BR112020000999A2

BR112020000999A2 - composição imunogênica tendo estabilidade aperfeiçoada, imunogenicidade melhorada e reatogenicidade reduzida e processo para a sua preparação

Info

Publication number: BR112020000999A2
Application number: BR112020000999-7A
Authority: BR
Inventors: Rakesh Kumar; Inder Jit SHARMA; Anil Vyankatrao SHITOLE; Manohar DODDAPANENI; Hitt Jyoti SHARMA
Original assignee: Serum Institute Of India Pvt Ltd.
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2020-07-14
Also published as: US20200206331A1; PE20201443A1; PH12020500133A1; JOP20180069B1; AU2018302767A1; JP2020527571A; KR102657910B1; JOP20180069A1; EP3655024A1; US11179453B2; JP7404226B2; GEP20227386B; CO2020001765A2; UY37811A; MX2020000441A; WO2019016654A1; SG11202000224SA; EA202090316A1; TW201919690A; KR20200042470A

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo antígeno de Toxóide de difteria (D), antígeno de toxóide de tétano (T), Antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg), inativados antígeno B. pertussis de célula inteira (wP) inativado, conjugado de sacarídeo de Haemophilus influenzae tipo B (Hib) capsular a uma proteína veículo, antígeno de Vírus de pólio inativado (IPV) e adicionalmente um ou mais antígenos e o método de preparação da mesma. Uma vacina combinada totalmente líquida, que apresenta imunogenicidade aperfeiçoada, reatogenicidade reduzida e estabilidade aperfeiçoada. Métodos aperfeiçoados de inativação de formaldeído, perfil de adsorção aperfeiçoado de antígeno de Toxóide de difteria (D), antígeno de toxóide de tétano (T) e antígeno de superfície de Hepatite B (HepB) adsorvidos individualmente sobre auxiliar de fosfato de alumínio, mínimo teor total de alumínio (Al3+) e concentração otimizada de 2-fenoxietanol (2-PE) como preservativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "COMPO- SIÇÃO IMUNOGÊNICA TENDO ESTABILIDADE APERFEIÇOADA, IMUNOGENICIDADE MELHORADA E REATOGENICIDADE REDU- ZIDA E PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO".

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia, mais particularmente, refere-se a uma composição de vacina combi- nada compreendendo um grupo de antígenos/imunógenos e a método de preparação da mesma. A presente revelação ulteriormente refere-se a uma metodologia no campo de produção de vacina combinada.

ANTECEDENTES

[0002] Uma vacina combinada que pode prover imunogenicidade contra um grande número de doenças é sempre vantajosa em compa- ração com uma vacina monovalente uma vez que ela reduz o número de doses dadas, complicações reduzidas associadas a múltiplas inje- ções intramusculares, reduzem a administração e custos de produção, custos diminuídos de estoque, risco reduzido de vacinação atrasada ou perdida e melhora a concordância do paciente por redução do número de vacinações separadas. Além do mais, as preparações totalmente lí- quidas de vacina combinada têm vantagens distintas em comparação com aquelas que exigem reconstituição. Tempo de preparação médio demonstrou ser quase a metade para a vacina totalmente líquida em comparação com a vacina não totalmente líquida. No mesmo estudo, quase a totalidade do pessoal da saúde (97,6%) afirmou que preferiria o uso de vacina totalmente líquida em sua prática diária. (Ref: Soube- yrand B, e outros; Avaliação de tempo de preparação com vacinas he- xavalentes pediátricas não totalmente líquidas versus totalmente líqui- das. Um estudo de tempo e movimento; Vaccine 2015; 33:3976-82).

[0003] As vacinas combinadas atualmente conhecidas e disponí-

veis podem não conter formulações apropriadas de antígenos apropria- dos nas formas imunogênicas apropriadas para alcançar níveis de se- gurança, eficácia e imunogenicidade desejados na população humana suscetível para numerosas doenças em uma dose. O número de dife- rentes combinações de vacinas que pode ser criado com apenas pou- cos antígenos adicionais, é considerável. Por adição de 1 a 4 outros componentes de antígeno (por exemplo, HIB (líquido ou seco por con- gelamento) HBV, IPV, HAV) para qualquer um DTwP ou DTaP, há 44 combinações de vacinas que podem ser geradas. O número aumentaria para se milhares componentes individuais de diferentes fabricantes fos- sem considerados. Como toda a nova vacina combinada individual (le- vando em conta diferenças nos componentes de acordo com a fonte) deve ser desenvolvida separadamente para demonstrar segurança, es- tabilidade, compatibilidade e eficácia no desenvolvimento de todas es- sas vacinas se torna uma tarefa desafiante.

Antígenos da vacina combinada: Antígenos de Difteria e de Tétano

[0004] Difteria e tétano são infecções agudas causadas por Cornye- bacterium Diphtheriae e Clostridium tetani, respectivamente. Em ambos OS casos é uma potente exotoxina destas bactérias que é responsável pela doença clínica. As vacinas que fornecem proteção contra estas bactérias contêm estas toxinas que são quimicamente modificadas, por- tanto, não são mais tóxicas mas é ainda antigênica. Toxina de difteria e toxina de tétano são produzidas por desenvolvimento de Corynebacterium Diphtheriae e Clostridium tetani, em um meio contendo extrato bovino. As toxinas são inativadas usando-se o seguinte tratamento que incluem Ca- lor, UV, Formalina /Formaldeído, glutaraldeído, Acetiletilenoimina, etc. para a fabricação de toxóides [Toxóide de difteria (D) e Toxóide de tétano (T)]. Preocupações com relação a encefalopatia espongiforme bovina (BSE), encefalopatia espongiforme transmissível (TSE), doença de

Creutzfeldt - Jakob (doenças de CJD e de CJD variantes) podem surgir de componentes de animal usados no meio de crescimento contendo extrato bovino que espalha através da vacina. (Ref: WHO Guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies in relation to Biological e Pharmaceutical Products; 2003 & EMEA/CPMP/BWP/819/01; 24 de abril de 2001). Antígenos de Coqueluche

[0005] A introdução de vacinas de célula inteira constituídas de or- ganismos de Bordetella pertussis inativados quimicamente e por calor na década de 1940 foi responsável por uma redução dramática na inci- dência de coqueluche causada por B. pertussis.

[0006] Vacinas de DTP de célula inteira estão comumente associa- das a vários eventos adversos locais (por exemplo, eritema, inchaço, e dor no sítio de injeção), febre, e outros eventos sistêmicos moderados (por exemplo, sonolência, inquietação, e anorexia) (Ref: Cody CL, Ba- raff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; A natureza e a taxa de reações adversas associadas à imunização de DTP e DT em crianças. Paediatrics 1981; 68:650-60) & (Ref: Long SS, DeForest A, Pennridge Pediatric Associates, e outros, estudo longitudinal de reações adversas após a vacina de difteria-tétano-coqueluche na infância. Paediatrics 1990; 85:294-302). Eventos sistêmicos mais severos (por exemplo, con- vulsões ífcom ou sem febre) e episódios hiporresponsíveis hipotônicos) ocorrem menos frequentemente (razão de um caso para 1.750 doses administradas) entre crianças as quais receberam vacina de DTP de célula inteira (Ref: Cody CL, Baraff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; A natureza e a taxa de reações adversas associadas a imunização de DTP e DT em bebês e crianças. Paediatrics 1981; 68:650-60). Ence- falopatia aguda ocorre ainda mais raramente (razão de 0-10,5 casos para um milhão de doses administradas). Os especialistas concordam que a vacina de coqueluche de célula inteira causa dano cerebral dura- douro em alguns casos raros. (Ref: Institute of Medicine; DPT vaccine and chronic nervous system dysfunction, a new analysis; Washington D.C., National Academy Press, 1994).

[0007] Diversos relatórios citando uma relação entre vacinação com vacina de coqueluche de célula inteira, reatogenicidade e sérios efeitos colaterais levaram a um declínio na aceitação da vacina e uma conse- quente renovação da epidemia (Miller, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H., e Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization e se- rious acute neurological illness in children: Brit Med. J. 282: 1595-1599).

[0008] Reações adversas relacionadas a coqueluche de célula in- teira (wP) são um obstáculo para o seu uso mundial continuado e por- tanto vacinas de combinação à base de wP foram gradualmente substi- tuídas por vacinas de coqueluche de combinação de base acelular no mundo industrializado.

[0009] Mais recentemente, vacinas de coqueluche de componentes definidos foram desenvolvidas. Todas as vacinas de coqueluche líqui- das de base acelular hexavalentes (DTaP IPV PRP-T-HBsAg) têm sido reportadas previamente (EP1028750).

[0010] Infanrixê Hexa (GSK) é presentemente a única vacina de combinação pediátrica hexavalente globalmente contendo Salk IPV. Esse produto (DTaP3 -IPV-HBV//Hib) é vendido como uma seringa pre- viamente enchida do produto pentavalente co-embalado com um conju- gado liofilizado de PRP-antígeno T Hib em um frasco separado a ser reconstituído com o restante da vacina antes do uso.

[0011] Uma segunda vacina hexavalente, a HexyonO (também cha- mada Hexacima€ e HexaximO) é um produto hexavalente totalmente líquido da Sanofi Pasteur; no entanto ele está também com aP. Essa vacina está provavelmente visada para mercados privados na Europa e mundialmente. Uma outra vacina hexavalente, também com aP, que está sendo conjuntamente desenvolvida pela Merck e pela Sanofi Pas- teur, está atualmente em estudos clínicos da Fase III.

[0012] Uma vacina de combinação heptavalente está sendo desen- volvida pela Bharat Biotech International que consiste de DT, coquelu- che Acelular, Sabin IPV (DU tipo 1: 40, DU tipo 2:8, DU tipo 3 :32), Ro- tavírus de cepa simples inativado (cepa G9, isto é, cepa 116E), um con- jugado Haemophilus influenza PRP tipo b conjugado para TT e uma va- cina de Hepatite B Recombinante.

[0013] No entanto têm surgido preocupações a respeito da eficácia a longo prazo de vacinas de coqueluche acelulares (aP), especialmente em cenários de países em desenvolvimento. Recentes relatórios suge- rem que imunidade a coqueluche diminui na adolescência e que isso é responsável e por um aumento nos casos em bebês de menos de 6 meses de idade, antes de eles serem completamente vacinados. Eficá- cia de vacina foi estimada como sendo de 24% em indivíduos de 8 a 12 anos imunizados quando bebês com a aP. Um estudo observacional na Austrália também mostrou maiores taxas de casos entre adolescentes que receberam vacina aP quando bebês do que entre aqueles que re- ceberam vacina wP (risco relativo de 3,3, a um intervalo de confiança de 95 por cento de 2,4—4,5).

[0014] De uma perspectiva de custos, antígenos aP têm historica- mente excedido o custos de antígenos wP por um fator de 10 a 30 de- vido a diferenças de produção e custos de "royalties" e portanto consti- tuem um peso econômico para países em desenvolvimento. Como re- sultado disso, o custo de vacinas hexavalentes de base wP seria melhor adequado para o uso no setor público de países com baixos recursos.

[0015] Portanto, o uso de células Inteiras de coqueluche (wP) em vacinas hexavalentes destinadas a países em desenvolvimento tornou- se importante tanto devido ao custo quanto das preocupações que sur- gem a respeito da eficácia de longo prazo de vacinas aP, especialmente em cenários de países em desenvolvimento.

[0016] Em comparação com as melhores vacinas de célula inteira de coqueluche (wP), vacinas de aP não são eficazes nos programas de imunização em massa (Vickers e outros, 2006; Cherry 2012).

[0017] Estudos recentes de surtos nas populações altamente imu- nizadas mostraram que a duração de proteção de vacinas de aP é de- masiadamente curta (Klein e outros, 2012; Misegades e outros, 2012), resultando em uma diminuição na imunidade em crianças mais velhas e adolescentes, e um aumento correspondente nos casos neste grupo de idade (Skowronski e outros, 2002; Klein e outros, 2012). Isto é, em contraste com vacinas de wP, que provêem boa proteção nos anos de adolescência (Klein e outros, 2012). Como um resultados dessas defici- ências, nos países que mudaram para a vacina de aP na década de 1990 nós agora temos uma geração de crianças não apenas menos bem protegidas contra coqueluche mais as quais podem também ser menos suscetíveis a reforçadores, uma vez que a vacina com a qual uma criança recebe uma primeira dose ("is primed") pode determinar sua resposta imune a vacinação de reforçador tardia (Podda e outros, 1995; Mascart e outros, 2007; Sheridan e outros, 2012; Liko, Robison e Cieslak 2013; Smits e outros, 2013).

[0018] Um dos fatores mais importante que contribui para reatoge- nicidade de wP é presença de lipo-oligossacarídeo (LOS), a endotoxina oriunda da membrana externa bacteriana.

[0019] A inativação de toxinas nas vacinas de wP pode ser feita por vários métodos, mas nenhuma toxina instável a calor ativa seria detec- tável no produto final. O processo em massa de célula inteira de coque- luche (wP) para inativação de toxinas de wP praticado por muitos fabri- cantes usam tratamento por calor/ /formalina. Vários relatórios citam o uso de Timerosal para a inativação de wP. No entanto, uso de Timerosal causa perda de antígenoicidade de IPV (Vaccine 1994 Volume 12 No. 9

851 - 856. Efeito nocivo de timerosal sobre a potência de vacina de po- liovírus inativada), e portanto, no caso de uma vacina combinada con- tendo IPV, pode ser necessário apresentar em um frasco separado de wP contendo timerosal para reter sua potência durante um tempo ou mudança da fonte na inativação em massa de coqueluche. Alguns antí- genos, isto é, PT ativos podem também servir como modificadores de resposta imune, e diferenças significativas em respostas imune a vários antígenos entre diferentes vacinas foram observadas (WHO, 1993).

[0020] Estração química de LOS resultou em uma significativa dimi- nuição no teor de endotoxina (20%) e em um acentuado declínio na to- xicidade relacionada a endotoxina (até 97%), dependendo do teste usado in vitro ou in vivo. A extração de LOS não afetou a integridade do produto e, mais importante, não afetou a potência e/ou a estabilidade de DTP baixa. Além do mais, dificilmente quaisquer diferenças em res- postas a anticorpo e célula T foram observadas. (Ref: Waldely Oliveira Dias e outros; uma vacina de coqueluche de célula interira aperfeiçoada com teor reduzido def endotoxina; Human Vacinas & Immunotherapeu- tics 9:2, 339—348; February 2012) Antígenos de Hepatite B

[0021] Há várias cepas de vírus de Hepatite. A Hepatite B é uma doença causada pelo vírus de Hepatite B (HepB) que infecta o fígado de seres humanos, e causa uma inflamação chamada hepatite. A vacina contra a doença contém uma das proteínas de envelope virais, antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg). Vacinas que têm sido usadas para a imunização massa estão agora disponíveis, por exemplo, o produto Recombivax HBO e ComvaxO pela Merck, Engerix-BO e PediarixO& pela Glaxo SmithKline Biologicals. Vacina combinada tendo um componente de Hepatite B estava associada tanto aos resultados de conclusão quanto concordância mais altos em comparação com vacina de antí-

geno simples de HepB. (Ref: Kurosky, e outros; efeitos de vacina com- binadas sobre a concordância de vacina de Hepatite B em crianças nos Estados Unidos; The Pediatric Infectious Disease Journal. 36(7):e189— e 196, JUL 2017). Várias referências citam adsorção do antígeno de superfície da hepatite B sobre fosfato de alumínio em combinação com outros antígenos. O Componente de Hepatite B estaria substancial- mente livre de thiomerosal (método de preparação de HBsAg sem thio- mersal foi anteriormente publicado na EP1307473). Hexavac6 uma va- cina combinada que foi retirada do mercado devido a baixa imunogeni- cidade do componente de hepatite B. Há, portanto, uma necessidade de uma composição de vacina combinada compreendendo um antígeno de Hepatite B com uma imunogenicidade adequada ou melhorada. Antígenos de Haemophilus influenzae (Hib)

[0022] Haemophilus influenzae é um coccobacillus Gram-negativo que é uma parte normal da flora do trato respiratório superior. Hae- mophilus influenzae tipo b (Hib b) é uma causa principal de infecções invasivas transmitidas pelo sangue por meningite em crianças jovens e a principal causa de meningite nos primeiros 2 anos de vida. Imunização contra Haemophilus influenzae começou no Canadá em 1987 com uma vacina de polissacarídeo [polirribose ribitol fosfato (PRP)]. A cápsula de polirribosilribitol fosfato (PRP) de Hib é um principal fator de virulência para o organismo. Anticorpo para PRP é o principal contribuidor para a atividade bacteriana de soro, e níveis crescentes de anticorpo estão as- sociados ao risco decrescente de doença invasiva. PRP é um antígeno independente de célula T e, portanto, é caracterizado por a) indução de um resposta de anticorpo pobre em menos do que bebês e crianças de 18 meses de idade, b) uma resposta de anticorpo variável e quantitati- vamente menor do que aquela vista com os antígenos dependentes de célula T c) produção de uma proporção mais alta de imunoglobulina M (IgM), e d) incapacidade de induzir uma resposta de reforço.

[0023] As vacinas iniciais com base apenas no componente de PRP provaram ser ineficazes nos bebês. Outros esforços referem-se à vacina de conjugado de PRP, em que o PRP é conjugado a proteínas chama- das as proteínas veículo tal como proteína de membrana externa de Neisseria meningitides, Toxóide de difteria, Toxóide de tétano e CRM

197. A inclusão de componentes de conjugado de Hib e em vacinas combinadas estava associada a imunogenicidade de Hib reduzida. Além do mais, os conjugados de Hib são instáveis em meio aquoso e não podem sobreviver a armazenagem prolongada em sua forma. Por- tanto, o polissacarídeo de PRP de Haemophilus influenzae b (Hib) é fre- quentemente formulado como um sólido seco, que é reconstituído na hora do fornecimento com uma formulação líquida dos outros antígenos. Por exemplo, em InfanrixO hexa (WO 99/48525). Antígeno de Poliomielite

[0024] Espécies diferentes de vacina estão disponíveis: * Uma vacina de pólio oral com vírus vivo atenuado (enfra- quecida) (OPV) desenvolvida pelo Dr. Albert Sabin em 1961. OPV, com- preendendo as cepas de Sabin, são dadas oralmente.

* Uma vacina de pólio com vírus inativado (morto) (IPV) de- senvolvida em 1955 por Dr. Jonas Salk. IPV, compreendendo as cepas de Salk, são dadas como uma injeção.

* Recentemente, o vírus de pólio inativado de Sabin, que foi preparado por inativação das cepas de Sabin de vírus da pólio com for- malina, foi desenvolvido para injeção e também estava disponível em produtos comerciais.

[0025] Tanto vacina de vírus de pólio atenuado (OPV) quanto inati- vado (IPV) eram eficazes no controle da doença de pólio mundialmente. A vacina de pólio pode compreender cepas de Salk ou de Sabin.

[0026] Em 1955, Dr. Jonas Salk teve sucesso na inativação do vírus da pólio de tipo selvagem, assim permitindo-o em uma formulação de tipo injeção, e nomeou-o como a cepa de Salk, que inclui Mahoney tipo 1, MEF tipo 2, e Saukett tipo 3 que foram usados na vacina contra a doença de poliomielite. As cepas de Sabin incluem as cepas de Sabin 1 e de Sabin 2.

[0027] A dose padrão atualmente aceitável de vacinas de pólio con- tém unidades de antígeno 40 D de poliovírus inativado tipo 1 (Mahoney), unidades de antígeno 8 D de poliovírus inativado tipo 2 (MEF-I) e unida- des de antígeno 32 D de poliovírus inativado tipo 3 (Saukett) por exem- plo, Infanrix- hexa& (WO 99/48525).

[0028] IPV é atualmente disponível ou como uma formulação inde- pendente não auxiliar, ou em várias combinações, incluindo DT-IPV (com toxóide de difteria e toxóide de tétano) e vacinas hexavalente de IPV (adicionalmente com pertussis, Hepatite B, e Haemophilus influen- zae b) por exemplo, Infanrix& hexa (WO 99/48525).

[0029] No entanto, quando em comparação com OPV, o custo de produção geral para IPV é significativamente mais alto. Isto é principal- mente devido a exigências para: (i) mais vírus por dose; (ii) processa- mento a jusante adicional (isto é, concentração, purificação e inativa- ção), e a testagem de QG relacionada (iii) perda de antígeno ou recu- peração pobre em a jusante e iv) contenção. Até agora, o desafio finan- ceiro foi uma principal desvantagem para inovação e implementação de IPV em países de baixa e média renda.

[0030] A demanda global future para IPV após erradicação de poli- ovírus poderia aumentar do nível real de 80 milhões de doses a 450 milhões de doses por ano. Consequentemente, abordagens de "exten- são" fornecimentos de IPV devem provavelmente ser necessários.

[0031] Formulações de vacina eficazes de dose reduzida que pro- vêem proteção contra infecção usando-se uma dose mais baixa de an- tígeno IPV são desejáveis em situações onde o fornecimento de vacina convencional é insuficiente para satisfazer as necessidades globais ou onde o custo de fabricação da vacina convencional evita que a vacina seja vendida em um preço que seja acessível para países em desenvol- vimento. Também a exposição a dose mais baixa de IPV; em compara- ção com as formulações comercializadas existentes poderiam ser mais seguras. Assim várias estratégias para tornar IPV disponível a preços mais acessíveis necessitam ser avaliados. Consequentemente, uma va- cina combinada que compreende uma dose de IPV reduzido poderia torná-la mais barata e fácil de se administrar.

[0032] No caso de vacinas de influenza pandêmicas o uso de auxi- liares permitiu redução da dose, aumentou a disponibilidade e reduziu custo da vacina. Portanto, foi especulado que uma formulação de vacina auxiliar de IPV reduziria custo e também aumentaria o número de doses de IPV disponíveis mundialmente.

[0033] Além do mais, sais de alumínio foram considerados seguros, já estão sendo usados em vacinas combinadas contendo IPV, têm os mais baixos obstáculos no desenvolvimento e são baratos para fabrica- ção. No entanto, auxiliares de alumínio não são conhecidos para permi- tir redução de dose significativa. Os Antígenos

[0034] Os outros antígenos que poderiam ser incluídos na vacina combinada são Haemophilus influenzae (sorotipos a, c, d, e, fe as ce- pas encapsuladas), Hepatite (cepas A, C, D, E, F e G), meningite A, B ou C, Influenza, Pneumococci, Streptococci, antrax, dengue, malária, sarampo, caxumba, rubéola, BCG, Rubéola, Rotavírus, varíola, febre amarela, tifóide, Singles, Vírus da varicela, e outros.

[0035] A faixa e o tipo de antígenos usados em uma vacina combi- nada dependem da população alvo como sendo usada tais como bebês, crianças pequenas, crianças, adolescentes, e adultos. A vacina combi- nada conhecida anteriormente que poderia evitar infecção de Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium Diphtheriae, e opcional- mente poliovírus inativado (IPV), e/ou vírus da Hepatite B, e/ou infecção por Haemophilus influenzae tipo B são conhecidos (vide, por exemplo, WO 93/24148, WO 97/00697, WO 2000/030678, WO 2008/028956, US 6013264 & WO 2005089794).

[0036] Entretanto, uma vacina de múltiplas doses deve usar um pre- servativo para evitar contaminação por microorganismos. Para os pro- dutos de vacina combinados exportados para países menos desenvol- vidos pela UN, etc., vacinas de múltiplas doses contendo um preserva- tivo são preferidas, considerando os ambientes dos países onde as va- cinas devem ser usadas, métodos de distribuição, custos, etc. Exemplos do preservativo a ser usado em uns produtos de vacina podem conter timerosal, 2-PE, fenol, formaldeído, e doses convencionais dos preser- vativos são conhecidos na técnica.

[0037] Os Inventores verificaram que a imunogenicidade, reatoge- nicidade, estabilidade e a manutenção da forma certa dos antígenos em uma composição de vacina combinada dependem do meio que a com- posição foi formulada que incluem o processo de tornar antígenos indi- viduais, sequência de adição dos antígenos, o uso dos auxiliares espe- cífico sem uma quantidade específica para certos antígenos, adsorção individual ou adsorção combinada de antígenos sobre auxiliares. Grau de adsorção de antígeno sobre auxiliares, teor total de alúmen, concen- tração e tipo de preservativo usados, o uso de vários parâmetros inclu- indo agitação, temperatura e pH.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0038] É revelada uma composição de vacina combinda estável, li- quida que mostra imunogenicidade aperfeiçoada e reatogenicidade re- duzida e processo de sua produção .

[0039] A presente revelação refere-se a uma composição de vacina combinada compreendendo de-

a) Um Toxóide de difteria (D) & um toxóide de tétano (T) al- tamente purificados produzidos usando-se um meio semi-sintético e subsequentemente desintoxicado.

b) Componente de B. pertussis (wP) de célula inteira inati- vado preparado usando-se uma combinação de inativação por via qui- mica e por calor, cepas de Bordetella pertussis específicas em uma ra- zão particular que resulta na reatogenicidade reduzida e potência au- mentada.

c) Antígeno de polissacarídeo capsular (PRP) de Haemophi- lus influenzae tipo B (Hib) conjugado a uma proteína veículo (CP) d) IPV de Sabin ou Salk de dose padrão ou de dose reduzida (Vírus de pólio inativado) preparado por utilização de métodos aperfei- çoados de inativação de formaldeído e pode ulteriormente ser adsorvido sobre hidróxido de alumínio.

e) Ótimo perfil de adsorção de antígeno(s) tal que antígeno de superfície de Hepatite B (HepB) é adsorvido individualmente sobre auxiliar de fosfato de alumínio, antígenos D e T são individualmente ad- sorvidos sobre auxiliar de fosfato de alumínio desse modo resultando na imunogenicidade melhorada f) Teor de alúmen mínimo desse modo garantindo reatogeni- cidade reduzida g) Ótima concentração de 2-fenoxietanol (2-PE) como pre- servativo.

OBJETIVOS

[0040] Alguns dos objetivos da presente revelação, que pelo menos uma concretização aqui satisfaz, são como se segue:

[0041] Um objetivo da presente revelação é para melhorar um ou mais problemas da técnica anterior ou para pelo menos prover uma al- ternativa útil.

[0042] Um outro objetivo da presente revelação é prover uma com- posição/formulação de vacina combinada, menos reatogênica e mais imunogênica, estável, líquida adequada para a prevenção e tratamento de mais do que um estado de doença e satisfaz o critério para a sero- proteção para cada um dos ditos componentes imunogênicos.

[0043] Ainda um outro objetivo da presente revelação é prover um método para a fabricação de tal composição/formulação de uma vacina combinada.

[0044] Outros objetivos e vantagens da presente revelação estarão mais evidentes a partir da seguinte descrição, pretende-se não limitar o escopo da presente revelação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0045] De acordo com uma primeira concretização da presente re- velação, uma composição de vacina combinada consiste de um grupo de antígenos/imunógenos selecionados mas não limitados a Toxóide de difteria (D), Toxóide de tétano (T), B. pertussis de célula inteira (wP), conjugado de PRP-CP - Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , Hepatite B (HepB), vírus de pólio inativado (IPV) e adicionalmente consiste de auxiliar à base de alumínio & preservativos.

[0046] De acordo com uma segunda concretização da presente re- velação, uma composição de vacina combinada poderia ulteriormente compreender um ou mais antígenos selecionados do grupo que consiste de, mas não se limita a, antígeno(s) de Haemophilus influenzae (soroti- pos a, c, d, e, fe as cepas encapsuladas), Hepatite (cepas de A, C, D, E, F e G), meningite A, B, C, Y, W-135, ou X, Influenza, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, antígeno de coqueluche acelular, adenilato ci- clase modificado, Antígeno de Malária (RTS,S), Pneumococci, Strepto- cocci, anthrax, dengue, malária, sarampo, caxumba, rubéola, BCG, pa- piloma vírus humano, Rubéola, Dengue, Zika, Ebola, Chikungunya, Ro-

tavirus, varíola, febre amarela, Flavivirus, Shingles, Vírus da varicela an- tígenos respectivamente.

[0047] De acordo com uma terceira concretização da presente re- velação, as cepas de IPV usadas em uma composição de vacina com- binada constituem de cepas de Sabin inativadas selecionadas do grupo de tipo 1, tipo 2, e tipo 3 ou cepas de Salk inativadas selecionadas do grupo de Mahoney tipo 1, MEF tipo 2 e Saukett tipo 3.

[0048] Em um dos aspectos da terceira concretização, vírus da pólio pode ser desenvolvido pelo seguinte método: * Linha de células de CCL81-VERO (rim de macaco) foi usada como células hospedeiras para o desenvolvimento dos vírus da pólio, isto é, cepas de sabin e de salk.

* Depois da infecção das células hospedeiras com cepas desejadas de vírus da pólio e incubação de 72 horas, o meio contendo o fragmento de célula e vírus foi combinado e foi coletado em um único recipiente.

e Ofiltrado foi submetido a filtração de fluxo tangencial como pacote de 100 KDa; diafiltrado usando-se fosfato tampão e purificado usando-se cromatografia de troca de ânions.

* Antes da administração a pacientes, os vírus devem ser inativados usando-se métodos de inativação apropriados.

[0049] No entanto, os presentes inventores surpreendentemente verificaram que a alta perda de percentagem de inativação de pós- for- maldeído de antígeno D poderia ser devido a presença de tampão de fosfato que inexplicavelmente causa agregação indesejada de partícu- las de vírus da pólio.

[0050] Portanto, um aspecto importante da presente revelação com- preende de, um processo aperfeiçoado de inativação de formalina com- preendendo das seguintes etapas: a) A combinação de vírus purificada foi submetida a troca de tampões de Tampão de fosfato em Tampão de Tris na faixa de (de 30 a 50 mM) tendo pH entre 7 a 7,5, b) À mistura acima de meio de M-199 contendo glicina (5 gm/1) foi adicionada, c) 0,025% de formaldeído foi adicionado e subsequente- mente foi misturado, d) A mistura foi subsequentemente incubada a 37ºC por 5 a 13 dias com agitação contínua da parte principal do vírus no agitador magnético, e) A mistura pós-incubação foi submetida ao sistema de TFF intermediário (100 KDa, 0,1 m?) no dia 7 e filtração final depois da inati- vação f) Subsequentemente a parte principal filtrada foi armaze- nada a 2-8ºC, g) Realização de D-Ag ELISA para a determinação de uni- dade de D-Ag .

[0051] De acordo com uma quarta concretização da presente reve- lação, as cepas de IPV usadas em uma composição de vacina combi- nada compreende de cepas de Sabin inativadas de dose reduzida sele- cionadas do grupo de tipo 1, tipo 2, e tipo 3 ou cepas de Salk inativadas selecionadas do grupo de Mahoney tipo 1, MEF tipo 2 e Saukett tipo 3.

[0052] De acordo com uma quinta concretização da presente reve- lação, o IPV (cepas de Sabin & Salk) não é adsorvido em qualquer au- xiliar (por exemplo, antes da misturação com outros componentes se presentes).

[0053] De acordo com uma sexta concretização da presente reve- lação, o(s) componente(s) IPV (cepas de Sabin & Salk) pode(m) ser ad- sorvido(s em um auxiliar selecionado do grupo de sal de alumínio (Al3+) tal como hidróxido de alumínio (AI(OH)3) ou fosfato de alumínio (AIPO3,),

alúmen, fosfato de cálcio, MPLA, 3D-MPL, QS21, um auxiliar de oligo- desoxinucleotídeo contendo CpG, lipossoma, ou emulsão de óleo-em- água ou uma sua combinação. (por exemplo, antes ou depois da mistu- ração com outros componentes se presentes). Se adsorvidos, um ou mais componentes de IPV podem ser adsorvidos separadamente ou juntos como uma mistura em hidróxido de alúmen.

[0054] O(s) componente(s) de IPV (Cepas Sabin & Salk) pode(m) ser adsorvido(s) sobre um sal de alumínio pelo seguinte procedimento: * Tomando o volume desejado de AI(OH)3 submetido a au- toclave para conseguir a concentração de Alúmen (Al+++) entre 0,1 a 0,8 mg/dose em um recipiente de 50 ml * Adição de parte principal de IPV com unidade de D-Ag ajustada e completando para o volume com diluente (10x M-199+ 0,5% de glicina), * Ajuste do pH da formulação final e obtenção da formula- ção final com pH entre 6 e 6,8.

[0055] Em um dos aspectos da sexta concretização, adsorção de IPV inativado com formalina pode ser feita em alúmen (AlIº?*) tendo con- centração selecionada de 0,1 mg/dose, 0,2 mg/dose, 0,3 mg/dose, 0,4 mg/dose, 0,5 mg/dose, 0,6 mg/dose, 0,7 mg/dose e 0,8 mg/dose, de preferência entre 0,1 mg/dose a 1,25 mg/dose por sorotipo e a um pH selecionado de 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7 e 6,8 de preferência 6,5.

[0056] Em ainda um outro aspecto da sexta concretização, a per- centagem de recuperação de inativação pós- formalina de D-antígeno na presença de Tris poderia ser ou 50%, 60%,70% ou 80% e percenta- gem de adsorção após adsorção de hidróxido de alumínio poderia estar entre 70% a 80%,80% a 90% ou 90% a 99% ou 95% a 99%.

[0057] De acordo com uma sétima concretização da presente reve- lação, toxina de Difteria (exotoxina) e toxina de tétano (exotoxina) foram obtidas a partir de Corynebacterium Diphtheria e Clostridium tetani res- pectivamente e subsequentemente e desintoxicado usando-se um mé- todo de inativação adequado. O Toxóide de difteria (D) e o Toxóide de tétano (T) assim obtidos foram ulteriormente purificados usando-se Cro- matografia de filtração de gel. O DT purificado assim obtido foi usado para a formulação de vacina combinada.

[0058] Em um dos aspectos da sétima concretização, toxina de Dif- teria é produzida por desenvolvimento de Corynebacterium Diphtheriae em um meio semi-sintético que consiste dos seguintes ingredientes a ótimas concentrações em qualquer uma das seguintes combinações: Combinação 1:

[0059] Hidrolisado de caseína, Monoidrato de maltose, Ácido acé- tico glacial, Lactato de sódio, Sulfato de magnésio, &-alanina, Ácido pi- mélico, Ácido nicotínico, Sulfato cúprico, Sulfato de zinco, Cloreto de manganês, L — Cistina, Diidrato de cloreto de cálcio, Ortofosfato de dii- drogênio de potássio, Di Fosfato de hidrogênio de potássio, Sulfato fer- roso e WFI. Combinação 2:

[0060] Hidrolisado de caseína, Monoidrato de maltose, Ácido acé- tico glacial, Lactato de sódio, Sulfato de magnésio, B-alanina, Ácido pi- mMélico, Ácido nicotínico, Cloreto de manganês, L — Cistina, Diidrato de cloreto de cálcio, Ortofosfato de diidrogênio de potássio, Di Fosfato de hidrogênio de potássio, Sulfato ferroso e WFI. Combinação 3:

[0061] Hidrolisado de caseína, Monoidrato de maltose, Ácido acé- tico glacial, Lactato de sódio, B-alanina, Ácido pimélico, Ácido nicotínico, Sulfato cúprico, Sulfato de zinco, Cloreto de manganês, L — Cistina, Dii- drato de cloreto de cálcio, Ortofosfato de diidrogênio de potássio, Di Fosfato de hidrogênio de potássio, e WFI. Combinação 4:

[0062] Extrato de levedura, Monoidrato de maltose, Ácido acético glacial, Lactato de sódio, Sulfato de magnésio, RB-alanina, Ácido pimé- lico, Ácido nicotínico, Sulfato cúprico, Sulfato de zinco, Cloreto de man- ganês, L — Cistina, Diidrato de cloreto de cálcio, Ortofosfato de diidrogê- nio de potássio, Di Fosfato de hidrogênio de potássio, Sulfato ferroso e WFI.

[0063] De acordo com um segundo aspecto da sétima concretiza- ção, Toxina de tétano é produzida por desenvolvimento de Clostridium tetanus em um meio semi-sintético que consiste dos seguintes ingredi- entes em ótimas concentrações em qualquer uma das seguintes com- binações: Combinação 1:

[0064] Digesto de caseína, Cloreto de cálcio, Di Fosfato de hidrogê- nio e potássio, Dextrose anidra, Cloreto de sódio, Sulfato de magnésio, Riboflavina, Cloridrato de tiamina, Cloridrato de piridoxina, Pantotenato de cálcio, Ácido nicotínico, L- Cistina, Cloreto férrico, solução de Vita- mina B12, Biotina, HCl Conc., NaOH, Etanol Absoluto e WFI Combinação 2:

[0065] Digesto de caseína, Cloreto de cálcio, R&-alanina, Di Fosfato de hidrogênio e potássio, Dextrose anidra, Cloreto de sódio, Sulfato de magnésio, Sulfato ferroso, Riboflavina, Cloridrato de tiamina, Cloridrato de piridoxina, Pantotenato de cálcio, Ácido nicotínico, L- Cistina, Cloreto férrico, solução de Vitamina B12, Biotin, Conc. HCl, NaOH, Etanol Ab- soluto, e WFI Combination 3:

[0066] Digesto de caseína, Cloreto de cálcio, Di Fosfato de hidrogê- nio de potássio, Dextrose anidra, Cloreto de sódio, Sulfato de zinco, Ri- boflavina, Cloridrato de tiamina, Cloridrato de piridoxina, Pantotenato de cálcio, Ácido nicotínico, L- Cistina, Cloreto férrico, solução de Vitamina B12, Biotina, HCl Conc, NaOH, Etanol absoluto, e WFI

Combinação 4:

[0067] Hidrolisado de caseína, Cloreto de cálcio, Di Fosfato de hi- drogênio e potássio, Dextrose anidra, Cloreto de sódio, Sulfato de mag- nésio, Cloreto de manganês Riboflavina, Cloridrato de tiamina, Clori- drato de piridoxina, Pantotenato de cálcio, Ácido nicotínico, L- Cistina, Cloreto férrico, solução de Vitamina B12, Biotina, HCl Conc., NaOH, Etanol absoluto, e WFI

[0068] Em ainda um outro aspecto da sétima concretização, a to- xina de difteria e toxina de tétano foram desintoxicada sando um ou uma combinação dos seguintes métodos de inativação que incluem Calor, UV, Formalina /Formaldeído, Acetiletilenoimina, etc.

[0069] De acordo com uma oitava concretização da presente reve- lação, o antígeno de Hepatite (Hep) usado em uma composição de va- cina combinada compreende de antígenos de Hep derivados da super- fície da cepa de Hepatite B (HBsAg).

[0070] Em um dos aspectos da nona concretização, HBsAg pode ser feita por um dos seguintes métodos: * Por purificação do antígeno em forma em partículas do plasma de veículos de hepatite B crônicos, uma vez que grandes quan- tidades de HBsAg são sintetizados no fígado e são liberados para dentro da corrente sanguínea durante a infecção por HBV * Expressão da proteína por métodos de DNA recombinan- tes.

[0071] De acordo com uma nona concretização da presente revela- ção, Toxóide de difteria (D), Toxóide de tétano (T) e Antígeno de super- fície de hepatite B (HBsAg) são individualmente adsorvidos no auxiliar selecionados do grupo de sal de alumínio (Al3+) tal como hidróxido de alumínio (AI(OH)3) ou fosfato de alumínio (AIPO4), alúmen, fosfato de cálcio, MPLA, 3D-MPL, QS21, um auxiliar de oligodesoxinucleotídeo contendo CpG, lipossoma, ou emulsão de óleo-em-água ou uma sua combinação.

[0072] Ainda de preferência Toxóide de difteria (D), Toxóide de té- tano (T) e Antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg) são individual- mente adsorvidos em fosfato de alumínio.

[0073] Em um dos aspectos da nona concretização, o antígeno de Toxóide de difteria (D) adsorvido em fosfato de alumínio tendo percen- tagem de adsorção de pelo menos 50%.

[0074] Em um outro aspecto da nona concretização, o antígeno de toxóide de tétano (T) adsorvido em fosfato de alumínio tendo percenta- gem de adsorção de pelo menos 40%.

[0075] Em ainda um outro aspecto da nona concretização, o Antí- geno de superfície de hepatite B (HBsAg) adsorvido em fosfato de alu- mínio tendo percentagem de adsorção de pelo menos 70%.

[0076] De acordo com uma décima concretização da presente re- velação, o antígeno Hib usado na vacina combinada da presente reve- lação é derivado do polissacarídeo capsular de cepa de Hib b 760705.

[0077] De acordo com um aspecto da décima concretização, o an- tígeno Hib b PRP é conjugado a uma proteína veículo selecionada do grupo de proteína veículo de mas não limitada a CRM197, Toxóide de difteria, complexo de membrana externa de Neisseria meningitidis, fra- gmento C de toxóide de tétano, toxóide de coqueluche, proteína D de H. influenzae, E. coli LT, E. coli ST, e exotoxina A oriunda de Pseudo- monas aeruginosa, complexo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, pneumolisina, proteína A de super- fície pneumocócica (PspA), adesina A de superfície pneumocócica (PsaA), PhtD pneumocócica, proteínas de superfície phneumocócicas BVH-3 e BVH-11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema desintoxicado (EF) e fator letal (LF) de Bacillus anthracis, oval- bumina, hemocianina de lapa "keyhole" (KLH), albumina de soro hu- mano, albumina de soro bovino (BSA) e derivado de proteína purificado de tuberculina (PPD), peptídeos sintéticos, proteínas de choque tér- mico, proteínas de coqueluche, citocinas, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos de célula de CD4+ T de ser humano de vários antígenos derivados de patógeno tal como N 19, proteínas de absorção de ferro, toxina A ou B oriunda de C. difficile e proteínas de S. agalactiae.

[0078] Ainda de preferência o Hib b PRP é conjugado a toxóide de tétano (TT), por química de CNBr, química de aminação redutora, qui- mica de cianilação ou qualquer outra química já revelada em Kniskern e outros, "Conjugation: design, chemistry, e analysis" in Ellis e outros, Development e clinical uses of Haemophilus b conjugate vacinas. New York: Marcel Dekker, 1994: 37-69

[0079] De acordo com um segundo aspecto da décima concretiza- ção, a proteína veículo está presente tanto na forma livre quanto na forma conjugada em uma composição da presente revelação, a forma não conjugada é de preferência não mais do que 20% da quantidade total da proteína veículo na composição como um todo, e mais de pre- ferência presente em menos do que 5% em peso.

[0080] De acordo com terceiro aspecto da décima concretização, o antígeno Hib não é substancialmente adsorvido em qualquer auxiliar.

[0081] De acordo com quarto aspecto da décima concretização, o antígeno Hib pode não ser submetida a adsorção deliberada ou intenci- onal em qualquer auxiliar.

[0082] De acordo com uma décima primeira concretização da pre- sente revelação, preparação de antígeno de coqueluche de célula in- teira (wP) usada em uma composição de vacina combinada da presente revelação é de preferência feita a partir de cepas de Bordetella pertussis 134, 509, 25525 e 6229 misturadas em uma razão específica e subse- quentemente inativadas por utilização de métodos aperfeiçoados de inativação destituído de timerosal, portanto, levando a reatogenicidade reduzida & potência aumentada e pode ou pode não ser absorvida em auxiliares à base de alumínio.

[0083] De acordo com um aspecto décima primeira concretização, preparação de antígeno de coqueluche de célula inteira (wP) usado em uma composição de vacina combinada da presente revelação é de pre- ferência feita a partir de cepas de Bordetella pertussis 134, 509, 25525 e 6229 misturadas em uma razão de 1:1:0,25:0,25.

[0084] De acordo com segundo aspecto da décima primeira concre- tização, preparação de antígeno de coqueluche de célula inteira (wP) usada em uma composição de vacina combinada foi inativada usando- se um ou mais dos seguintes tratamentos com inativação que incluem Calor, UV, Formalina /Formaldeído, Acetiletilenoimina, etc.

[0085] Ainda de preferência a preparação de antígeno de coquelu- che de célula inteira (wP) usada em uma composição de vacina combi- nada foi inativada usando-se uma combinação de tratamento térmico e químico. Ainda de preferência calor inativado a 56+2ºC, de 10 a 15 mins na presença de formaldeído em que a parte principal ("bulk") de wP per- manece não amontoada e facilmente homogeneizada desse modo le- vando a reatogenicidade reduzida e dando melhor potência de wP por uma duração mais longa.

[0086] De acordo com um terceiro aspecto da décima primeira con- cretização, preparação de antígeno de coqueluche de célula inteira (wP) usada em uma composição de vacina combinada pode ou pode não ser adsorvida em um auxiliar à base de alumínio tal como hidróxido de alu- mínio, fosfato de alumínio ou sua combinação (por exemplo, antes ou depois da misturação com outros componentes se presentes). Se ad- sorvidas, uma ou mais cepas de wP (isto é, 134, 509, 25525 e 6229) pode ser adsorvidas separadamente ou juntas como uma mistura.

[0087] De acordo com uma décima segunda concretização da pre- sente revelação, Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade na faixa de 1-40 Lf; Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade na faixa de 4-25 Lf; wP está em uma quantidade na faixa de 4-30 IOU por 0,5 ml; conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade na faixa de 1 — 20 ug de teor de PRP por 0,5 ml; antígeno HBsAg está em uma quantidade na faixa de 1 - 20 ug por 0,5 ml; Sabin IPV que inclui tipo 1, tipo 2, e tipo 3, em que tipo 1 está contido em uma quantidade de 1-50 DU/0,5 ml, tipo 2 está contido em uma quantidade de 1 - 20 DU/0,5 ml, e tipo 3 está contido em uma quantidade de 1 - 50 DU/0,5 ml e adi- cionalmente compreende de auxiliar à base de alumínio & preservativos na composição/formulação de vacina combinada final.

[0088] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 25 Lf na composição de vacina combinada final.

[0089] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 20 Lf na composição de vacina combinada final.

[0090] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0091] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0092] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 4 Lf na composição de vacina combinada final.

[0093] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 2 Lf na composição de vacina combinada final.

[0094] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 16 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0095] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 14 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0096] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0.5 ml na composição de vacina combinada final.

[0097] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 13 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0098] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 10 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0099] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 8 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0100] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 15 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0101] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 10 ug por 0,5 m! na composição de vacina combinada final.

[0102] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 8 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0103] Ainda de preferência a vacina de pólio de Sabin inativada (sIPV) que inclui cepas tipo 1, tipo 2, e tipo 3 estão presentes em uma quantidade de cerca de 40 DU, 8 DU e 32 DU, respectivamente por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0104] De acordo com uma décima terceira concretização da pre- sente revelação, Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade na faixa de 1-40 Lf; Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade na faixa de 4-25 Lf; wP está em uma quantidade na faixa de 4-30 IOU por 0,5 ml; conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade na faixa de 1 — 20 ug de teor de PRP por 0,5 ml; antígeno HBsAg está em uma quantidade na faixa de 1 - 20 ug por 0,5 ml; vírus de pólio de Salk inativado (IPV), que inclui Mahoney tipo 1, MEF Tipo 2 e as cepas de Saukett tipo 3, em que Mahoney tipo 1 está contido em uma quantidade de 1 - 50 DU/0,5 ml, MEF Tipo 2 está contido em uma quantidade de 1 - 20 DU/0,5 ml e Saukett tipo 3 está contido em uma quantidade de 1 - 50 DU/0,5 ml e adicionalmente compreende de auxiliar à base de alu- mínio & preservativos na composição/formulação de vacina combinada final.

[0105] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 25 Lf na composição de vacina combinada final.

[0106] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 20 Lf na composição de vacina combinada final.

[0107] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0108] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0109] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 4 Lf na composição de vacina combinada final.

[0110] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 2 Lf na composição de vacina combinada final.

[0111] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 16 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0112] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 14 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0113] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0114] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 13 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0115] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 10 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0116] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 8 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0117] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 15 ug por 0,5 m! na composição de vacina combinada final.

[0118] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 10 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0119] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 8 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0120] Ainda de preferência a vacina de pólio de Salk inativada que inclui Mahoney tipo 1, MEF Tipo 2 e as cepas de Saukett tipo 3 estão presentes em uma quantidade de cerca de 40 DU, 8 DU e 32 DU, res- pectivamente por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0121] De acordo com uma décima quarta concretização da pre- sente revelação, Toxóide de difteria está em uma quantidade na faixa de 1-40 Lf; Toxóide de tétano está em uma quantidade na faixa de 4-25 Lf; wP está em uma quantidade na faixa de 4-30 IOU por 0,5 ml; conju- gado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade na faixa de 1 — 20 ug de teor de PRP por 0,5 ml; Heo antígeno está em uma quanti- dade na faixa de 1 - 20 ug por 0,5 ml; vacina de pólio de Sabin inativada (sIPV) de dose reduzida usada em uma composição de vacina combi- nada, que inclui tipo 1, tipo 2, e tipo 3, em que tipo 1 está contida em uma quantidade de 2,5 — 10 DU/0,5 ml, tipo 2 está contida em uma quantidade de 5 - 20 DU/0,5 ml, e tipo 3 está contida em uma quantidade de 1 - 20 DU/0,5 ml e adicionalmente compreende de auxiliar à base de alumínio & preservativos na composição/formulação de vacina combi- nada final.

[0122] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 25 Lf na composição de vacina combinada final.

[0123] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 20 Lf na composição de vacina combinada final.

[0124] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0125] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0126] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 4 Lf na composição de vacina combinada final.

[0127] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 2 Lf na composição de vacina combinada final.

[0128] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 16 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0129] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 14 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0130] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0131] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 13 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0132] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 10 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0133] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 8 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0134] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 15 ug por 0,5 m! na composição de vacina combinada final.

[0135] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 10 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0136] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 8 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0137] Ainda de preferência a vacina de pólio de Sabin inativada (SIPV) de dose reduzida que inclui cepas tipo 1, tipo 2, e tipo 3 estão presentes em uma quantidade de cerca de 5 DU, 16 DU e 10 DU, res- pectivamente por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0138] De acordo com uma décima quinta concretização da pre- sente revelação, Toxóide de difteria está em uma quantidade na faixa de 1-40 Lf; Toxóide de tétano está em uma quantidade na faixa de 4-25 Lf; wP está em uma quantidade na faixa de 4-30 IOU por 0,5 ml; conju- gado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade na faixa de 1 — 20 ug de teor de PRP por 0,5 ml; Heo antígeno está em uma quanti- dade na faixa de 1 - 20 ug por 0,5 ml; vacina de pólio de Salk inativada de dose reduzida, que inclui Mahoney tipo 1, MEF Tipo 2 e as cepas de Saukett tipo 3, em que Mahoney tipo 1 está contido em uma quantidade de 5- 15 DU/0,5 ml, MEF Tipo 2 está contido em uma quantidade de 1 - 18 DU/0,5 ml e Saukett tipo 3 está contido em uma quantidade de 5 - DU/0,5 ml e adicionalmente compreende de auxiliar à base de alu- mínio & preservativos na composição/formulação de vacina combinada final.

[0139] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 25 Lf na composição de vacina combinada final.

[0140] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 20 Lf na composição de vacina combinada final.

[0141] Ainda de preferência o Toxóide de difteria (D) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0142] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 10 Lf na composição de vacina combinada final.

[0143] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 4 Lf na composição de vacina combinada final.

[0144] Ainda de preferência o Toxóide de tétano (T) está em uma quantidade de cerca de 2 Lf na composição de vacina combinada final.

[0145] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 16 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0146] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 14 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0147] Ainda de preferência o wP está em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0148] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 13 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0149] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 10 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0150] Ainda de preferência o conjugado de H. Influenzae B PRP-TT está em uma quantidade de cerca de 8 ug de teor de PRP por 0,5 ml.

[0151] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 15 ug por 0,5 m! na composição de vacina combinada final.

[0152] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 10 ug por 0,5 m! na composição de vacina combinada final.

[0153] Ainda de preferência o antígeno HBsAg está em uma quan- tidade de cerca de 8 ug por 0,5 ml! na composição de vacina combinada final.

[0154] Ainda de preferência a vacina de pólio de Salk inativada de dose reduzida que inclui Mahoney tipo 1, MEF Tipo 2 e as cepas de Saukett tipo 3 estão presentes em uma quantidade de cerca de 10 DU, 2 DU e 10 DU, respectivamente por 0,5 ml na composição de vacina combinada final.

[0155] De acordo com uma décima sexta concretização da presente revelação, um ou mais antígenos da composição de vacina combinada final podem não ser substancialmente adsorvidos em qualquer auxiliar.

[0156] De acordo com uma décima sétima concretização da pre- sente revelação, a composição compreende um ou mais auxiliares se- lecionados do grupo de sal de alumínio (Al3+) tal como hidróxido de alumínio (AI(OH)3) ou fosfato de alumínio (AIPO4), alúmen, fosfato de cálcio, MPLA, 3D-MPL, QS21, um auxiliar de oligodesoxinucleotídeo contendo CpG, lipossoma, ou emulsão de óleo-em-água.

[0157] Ainda de preferência a composição compreende fosfato de alumínio (AIPO4) como um auxiliar.

[0158] Em um dos aspectos da décima sétima concretização, antí- genos da formulação final podem ser adsorvidos em gel de fosfato de alumínio in situ ou pronto feito de gel de fosfato de alumínio ou uma sua combinação.

[0159] Em um dos aspectos preferidos da décima sétima concreti- zação, a composição da presente revelação pode conter o auxiliar em uma quantidade de 2,5 mg/0,5 ml ou menos, e especificamente, em uma quantidade de 1,5 mg/0,5 ml a 0,1 mg/0,5 ml.

[0160] Em ainda um outro aspecto preferido da décima sétima con- cretização, o teor de alumínio (Al+3) na composição/formulação de va- cina combinada final pode não ser mais do que 1,25 mg por 0,5 ml, de preferência 1 mg por 0,5 ml e mais de preferência em uma quantidade de 0,1 mg por 0,5 ml a 0,63 mg por 0,5 ml.

[0161] De acordo com uma décima oitava concretização da pre- sente revelação, uma composição/formulação de vacina combinada pode compreender preservativo selecionado do grupo que consiste de 2-fenoxietanol, cloreto de Benzetônio (Phemerol), Fenol, Thiomersal, Formaldeído, metil e propil parabenos, ou álcool benzílico ou uma sua combinação.

[0162] Ainda de preferência uma composição/formulação de vacina combinada pode compreender de 2- fenoxietanol (2-POE) como preser- vativo.

[0163] De acordo com um outro aspecto da invenção a quantidade de 2 - fenoxietanol na vacina combinada da invenção pode não ser mais do que de preferência 3,5 mg/0,5 ml; mais de preferência 3,0 mg/0,5 ml; e com mais preferência 2,5 mg/0,5 ml.

[0164] De acordo com uma décima nona concretização da presente revelação, uma composição/formulação de vacina combinada da pre- sente revelação pode conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis selecionados do grupo que consiste de açúcares e polióis, tensoativos, polímeros, sais, amino ácidos, modificadores de pH (ajustar o pH da composição de vacina) etc. Exemplos dos açúcares e polióis a serem usados pode incluir sucrose, trealose, lactose, maltose, galactose, ma- nitol, sorbitol, glicerol, etc. Exemplos dos tensoativos podem incluir ten- soativos não iônicos tais como como polysorbate 20, polysorbate 80, etc. Exemplos dos polímeros podem incluir dextrano, carboximetilcelu- lose, ácido hialurônico, ciclodextrina, etc. Exemplos dos sais podem in- cluir NaCl, MgC12, KCI, CaC12, etc. Exemplos dos amino ácidos podem incluir Arginina, glicina, Histidina, etc. Exemplos dos modificadores de PH podem incluir hidróxido de sódio, ácido clorídrico, etc.

[0165] De acordo com uma vigésima concretização da presente re- velação, a dita vacina combinada pode ser uma formulação liofilizada ou líquida, de preferência formulação líquida.

[0166] De acordo com uma vigésima primeira concretização da pre- sente revelação, a dita vacina combinada pode ser estável a 2-8 deg C de 12 a 36 meses; a 25 deg C de 2 a 6 meses; a 37 deg C de 1 semana a 4 semanas, tendo pH final na faixa de pH de 6,0 a pH 7,0; mais de preferência na faixa de pH 6,2 a pH 6,8; e com mais preferência na faixa de pH 6,3 a pH 6,7.

[0167] De acordo com uma vigésima segunda concretização da pre- sente revelação, o requente verificou que uma vacina multivalente está- vel com imunogenicidade aperfeiçoada e reatogenicidade reduzida pode ser obtida quando vacina é fabricada pelo processo revelado abaixo levando em consideração i) processo de produção de antígenos individuais ii)sequência de adição de o antígenos iii) o uso dos auxiliares específico sem uma quantidade específica para certos antígenos, iv)

adsorção individual ou adsorção combinada de antígenos sobre auxilia- res v) Grau de adsorção de antígeno sobre auxiliares vi) usando-se con- centração de Alúmen mínima vii) usando-se ótima concentração e tipo de preservativo e viii) uso de vários parâmetros incluindo agitação, tem- peratura e pH. Fonte biológica de cepas usada em vacina combinada de SIIPL: TOXÓIDE DE DIFTERIA:

[0168] A cepa Corynebacterium diphtheriae PW8 CN2000 foi obtida a partir do Wellcome Research Laboratory, Londres, Reino Unido by the National Control Authority Central Research Institute (C.R.1.) Kasauli, Hi- machal Pradesh, Índia na forma liofilizada no ano de 1973. The cepa foi revista e ulteriormente liofiizada ob Master Seed Lot- C. diphtheriae CN2000 A1 at C.R.l. Kasauli. TOXÓIDE DE TÉTANO:

[0169] A cepa Clostridium tetani Harvard Cepa No. 49205 foi obtida a partir de The Rijks Institute Voor de Volksgezondheid (Netherlands) by the National Control Authority C.R.1|. Kasauli, na forma liofilizada. COQUELUCHE:

[0170] Fabricação de vacina em massa de coqueluche em SIIPL envolve o uso de quatro cepas de Bordetella pertussis viz. Cepas 134, 509, 6229 e 25525. A principal geração de Cepas 134 e 509 são origi- nalmente de Rijks Institute, Países Baixos, obtidas através da National Control Authority, Central Research Institute, Kasauli, Himachal Pra- desh, India. A principal geração de Cepas 6229 e 25525 são original- mente de Lister Institute, Inglaterra. HEPATITE B:

[0171] Rhein Biotech (Alemanha) formou a cepa de Hansenula- polymorpha recombinante contendo o gene de antígeno de superfície de HBsAg. Rhein Biotech também formou o Master Cell Bank (MCB Hansenulapolymorpha K3/8-1 cepa ADW, 12/94) e realizou todos os testes de caracterização neste banco. HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B:

[0172] O organismo original para a geração de substrato de célula é Haemophilus influenzae tipo b, cepa 760705. A cepa foi originalmente isolada de um menino bebê de 2 anos e 2 meses (nascido em 14-8-74) em Novembro de 1976. Três passagens da cepa aconteceram antes da armazenagem a-70 ºC na Academic Medical Centre (AMC), University of Amsterdam. Esta cepa foi transferida para SIIPL como uma parte de coloração entre SIIPL e Netherlands Vaccines Institute (NVI, Os Países Baixos). IPV:

[0173] A cepa e fonte de poliovírus é dada abaixo. Poliovírus tipo 1: Cepa: Mahoney Fonte: Dr. J.Salk (Pitman & Moore company) Poliovírus tipo 2: Cepa: MEF1 Fonte: Statens Serum Institute, Copenhagen Poliovírus tipo 3: Cepa: Saukett Fonte: Statens Serum Institute, Copenhagen

[0174] Através de todo esse relatório a palavra "compreender", ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo", será entendido como implicando a inclusão de um elemento afirmado, totalidade ou etapa, ou grupo de elementos, totalidade ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, totalidade ou etapa, ou grupo de elemen- tos, totalidade ou etapas.

[0175] O uso da expressão "pelo menos" ou "pelo menos um" su- gere o uso de um ou mais elementos ou ingredientes ou quantidades, como o uso pode estar na concretização da invenção para conseguir um ou mais dos objetos ou resultados desejados. Embora certas con- cretizações das invenções fossem descritas, essas concretizações fo- ram preservadas apenas a título de exemplo, e não se destinam a limitar o escopo das invenções. Variações ou modificações na formulação dessa invenção, dentro do escopo da invenção, podem ocorrer por aqueles versados na técnica na revisão da revelação aqui. Tais varia- ções ou modificações estão bem dentro do espírito dessa invenção.

[0176] Os valores numéricos dados para vários parâmetros físicos, dimensões e quantidades estão apenas valores próximos e é conside- rado que os valores mais altos do que o valor numérico atribuído aos parâmetros físicos, dimensões e quantidades caem dentro do escopo da invenção a não ser que haja uma afirmação no relatório para o país.

[0177] Enquanto ênfase considerável foi colocada aqui sobre as ca- racterísticas especificas da concretização preferida, será apreciado que muitas características adicionais podem ser adicionadas e que muitas mudanças podem ser feitas na concretização preferida sem se afastar dos princípios da revelação. Essas e outras mudanças na concretização preferida da revelação estarão evidentes por aqueles versados na téc- nica da revelação aqui, pelo que deve ser distintativamente que a ma- téria descritiva exposta acima deve ser interpretada meramente como ilustrativa da revelação e não como uma limitação.

VANTAGENS

[0178] A presente revelação descrita aqui acima tem vários avanços e vantagens técnicas incluindo, mas não limitados à realização de uma composição de vacina combinada compreendendo D, T, wP, HBsAg, conjugado de Hib PRP-TT e IPV e o método de fabricação da mesma. Quando em comparação com outra composição de vacina combinada, a presente revelação provê as seguintes vantagens:

1. Vacina combinada totalmente líquida

2. imunogenicidade aperfeiçoada

3. Reatogenicidade reduzida

4. Estabilidade aperfeiçoada a 2-8ºC e temperatura ambi- ente testada durante um período de 12 meses.

5. Toxóides de difteria (D) & toxóides de tétano altamente purificados (T) produzidos usando-se um meio semi-sintético livre de Encefalopatia Espongiforme Transmissível (TSE) ou Encefalopatia Es- pongiforme Bovina (BSE).

6. antígeno B. pertussis de célula interira (wP) compreende Bordetella pertussis cepas 134, 509, 25525 e 6229 em uma razão de 1:1:0.25:0.25 desse modo aperfeiçoando a potência e imunogenicidade contra B. pertussis.

7. Método aperfeiçoado de inactivation de componente de B. pertussis de célula inteira (wWP) usando-se combinação de inativação com calor e formaldeído. O processo é destituído de timerosal e antí- geno de coqueluche de célula inteira inativado permanece não amonto- ado e homogêneo desse modo levando a reatogenicidade reduzida e dando melhor potência e duração mais longa.

8. PRP livre de baixo teor (menos do que 7%) na parte prin- cipal de conjugado Total de Haemophilus influenzae Tipo b PRP-TT .

9. Perfil de adsorção aperfeiçoado de antígeno de toxóide de difteria (D), antígeno de toxóide de tétano (T) e antígeno de superfície de Hepatite B (HepB) adsorvidos individualmente em auxiliar de fosfato de alumínio desse modo melhorando a potência e imunogenicidade.

10. Teor total de alúmen mínimo (AIº*) desse modo garan- tindo reatogenicidade reduzida.

11. Concentração otimizada de 2-fenoxietanol (2-PE) como preservativo.

EXEMPLOS

[0179] Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar con-

cretizações preferidas da invenção.

Seria apreciado por aqueles de ha- bilidade na técnica que as composições e técnicas reveladas nos exem- plos que seguem representam técnicas reveladas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim pode ser considerado para constituir modos preferidos para sua prática.

No entanto, aqueles de habilidade na técnica, a luz da presente revelação, apreciaria que muitas mudanças podem ser feitas nas concretizações bi-específicas que são reveladas e ainda obteria um resultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

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[0181] A vacina pode conter traços de glutaraldeído, formaldeído, neomicina, estreptomicina e polimixina B que são usados durante o pro- cesso de fabricação. Exemplo 3: Processo de fabricação de parte principal de conjugado de Hae- mophilus influenzae Tipo b

[0182] A ampla visão das etapas de processo de fabricação de parte principal de conjugado de Haemophilus influenzae Tipo b é apresentada com o auxílio das 53 etapas do processo que são resumidamente des- critas abaixo: Etapa 1: Frasco de agitação de inóculo estágio | (S1):

[0183] Um frasco de lote de geração de trabalho é usado para ino- cular o frasco de agitação de inóculo estágio, que contém 0,22 um de meio de geração filtrada. Um frasco de 125 ml de PETG descartável com 25 mL de volume de trabalho é usado. Este estágio é realizado em uma agitadora de incubadora com agitação controlada (200 + 50 rom) e Temperatura (36 + 2 ºC). Depois que crescimento bacteriano apropriado é conseguido (ODs90o = 1,0), a cultura é transferida para o próximo inó- culo estágio (Estágio S2), que é descrita na etapa 2. A coloração de Gram é realizada como um controle em processo para garantir pureza de cultura (Cocobacilli gram negativo). Etapa 2: Frasco de agitação de inóculo Estágio 1l (S2):

[0184] Inóculo estágio S2 consiste de frascos de "fernbach" de 2L (S2A e S2B) com 800 ml de volume de trabalho. Frasco S2A é usado para a medição de ODsoo, até que ODs9o esteja dentro dos critérios acei- táveis e frasco S2B é usado para a inoculação de estágio S3. Ambos os frascos são carregados com meio esterilizado por filtragem, que é idên- tico ao inóculo estágio S1. O frasco de estágio S1 é usado para inocular ambos os frascos de agitação de estágio Il. Este estágio é realizado em um agitador de incubadora com agitação controlada (200 + 50 rpm) e

Temperatura (36 + 2 ºC). Depois de crescimento bacteriano apropriado é conseguido (ODs9o = 1,0), a cultura é transferida para o próximo inó- culo estágio (S3 Estágio), que é descrita na etapa 3. A coloração de Gram é realizada como um controle em processo para garantir pureza de cultura (Cocobacilli gram negativo). Etapa 3: Fermentador de inóculo estágio Ill:

[0185] Inóculo estágio S3 consiste de um fermentador de 120 L com um volume de trabalho de 35 L. O fermentador é carregado com um meio que é idêntico aos inóculos de estágios anteriores. O frasco de estágio S2 é usado para inocular o fermentador de inóculo. Crescimento é realizado a temperatura (36 + 2 ºC), DO (10% de ponto de ajuste), agitação (300-600 rpm), aeração (1-5 LPM) e retro-pressão (0,2 bar) no fermentador de inóculo. Depois que o crescimento bacteriano apropri- ado é conseguido (ODs2so = 1,0), a cultura é transferida para a próxima produção estágio (Estágio S4), que é descrita na etapa 4. A coloração de Gram é realizada como um controle em processo para garantir pu- reza de cultura (Gram negative cocobaccilli). Etapa 4: Fermentação de produção de escala de 1200 L:

[0186] O fermentador de produção de 1200 L em um volume de tra- balho de 800 L. É carregado com componentes de meio basal e vapor esterilizado in-situ. Subsequentemente, vários suplementos de meio são adicionados depois da passagem através de um filtro de 0,22 um. O fermentador é inoculado com uma cultura de estágio S3 obtido a partir da etapa 3. A fermentação é realizada sob oxigênioLPM ) e retro-pressão (0,2 bar). Dois "spikes" nutrientes discretos são adicionados durante o curso da fermentação. O crescimento é monitorado por medição de ODs90 (OD590 >= 3,5) e fermentação é considerado completar depois que o estágio estacionário é alcançado. Durante o crescimento e fase esta- cionária, o produto de polissacarídeo é secretado e se acumula no caldo de cultura. A coloração de Gram é realizada como um controle em pro- cesso para garantir pureza de cultura (Cocobacilli gram negativo). Etapa 5: Tratamento com formalina:

[0187] Redução da carga biológica é conseguida nesta etapa por uso de agente química (formalina). 0,1% de formalina é adicionado e o caldo fermentado é incubado por NLT 2 horas a 37 ºC. Depois do trata- mento com formalina, o vaso é rapidamente resfriado para <15 ºC. Adi- ção de formalina é validada para conseguir redução da carga biológica. Isto é verificado por placas de cultura depois do período de incubação. O caldo reduzido de carga biológica está pronta para coleta como des- crito na etapa 6. Etapa 6: Coleta de centrifugação contínua:

[0188] Centrifugação contínua é empregada como uma etapa de coleta primária. Essa etapa é realizada para separar o caldo bruto con- tendo polissacarídeo oriundo da biomassa inativada. Uma centrífuga continua é usada com o objetivo de remoção de >90% da biomassa, como medido pela redução de ODsoo. A centrífuga é operada a cerca de 15000 g e em uma taxa de fluxo de 200-500 L/h. O sobrenadante cen- trifugado é ulteriormente processado como descrito na etapa 7. Etapa 7: Filtração profunda de 50LP:

[0189] O sobrenadante centrifugado é passado através de uma fil- tragem profunda de 50LP para remover material grosso tal como frag- mento de célula. A etapa permite o produto para passar através do fil- trado, e está em série com uma filtragem profunda adicional, como des- crito na etapa 8. Etapa 8: Filtração profunda de 90LP:

[0190] O filtrado oriundo da filtragem profunda de 50LP é ulterior- mente passado através de uma filtragem profunda de 90LP (grau nomi- nal 0,22 um) para ulteriormente remover qualquer material insolúvel que pode não ter sido retido pela filtragem profunda anterior. Esta etapa ga- rante que o filtrado está essencialmente livre de fragmento de célula, e pode passar através de um filtro de 0,22 um robusto. A etapa de filtração subsequente é descrita na etapa 9. Etapas 9 e 10: Filtração de 0,22 um:

[0191] O filtrado oriundo da filtragem profunda de 90LP é ulterior- mente passado através de um filtro de 0,22 um, e o filtrado é coletado no tanque de retenção. Etapas 11 e 12: Diafiltração e concentração de 100kD:

[0192] Esta etapa é realizada para remover componentes de meio e impurezas de pequeno peso molecular. Além disso, concentração é realizada para reduzir o volume de trabalho. O corte de peso molecular de 100 kD é escolhido como o peso molecular de polissacarídeo de Hib (PRP) é > 500 kD. O caldo é concentrado para cerca de 10 vezes e subsequentemente diafiltrado para 5 volumes de NLT usando-se um tampão de PBS a 0,01 M (pH 7,2). O produto resultante no retentato é chamado de "PRP bruto" e é ulteriormente processado como descrito na etapa 13. O caldo concentrado é transferido para área de DSP atra- vés da porta de transferência via um filtro de 0,22 um para garantir que nenhuma bactéria está sendo transportada para a área de DSP. Etapa 13: Precipitação de CTAB:

[0193] CTAB (Brometo de Cetil-trimetil amônio) é um detergente ca- tiônico, que é usado para a precipitação de polissacarídeo. CTAB con- siste de uma região hidrofílica bem como uma parte hidrofóbica, e pre- cipita proteína, ácido nucléico e polissacarídeo. PRP bruto obtido a partir de etapa 12 é precipitado a 1% de concentração de CTAB e é incubado por > 2 horas. A coleta de pelota de CTAB é descrita na etapa 14. Etapas 14, 15 e 16: Centrifugação, coleta e armazenagem de pelota de CTAB:

[0194] Em SEZ-3, FF, pelota de CTAB é centrifugada usando-se centrífuga contínua a 15000 rpm. A pelota de CTAB é coletada, é pe- sada, é dividida em alíquotas e é armazenada a < -20 ºC para proces- samento ulterior. Essa é a primeira etapa de retenção em processo. Etapa 17 e 18: Dissolução e descongelamento de pasta de CTAB:

[0195] A pasta de CTAB congelada é descongelada para tempera- tura ambiente. A pelota descongelada é dissolvida na solução de 5,85% de NaCl. A dissolução é realizada em um tanque agitado e o produto de polissacarídeo é solubilizado na fase aquosa. O tanque contém algum ma- terial não dissolvido, que vem de proteínas precipitadas e ácido nucléico. Esta suspensão é ulteriormente processada como descrito na etapa 19. Etapa 19: Centrifugação:

[0196] O material obtido a partir de etapa 18 é centrifugado a 2-8 ºC, 5000-6500 rpm por 20-30 minutos para remover o material não dis- solvido. O sobrenadante centrifugado é coletado, e ulteriormente é pro- cessado como descrito na etapa 20. Etapa 20: 72% de precipitação de etanol:

[0197] 72% de Etanol são usados para precipitar PRP. 96% de eta- nol é usado para geral uma concentração final de 72% de etanol com relação ao sobrenadante obtido na etapa 19. Esta precipitação é reali- zada a 2-8 ºC de um dia para o outro. O precipitado resultante é coletado como descrito na etapa 21. Etapas 21 e 22: Centrifugação e Dissolução de pelota:

[0198] Os 72% de precipitado de etanol são coletados por centrifu- gação a 2-8 ºC, 5000-6500 rpm por 20-30 minutos. A pelota resultante é dissolvida em W.F.1I. até que a claridade visual seja obtida. Processa- mento subsequente da pelota solubilizada é descrito na etapa 23. Etapa 23: DOC e 32% de Precipitação de etanol:

[0199] Para o material obtido a partir de etapa 22, 6% de acetato de sódio e 1% de desoxicolato de sódio (DOC) é adicionado. 96% de Etanol são usados para gerar uma concentração final de 32% de etanol. Tanto

DOC quanto 32% de álcool dirigem a precipitação de impurezas de prote- na, enquanto permite que o polissacarídeo esteja na fase líquida. Essa precipitação é realizada a 2-8 ºC de um dia para o outro (NLT 8 hrs). Etapa 24: Centrifugação:

[0200] O material obtido a partir de etapa 23 é centrifugado a 2-8 ºC, 5000-6500 rpm por 20-30 minutos para remover o precipitado. O sobrenadante centrifugado é coletado e ulteriormente é processado como descrito na etapa 25. Etapa 25: Filtração de carbono e profundidade:

[0201] A solução de sobrenadante obtida na etapa 24 contém PRP solúvel e é submetida a filtração profunda seguido por filtração de car- bono para remover ácido nucléicos e matéria de coloração. Remoção de ácidos nucléicos é monitorada por medição de absorbância intermi- tentemente a 260 nm (A26o). Depois que o alvo Axo é alcançado a solu- ção é filtrada através de um filtro de 0,22 um e essa solução filtrada é ulteriormente processada como descrito na etapa 26. Etapa 26: 64% de Precipitação de etanol:

[0202] O material filtrado obtido na etapa 25 é ulteriormente precipi- tado com 96% de etanol a uma concentração final dos 64% de etanol. Essa precipitação é realizada a 2-8 ºC de um dia para o outro. O preci- pitado resultante é coletado por centrifugação, e é ulteriormente proces- sado como descrito na etapa 27. Etapa 27: Coleta de pelota e dissolução:

[0203] O sobrenadante é decantado e é descartado para coletar a pelota. A pelota é dissolvida em W.F.1. a temperatura ambiente. Etapa 28: Diafiltração e concentração de 300 kD:

[0204] A solução de pelota dissolvida é concentrada usando-se membrana de NMWCO de 300 kD. Isso é ulteriormente diafiltrado não menos do que (NLT) 8X usando-se W.F.l. O retentato resultante é pro- cessado ulteriormente como descrito na etapa 29.

Etapas 29 e 30: filtração de 0,22 um e armazenagem de PRP purifi- cado:

[0205] O retentato de UV de 300 kD é passado através de um filtro de 0,22 um como uma etapa de clarificação para minimizar a carga bi- ológica. O PRP purificado resultante é divido em alíquotas e é armaze- nado a < -20 ºC até ulteriormente usar como descrito na etapa 31. Amostra de PRP purificado é mandado para análise de Q.C.. Etapa 31: Descongelamento e combinação:

[0206] Com base na quantidade apropriada de tamanho de carga de conjugado de polissacarídeo nativo obtido a partir de etapa 30 é des- congelada. O material combinado é analisado quanto ao teor de PRP, que é necessário para outro processamento como descrito na etapa 32. Etapa 32: Concentração de 100 kD:

[0207] O polissacarídeo purificado combinado é necessário que es- teja de uma concentração mínima (8-12 mg/mL) para outro processa- mento. Se a combinação de concentração de polissacarídeo estiver abaixo do alvo, solução de polissacarídeo combinado é concentrada por uso de uma membrana de UF NMWCO de 100 kD.

[0208] Amostra é removida depois da concentração para garantir que a concentração mínima seja alcançada para as etapas subsequen- tes (etapa 33). Etapa 33: Despolimerização alcalina:

[0209] O polissacarídeo concentrado (equivalente a 74 g/110 g) ob- tido a partir de etapa 32 é despolimerizado sob condições alcalinas mo- deradas usando-se tampão carbonato-bicarbonato. Depois que o tama- nho de polissacarídeo alvo é conseguido, o polissacarídeo despolimeri- zado é ativado como descrito na etapa 34. Etapa 34: Ativação de polissacarídeo:

[0210] O polissacarídeo despolimerizado obtido na etapa 33 é ati-

vado usando-se Brometo de Cianogênio. Essa ativação é feita sob am- biente de nitrogênio. Brometo de Cianogênio é um produto químico al- tamente tóxico e cuidado apropriado é tomando enquanto se manipu- lando esse produto químico. Etapa 35: Ligação do ligador:

[0211] Solução de diidrazida de ácido adípico frescamente prepa- rada (ADH) é adicionada no período de 6-10 minutos à mistura de rea- ção obtida a partir de etapa 34. A reação é realizada para NLT por 16 horas a 2-10 ºC. O papel do ligador de ADH é prover grupos amina no polissacarídeo necessário para a reação de conjugação. Etapa 36: Concentração e diafiltração:

[0212] Uma mistura de reação obtida a partir de etapa 35 é concen- trada e volume diafiltrado por volume com solução salina de tampão de fosfato (PBS) usando-se membrana de NMWCO UF 10 kD para remo- ver ADH livre. A remoção de ADH é monitorada sobre HPLC e diafiltra- ção é continuada até que o nível de ADH livre atinja abaixo de 5%. O retentato resultante é ulteriormente diafiltrtado com NLT 5X MES-NacCl tampão. Esse é ulteriormente concentrado para conseguir uma concen- tração de NLT 20 mg/mL. O PRP processado concentrado é mantido a 2-8ºC até ulteriormente usar como descrito na etapa 37. Etapas 37 e 38: filtração de 0,22 um e armazenagem de PRP pro- cessado:

[0213] O retentato oriundo da etapa 36 é passado através de um filtro de 0,22 um, que serve como uma etapa de clarificação. Isso tam- bém garante que níveis de carga biológica sejam controlados durante o processo, que é realizado área de grau C. O polissacarídeo ativado fil- trado é coletado, é amostrado, é dividido em alíquotas e é armazenado a 2-8 ºC até processamento ulterior. Uma amostra é removida a partir da combinação de polissacarídeo processado para análise, que inclui tamanho molecular de PRP (KkD), teor de PRP, e grau de PRP de ativa- ção. Processamento ulterior do PRP processado é descrito na etapa 40. Etapa 39: Concentração e diafiltração de TT 10 kD:

[0214] A reação de conjugação exige dois componentes viz. polis- sacarídeo processado e a proteína veículo (TT). A proteína veículo é concentrada e é diafiltrada com tampão de MES-NaCl usando-se mem- brana de UF NMWCO 10 KD. Essa proteína veículo diafiltrada é ulteri- ormente concentrada para NLT 20 mg/mL usando-se a mesma mem- brana. Etapa 40: Conjugação:

[0215] A reação de conjugação exige dois componentes viz. polis- sacarídeo processado e a proteína veículo (TT). O componente de po- lissacarídeo ativado é obtido a partir de etapa 38. A proteína veículo é obtida a partir de etapa 39. Os dois componentes são misturados em quantidade apropriadas na razão de PRP: TT = 1:1 (W/w) na presença de EDC sob agitação. A reação de conjugação é monitorada sobre HPLC e é continuada até que >= 85% de conversão de proteína (com base na conversão de proteína livre em conjugado) seja alcançada. Etapa 41: Resfrimento brusco:

[0216] Depois que a reação de conjugação procedeu a seus crité- rios de aceitação para conversão (etapa 40), a reação é terminada por resfriamento brusco. A reação de conjugação é refriada bruscamente tampão de fosfato EDTA. Essa reação de conjugação é subsequente- mente processada como descrito na etapa 42. Etapa 42: Filtração de 30 SP e 0.22 micra:

[0217] O conjugado obtido a partir de etapa 41 é filtrado através de um filtro 30 SP seguido por filtração de 0,22 um. Isso garante a remoção de quaisquer agregados grandes. O conjugado filtrado é processado como descrito na etapa 43.

Etapa 43: 300 kD ultrafiltração e diafiltração:

[0218] A mistura de reação de conjugação obtida a partir de etapa 42 é diafiltrada com 0,05% de solução salina usando-se membrana de UF NMWCO de 300 kD. A diafiltração é realizada para remover reagen- tes de conjugação e TT não reagidas. O retentato resultante é ulterior- mente processado como descrito na etapa 44. Etapas 44 e 45: filtração de 0,22 um e armazenagem de conjugado bruto:

[0219] O retentato oriundo da etapa 43 é passado através de um filtro de 0,22 um, que serve como uma etapa de clarificação. Isso tam- bém garante que os níveis de carga biológica são controlados durante O processo, que é realizado em área de grau C. O conjugado bruto fil- trado é coletado, é amostrado e é armazenado a 2-8 ºC até o processa- mento ulterior. Processamento ulterior do conjugado bruto é descrito na etapa 46. Etapa 46: Diluição de conjugado bruto:

[0220] O conjugado bruto oriundo da etapa 45 é diluído com W.F.1. para uma concentração alvo de 4+1 mg/mL, se necessário e ulterior- mente é processado por etapas de precipitação como descrito na etapa

47. Etapa 47: Precipitação de sulfato de amônio:

[0221] A mistura de reação de conjugada diluída é ulteriormente processada para remover PRP livre usando-se sulfato de amônio (50% p/v de solução de estoque). A etapa de precipitação é realizada a menos do que 15 ºC sob agitação. A etapa de precipitação dirige o conjugado no precipitado, e deixa o PRP livre no sobrenadante. Depois de adição de sulfato de amônio a suspensão resultante é armazenada a menos do que 15 ºC sem agitação por NLT 12 horas. Etapa 48: Coleta de pelota e dissolução:

[0222] A suspensão obtida a partir de etapa 47 é centrifugada a

7000 g a 2-8 ºC por 40+10 minutos. O sobrenadante é descartado por decantação e a pelota obtida é dissolvido em solução salina de Tris. Etapa 49: Diafiltração de 300 kD:

[0223] A solução resultante oriunda de etapa 48 é filtrada através de filtro profundo de 30 SP e é diafiltrada com solução salina de Tris a mM usando-se membrana de NMWCO de 300 kD. Etapa 50: Purificação de cromatografia de GPC:

[0224] A solução resultante oriunda de etapa 49 é carregada em uma coluna de GPC de cerca de 70 L contendo gel de conta de polímero metacrílico hidroxilada para cromatografia de exclusão por tamanho. O uso de cromatografia de GPC para o conjugado processado (pós-sulfato de amônio) reduz os níveis de PRP livres no material resultante. A co- luna é eluída com Tris a 20 mM 0,9% de NaCl, e frações são coletadas com base em Azgo. Frações apropriadas com base em critérios aceitá- veis com relação ao PRP livre, Razão e tamanho molecular são combi- nados, e a combinação é ulteriormente processada, como descrito na Etapa 51. Etapa 51: Diafiltração de 300 kD:

[0225] O eluato de conjugado combinado resultante da etapa 50 é diafiltrado com Tris a 20 mM usando-se membrana de UF NMWCO de 300 kD. Esse volume de retentato é direcionado tal que o teor de PRP é cerca de 1 mg/mL. Etapas 52 e 53: Filtração de 0,22 um:

[0226] O conjugado em massa obtido a partir de etapa 51 é filtrado através de um filtro de 0,22 um sob ambiente de grau A para garantir esterilidade. O filtro de 0,22 um é totalmente testado. Uma amostra ori- unda do conjugado da parte principal filtrada é enviada para Q.C. para análise completa. O conjugado filtrado é marcado como "Conjugado de massa de Hib Estéril" e armazenado a 2-8 ºC. O Conjugado de massa será armazenado a 2-8 º*C por no máximo 3 meses e depois disso, se não usado, ele pode ser armazenado a -70ºC por uma duração total de até 1 ano.

[0227] Características de Qualidade de antígeno de conjugado de Hib PRP-TT obtido eram as seguintes: Teor de PRP (ug/0,5 ml): 8,1 Razão (PRP:TT)Z 0,5 PRP livre (%): 4,8% PMW (kD): 983 PM médio (kD): 752 Exemplo 4: Método De Inativação de antígeno de coqueluche de Célula Inteira (wP):

[0228] A otimização de Método De Inativação é feita depois de rea- lizar vários experimentos que incluem a inativação a 56ºC por 10 min na presença de formaldeído, 56ºC por 15 min na presença de formaldeído, 56ºC por 10 min na presença de himina, 56ºC por 15 min na presença de himina e apenas aquecimento a 56ºC por 30 min. Nenhuma diferença significatiiva em potência é observada com esses métodos. Desses mé- todos, 56ºC por 10 min na presença de formaldeído é selecionado por- que a massa de células de coqueluche produzida usando-se esse mé- todo é mais homogênea em comparação com outros métodos mencio- nados acima. Processo de produção de antígeno wP inativado compreende as seguintes etapas: a). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 134 b). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 509 c). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 25525 e 6229 d). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 6229 e). misturação subsequente de cepas de Bordetella pertussis 134, 509, 25525 e 6229 inativadas em uma razão de 1:1:0,25:0,25. f). opcionalmente adsorvidas em auxiliar à base de alumínio.

[0229] O processo é destituído de timerosal e antígeno de coquelu- che de célula inteira inativado permanece não amontoado e homogêneo desse modo levando a reatogenicidade reduzida e dando melhor potên- cia e duração mais longa. Exemplo 5: Processo de produção de vírus de pólio inativado (IPV)

[0230] O vírus da pólio pode ser desenvolvido pelo seguinte mé- todo: * Linhas de células de CCL81-VERO (rim de macaco) foi usada como células hospedeiras para o desenvolvimento dos vírus da pólio, isto é, cepas sabin e salk.

* “Depois da infecção das células hospedeiras com cepas desejadas de vírus da pólio e incubação de 72 horas, o meio contendo o vírus e fragmento de célula foi combinado e foi coletado em um único recipiente.

* —Ofiltradofoisubmetido a filtração de fluxo tangencial com pacote de 100 KDa; diafiltrado usando-se tampão de fosfato e purificado usando-se cromatografia de troca de ânions.

* Antesda administração a pacientes, os vírus precisaram ser inativados usando-se métodos de inativação adequados. Inativação de Formalina compreendendo as seguintes etapas: a) A combinação de vírus purificada foi submetida a troca de tampões de Tampão de fosfato para Tampão de Tris na faixa de (30 a 50 mM) tendo pH entre 7 e 7,5, b) À mistura acima meio M-199 contendo glicina (5 gm/1) foi adicionado c) 0,025% de formaldeído foi adicionado e subsequente- mente foi misturado, d) A mistura foi subsequentemente incubada a 37ºC por 5 a 13 dias com agitação contínua de parte principal do vírus no agitador magnético, e) A mistura de pós-incubação foi submetida a sistema de TFF intermediário (100 KDa, 0,1 m?) no dia 7 e filtração final depois da inativação f) Subsequentemente a parte principal filtrada foi armaze- nada a 2-8ºC, g) Realização de ELISA D-Ag para determinação de unidade de D-Ag Exemplo 6:

[0231] Este exemplo dá um resumo do processo de produção de uma composição de vacina combinada compreendendo D, T, wP, HBsAg, conjugado de Hib PRP-TT e IPV:

1. Procedimento de formulação do componente |: a). Transferência de fosfato de alumínio para o recipiente/ vaso b). adição do Toxóide de difteria c). ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com Ácido acético/Hidróxido de Sódio d). Esperar a estabilização e). ajuste de pH para 5,5 a 6,5 com Hidróxido de Sódio/ Car- bonato de Sódio f). Esperar a estabilização

2. Procedimento de formulação do componente Il: a). Transferência de fosfato de alumínio para o recipi- ente/Vaso b). adição do Toxóide de tétano c). ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com Ácido acético/Hidróxido de Sódio d). Esperar a estabilização e). ajuste de pH para 5,5 a 6,5 com Hidróxido de Sódio/Car- bonato de Sódio f). Esperar a estabilização

3. Procedimento de formulação do componente Ill: a). Transferência de fosfato de alumínio para o recipi- ente/Vaso b). adição do Antígeno de superfície de hepatite B c).ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com Ácido acético/Hidróxido de Sódio d). Esperar a estabilização e).ajuste de pH para 5,5 a 6,5 com Hidróxido de Sódio/Car- bonato de Sódio f). Esperar a estabilização

4. Misturação de Componente | no Componente |l e agitação a temperatura ambiente.

5. Antígeno inativado wP foi adicionado à mistura acima, se- guido por agitação à temperatura ambiente.

6. Componente Ill foi adicionado à mistura obtida na etapa 5 à temperatura ambiente

7. Conjugado de Hib PRP foi adicionado à mistura obtida na etapa 6 at 6 — 16 ºC.

8. Antígeno IPV foi adicionado à mistura obtida na etapa 6 a 6—-16"ºC.

9. 2-Fenoxietano! foi adicionado à mistura obtida na etapa 7 a6—16ºC.

10. Verificar o pH, se necessário ajustar o pH 6,0 a 7,0 com

Hidróxido de Sódio/Carbonato de Sódio

11. NaCl foi adicionado à mistura obtida na etapa 10, seguido por agitação por 3 horas. Exemplo 7: Estudos de Toxicidade de Vacina Hexavalente

[0232] Os seguinte estudos de toxicidade foram conduzidos com vacina de DTwP-HepB-IPV-Hib conforme o plano de estudo em concor- dância com o Programa (Schedule )Y' e diretrizes da WHO sobre ava- liação não clínica de vacinas e de acordo com os Princípios de Boa Prá- tica de Laboratório da OECD.

1. Estudo de toxicidade de Dose Única em Ratos Sprague Dawley por via Subcutânea

[0233] Um total de 20 ratos machos e 20 ratos fêmeas com idade de 5-6 semanas no início do tratamento foram aleatoriamente divididos em 4 grupos. Cada grupo compreendia 5 ratos machos e 5 ratos fê- meas. O pronto para o uso placebo, o auxiliar, a dose única de DTwP- HepB-IPV-Hib e a vacina de múltiplas doses foram administrados por via Subcutânea. Os ratos foram observados por 14 dias após a dose.

2. Estudo de toxicidade de Dose Repetida em Ratos Sprague Dawley por via Intramuscular

[0234] Um total de 100 ratos machos e 100 ratos fêmeas foram ale- atoriamente alocados em grupos principal e de recuperação. O pronto para o uso controle de placebo, o controle de auxiliar, as vacinas de dose única e de dose múltipla de DTwP-HepB-IPV-Hib foram injetadas lentamente por injeção intramuscular profunda nos Dias 1, 29, 57 e 85. Animais nos grupos de recuperação não foram tratados e observados por 28 Dias.

3. Estudo de toxicidade de Dose Única em Coelhos Brancos da Nova Zelândia por via Subcutânea

[0235] Um total de 16 coelhos machos e 16 coelhos fêmeas foram aleatoriamente divididos em 4 grupos. O placebo pronto para o uso, o auxiliar e as vacinas de única dose e de múltiplas doses de DTwP- HepB-IPV-Hib foram administrados por via sub-cutânea a cada animal do respectivo grupo. Aos coelhos foi administrada uma dose sub-cutâ- nea única e eles foram observados por 15 dias.

4. Estudo de toxicidade de Dose Repetida em Coelhos Brancos da Nova Zelândia por via Intramuscular

[0236] Um total de 40 coelhos machos e 40 coelhos fêmeas foram aleatoriamente alocados em grupos principal e de recuperação. O con- trole de placebo pronto para o uso, o controle de auxiliar e diferentes doses de vacina de dose única e de múltipla doses de DTwP-HepB-lIPV- Hib foram lentamente injetados por injeção intramuscular profunda nos Dias 1, 29, 57 e 85. Animais nos grupos de recuperação não foram tra- tados nem foram observados por 28 Dias.

[0237] Com base nos resultados, concluiu-se que a Vacina de única dose e de múltipla dose Hexavalente [Difteria, Tétano, Coqueluche (Cé- lula Inteira), Hepatite-B, Poliomielite (inativados) e Vacina conjugada de Haemophilus influenzae tipo b (Adsorvida) não produziram qualquer efeito sistêmico adverso em ratos de Sprague-Dawley e em Coelhos Brancos da Nova Zelândia quando uma única dose humana (0,5 mL) foi administrada por via sub-cutânea ou intra-muscular sob as condições de teste empregadas. Reações inflamatórias locais no sítio de injeção e constatações de resposta imunológica observadas em grupos tratados com a vacina são esperadas e comumente e observadas em estudos de toxidez com administração de vacinas contendo auxiliar de alumínio. Portanto, o item de teste “Vacina de DTwP-HepB-IPV- Hib' na dose mais alta de 0,5 mL/animal (1 human dose) é considerada como "Nenhum Nível de Efeito Adverso Observado" (NOAEL), sob as condições de teste e doses empregadas.

Exemplo 8 Tabela 10: Esta tabela provê comparação de Percentagem de adsorção de antígenos individuais, Potência, Teor de PRP livre entre Vacina de Combinação da SIIPL e a "Easy Six" (Panacea): Vacina de Combinação | Vacina de Combinação da SIIPL Panacea Easy-Six""

DAT Fis 1) HBsAg Ads, (%) 95,44 Mais do que 95,0 Potência “D' (IU/dose) 98,5120 Mais do que 40 Potência “T' (IU/dose) 139,030 Mais do que 50 Potência de 'HBsAg' 35,490 (34,210-36,818) — |23,167 In-Vitro (pug/ml) “Potência de 'HBsAg' In-Vivo 1,07 (0,74-1,57) 0,71 (0,42-1,13) (R/P) Potência de “wP' (IU/Dose) 4,6749 (2,6492-8,2763) — | 3,2221 (1,8032-5,7706) HIB (PRP total) ug/0,5 ml | 8,1 13,20 HIB (PRP Livre) (%) 4,8 18,45 Formaldeído Livre (%P/V) 0,0013 0,0011 Teor de 2-Fenoxietano!| 2,71 3,3 (mg/0,5 ml!) Teor Total de Alumínio 0,2863 0,6034 (mg/0,5 ml!) Tipo-l=39,046 Tipo-l=43,504 antígeno “PV' D (DU/0,5 ml) Tipo-ll=7,280 Tipo-ll=8,056 Tipo I11=33,058 Tipo I11=39,840 D = Antígeno de Toxóide de difteria T = Antígeno de Toxóide de tétano wP = Antígeno de coqueluche de célula inteira HBsAg = Antígeno de superfície de hepatite B IPV = Antígeno de Vírus de pólio inativado Ads. (%) = Percentagem de adsorção de Antígeno sobre sal de alumínio (AIº*)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um toxóide de difteria, (D); (ii) um toxóide de tétano, (T); (iii) um antígeno de coqueluche de célula inteira inativado (wP); (iv) um antígeno de superfície de vírus de Hepatite B, (HBsAg); (v) um sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) conjugado com uma proteína veículo; (vi) um antígeno de vírus da pólio inativado, (IPV); (vii) um auxiliar (viii) um preservativo; e (ix) um meio de diluição ou tampão em que a composição é uma vacina de combinação totalmente líquida, mostrando imunogenicidade aperfeiçoada, reatogenicidade reduzida e estabilidade aperfeiçoada a 2-8ºC e temperatura ambiente.

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um ou mais antígenos selecionados do grupo de Haemophilus influenzae (sorotipos a, c, d, e, fe as cepas encapsuladas), Hepatitis (cepas A, C, D, E, F e G), rotavírus, antígeno(s) de Neisseria meningitidis A, antí- geno(s) de Neisseria meningitidis C, antígeno(s) de Neisseria meningi- tidis W-135, antígeno(s) de Neisseria meningitidis Y, antigeno(s) de Neisseria meningitidis X, antíigeno(s) de Streptococcus Pneumoniae, antígeno(s) de Neisseria meningitidis B, antigeno(s) de Staphylococcus aureus antígeno(s), Anthrax, BCG, vírus do papiloma humano, antí- geno(s) de Salmonella typhi, antígeno de coqueluche acelular, adenilato ciclase modificado, Antígeno de Malária (RTS,S), Sarampo, Caxumba,

Rubéola, Antígeno de Flavivirus, Dengue, Zica, Ebola, Chicungunha, encefalite japonesa, e antígenos de Diarréia.

3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de coqueluche acelular compreende um ou mais antígenos selecionados de adenilato ciclase modificado, toxóide de coqueluche (PT), Hemaglutinina filamentosa (FHA), Pertactina (P69 ou PRN) ou Proteínas Fimbriais (FIM 1, 2 e 3).

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um ou mais auxiliares selecionados do grupo de sal de alumínio (Al**) tal como hi- dróxido de alumínio (AI(OH)3) ou fosfato de alumínio (AIPO,4), alúmen, fosfato de cálcio, MPLA, 3D-MPL, QS21, um auxiliar de oligodesoxinu- cleotídeo contendo CpG, lipossoma, ou emulsão de óleo-em-água.

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a composição compreende fosfato de alumínio (AIPO4) como auxiliar.

6. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um teor total de alumínio (Al?*) em uma quantidade de 0,1 mg por 0,5 ml a 0,6 mg por 0,5 ml.

7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno de coqueluche de célula inteira inativado (wP) é de cepas de Bordetella pertussis 134, 509, 25525 e 6229.

8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os antígenos IPV são cepas Salk se- lecionadas do grupo de cepas Mahoney tipo 1, MEF Tipo 2 ou Saukett tipo 3 ou Sabin selecionadas do grupo de Tipo 1, Tipo 2 ou Tipo 3.

9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os antígenos IPV estão adsorvidos sobre sal de alumínio tendo concentração de Al3+ entre 0,1 mg por 0,5 ml a 1,25 mg por 0,5 ml e adsorção percentual de pelo menos 70 %.

10. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que os antígenos IPV estão adsorvidos sobre sal de alumínio tendo concentração de Al3+ entre 0,1 mg por 0,5 ml a 0,6 mg por 0,5 ml e adsorção percentual de pelo menos 90 %.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que os antígenos D estão adsorvidos sobre sal de alumínio tendo adsorção percentual de pelo menos 50%.

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que os antígenos T estão adsorvidos sobre sal de alumínio tendo adsorção percentual de pelo menos 40%.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que os antígenos HBsAg estão adsor- vidos sobre sal de alumínio tendo adsorção percentual de pelo menos 70%.

14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno Hib é um conjugado de polissacarídeo de polirribosilribitol fosfato de Hib (PRP) a uma proteína veículo usando-se uma química de conjugação de cianilação ou química de conjugação de aminação redutora, em que o dito reagente de ciani- lação é selecionado dentre Brometo de Cianogênio, tetrafluorborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) tetrafluorborato de 1-ciano-4- pirrolidinopiridínio (CPPT), 1-clanoimidazol nomeadamente (1-CI), 1-ci- anobenzotriazol (1-CBT) ou 2-cianopiridazina-3(2H)ona (2-CPO); e a pro- teína portadora é selecionada de um grupo compreendendo CRM197, To- xóide de difteria, complexo de membrana externa de Neisseria menin- gitidis, fragmento C de toxóide de tétano, toxóide de coqueluche, prote- ína D de H, influenzae, E.coli LT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudo- monas aeruginosa, complexo c de membrana externa (OMPC), porinas,

proteínas de ligação de transferrina, pneumolisina, proteína A de super- fície pneumococcal (PspA), adesina A de superfície pneumococcal (PsaA), PhtD pneumococcal, proteínas de superfície pneumococcal BVH-3 e BVH-11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema desintoxificado (EF) e fator letal (LF) de Bacillus anthracis, oval- bumina, hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH), albumina de soro humano, albumina de soro bovino (BSA) e derivado de proteína purificado de tuberculina (PPD), peptídeos sintéticos, proteínas de cho- que térmico, proteínas de coqueluche, citocinas, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, proteínas artificiais compreendendo epitopos de célula T CD4+ humanos múltiplos de vários antígenos derivados de pa- tógeno tal como N 19, proteínas de absorção de ferro, toxina A ou B de C, difficile e proteínas de S.agalactiae com ou sem ligador.

15. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno Hib não está substan- cialmente adsorvido sobre qualquer auxiliar.

16. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pre- servativo selecionado do grupo de 2-fenoxietanol, cloreto de Benzetônio (Phemerol), Fenol, Tiomersal, Formaldeído, metil e propil parabenos, ou álcool benzílico ou uma sua combinação.

17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a composição compreende 2- fenoxietanol como preservativo.

18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a composição é livre de preserva- tivo.

19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende tam-

pão selecionado do grupo de cloreto de sódio, tampão de salina de fos- fato.

20. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que a composição compreende clo- reto de sódio como meio de diluição ou tampão.

21. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável, excipiente, ligante, veí- culo, agente isotônico, emulsificador ou umectante.

22. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 20, caracterizada pelo fato de que a composição compreende exci- piente farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo de açúcares e polióis, tensoativos, polímeros, sais, aminoácidos, modificadores de pH.

23. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno D em uma quantidade de cerca de 10 Lf por 0,5 ml a 25 Lf por 0,5 ml; antígeno T em uma quantidade de cerca de 2 Lf por 0,5 ml a 10 Lf por 0,5 ml; antígeno wP em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml a 16 IOU por 0,5 ml; HBsAg em uma quantidade de cerca de 7 ug por 0,5 ml a 15 ug por 0,5 ml; antígeno Hib em uma quantidade de cerca de 7 ug por 0,5 ml a 13 ug por 0,5 ml; antígeno Salk IPV tipo 1 em uma quantidade de cerca de 1 - 50 DU, Salk Tipo 2 em uma quantidade de cerca de 1 - 20 DU ou Salk tipo 3 em uma quan- tidade de cerca de 1 - 50 DU, respectivamente, por 0,5 ml; fosfato de alumínio em uma quantidade de cerca de 0,1 mg por 0,5 ml a 2,5 mg por 0,5 ml; 2-Fenoxietanol em uma quantidade de cerca de 1 mg por 0,5 ml a 6 mg por 0,5 ml; cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 0,5% a 1,5%.

24. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno D em uma quantidade de cerca de 10 Lf por 0,5 ml a 25 Lf por 0,5 ml; antígeno T em uma quantidade de cerca de 2 Lf por 0,5 ml a 10 Lf por 0,5 ml; antígeno wP em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml a 16 IOU por 0,5 ml; HBsAg em uma quantidade de cerca de 7 ug por 0,5 ml! a 15 ug por 0,5 ml; antígeno Hib em uma quantidade de cerca de 7 ug por 0,5 ml a 13 ug por 0,5 ml; IPV antígeno Sabin tipo 1 em uma quantidade de cerca de 1 - 50 DU, Sabin Tipo 2 em uma quantidade de cerca de 1 - 20 DU ou Sabin tipo 3 em uma quantidade de cerca de 1 - 50 DU, respectivamente, por 0,5 ml; fosfato de alumínio em uma quantidade de cerca de 0,1 mg por 0,5 ml a 2,5 mg por 0,5 ml; 2-Fenoxietanol em uma quantidade de cerca de 1 mg por 0,5 ml a 6 mg por 0,5 ml; cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 0,5% a 1,5%.

25. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno D em uma quantidade de cerca de 10 Lf por 0,5 ml; antígeno T em uma quantidade de cerca de 2 Lf por 0,5 ml; antígeno wP em uma quantidade de cerca de 12 IOU por 0,5 ml; HBsAg em uma quantidade de cerca de 8 ug por 0,5 ml; antígeno Hib em uma quanti- dade de cerca de 8 ug por 0,5 ml; antígeno IPV Salk tipo 1 em uma quantidade de cerca de 40 DU, Salk Tipo 2 em uma quantidade de cerca de 8 DU ou Salk tipo 3 em uma quantidade de cerca de 32 DU, respec- tivamente, por 0,5 ml; fosfato de alumínio em uma quantidade de cerca de 1,25 mg por 0,5 ml; 2-Fenoxietanol em uma quantidade de cerca de 2,5 mg por 0,5 ml; cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 0,9%.

26. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno D em uma quantidade de cerca de 20 Lf por 0,5 ml; antígeno T em uma quantidade de cerca de 4 Lf por 0,5 ml; antígeno wP em uma quantidade de cerca de 14 IOU por 0,5 ml; HBsAg em uma quantidade de cerca de 15 ug por 0,5 ml; antígeno Hib em uma quanti- dade de cerca de 10 ug por 0,5 ml; antígeno IPV Salk tipo 1 em uma quantidade de cerca de 40 DU, Salk Tipo 2 em uma quantidade de cerca de 8 DU ou Salk tipo 3 em uma quantidade de cerca de 32 DU, respec- tivamente, por 0,5 ml; fosfato de alumínio em uma quantidade de cerca de 1,25 mg por 0,5 ml; 2-Fenoxietanol em uma quantidade de cerca de 2,5 mg por 0,5 ml; cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 0,9%.

27. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno D em uma quantidade de cerca de 25 Lf por 0,5 ml; antígeno T em uma quantidade de cerca de 10 Lf por 0,5 ml; antí- geno wP em uma quantidade de cerca de 16 IOU por 0,5 ml; HBsAg em uma quantidade de cerca de 15 ug por 0,5 ml; antígeno Hib em uma quantidade de cerca de 13 ug por 0,5 ml; antígeno IPV Salk tipo 1 em uma quantidade de cerca de 40 DU, Salk Tipo 2 em uma quantidade de cerca de 8 DU ou Salk tipo 3 em uma quantidade de cerca de 32 DU, respectivamente, por 0,5 ml; fosfato de alumínio em uma quantidade de cerca de 1,25 mg por 0,5 ml; 2-Fenoxietanol em uma quantidade de cerca de 2,5 mg por 0,5 ml; cloreto de sódio em uma quantidade de cerca de 0,9%.

28. Processo de produção de uma composição de vacina combinada totalmente líquida que apresenta imunogenicidade aperfei- çoada, reatogenicidade reduzida e estabilidade aperfeiçoada compre- endendo (1) uma toxóide de difteria, (D); (ii) uma toxóide de tétano, (T); (iii) um antígeno de coqueluche de célula inteira inativado,

(wP) (iv) um antígeno de superfície de vírus de Hepatite B, (HBsAg); (v) um sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) conjugado a uma proteína veículo; e (vi) um antígeno de vírus de pólio inativado, (IPV); caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a). Adição de salina Normal em um recipiente/vaso de com- binação b). Adição de Componente - | compreendendo Toxóide de difteria c). Adição de Componente — Il compreendendo Toxóide de tétano d). Adição de antígeno de coqueluche de célula inteira inati- vado e). Adição de Componente — Ill! compreendendo Antígeno de superfície de Hepatite B f). Adição de Antígeno Hib g). Adição de antígeno IPV h). Adição de 2-Fenóxi Etanol i). Ajuste de pH para 6,0 para 7,0 com Hidróxido de Só- dio/Carbonato de Sódio j). Adição de salina normal para completar o volume.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a preparação do componente | compreende as seguintes etapas: a). transferência de fosfato de alumínio em recipiente/vaso b). adição do Toxóide de difteria c), ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com Ácido acético/Hidróxido de Sódio d), estabilização e), ajuste de pH para 5,5 a 6,5 com hidróxido de Sódio/car- bonato de Sódio f). estabilização

30. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a preparação do componente Il compreende as seguintes etapas: a). transferência de fosfato de alumínio para o recipiente/ vaso b). adição do Toxóide de tétano c). ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com ácido acético/Hidróxido de sódio d). estabilização e). ajuste de pH para 5,5 a 6,5 com hidróxido de Sódio/car- bonato de sódio f). estabilização

31. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a preparação do componente Ill compreende as seguintes etapas: a). transferência de fosfato de alumínio para o recipiente/ vaso b). adição do antígeno de superfície de hepatite B c). ajuste de pH para 4,5 a 5,5 com ácido acético/hidróxido de sódio d). estabilização e). ajuste de pH para 5,8 a 6,8 com hidróxido de sódio/car- bonato de sódio f). estabilização

32. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a preparação do antígeno de coqueluche de célula inteira inativado compreende as seguintes etapas: a). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 134 b). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 509 c). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 25525 e 6229 d). inativação a 56ºC por 10 — 15 minutos na presença de formaldeído de cepas de Bordetella pertussis 6229 e). subsequente misturação de cepas de Bordetella pertussis 134, 509, 25525 e 6229 inativadas em uma razão de 1:1:0,25:0,25.

f). opcionalmente adsorvido sobre auxiliar à base de alumií- nio, em que o processo é destituído de timerosal e antígeno de coqueluche de célula inteira inativado permanece não amontoado e ho- mogêneo, desse modo levando a reatogenicidade reduzida e dando me- lhor potência e duração mais longa.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a preparação do antígeno Hib compreende as etapas de: a). Fermentação de Haemophilus influenzae Tipo b b). Inativação a 37 ºC por 2 horas na presença de formalde- ido a 0.1% c). Purificação de polissacarídeo de Hib polirribosilribitol fos- fato (PRP) d). Conjugação de produto purificado da etapa c a toxóide de tétano (TT) usando-se uma química de conjugação de cianilação de Brometo de Cianogênio na presença de ligador de diidrazida de ácido adípico (ADH) e). purificação de conjugado da etapa d f). filtração de conjugado purificado de preferência através de filtro de 0,22 um em que a percentagem de PRP livre não é mais do que 5% no total de conjugado de massa de Hib purificado.

34. Composição de vacina combinada totalmente líquida que apresenta imunogenicidade aperfeiçoada, reatogenicidade reduzida e estabilidade aperfeiçoada, caracterizada pelo fato de que é substancial- mente como aqui descrita com referência aos exemplos acompanhan- tes.

35. Processo para a fabricação de uma composição de va- cina combinada totalmente líquida que apresenta imunogenicidade aperfeiçoada, reatogenicidade reduzida e estabilidade aperfeiçoada. ca- racterizado pelo fato de que é substancialmente como aqui descrito com referência aos exemplos acompanhantes.