ES2224252T3 - Composicion de vacuna que comprende fragmentos de la proteina de membrana externa de bordetella pertussis. - Google Patents
Composicion de vacuna que comprende fragmentos de la proteina de membrana externa de bordetella pertussis.Info
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Abstract
SE PRESENTAN COMPOSICIONES PARA VACUNAS QUE COMPRENDEN LA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERNA 69K DE LA B. PERTUSIS " (PERTACTINA) QUE TIENE ENTRE 10 Y 100 MI G DE 69K POR 0,5 ML DE DOSIS PARA EL TRATAMIENTO DE LA INFECCION POR TOS FERINA. TAMBIEN SE DESCRIBEN VACUNAS COMBINACIONALES QUE COMPRENDEN ENTRE 2 Y 100 MI G DE 69K POR 0,5 ML, ESPECIALMENTE VACUNAS EN LAS CUALES EL COMPONENTE 69K SE FORMULA CON HEMAGLUTININA FILAMENTOSA (FHA) Y PERTUSSIS TOXOIDE (PT), OPCIONALMENTE EN COMBINACION CON UNO O MAS DE OTROS ANTIGENOS TALES COMO EL ANTIGENO SUPERFICIAL DE LA HEPATITIS B, HAEMOPHILUS INFLUENZAE B (HIB), POLIO INYECTABLE (IPV) Y HEPATITIS A. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR LAS VACUNAS.
Description
Composición de vacuna que comprende fragmentos de
la proteína de membrana externa de Bordetella pertussis.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de vacuna, que comprenden una dosis alta de
pertactina, la proteína de la membrana externa de 69 kDa de
Bordetella pertussis (de aquí en adelante denominada
"69K" o "antígeno 69K"), descrita en la patente europea 0
162 639. El recombinante 69K (P69) lo han descrito N F Fairweather y
col., Symposium On Pertussis (Bethesda), 26-28 de
septiembre de 1990. La invención también se refiere a una vacuna que
comprende más de un antígeno, opcionalmente una vacuna multivalente,
que es: una vacuna para la mejora o tratamiento de más de un estado
patológico. La presente invención también se refiere a la producción
y uso de tales vacunas en medicina.
Se sabe que 69K es un componente importante de
las vacunas de tos ferina acelulares (vacunas Pa) para la prevención
eficaz de la tos ferina. Las vacunas que contienen 69K que incluyen
vacunas "trivalentes" que comprenden antígenos contra difteria
(abreviadamente en inglés D), tétanos (abreviadamente en inglés T) y
tos ferina (abreviadamente en inglés Pa) se han descrito en ensayos
clínicos llevados a cabo en Italia y Suecia y están comercializadas
[por ejemplo bajo la marca registrada INFANRIX - DTPa (SmithKline
Beecham Biologicals)]. Típicamente el componente de tos ferina de
tales vacunas comprende la toxina de tos ferina (abreviadamente en
inglés PT), hemaglutinina filamentosa (abreviadamente en inglés FHA)
y 69K. En una de tales vacunas las cantidades de PT:FHA:69K usadas
son 25 \mug 5 \mug:8 \mug por 0,5 ml de dosis de vacuna a
granel.
Se conocen también otras vacunas multivalentes
que comprenden 69K, por ejemplo las vacunas que comprenden un
antígeno contra hepatitis B y antígenos contra difteria, tétanos y
tos ferina (Hep B, DTPa) se describieron en el documento WO
93/24148. En tales formulaciones la cantidad de 69K descrita no
excedió de 8 \mug por 0,5 ml de dosis de vacuna a granel.
Ahora se ha encontrado que las vacunas que
contienen una dosis alta de 69K son especialmente eficaces en la
prevención de la tos ferina. Dentro de los límites descritos en esta
memoria descriptiva tales vacunas son seguras cuando se administran
a sujetos humanos e inducen una protección rápida contra la
infección por B. pertussis. En las vacunas de combinación que
comprenden 69K y otros antígenos sorprendentemente se ha encontrado
que no existe ninguna interferencia, es decir, tales vacunas no
muestran pérdida de inmunogenicidad, y son eficaces cuando se
administran a seres humanos. En particular las vacunas de esta
invención son adecuadas para la administración a niños.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona una composición de vacuna que comprende una dosis alta
de antígeno 69K. Se entenderá que el antígeno en la composición de
vacuna se formula con un vehículo o adyuvante adecuado.
Por "dosis alta de antígeno 69K" se entiende
una dosis en la que la concentración de 69K es al menos 10 \mug
por dosis de 0,5 ml de vacuna a granel y está preferiblemente en el
intervalo entre 10 \mug y 100 \mug por dosis de 0,5 ml de vacuna
a granel. Más preferiblemente la concentración de 69K en la vacuna
está en el intervalo entre 10-50 \mug, por ejemplo
aproximadamente 30 \mug. También se puede usar ventajosamente una
dosis de 15-35 \mug, típicamente aproximadamente
20 a 25 \mug por dosis de 0,5 ml de vacuna a granel.
El documento
EP-A-0 437 687 describe una vacuna
que contiene la proteína de 69kDa de la membrana externa de
Bordetella pertussis en el intervalo entre
0,01-5 mg/ml como una concentración final de la
proteína antigénica.
En un aspecto adicional la presente invención
proporciona una composición de vacuna que comprende una dosis alta
de 69K (como se ha definido anteriormente en esta memoria
descriptiva) en combinación con uno o más antígenos.
En un aspecto tal vacuna puede comprender uno o
más antígenos de tos ferina, tal como PT y FHA que se conocen bien
en la técnica. El documento EP-A-0
484 621 describe el antígeno FHA en una vacuna de Bordetella
pertussis en combinación con la proteína de la membrana externa
de 69 kDa. Opcionalmente el componente PT puede ser recombinante
(por ejemplo, como se describe en las solicitudes de patentes
europeas EP 0 306 318, EP 0 322 533, EP 0 396 964, EP 0 322 115 y EP
0 275 689) o el componente PT puede ser un toxoide, por ejemplo como
se describe en el documento EP 0 515 415. Véase también el documento
EP 0 427 462 y el documento WO 91/12020 para la preparación de
antígenos de tos ferina. Típicamente los componentes PT y FHA
estarán en el intervalo entre 10-25 \mug por 0,5
ml de dosis de vacuna a granel. En un aspecto la relación de
PT:FHA:69K puede ser aproximadamente 1:1:1.
En un aspecto adicional la composición de vacuna
de la invención puede comprender antígenos para la prevención de
enfermedades distintas de tos ferina, por ejemplo antígenos de
difteria y de tétanos toxoides. Una composición de vacuna favorable
de la invención es tal como DTPa* donde Pa* designa una combinación
de PT, FHA y una dosis alta de 69K como se ha descrito anteriormente
en esta memoria descriptiva. Se ha encontrado sorprendentemente que
la dosis alta de 69K no es reactogénica y no conduce a interferencia
con los otros componentes de la composición de vacuna de DPTa*.
Ninguna dosis alta de 69K reduce sustancialmente la inmunogenicidad
de cualquiera de los componentes antigénicos de las vacunas
multivalentes descrita en esta memoria descriptiva más
adelante.
adelante.
Todavía en otro aspecto adicional la invención
proporciona una vacuna multivalente que comprende una dosis alta de
69K, particularmente Pa* como se ha definido anteriormente, en la
que está presente un antígeno contra la hepatitis B (Hep B) (es
decir, preferiblemente una vacuna de Hep B - DTPa*). Tales vacunas
multivalentes se describen generalmente como se describe en el
documento WO 93/24148 excepto que una dosis alta de 69K, como se ha
definido en esta memoria descriptiva anteriormente, se usa en la
formulación. Como se describe en el documento WO 93/24148 el
antígeno de hepatitis B es preferiblemente el antígeno de superficie
de hepatitis B.
La preparación del antígeno de superficie de la
Hepatitis B (abreviadamente en inglés HBsAg) está bien documentada.
Véase por ejemplo, Harford y col en Develop. Biol. Standard
54, página 125 (1983), Gregg y col en
Biotechnology, 5, página 479 (1987), documento EP-A-0 226 846, documento EP-A-0 299 108 y las referencias en esos documentos.
Biotechnology, 5, página 479 (1987), documento EP-A-0 226 846, documento EP-A-0 299 108 y las referencias en esos documentos.
Como se usa en esta memoria descriptiva la
expresión "antígeno de superficie de Hepatitis B" o
"HBsAg" incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo
que muestra la antigenicidad del antígeno de superficie HBV. Se
entenderá que en adición a la secuencia de 226 aminoácidos del
antígeno SS de HBsAg (véase Tiollais y col., Nature, 317, 489 (1985)
y las referencias en ese documento) HBsAg como se describe en esta
memoria descriptiva puede, si se desea, contener todos o parte de
una secuencia pre-S como se describe en las
referencias anteriores y en el documento
EP-A-0 278 940. HBsAg como se
describe en esta memoria descriptiva también se puede referir a
variantes, por ejemplo el "mutante escape" descrito en el
documento WO 91/14703. En un aspecto adicional el HBsAg puede
comprender una proteína descrita como L* en la solicitud de patente
europea número 0 414 374, es decir una proteína, la secuencia de
aminoácidos de la cual constituida por partes de la secuencia de
aminoácidos de la proteína grande (L) del virus de la hepatitis B
(subtipo ad o ay), caracterizada porque la secuencia de aminoácidos
de la proteína está constituida por bien:
- (a)
- residuos 12-52, seguido de los residuos 133-145, seguido de los residuos 175-400 de dicha proteína L; o
- (b)
- residuo 12, seguido de los residuos 14-52, seguido de los residuos 133-145, seguido de los residuos 175-400 de dicha proteína L.
HBsAg también se puede referir a los polipéptidos
descritos en el documento EP 0 198 474 o documento EP 0 304 578.
Normalmente el HBsAg estará en forma particulada.
Puede comprender la proteína S sola o puede estar en forma de
partículas de material compuesto, por ejemplo (L*, S) en la que L*
es como se ha definido anteriormente y S designa la proteína S del
antígeno de superficie de la hepatitis B.
Preferiblemente el HBsAg se adsorberá sobre
fosfato de aluminio como se describe en el documento WO 93/24148.
Otros antígenos se pueden adsorber sobre fosfato de aluminio o
hidróxido de aluminio pero en algunos casos se obtendrán resultados
satisfactorios solamente si el otro antígeno se adsorbe sobre
fosfato de aluminio. Por ejemplo, en el caso de Hib (como se
describe más adelante) puede ser apropiado preabsorber el Hib sobre
fosfato de aluminio.
Se pueden incluir otros antígenos en las vacunas
de la invención, por ejemplo en las formulaciones de Pa* o DTPa*,
para proporcionar otras vacunas multivalentes. Dichos otros
antígenos adecuados pueden comprender los conocidos en la técnica
para proporcionar protección contra Haemophilus influenzae b
(abreviadamente en inglés Hib) y/o polio (abreviadamente en inglés
IPV) y/o hepatitis A, como se describe en el documento WO
93/24148.
Una vacuna para la prevención de infecciones por
Haemophilus influenzae b (abreviadamente en inglés Hib) se
basa en el polisacárido capsular (abreviadamente en inglés PRP)
conjugado con una proteína vehículo. El polisacárido es un polímero
de ribosa, ribitol y fosfato. Estas vacunas se presentan
típicamente como formulaciones puras (es decir, sin adyuvantes).
Aunque en un caso, (Pedvax Hib producido por Merck) se utiliza un
diluyente que contiene hidróxido de aluminio para reconstituir el
conjugado liofilizado. Típicamente la proteína vehículo es un
toxoide de difteria o tétanos o una proteína de la membrana externa
de N. meningitidis. Los ejemplos de tales antígenos
conjugados de vacunas se describen en los documentos US 4 365 170,
US 4 673 574, EP 208 375, EP 477508 y EP 161
188.
188.
En el caso de vacunas de combinación de Hib que
comprenden Pa*, se debe esperar que la mezcla simple de los
componentes daría como resultado una reducción de títulos de
anticuerpos para el componente de los polisacáridos (Hib).
Los inventores han descubierto que esta reducción
se puede inhibir si el antígeno conjugado se adsorbe sobre fosfato
de aluminio. En contraste, si el antígeno se adsorbe sobre hidróxido
de aluminio, existe una reducción completa de títulos de anticuerpos
para el componente de polisacáridos.
De acuerdo con lo anterior en un aspecto
preferido de la presente invención se proporciona una composición de
vacuna que comprende una dosis alta de 69K (especialmente Pa* o
DTPa*) y un antígeno conjugado de polisacárido adsorbido sobre
fosfato de aluminio. Preferiblemente el antígeno es un polisacárido
capsular (PRP) de Hib conjugado con una proteína vehículo.
Preferiblemente la proteína vehículo es bien
toxoide de difteria, tétanos o un fragmento de los mismos
(ventajosamente fragmento C), proteína de difteria Crm_{197} o una
proteína de la membrana externa de una bacteria tal como N.
meningitidis.
El conjugado de polisacárido se puede preparar
mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida. Por ejemplo el
polisacárido se puede acoplar mediante un enlace tioéter.
El procedimiento de conjugación se basa en la
activación del polisacárido con tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio
(abreviadamente en inglés CDAP) para formar éster cianato. El
polisacárido activado se puede así acoplar directamente o mediante
un grupo espaciador a un grupo amino sobre la proteína vehículo.
Preferiblemente, el éster cianato se acopla con hexanodiamina y el
polisacárido amino - derivatizado se conjuga a la proteína vehículo
usando química de hetero ligamiento que implica la formación del
enlace tioéter. Tales conjugados se describen en la solicitud PCT
publicada WO 93/15760 de Uniformed Services University.
Los conjugados también se pueden preparar
mediante procedimientos de aminación reductora como se describe en
el documento US 4365170 (Jennings) y el documento US 4673574
(Anderson). Otros procedimientos se describen en los documentos
EP-0-161-188,
EP-208375 y EP-0477508.
Un procedimiento adicional implica el
acoplamiento de un polisacárido activado por bromuro de cianógeno
derivatizado con hidracida del ácido adípico (abreviadamente en
inglés ADH) al vehículo proteico mediante condensación con
carbodiimida. Tal conjugación describe en Chu C. y col Infec.
Immunity, 1983, 245 256.
En una realización preferida de la invención la
relación del polisacárido PRP a la proteína vehículo se modifica
entre una típica de 1:3 a 1:0,3 a 1:2.
El documento
WO-A-93/21950 describe una vacuna
que comprende DTPa* - Hib. Las composiciones de vacunas
multivalentes particulares dentro del alcance de la invención
incluyen una vacuna Hep B - DTPa*, una vacuna DTPa* - Hib -
Hepatitis B, y una vacuna DTPa* - Hib - Hepatitis B - IPV (polio
inactivada) y una vacuna DTPa* - Hib - Hepatitis B - IPV
(DTPa*HBIPV).
Las combinaciones anteriores pueden opcionalmente
incluir un componente que es protector contra la Hepatitis A.
Los componentes adecuados para uso en tales
vacunas están ya disponibles comercialmente y los detalles se pueden
obtener a partir de la Organización mundial de la salud. Por ejemplo
el componente IPV puede ser la vacuna de la polio inactivada de tipo
Salk. El componente que produce protección contra la hepatitis A es
preferiblemente el producto conocido como "Havrix" (SmithKline
Beecham Biologicals) que es una vacuna atenuada matada derivada de
la cepa HM-175 de VAH [véase "Inactivated
Candidate Vaccines for Hepatitis A" de F. E. Andre, A Hepburn y
E. D' Hondt, Prog Med. Virol. Vol 37, páginas
72-95 (1990) y la monografía del producto
"Havrix" publicada por SmithKline Beecham Biologicals (1991)].
Convenientemente, el componente de la hepatitis B puede comprender
el antígeno "S" como ya presente en la vacuna comercial
"Engerix-B" (SmithKline Beecham
Biologicals).
La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos secundarios, adversos significativos en
las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué
inmunógenos específicos se emplean. Generalmente se espera que cada
dosis comprenderá 10-100 \mug del inmunógeno
total. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir
una o dos inyecciones de recuerdo a aproximadamente intervalos de 4
semanas.
En general las formulaciones de vacunas de
cualquier aspecto de la invención se pueden preparar como sigue. Los
componentes Pa* requeridos se adsorben sobre un adyuvante adecuado,
más especialmente fosfato de aluminio. Después de permitir un tiempo
para la adsorción completa y estable de los componentes respectivos,
se pueden combinar los componentes diferentes en condiciones
apropiadas.
En un aspecto preferido de preparación de una
composición de vacuna combinada que contiene hepatitis B según la
invención se proporciona un procedimiento que implica la mezcla de
HBsAg adsorbido sobre fosfato de aluminio con uno o más antígenos
adsorbidos sobre hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención:
La vacuna que contiene 69K se formuló mediante
técnicas habituales y se usó una dosis de 20 \mug de 69K por dosis
de 0,5 ml de vacuna a granel.
Cuando la formulación de vacuna se ensayó en
seres humanos adultos, los resultados mostraron que la vacuna que
contiene alta dosis de 69K fue segura.
Los detalles fueron como sigue.
En un estudio doble ciego, aleatorio, controlado
por placebo, 50 voluntarios adultos sanos con historia de vacunación
con vacuna de tos ferina de células enteras en la infancia
recibieron bien una preparación de vacunas de tos ferina
monocomponente que contenía 20 \mug de 69kDa (20 sujetos), una
preparación de biocomponentes con 25 \mug de PT y 25 \mug de FHA
(20 sujetos) o placebo constituido por los excipientes de vacunas
sin los antígenos (10 sujetos) como vacunación de recuerdo.
Los participantes del estudio recibieron una de
las dos vacunas de estudio o un placebo en el presente estudio.
Grupo I: 20 \mug de 69 kDa (vacuna de tos
ferina acelular monocomponente (0,5 ml/dosis). Lote 69K1A2
Grupo II: 25 \mug de PT/25 \mug de FHA
(vacuna de tos ferina acelular bicomponente). Lote DPSK 314A2.
Grupo III: placebo constituido por los
excipientes de vacunas sin los componentes de tos ferina acelular,
es decir
- 1 dosis = 0,5 ml
- NaCl 150 mM
- 0,5 mg de Al + 3
(Al(OH)_{3})
- 2,5 mg de 2-fenioxietanol
- pH 6,0 - 7,0
Se distribuyeron cincuenta y cinco viales de
monodosis de las vacunas del estudio y placebo, codificados según
una lista aleatoria.
Los días 7, 14 y 28 el investigador examinó los
sujetos y se verificó el cumplimiento de la ficha diaria. Se
recogieron muestras de sangre después de la vacunación los días 7 y
28.
La vacuna de 69 kDa no fue más reactogénica que
la vacuna PT/FHA. Se observaron inflamación y enrojecimiento en los
grupos de vacunas del estudio, y no en el grupo placebo, pero nunca
en más del 20% de los sujetos. Se reseñó dolor en el 85% de los
sujetos tanto en el grupo 69 kDa como en el grupo PT/FHA y en el 80%
de los sujetos que recibieron placebo, indicando que el dolor se
puede deber más a los excipientes de las vacunas que a los propios
antígenos. Un gran porcentaje de dolor reseñado no fue dolor
espontáneo sino solamente dolor cuando se efectuó presión sobre el
sitio de inyección.
Se reseñaron reacciones locales de aparición
tardía o locales en los mismos receptores de la vacuna PT/FHA
mientras que se produjeron reacciones locales en los receptores de
69 kDa generalmente dentro de los primeros 4 días después de la
vacunación y fueron de corta duración. Se reseñaron dos reacciones
locales graves de larga duración en el grupo de PT/FHA, la causa de
las cuales no son claras.
No se reseñó fiebre clínicamente significativa.
Los síntomas generales solicitados y los síntomas no solicitados se
observaron a bajas frecuencias en los tres grupos de estudio y están
los más probablemente asociados a la vacunación.
Se observó una respuesta inmune a 69 kDa en el
100% de los receptores del antígeno con un incremento 77 veces en la
media geométrica de la titulación (abreviadamente en inglés GMT) de
los anticuerpos anti - 69 kDa sobre el título de prevacunación el
día 28 después de la vacunación. El 90% y 95% de los receptores de
biocomponente PT/FHA demostraron una respuesta inmune a PT y FHA,
respectivamente, con un incremento de 25 veces la GMT de anticuerpos
anti - PT y un incremento de 80 veces los anticuerpos anti - FHZ en
los títulos de prevacunación.
Se puede concluir que la dosis la dosis de 20
\mug de 69 kDa se podría administrar con seguridad a adultos.
La unión covalente de PRP y TT se lleva a cabo
mediante química de acoplamiento desarrollada en el NIH (Chu C. y
col., (1983), further studies on the immunogenicity of Haemophiles
influenzae type b and pneumococcal type 6A polysaccharide protein
conjugates. Infec. Immunity, 245-256). El PRP se
activa en condiciones controladas mediante bromuro de cianógeno y se
derivatiza con un espaciador de hidracida adípica.
Después de la derivatización, el polisacárido
activado (PRP - AH) se purifica mediante diafiltración. El
acoplamiento de los dos componentes purificados (PRP - AH y TT) se
efectúa mediante condensación con carbodiimidas. Después el
conjugado se purifica mediante ultrafiltración y filtración en gel
para retirar el reactivo y el PRP y en TT no conjugados.
Se disolvieron 30 mg de Hib PRP en 6 ml de NaCl 2
M. Se añadieron 225 mcl de CDAP (tetrafluoborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio)
a la solución de polisacáridos (a partir de una solución madre de
100 mg/ml en acetonitrilo) 90 segundos más tarde, se añadieron 450
mcl de trietilamina 0,2 M. La activación se realizó a pH 10,0
durante 1 minuto sobre hielo y un minuto a temperatura ambiente.
Se añadieron 90 mg de toxoide de tétanos
(relación inicial de PS/proteína de 1/3) al polisacárido activado y
la reacción de acoplamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente
durante 1 hora. Después, la reacción se inactivó con 3 ml de
solución de glicina 1 M, pH 5,0 durante 30 minutos a temperatura
ambiente y durante una noche a 4ºC.
El conjugado se purificó mediante filtración
sobre gel en una columna HR 500 equilibrada en NaCl 0,2 M. Se
determinó en cada fracción el contenido de carbohidratos y
proteínas. El conjugado se reunió y se filtró de manera estéril
(membrana Minisart + 0,222 \gammam).
A 0,15 mg de fosfato de aluminio se añadieron
12,5 \mug del conjugado de polisacáridos del ejemplo 2 (a). Estos
se agitó durante dos horas y el pH se ajustó hasta 5,1. Se dejó la
mezcla en reposo durante un día a temperatura ambiente y después el
conjugado adsorbido se dejó durante 9 días adicionales entre 2 y
8ºC. Para preparar un producto liofilizado el producto adsorbido se
diluye en lactosa (15,75 mg) para proporcionar una composición final
de 25 \mug de polisacárido/ml y 0,4 mg de Al/ml y la composición
resultante se introdujo en viales de 0,5 ml y se liofilizó.
Para preparar un producto líquido el conjugado
adsorbido se diluye en agua para inyección con NaCl 150 mM y 5 mg/ml
de fenoxietanol para proporcionar una composición final de 20 \mug
de polisacárido/ml y 0,32 mg de Al/ml.
Esto se hizo de acuerdo a los procedimientos del
documento WO 93/24148 (SmithKline Beecham Biologicals). La
formulación se preparó se acuerdo al ejemplo 4 más adelante.
El conjugado se preparó de una manera análoga al
ejemplo de 2 (a), pero se usó una cantidad reducida de tétanos (30
\mug, 60 \mug) para proporcionar un producto una relación de
polisacárido:proteína de 1:1 ó 1:2. Después el conjugado se adsorbió
sobre fosfato de aluminio según el procedimiento del ejemplo 2 (c).
La preparación liofilizada final contiene 12,5 \mug de conjugado,
0,15 mg de AlPO_{4}, 15,75 mg de lactosa. Esto se reconstituye en
0,5 ml de agua para inyección antes de uso a un pH de 0,1 +/-
0,1.
El conjugado Hib del ejemplo 2 (a), bien puro o
preabsorbido sobre AlPO_{4} (se liofilizaron ambas vacunas) se
mezcló con DTPa* o DTPa* - Hep B no más de 1 hora antes de inyección
y la combinación se inyectó en ratas infantiles (1 semana de edad)
mediante la vía subcutánea a una dosis correspondiente a 1/20 de una
dosis humana (0,5 \mug de PRP). A las ratas se les proporcionó una
dosis de recuerdo 2 semanas y 4 semanas más tarde y el suero se
recogió después de cada inmunización para medir los anticuerpos anti
- PRP. Los controles incluyeron las vacunas Hib (adsorbidos o no
sobre AlPO_{4}) reconstituidas en solución salina.
Se inmunizaron grupos de 10 ratas distribuidas al
azar (1 semana de cepa ago - OFA) 3 veces subcutáneamente los días
0 - 14 - 28 con 1/20 de dosis humana de vacuna de Hib, sola o
combinada con DTPa* o DTPa* - Hep B (1/20 de dosis humana). La
reconstitución de la vacuna liofilizada de Hib con solución salina o
combinaciones (DTPa* o DTPa* - Hep B) se realizó menos de 1 hora
antes de la inmunización.
Las ratas se desangraron bajo anestesia en los 14
- 24 - 42 y 56 días. Se midieron los anticuerpos anti - PRP mediante
ELISA en sueros individuales y los títulos se expresaron en
\gamma/ml usando una referencia calibrada. La GMT se calculó para
cada grupo y en cada instante. Los límites de confianza al 95% se
calcularon para los títulos obtenidos después de la tercera
inmunización.
La adsorción del conjugado Hib sobre AlPO_{4}no
modifica su inmunogenicidad, se produjeron algunos de anti - PS
después de la segunda dosis y se muestra un buen efecto de recuerdo
después de la tercera dosis como se observa en niños humanos.
La formulación se preparó exactamente como en el
ejemplo 5 del documento WO 93/24148 excepto que 20 \mug de 69K se
usaron para preparar una dosis de 0,5 ml de vacuna a granel.
El procedimiento se puede repetir según se desee
para preparar vacunas que comprenden entre 10 y 50 \mug de 69K por
dosis de 0,5 ml de vacuna a granel.
Se sometieron a desafío grupos de ratones Balb/C
(15 por grupo) con tos ferina B bien usando desafío intranasal
(abreviadamente en inglés IN) o desafío con aerosol como se indica
en la figura 1.
Las vacunas ensayadas en este desafío pueden
ser:
- \bullet
- "DTPa Bi", en el que PaBi denota PT/FHA sin 69K presente
- \bullet
- DTPa*, en la que Pa* es como se ha definido en esta memoria descriptiva, que es PT/FHA/69K con alta dosis de 69K presente
- \bullet
- DTPa* HB IPV, que es DTPa* con antígeno se superficie de hepatitis B (antígeno S) e IPV presentes; y
- \bullet
- una vacuna de tos ferina de células enteras (DTPw) (por ejemplo la fabricada por Connaught)
Las formulaciones que contienen 69K se pueden
ensayar con y sin Hib presente.
Las figuras 2 a 5 muestran los resultados que se
pueden obtener típicamente con una dosis de 69K en el intervalo
entre 15-25 \mug por 0,5 ml de vacuna a granel y
otras composiciones de vacunas adaptadas apropiadamente de manera
que se proporcione una comparación apropiada. Los resultados que se
pueden obtener demuestran que la vacuna que contiene alta dosis de
69K es superior a los otros y, sorprendentemente, pueden no producir
ninguna interferencia. Estos datos muestran que 69K es el antígeno
protector clave en las vacunas contra tos ferina B.
Se inmunizaron SC grupos de 15 ratones Balb/C
(hembras, 5 semanas de edad) con 1/4 de dosis humana.
Se les suministro un recuerdo a los ratones 3
semanas después con la misma dosis. Una semana después del recuerdo,
se tomaron muestras de sangre para evaluación de anticuerpos y los
ratones se sometieron a desafío mediante instilación de 50 \mul de
suspensión bacteriana en los orificios nasales bajo una ligera
anestesia (+/- 5 x 10^{6} UFC/50 \mul de cepa 18233, fase
logarítmica). Se sacrificaron cinco ratones en 5 momentos diferentes
(d1, d2, d4, d8, d14) después del desafío y se extrajeron los
pulmones asépticamente y se homogeneizaron individualmente en 2 ml
de casamicoácido (1% en solución salina fisiológica). Se cultivaron
100 \mul de 4 diluciones en serie 10 veces en placas agar Bordet
Gengou durante 6 días a 37ºC. El número de unidades formadoras de
colonias (abreviadamente UFC) se determinó para cada pulmón (el
nivel mínimo de detección es 20 UFC/pulmón). Se calculó en cada
instante la media aritmética del log 10 de UFC/pulmón y la
desviación estándar.
La eliminación de bacterias se evaluó calculando
la diferencia (log de UFC de ratones control menos log UFC de
ratones inmunizados) los días 4, 8 y 14. El día 14 se registró el
número de ratones protegidos (< 20 UFC/pulmón). Los datos se
muestran en la tabla más adelante.
Claims (9)
1. Una composición de vacuna que comprende una
dosis alta de la proteína de la membrana externa de B.
pertussis de 69kDa, en la que la dosis está en el intervalo
entre 10-100 \mug por 0,5 ml de vacuna total y que
adicionalmente comprende los antígenos de tos ferina PT y FHA,
difteria (D) y tétanos (T) y antígeno de hepatitis B, junto con un
vehículo o adyuvante adecuado.
2. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1 en la que el antígeno de hepatitis B es el antígeno
de superficie de hepatitis B.
3. Una composición de vacuna según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 que adicionalmente comprende
un conjugado de polisacárido capsular Hib tipo B.
4. Una composición de vacuna según la
reivindicación 3 en la que el conjugado de polisacárido es un
conjugado de proteína toxoide de tétanos (PRP - TT).
5. Una composición de vacuna según la
reivindicación 4 en la que la relación de polisacáridos a proteínas
es 1:1 ó 1:2.
6. Una composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende vacuna
de polio inactivada.
7. Una composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende una
vacuna de hepatitis A inactivada.
8. Una composición de vacuna según la
reivindicación 7 en la que la vacuna de hepatitis A se deriva de la
cepa HM - 175.
9. Una composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en la que el adyuvante comprende
fosfato de aluminio.
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