmunógenos anteriores con hidróxido de aluminio, los conservantes y agua. Para hacer esto, se esteriliza el gel de aluminio en presencia de agua, se ajusta el pH entre 5,6 y 6, se añade secuencialmente ADP, ATP y PT y la F-HA de B. pertussis. Se ajusta el pH a 6,8-7, se añade medio 199 de Hanks y los tres tipos de poliovirus, se ajusta el pH a 6,8, si es necesario, y después se ajusta secuencialmente el HBs y el virus de la hepatitis A inactivado.

Claims (8)

1. Una vacuna de recuerdo que comprende:

-

menos de 11,2 mg por ml de una sal de aluminio, expresada con respecto al ion Al^{3+},

-

antígenos inmunógenos que proceden al menos del poliovirus, de Corynebacterium diphteriae y de Clostridium tetani, y

-

una cantidad de anatoxina diftérica utilizada como antígeno inmunógeno de Corynebacterium diphteriae comprendida entre 4-116 Lf.

2. Una vacuna de recuerdo según la reivindicación 1, caracterizada porque la cantidad de anatoxina diftérica es del orden de 10 Lf por ml.

3. Una vacuna de recuerdo según la reivindicación 1 ó 2, en la cual la cantidad de anatoxina tetánica es del orden de 20 Lf por ml.

4. Una vacuna de recuerdo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además al menos un antígeno elegido entre los antígenos de Bordetella pertussis, de la hepatitis A y de la hepatitis B.

5. Una vacuna de recuerdo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para minimizar los efectos reactógenos y/o alérgicos inducidos por estos antígenos y/o las sales de aluminio en una vacunación de recuerdo.

6. La utilización de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricación de un medicamento para la protección de un individuo vacunado por primera vez o sensibilizado contra al menos el poliovirus, de Corynebacterium diphteriae y de Clostridium tetani.

7. Utilización según la reivindicación 6, para la preparación de al menos dos dosis de vacunas destinadas a ser inyectadas separadamente en un mismo sujeto adulto en un intervalo de tiempo comprendido entre 10 días y 3 meses, estando dicha vacuna destinada a minimizar los efectos reactógenos y/o alérgicos inducidos por estos antígenos.

8. Kit farmacéutico que comprende al menos 2 dosis inyectables de una vacuna según una de las reivindicaciones 1 a 5.