JP2000511553A - ボルデテラ・ペルツッシスの外膜タンパク質フラグメントを有してなるワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ０.５ｍｌあたり１０−１００μｇの６９Ｋを有するボルデテラ・ペルツッシス（ペルタクチン）の６９Ｋ外膜タンパク質を含むワクチン組成物を、百日咳感染の治療について記載する。さらに、０.５ｍｌあたり１０−１００μｇの６９Ｋを含む複合ワクチン、特に、６９Ｋ成分が線状赤血球凝集素（ＦＨＡ）および百日咳トキソイド（ＰＴ）とともに配合され、所望により１またはそれ以上の他の抗原、例えばＢ型肝炎表面抗原、ヘモフィルス・インフルエンゼｂ（Hib）、注射可能なポリオ（ＩＰＶ）およびＡ型肝炎と組み合わせてもよい複合ワクチンも記載する。ワクチンの調製法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 ボルデテラ・ペルツッシスの外膜タンパク質フラグメントを有してなるワクチン 組成物 本発明は、高用量のペルタクチン（pertactin）、ヨーロッパ特許番号０１６ ２６３９に開示されている，ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella Pertussis ）の６９ｋｄａの外膜タンパク質（以下、「６９Ｋ」または「６９Ｋ抗原」と称 する）を含む新規ワクチン処方に関する。組換え６９Ｋ（Ｐ６９）がＮＦ Fairw eatherら［Symposium On Pertussis（Bethesda）、２６−２８、１９９０年９月 ］に開示されている。本発明はさらに、１種以上の抗原を有してなるワクチン、 所望により多価ワクチン、すなわち：１種以上の病態の改善または治療用ワクチ ンに関する。本発明はさらに、このようなワクチンの産生および医学における使 用に関する。 ６９Ｋは百日咳を有効に予防するための無細胞百日咳ワクチン（Paワクチン） の重要な成分であることが知られている。６９Ｋ含有ワクチンは、ジフテリア（ Ｄ）、破傷風（Ｔ）および百日咳（Pa）に対する抗原を含む「三価」ワクチンを 含め、イタリアおよびスウェーデンで行われた臨床試験に記載されており、［例 えば、商標INFANRIX−DTPa（SmithKhne Beecham Biologicals）］で市販されて いる。典型的には、このようなワクチンの百日咳成分は、百日咳トキシン（ＰＴ ）、線状赤血球凝集素（ＦＨＡ）および６９Ｋを含む。このようなワクチンにお いて、用いるＰＴ：ＦＨＡ：６９Ｋの量は、０.５ｍｌの量のバルクワクチンに 付き２５μｇ：２５μｇ：８μｇである。 ６９Ｋを有してなる他の多価ワクチンも公知であり、例えば、Ｂ型肝炎に対す る抗原およびジフテリア、破傷風および百日咳に対する抗原を有してなるワクチ ン(Hep B、DTPa）がＷＯ９３／２４１４８に記載された。このような処方におい て、開示された６９Ｋの量は０.５ｍｌのバルクワクチンに付き８μｇを越えな いものであった。 高用量の６９Ｋを含むワクチンは百日咳の予防に特に有効であることが判明し て いる。本明細書に記載した範囲内で、このようなワクチンはヒト対象に投与した 場合に安全で、ボルデテラ・ペルツッシス感染症に対して迅速な防御を誘発する 。６９Ｋおよび他の抗原を含む複合ワクチンにおいて、意外にも、相互作用がな いこと、すなわち、このようなワクチンはヒトに投与した場合に免疫原性の損失 を示さず、効果的であることが判明した。特に、本発明のワクチンは子供に対す る投与に適している。 したがって、本発明は高用量の６９Ｋ抗原を有してなるワクチン組成物を提供 する。ワクチン組成物中の抗原は適当な担体またはアジュバントと一緒に処方さ れることは理解できるであろう。 「高用量の６９Ｋ抗原」なる用語により、６９Ｋの濃度が０.５ｍｌのバルク ワクチンに付き少なくとも１０μｇである用量を意味し、好ましくは、０.５ｍ ｌのバルクワクチンに付き１０μｇないし１００μｇの範囲である。より好まし くは、ワクチン中の６９Ｋの濃度は１０ないし５０μｇの範囲であり、例えば約 ３０μｇである。０.５ｍｌのバルクワクチンに付き１５−３５μｇの用量、典 型的には約２０ないし２５μｇの用量もまた用いるのに有利である。 一態様において、本発明は唯一の抗原性成分として高度に精製された６９Ｋ抗 原を有してなるワクチン組成物を提供する。 さらに別の態様において、本発明は高用量の６９Ｋ（前記のとおり）を１また はそれ以上の抗原と組みあわせて含むワクチン組成物を提供する。 一態様において、このようなワクチンは、当業界で周知のＰＴおよびＦＨＡな どの１またはそれ以上の百日咳抗原を含みうる。所望により、ＰＴ成分は組換え 体であってもよく(例えば、ヨーロッパ特許出願番号ＥＰ０３０６３１８、ＥＰ ０３２２５３３、ＥＰ０３９６９６４、ＥＰ０３２２１１５およびＥＰ０２７５ ６８９に記載)、あるいはＰＴ成分は例えばＥＰ０５１５４１５に記載されてい るようにトキソイド化されていてもよい。百日咳抗原の調製に関してはEＰ０４ ２７４６２およびＷＯ９１／１２０２０参照。典型的には、ＰＴおよびＦＨＡ成 分は０.５ｍｌのバルクワクチンに付き、１０−２５μｇの範囲である。一態様 において、ＰＴ：ＦＨＡ：６９Ｋの割合は、およそ１：１：１である。 さらに別の態様において、本発明のワクチン組成物は、百日咳以外の疾患の予 防に関する抗原、例えば通常のトキソイド化ジフテリアおよび破傷風抗原を含み うる。本発明の好ましいワクチン組成物は、したがってDTPa^*（ここに、Pa^*は前 記のようなＰＴ、ＦＨＡおよび高用量の６９Ｋの組み合わせを意味する）である 。意外にも、高用量の６９Ｋは反応原性でなく、DTPa^*ワクチン組成物の他の成 分を干渉するに至らないことが見出された。さらに、高用量の６９Ｋは以下に記 載する多価ワクチンの抗原性成分のいずれの免疫原性も実質的に減少させない。 さらに別の態様において、本発明は高用量の６９Ｋ、特にＢ型肝炎（Hep B） に対する抗原が存在する前記のPa^*を含む多価ワクチン(すなわち、好ましくはHe p B−DTPa^*ワクチン）を提供する。このような多価ワクチンは、前記の高用量の ６９Ｋを処方に用いる以外は、一般にＷＯ９３／２４１４８に記載されていると おりである。ＷＯ９３／２４１４８に記載されているように、Ｂ型肝炎抗原は好 ましくはＢ型肝炎表面抗原である。 Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）の調製は十分に書面に記載されている。例えば、H arfordら、Develop.Biol.Standard、５４、ｐ１２５（１９８３）、Greggら、Bi otechnology)５、４７９ページ（１９８７）、ＥＰ−Ａ−０２２６８４６、ＥＰ −Ａ−０２９９１０８およびその引用文献を参照のこと。 本明細書において用いる「Ｂ型肝炎表面抗原」または「HBsAg」なる表現は、 ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すいずれかのHBsAg抗原またはそのフラグメントを 包含する。HBsAg抗原の２２６アミノ酸配列（Tiollaisら、Nature、３１７、４ ８９（１９８５）およびその引用文献を参照のこと）に加えて、本明細書におい て記載するHBsAgは、所望により、前記引例およびＥＰ−Ａ−０２７８９４０に 記載されているようなプレ-Ｓ配列の全部または一部を含んでもよい。本明細書 において記載するHBsAgはさらに変種、例えばＷＯ９１／１４７０３に記載され ているような「逸脱（escape）変異体」なども意味する。さらに別の態様におい て、HBsAgはヨーロッパ特許出願番号０４１４３７４においてＬ^*と記載されてい るタンパク質、すなわち、そのアミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスラージ（Ｌ）タ ンパク質（ａｄまたはａｙサブタイプ）のアミノ酸配列の一部を含むタンパク質 を含んでもよく、 そのタンパク質のアミノ酸配列は： （ａ）前記Ｌタンパク質の１２−５２残基、それに続く１３３−１４５残基、 それに続く１７５−４００残基；または （ｂ）前記Ｌタンパク質の１２残基、それに続く１４−５２残基、それに続く １３３−１４５残基、それに続く１７５−４００残基 のいずれかを含むことを特徴とする。 HBsAgはさらに、ＥＰ０１９８４７４またはＥＰ０３０４５７８に記載されて いるポリペプチドも意味する。 通常、HBsAgは粒子形態である。これはＳタンパク質単独からなるか、または 複合粒子であり、例えば（Ｌ^*、Ｓ）にこに、Ｌ^*は前記の通りであり、ＳはＢ型 肝炎表面抗原のＳ−タンパク質を意味する）である。 ＷＯ９３／２４１４８に記載されているように、HBsAgをリン酸アルミニウム 上に吸着させることが好ましい。他の抗原をリン酸アルミニウムまたは水酸化ア ルミニウム上に吸着させてもよいが、ある場合には、満足できる結果は他の抗原 がリン酸アルミニウム上に吸着される場合にのみ得られるであろう。例えば、Hi b（以下に記載する）の場合、Hibを予めリン酸アルミニウム上に吸着させるのが 適当である。 他の抗原を本発明のワクチン中、例えばPa^*またはDTPa^*処方に配合して他の多 価ワクチンを得ることもできる。適当な前記の他の抗原は、当業界で公知のもの を含み、ＷＯ９３／２４１４８に記載されているようにヘモフィルス・インフル エンゼｂ（Hib）および／またはポリオ（ＩＰＶ）および／またはＡ型肝炎に対 する防御を得ることができる。 ヘモフィルス・インフルエンゼｂ（Hib）感染症の予防用ワクチンは、キャリ アタンパクと接合した莢膜多糖（ＰＲＰ）をベースとする。多糖はリボース、リ ビトールおよびホスフェートのポリマーである。これらのワクチンは、典型的に はプレーン（すなわちアジュバントを含まない）処方として付与される。ある場 合には、水酸化アルミニウムを含有する希釈剤（Merk社製造のPedvax Hib）を利 用して凍結乾燥した接合体を復元する。典型的には、キャリアタンパクはジフテ リアまたは破 傷風トキソイドまたはエヌ・メニギティディスの外膜タンパク質である。このよ うな接合ワクチン抗原の例は、ＵＳ４３６５１７０、ＵＳ４６７３５７４、ＥＰ ２０８３７５、ＥＰ４７７５０８およびＥＰ１６１１８８に開示されている。 Pa^*を含むHib複合ワクチンの場合、単に成分を混合するだけでは、多糖（Hib ）成分に対する抗体価の減少が生じると予想される。 本発明者らは、接合抗原がリン酸アルミニウム上に吸着されている場合にこの 減少を抑制することができることを見いだした。対照的に、抗原が水酸化アルミ ニウム上に吸着されている場合、多糖成分に対する抗体価が完全に減少する。 したがって、本発明の好ましい一態様において、リン酸アルミニウム上に吸着 された高用量の６９Ｋ（特にPa^*またはDTPa^*）および多糖接合抗原を含むワクチ ン組成物が提供される。好ましくは、抗原はキャリアタンパクと接合したHib由 来の莢膜多糖（ＰＲＰ）である。 好ましくは、キャリアタンパクはジフテリア、破傷風トキソイドまたはそのフ ラグメント（有利には、フラグメントＣ）、ジフテリアＣｒｍ₁₉₇タンパク質ま たはエヌ・メニギティディスなどの細菌由来の外膜タンパク質のいずれかである 。 多糖接合体は、いずれかの公知のカップリング技術により調製される。例えば 、多糖はチオエーテル結合によりカップリングさせることができる。この接合法 は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(Ｃ ＤＡＰ)で多糖を活性化してシアネートエステルを形成することに基づく。活性 化多糖をこのように直接またはスペーサー基を介してキャリアタンパク上のアミ ノ基とカップリングする。好ましくは、シアネートエステルをヘキサンジアミン と結合させ、アミノ誘導化多糖をチオエーテル結合の形成を含むヘテロ結合化学 反応を用いてキャリアタンパクと接合させる。このような接合体は、ＰＣＴ公開 出願ＷＯ９３／１５７６０ Uniformed Services Universityに記載されている。 接合体はまた、ＵＳ４３６５１７０（Jennings）およびＵＳ４６７３５７４（ Anderson）に記載されているような直接還元的アミノ化法により調製できる。他 の方法は、ＥＰ−０１６１１８８、ＥＰ−２０８３７５およびＥＰ−０４７７５ ０８に記載されている。 さらに別の方法は、アジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導化した臭化シアン 活性化多糖をカルボジイミド縮合によりタンパク質キャリアにカップリングする ことを含む。このような接合は、Che C.ら、Infec Immunity、１９８３ ２４５ ２５６に記載されている。 本発明の好ましい具体例において、ＰＲＰ多糖のキャリアタンパク質に対する 比は、典型例として１：３から１：０.３ないし１：２に変更される。 本発明の範囲内に含まれる特定の多価ワクチン組成物は、Hep B-DTPa^*ワクチ ン、DTPa^*（ジフテリア−破傷風−無細胞百日咳）−Hibワクチン、DTPa^*-Hib− Ｂ型肝炎ワクチン、およびDTPa^*−Hib−Ｂ型肝炎−ＩＰＶ（不活化ポリオ）ワク チンおよびDTPa^*−Ｂ型肝炎−ＩＰＶワクチン（DTPa^*HBIPV）を包含する。 前記組み合わせはＡ型肝炎に対して防御的な成分を所望により含んでもよい。 このようなワクチンにおいて用いるのに適した成分はすでに市販されていて、 詳細は世界保健機構より入手できる。例えば、ＩＰＶ成分はＳａｌｋ不活化ポリ オワクチンである。Ａ型肝炎に対する防御をもたらす成分は、好ましくは「Havr ix」（SmithKline Beecham Biologicals）として知られる製品であって、ＨＡＶ のＨＭ−１７５株由来の死菌弱毒化ワクチンである［「Inactivated Canddates Vaccines for Hepatitis A」、F.E.Andre、A.HepburnおよびE.D'Hondt、Prog.Me d.Virol.、第３７巻、７２−９５頁（１９９０）および製品モノグラフ「Havrix 」SmithKline Beecham Biologicals出版（１９９１）を参照のこと］。都合よく は、Ｂ型肝炎成分は市販のワクチン「Engerix−B」（SmithKline Beecham Biolo gicals）にすでに配合されているような「Ｓ」抗原を含んでいてもよい。 各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的な被接種者において著しい副作用を起 こすことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。このような量は、ど の免疫原を用いるかによって変わる。一般に、各用量は、１０ないし１００μｇ の総免疫原を含有すると考えられる。初回接種の後、対象は、１回または約４週 間の間隔をあけて２回のブースター注射を受ける。 一般に、本発明のいずれかの態様のワクチン処方は、以下のようにして調製す ることができる。必要なPa^*成分を適当なアジュバント、特にリン酸アルミニウ ム上 に吸着させる。各成分の完全で安定な吸着が得られるまで時間をおいた後、異な る成分を適当な条件下で合することができる。 本発明に係るＢ型肝炎抗原含有複合ワクチン組成物の調製の好ましい態様にお いて、リン酸アルミニウム−吸着HBsAgを１またはそれ以上の水酸化アルミニウ ムまたはリン酸アルミニウム−吸着抗原と混合することを含む方法が提供される 。 以下の実施例を用いて本発明を説明する。 実施例１：精製された高用量６９Ｋ抗原を単独で含むワクチン処方の調製および 成人対象における安全性試験 ６９Ｋ−含有ワクチンを標準的技術により処方し、０.５ｍｌのバルクワクチ ンに付き２０μｇの用量の６９Ｋを用いた。 ワクチン処方を成人において試験した場合、その結果から高用量６９Ｋ−含有 ワクチンは安全であることが判明した。 詳細は以下の通りである。 二重盲検の無作為抽出するプラセボ−制御試験において、全細胞百日咳ワクチ ンを子供時代に受けた経験がある５０人の健康な成人ボランティアに、２０μｇ の６９kDaを含有する一成分百日咳ワクチン製剤（２０対象）、２５μｇのＰＴ および２５μｇのＦＨＡを含む二成分製剤（２０対象）のいずれかまたは抗原を 含まないワクチン賦形剤からなるプラセボ（１０対象）のいずれかをブースター ワクチン注射として投与した。 試験参加者に、この試験の２種のうちの１種の試験ワクチンまたはプラセボを 投与した。 Ｉ群：２０μｇの６９kDa（一成分無細胞百日咳ワクチン（０．５ｍｌ／用量 ）。ロット６９Ｋ１Ａ２ ＩＩ群：２５μｇのＰＴ/２５μｇのＦＨＡ（二成分無細胞百日咳ワクチン） 。ロットＤＰＳＫ３１４Ａ２ ＩＩＩ群:無細胞百日咳成分を含まないワクチン賦形剤からなるプラセボ、す なわち: −１服用量＝０.５ｍｌ −１５０ｍＭ ＮａＣｌ −０.５ｍｇ Ａ１⁺³（Ａｌ(ＯＨ)₃） −２.５ｍｇ ２−フェニルオキシエタノール −ｐＨ ６.０−７.０ 無作為抽出リストにしたがって番号付けした試験ワクチンおよびプラセボの５ ５個の単一用量バイアルを配付した。 ７日、１４日および２８日に、試験官が対象を試験しれ、ダイアリーカードの 完成を確認した。接種後の血液サンプルを７日および２８に集めた。 結果 ６９kDaワクチンはＰＴ／ＦＨＡワクチンと同様に反応原性でなかった。腫脹 および発赤が試験ワクチン群で見られたが、プラセボ群では見られず、対象の２ ０％を越えなかった。６９kDa群およびＰＴ／ＦＨＡ群の両方において８５％の 対象が痛みを報告し、プラセボを摂取した対象の８０％が痛みを報告し、痛みは 抗原そのものよりもワクチン賦形剤に起因することがわかる。報告された痛みの 大部分は自発的な痛みでなく、圧力を注射部位上に加えた場合の単なる痛みであ った。 遅発性または二相局所反応がＰＴ／ＦＨＡワクチンの摂取者の数人により報告 されているが、６９kDa摂取者については局所反応は一般に予防接種後の初めの ４日以内におこり、短期間のものであった。長期間にわたる２つの重度の局所反 応がＰＴ／ＦＨＡにより報告されているが、その原因は明らかでない。 臨床的に重要な発熱は報告されなかった。予想される一般的徴候および予想さ れない徴候は３つのすべての群において低頻度で見られるが、予防接種と関連し て起こる可能性はほとんどない。 ６９kDaに対する免疫応答は抗原の摂取者の１００％においてみられ、予防接 種後２８日までに予防接種力価よりも抗−６９kDa抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ ）において７７倍の増加が見られた。９０％および９５％の二成分ＰＴ／ＦＨＡ 摂取者はそれぞれＰＴおよびＦＨＡに対して免疫応答を示し、抗ＰＴ抗体ＧＭＴ で予防接種力価よりも２５倍増加し、抗ＦＨＡ抗体で８０倍増加した。 ２０μｇの６９kDaは成人に対して安全に投与できると結論できる。 実施例２：リン酸アルミニウム上に吸着された破傷風トキソイド上に接合したHi b多糖を含むワクチン処方 ヘモフィルス・インフルエンゼＢ型莢膜多糖（ＰＲＰ）破傷風トキソイド（Ｔ Ｔ）接合体の合成 （ａ）臭化シアンカップリングＰＲＰおよびＴＴの共有結合を、ＮＩＨ［Chu C.ら、（１９８３）、ヘモフィルス・インフルエンゼＢ型およびニューモコッカ ル６Ａ型多糖タンパク質接合体の免疫原性に関する更なる研究 Infec.Immunity 、２４５−２５６］で開発されたカップリング化学反応により行う。ＰＲＰは臭 化シアンにより制御条件下で活性化され、アジピン酸ヒドラジドスペーサーで誘 導化される。 誘導化の後、活性化多糖（ＰＲＰ−ＡＨ）をダイアフィルトレーションにより 精製する。２つの精製成分（ＰＲＰ−ＡＨおよびＴＴ）のカップリングをカルボ ジイミド縮合により行う。接合体を次に限外濾過およびゲル濾過により精製して 、試薬および未接合ＰＲＰおよびＴＴ除去する。 ＰＲＰ−ＴＴ接合体の合成 （ｂ）ＣＤＡＰカップリング ３０ｍｇの天然Hib ＰＲＰを６ｍｌの２Ｍ NaCl中に溶解した。２２５ｍｃｌ のＣＤＡＰ(１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボ レート)を多糖溶液に添加した（アセトニトリル中１００ｍｇ／ｍｌストック溶 液から）。９０秒後、４５０ｍｃｌの０.２Ｍトリエチルアミンを添加した。活 性化をｐＨ１０.０で１分間氷上で、１分間室温で行った。 ９０ｍｇの破傷風トキソイド（初期ＰＳ／タンパク質比１／３）を活性化多糖 に添加し、カップリング反応を室温で１時間行った。ついで、３ｍｌの１Ｍグリ シン溶液（ｐＨ５.０）で室温で３０分間、４℃で一夜反応物をクエンチした。 接合体を０.２Ｍ NaClで平衡化したセファクリルＨＲ５００カラム上ゲル濾過 により精製した。炭水化物およびタンパク質含量を各フラクションにおいて測定 した。接合体をプールし、滅菌濾過した（膜Minisart＋０.２２２γｍ）。 （ｃ）リン酸アルミニウム上への吸着 ０.１５ｍｇのリン酸アルミニウムに１２.５μｇの実施例２（ａ）の多糖接合 体を添加した。これを２時間攪拌し、そのｐＨを５.１に調節した。混合物を一 日室温で静置し、吸着した接合体をさらに９日間２ないし８℃に放置した。凍結 乾燥製品を調製するために、吸着した製品をラクトース（１５.７５ｍｇ）中に 希釈して、２５μｇの多糖／ｍｌおよび０.４ｍｇＡｌ／ｍｌを得、得られた組 成物を０.５ｍ１バイアル中に充填し、凍結乾燥した。 液体製品を調製するために、吸着した接合体を１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ ｍｇ／ｍｌのフェノキシエタノールを含有する注射用水中に希釈して、２０μｇ 多糖／ｍｌおよび０.３２ｍｇ Ａｌ／ｍｌの最終組成物を得る。 （ｄ）Ｂ型肝炎抗原と共にまたは無しのジフテリア、破傷風および百日咳（無 細胞）ワクチンの調製 これはＷＯ９３／２４１４８（SmithKhne Beecham Biologicals）の方法にし たがって行った。処方は後述の実施例４にしたがって調製した。 （ｅ）「低比」ＰＲＰ−ＴＴリン酸アルミニウムに予め吸着させた接合体の調 製 用いた破傷風の量を減らす〈３０μｇ、６０μg）以外は、実施例２（ａ）と 同様にして接合体を調製して、多糖：タンパク質の割合が１：１または１：２で ある生成物を得た。接合体を次に実施例２（ｃ）の方法にしたがってリン酸アル ミニウム上に吸着させる。最終凍結乾燥処方は１２.５μｇの接合体、０.１５mg のAlPO₄、１５.７５ｍｇのラクトースを含有する。これをｐＨ０.1＋／−０.１ で使用前に０.５ｍｌの注射用水中で復元する。 実施例３：リン酸アルミニウム上に予め吸着させ、DTPa^*またはDTPa^*-Hep Bと合 したＰＲＰ−ＴＴ接合体の免疫原性 プレーンであるかまたはAlPO₄上に予め吸着させた実施例２（ａ）のHib接合体 （両ワクチンを凍結乾燥した）をDTPa^*またはDTPa^*Hep Bと注射前にほんの１時 間混合し、その組合わせを皮下経路によりヒト用量（０.５μｇの１）の２０分 の１に対応する量を乳児ラット（１週齢）に注射した。ラットに２週間および４ 週間後ブースター投与し、各免疫化の後に血清を集めて、抗−ＰＲＰ抗体を測定 した。 対照として食塩水中で復元したHibワクチン（AlPO₄上に吸着または吸着していな い）が挙げられる。 一群１０匹の無作為抽出した乳児ラット（１週齢−ＯＦＡ種）を−１４−２８ 日にヒト用量の２０分の１のHibワクチンを単独またはDTPa^*またはDTPa^*Hep B（ ヒト用量の２０分の１）とともに皮下的に３回免疫化した。凍結乾燥したHibワ クチンの食塩水または複合体（DTPa^*またはDTPa^*Hep B）での復元は免疫化前１ 時間以内に行った。 ラットを麻酔下で１４−２８−４２および５６日に採血した。各血清中抗−Ｐ ＲＰ抗体をＥＬＩＳＡにより測定し、力価を校正基準を用いてγ／ｍｌで表した 。ＧＭＴを各群および各時点について計算した。９５％の信頼限界を三回目の免 疫化後に得た力価について計算した。 Hib接合体のAlPO₄上への吸着は、その免疫原生を変更しない：すなわち、第二 の投薬後、抗−ＰＳが産生され、ヒト乳児においてみられるように、三回目の投 薬後に良好な促進効果が得られる。 実施例４：Hep B−DTPa^*ワクチンの調製 ２０μｇの６９Ｋを用いて０.５ｍｌ用量のバルクワクチンを調製する以外は ＷＯ９３／２４１４８の実施例５におけるのと全く同じようにして処方を調製し た。 望ましいならば同手順を繰り返して、０.５ｍｌ用量のバルクワクチン当たり １０と５０μｇの間の６９Ｋを含むワクチンを調製する。 実施例５:Hep B−DTPa^*ワクチンおよび他の多価ワクチンのマウス実験における 性能 Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群（一群１５匹）をボルデテラ・ペルツッシスで、図１ に示すように鼻腔内（ＩＮ）攻撃またはエアゾル攻撃のいずれかを用いて攻撃す る。 この攻撃で試験したワクチンは： ・「DTPa Bi」（ここに、ＰａＢｉは６９Ｋが存在しないＰＴ／ＦＨＡを意味 する） ・DTPa^*（ここにPa^*は本明細書において定義したとおり、すなわち、高用量の ６９Ｋが存在するＰＴ／ＦＨＡ／６９Ｋ） ・DTPa^*HBIPV、すなわち、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｓ−抗原）およびＩＰＶが存在 するDTPa^*;および ・全細胞（ＤＴＰｗ）百日咳ワクチン（例えば、Connaughtにより製造される もの） である。 ６９Ｋ含有処方をHibの存在下または非存在下で試験してもよい。 図２ないし５は、０.５ｍｌのバルクワクチンに付き１０ないし２５μｇの範 囲にある一用量の６９Ｋを用いて、および適切な比較ができるように適宜採用さ れた他のワクチン組成物を用いて典型的に得られる結果を示す。得ることのでき る結果は、高用量の６９Ｋ含有ワクチンが他のものより優れ、驚くべきことに干 渉を引き起こさないことを示す。データは６９Ｋがボルデテラ・ペルツッシスに 対するワクチンにおいて重要な防御抗原であることを示す。 実施例６ マウスの鼻腔内攻撃実験におけるボルデテラ・ペルツッシス感染症に対する６ ９Ｋの防御効果 一群１５ないし３０匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（雌、５週齢）を人ヒト用量の４ 分の１でＳＣで免疫化した。 マウスに３週間後に同じ投薬量でブースター投与した。ブースター投与の１週 間後、血液サンプルを抗体評価のために採取し、マウスを軽い麻酔下（＋／−５ .１０⁶ｃｆｕ／５０μｌの１８３２３株、対数期）で５０μｌの細菌懸濁液の外 鼻孔中への点滴注入により攻撃した。５匹のマウスを攻撃後に種々の異なる５時 点（ｄ１、ｄ２、ｄ４、ｄ８、ｄ１４）で殺し、肺を無菌的に摘出し、それぞれ ２ｍｌのカザミコ酸（生理的食塩水中１％）中に均質化した。１００μｌの４連 続の１０倍希釈体をBordet−Gengou寒天平板上で６日間３７℃で培養した。コロ ニー形成単位（ｃｆｕ）数を各肺で測定した（検出の下限２０ｃｆｕ／肺）。ｌ ｏｇ１０ｃｆｕ／肺の相加平均および標準偏差を各時点について計算した。 ４、８および１４日での差（ｌｏｇ ｃｆｕ対照マウス−ｌｏｇ ｃｆｕ免疫化 マウス）の計算により細菌の浄化値を評価した。１４日間、防御されたマウス数 （＜２０ｃｆｕ／肺）を記録した。データを以下の表に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｋ 39/29 39/39 39/39 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ステフェンヌ，ジャン ベルギー、ベー―1330リクセンザルト、リ ュ・デュ・ランスティテュート89番、スミ スクライン・ビーチャム・バイオロジカル ス・ソシエテ・アノニム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ボルデテラ・ペルツッシス（６９Ｋ抗原）の高用量の６９kDa外膜タンパ クを含み、その量が０.５ｍｌのバルクワクチン当たり１０ないし１０μｇの範 囲であることを特徴とするワクチン組成物。 ２．６９Ｋ抗原の濃度が０.５ｍｌのバルクワクチン当たり１０−５０μｇの 範囲であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。 ３．６９Ｋ抗原の濃度が０.５ｍｌのバルクワクチン当たり１５−３５μｇの 範囲であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン組成物。 ４.単独抗原成分として６９Ｋ抗原を含む請求項１ないし３のいずれかに記載 のワクチン組成物。 ５．百日咳抗原ＰＴおよびＦＨＡ（以下、Pa^*と称する）を含む請求項２に記 載のワクチン組成物。 ６．付加的にジフテリア（Ｄ）および破傷風（Ｔ）抗原（以下、DTPa^*と称す る）を含む請求項５に記載のワクチン組成物。 ７．付加的にＢ型肝炎感染に対する免疫性を付与する抗原を含む請求項５また は６に記載のワクチン組成物。 ８．付加的にHib感染に対する防御をもたらす抗原を含む請求項６または７に 記載のワクチン組成物。 ９．Hep B−DTPa^* Hep B−DTPa^*−Hib Hep B−DTPa^*−IPV Hep B−DTPa^*−IPV−Hib である請求項７または８に記載のワクチン組成物。 １０．付加的にＡ型肝炎感染に対する免疫性を付与する抗原を含む請求項９に 記載のワクチン組成物。 １１．処方に用いるアジュバントがリン酸アルミニウムを含む前記いずれかの 請求項に記載のワクチン組成物。