KR20160045829A - 박테리아성 백신 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 예방을 위한 안정한 컨쥬게이트 백신 제제, 및 살모넬라 타이피로 인한 장티푸스에 대해 개선된 T-의존성 면역반응을 생산하는, 담체 단백질로서 파상풍 톡소이드와 살모넬라 타이피의 Vi-폴리사카라이드 간 컨쥬게이션 방법에 관한 것이다. 본 발명에 기술된 방법과 생성된 제제는 완전한 백신 접종 스케줄을 포함하는 단 1회 주사를 통해 2세 이하 어린이에서 장티푸스에 대한 면역을 유도할 수 있다.
Description
본 발명은 장티푸스(typhoid fever)에 대해 유아, 소아 및 성인의 적절한 면역반응을 일으키는 것을 특징으로 하는 박테리아성 백신 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 컨쥬게이트 백신과 그의 제조방법에 관한 것으로, 여기서 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)의 고유 폴리사카라이드는 담체 단백질에 컨쥬게이트되어 예방적 컨쥬게이트 백신으로 제제화된다. 또한, 본 발명은 살모넬라 타이피와 홍역 바이러스 방어를 위한 조합된 백신 제제 분야에 관한 것이다.
살모넬라 타이피는 인간의 장티푸스 원인균으로 아프리카, 아시아 및 중동에서 주요 풍토병이다. 살모넬라 타이피 균으로 오염된 음식과 물이 이 질환의 전파에 중요한 요인인 것으로 확인되었다. 다양한 연구들은 장티푸스에 대한 세계적인 부담이 세계의 상이한 지역에서 다른 것을 보여주고 있다. 남중앙 아시아와 남동 아시아에서는 매해 인구 10만 중에서 100 케이스 이상이 보고되었고; 아시아, 아프리카, 라틴 아메리카 및 카리브 지역은 중등도의 장티푸스 발병, 즉 매해 인구 10만 중에서 10 내지 100 케이스가 있는 것으로 추정되며; 뉴질랜드, 호주 및 유럽은 발병률이 낮거나 매우 낮다(Crump et al., 2004). 이것은 장티푸스가 세계의 지역, 특히 개발도상국과 자원 세팅이 낮은 국가에서 더욱 풍토적인 것을 시사한다.
살모넬라속은 이질균속(Shigella), 대장균속(Escherichia), 및 비브리오속(Vibrio)을 포함하는 장내세균과에 속한다. 살모넬라속은 2개의 상이한 종인 에스. 엔테리카(S. enterica)와 에스. 봉고리(S. bongori)를 함유한다. 에스. 엔테리카는 또한 2443개의 혈청형(serovar)을 함유하는 6개의 아종으로 나뉜다(엔테리카, 살라마에(salamae), 아리조나에(arizonae), 디아리조나에(diarizonae), 휴테나에(houtenae) 및 인디카). 따라서, 장 열(fever)을 유발하는 물질은 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 타이피(typhi)(통상 S. enterica serovar typhi라 지칭함)와 혈청형 파라타이피(Paratyphi) A, B 및 C이다. 혈청형 또는 세로타입(serotype)은 특이적 항체의 생산을 담당하는 고유한 표면 분자를 갖는 균주로 정의할 수 있다. 각각의 세로타입은 그의 항원영역에서 미묘한 화학적 차이를 갖는다(Brenner et al., 2000).
살모넬라 타이피는 이를 효과적인 병원균이 되게 하는 특성의 조합을 가지고 있다. 이 종은 그람 음성 유기체의 전형적 내독소뿐만 아니라 독성을 증가시키는 것으로 생각되는 Vi 폴리사카라이드 항원을 포함한다. 이것은 또한 비탐식성 세포가 박테리아를 흡수하여 이를 세포 내에서 살 수 있도록 하는 "인바신(invasin)"이라고 알려진 단백질을 생산하고 분비한다. 또한, 이것은 백혈구의 순간적 산소 과소비를 저해하여 선천성 면역반응을 비효과적으로 만들 수 있다. 지난 10년 동안, 살모넬라종은 점점 더 많은 항생물질 내성(resistance)을 얻은 것으로 확인되었다. 그 원인은 사람과 동물의 살모넬라증 치료시 항생물질의 증가된 무분별한 사용과, 사육 동물의 먹이에 성장 촉진 항생물질을 첨가하는데 있는 것으로 보인다. 플라스미드 매개성 항생물질 내성은 소아성 전염병과 연관된 살모넬라 균주 중에서 매우 빈번하다. 암피실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 세프트리악손(ceftriaxone), 세포탁신, 세포페라존 및 설폰아미드에 대한 내성이 통상적으로 관찰되며; 콜리스틴 내성은 아직 관찰되지 않았다. 살모넬라 균주는 필요할 때 효과적 약물의 선택을 돕고 균주(동물 또는 인간 기원)의 항생물질 감수성의 변화를 검출하기 위해 항생물질 내성에 대해 전신적으로 확인하여야 한다. 1972년까지 살모넬라 타이피 균주는 클로람페니콜(장티푸스에 대해 가장 통상적으로 사용되는 항생물질)을 포함하는 항생물질에 대해 감수성이 있었지만; 1972년, 멕시코에 만연한 전염병은 살모넬라 타이피의 클로람페니콜 내성 균주로 인한 것이었다. 다른 클로람페니콜 내성 균주는 그 이후에 인도, 태국 및 베트남에서 단리되었다.
살모넬라 타이피로 인해 유발된 장티푸스에 대한 백신 접종(vaccination)은 항생물질 내성 증가로 인해 생명을 위협하는 질환의 예방에 필수적이다. 또한, 이것은 장티푸스가 유행하는 지역으로 여행하는 사람들에게 중요한 예방수단이기도 하다. 박테리아는 다수 약물 내성능을 획득하는 능력을 가지기 때문에 항생물질이 완전한 방어를 제공할 수는 없다. 다음 3 종류의 장티푸스 백신이 지금까지 사용에서 현재 이용가능하다: (1) 비경구 사멸 전세포 백신; (2) 경구 생약독화(live-attenuated) 백신; 및 (3) 비경구용 Typhoid-Vi 피막(capsular) 폴리사카라이드 백신. 장티푸스 백신은 생물의 세포 및 분자 복잡성이 명확하게 연구된 초기에 설계되었다. 열-페놀-불활성화 방법으로 사멸된, 초기에 비경구적으로 투여된 전세포 살모넬라 타이피가 2회 투여되어야 하는 백신으로 사용되었다. 전세포 불활성화 백신은 'O' 항원(내독소)을 함유하기 때문에, 백신 접종된 개인에서 국소적이고 일반적인 반응을 생성하는 경향이 있고 이러한 종류의 백신은 2년마다 추가접종해야 한다. 경구 생약독화 Ty21a 백신은 아데닐레이트-사이클라제 및 AMP 리셉터 단백질이 없는 돌연변이성 살모넬라 타이피 균주와 p-아미노 벤조에이트와 아데닌 영양요구성 돌연변이체로 제조된 차세대 백신으로 여겨지고 있다. 이러한 생약독화 백신들은 효능이 낮은 것으로 알려져 있고. 6세 이하의 어린이에게 투여하기에 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 이외에도, 5년마다 추가접종 또한 필요하다. 이후, 살모넬라 타이피의 피막 Vi-폴리사카라이드는 인간에서 적절한 면역반응을 유도할 수 있는 방어적 면역원으로 동정되었고, 따라서 정기적 예방접종 스케쥴에서 잠재적 백신 후보물질로서 사용되었다. 0.5mL 주사당 25μg의 정제된 피막 Vi-폴리사카라이드(ViPs) 투여는 항체에서 최대 혈청전환율(seroconversion), 즉 4배(four fold) 상승을 일으킬 수 있다. 그러나, 고유의 폴리사카라이드 백신이 2차 메모리 반응을 할 수 없거나 생성하지 않는 수많은 임상실험에서 Vi-폴리사카라이드 백신의 제한성이 보고되었다. 이러한 현상은 박테리아성 폴리사카라이드가 사실상 T-세포 독립적이고, 그에 따라 세포 매개 면역반응을 생성할 수 없기 때문이다. 그러므로, 상기한 문제를 해결하기 위해 살모넬라 타이피의 폴리사카라이드와 담체 단백질이 추가로 컨쥬게이트되어 T-세포 의존성 항원이 되는 폴리사카라이드-단백질 분자를 형성한다. 폴리사카라이드와 단백질의 결합에 영향을 주는 다양한 인자들이 있으며, 이것은 선택된 담체 단백질과 ViPs의 분자량 및 작용 그룹의 활성화에 따라 달라진다. 저분자량 폴리사카라이드는 담체 단백질과의 효율적인 결합을 유발할 수 있다. 상이한 담체 단백질, 예를 들어 파상풍 톡소이드, 디프테리아 CRM 197, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 독소의 B 서브유니트(LT-B), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 재조합 엑소단백질(exoprotein) A (rEPA) 및 Horseshoe rab Haemocyanin (HCH)이 주로 컨쥬게이션에 사용되고 있다.
국제출원공개 WO1996/011709에서는 담체 단백질 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이트된 Vi 폴리사카라이드 서브유니트 구조와 실질적으로 동일한 O-아세틸화 올리고뉴클레오티드 또는 폴리갈락토우로네이트 펙틴이 기술되었으며, 여기서 담체 단백질은 시스타민으로 유도되었다. 이 특허에서는 상이한 유도인자, 즉 시스타민으로 담체 단백질에 Vi-폴리사카라이드가 아니라 동일한 폴리사카라이드를 컨쥬게이트하는 것을 개시하고 있다. 이후, 국제출원공개 WO1998/026799에서는 살모넬라 파라타이피 A의 단리된 리포-폴리사카라이드를 기술하였으며, 여기서는 그의 리피드 A를 디톡스(detoxification)에 의해 제거하여 그의 O-아세틸 함량을 70% 내지 80%로 유지한 다음, 아디프산 디하이드라지드(ADH)에 의해 담체 단백질 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이트하였다. 국제출원공개 WO2000/033882에서는 아디프산 디하이드라지드에 의해 단백질 슈도모나스 아에루기노사(Vi-rEPA) 컨쥬게이트에 공유결합된 살모넬라 타이피의 Vi-폴리사카라이드를 기술하였다. 국제출원공개 WO2007/039917은 열 쇼크 단백질에 공유/비공유 결합된 살모넬라 타이피의 외인성 항원을 기술하였다. 국제출원공개 WO2009/150543에서는 장티푸스를 유발하는 살모넬라 타이피에 대한 백신 조성물로서 사용될 컨쥬게이트된 Vi-폴리사카라이드를 기술하였으며, 여기서 Vi-폴리사카라이드는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드로부터 선택된 단백질에 공유적으로 컨쥬게이트된다. 국제공개특허 WO2009/150543에 기술된 컨쥬게이션 방법은 먼저 바람직하게 CRM197 또는 파상풍 톡소이드인 담체 단백질을 링커, 예컨대 아디프산-디하이드라지드 (ADH), 및 카보디이미드, 예컨대 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDAC)에 동시에 첨가하여 유도된 담체 단백질을 2-(N-모폴리노) 에탄 설폰산(MES 완충제) 존재 하에 얻는 것을 포함한다. 카보디이미드 EDAC 대 담체 단백질의 중량비는 0.1 내지 0.15이다. 이것은 또한 다량의 카보디이미드/단백질 비율이 응집물 형성을 유발할 수 있음을 기술하였다. 담체 단백질의 유도는 Vi-폴리사카라이드 (ViPs)의 활성화로도 이어진다. Vi-폴리사카라이드는 또한 카보디이미드로 활성화되고, 여기서 다양한 비율의 ViPs와 카보디이미드 (EDAC)를 혼합하여 Vi-폴리사카라이드를 활성화한다. Vi 활성화는 실온에서 2분 이내에 수행될 수 있고, 여기서 1.5:1 내지 200:1의 높은 비율이 사용될 수 있는 것으로 언급되었다. 유도된 담체 단백질 CRM197 또는 파상풍 톡소이드와 살모넬라 타이피의 활성화된 Vi-폴리사카라이드는 이후 서로 반응하여 컨쥬게이트된 ViPs-CRM197 또는 ViPs-TT 컨쥬게이트를 얻은 후, 과량의 링커가 제거된다.
Zuzana Kossaczka 등은 1999년에 베트남의 성인, 10대 및 2 내지 4세 어린이에서 ViPs 컨쥬게이트 백신의 안전성과 면역원성을 평가하였다. 이 연구에서, 2 내지 4세 어린이의 항-Vi-rEPA(컨쥬게이트 백신)의 기하평균레벨(geometric mean level)이 5 내지 14세 어린이에서 Vi 피막 폴리사카라이드 백신으로 유도된 것보다 더 높았다. 컨쥬게이트 백신의 재주사는 2 내지 4세 어린이에서 항체 역가의 증가를 유도하였다(T-세포 의존적). Konadu 등(2000)은 살모넬라 파라타이피 A O-특이적 폴리사카라이드(O-Sp)를 제조하여 파상풍 톡소이드에 결합하였다. 이 컨쥬게이트들은 마우스에서 IgG 항체를 유도하였고 컨쥬게이트의 안정성과 면역원성은 베트남 성인, 10대 및 2-4세의 어린이에서 평가되었다. 연구 결과, 이러한 실험적 컨쥬게이트들은 안전하고 성인, 10대 및 2-4세의 어린이에서 IgG 항체를 유도하는 것이 증명되었다. Feng Ying C 등은 살모넬라 타이피 ViPs 컨쥬게이트 백신의 효능을 2 내지 5세 어린이에서 평가하였다. 이 연구에서는 컨쥬게이트 장티푸스 백신이 안전하고 면역성인 것으로 확인되었고, 2 내지 5세 어린이에서 90%를 초과하는 효능을 보였다. 2차 투여 농도의 6주 후 혈청 IgG Vi 항체는 36명의 평가 어린이에서 10배 증가하였다. 이러한 경우는 27개월 동안 이어졌다. 심각한 부작용은 이 연구에서 백신 접종으로 인해 관찰되지 않았다. Do Gia Canh 등은 2 내지 5세의 베트남 어린이에게 2회 주사된 ViPs 컨쥬게이트 백신의 면역원성에 대한 투여량 효과를 연구하였다. 이 연구에서는 5 μg, 12.5 μg 및 25 μg의 컨쥬게이트 백신의 투여량 면역원성 시험을 별도로 2회, 6주 동안 주사하여 평가하였다. 이 연구는 또한 이번 시험과 이전 시험에서 4개 분량의 컨쥬게이트 백신에 대한 안전성과 일관성 있는 면역원성을 확인하였다. 국제 건강증진을 위한 노파르티스(Novartis) 백신 연구소는 3개의 상이한 용량 관련 ViPs-CRM197 제제화를 수행하였다. 이들은 투여당 25 μg, 12.5 μg, 5 μg 및 1.25 μg인 상이한 투여량으로 수행하였다. 이러한 농도에 대한 28일째 GMT는 각각 304U (단위), 192U, 111U 및 63U였다. 28일째에 투여당 25 μg으로의 GMT는 1회 주사 후에 가장 높은 항체 농도(304U)를 나타냈다.
이 분야의 최근 기술이 Vi-폴리사카라이드와 담체 단백질을 갖는 컨쥬게이트 백신을 포함하지만, 사람에서의 수많은 임상시험에서 시험할 때 현존하는 고유 Vi-폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신은 성인에서는 안전하고 면역성이 있지만 2세 이하 어린이의 방어적 면역반응을 유도하지 못하는 것으로 나타났다. 그러므로, 이러한 고유 살모넬라 타이피 폴리사카라이드 백신은 2세 이하 어린이에서 치명적인 살모넬라 타이피 감염에 대한 구체적인 해결책을 찾은 것이 입증되지 않았고, 이는 장티푸스를 유발하는 원인이 되는 살모넬라 타이피 감염에 대해 2세 이하 어린이를 면역화할 수 있는 새로운 백신을 요구한다. 2세 이하의 연령군은 살모넬라 타이피에 감염되기 매우 쉽지만, 현재 여전히 2세 이하 유아를 위한 살모넬라 타이피에 대한 방어적 백신을 이들에게 제공할 수는 없는 것으로 보인다. 상기한 바와 같이, 다양한 담체 단백질, 예컨대 CRM-197, r-EPA는 Vi-폴리사카라이드에 컨쥬게이트되고, 여기서 Vi-폴리사카라이드는 살모넬라 타이피로부터 단리되지 않을 수 있거나 다른 공급원으로부터 기술되는 것이다. 따라서, 장티푸스 컨쥬게이트 백신을 생산하는 것은 컨쥬게이션 방법과 관련된 고유 폴리사카라이드 및 관련된 특정 담체 단백질 및 얻어진 컨쥬게이트 백신에 특이적이다. 각각의 담체 단백질-폴리사카라이드 컨쥬게이션은 그 자체에 컨쥬게이트 백신의 상이한 정체성을 제공한다. 장티푸스 컨쥬게이트 백신, 방법론의 영역에서 기술된 선행기술 및 현재 사용되는 것들은 그 자체의 단점을 가지며, 이것은 2세 이하 어린이를 보호할 수 있는 현재 입수가능한 컨쥬게이트 백신이 없는 배후의 가능한 이유일 수 있다.
당 분야의 최근 기술에서, 장티푸스 컨쥬게이트 백신은 BioMed에 의해 일반에게 사용 가능하게 된 완전 백신 접종 스케쥴 A 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 (ViPs-TT) 컨쥬게이트 백신을 포함하는 6-8주의 간격으로 적어도 2 또는 그 이상의 주사를 필요로 하고, 이것은 단일 백신 접종 스케쥴을 완료하기 위해 5 μg의 2회 주사를 각각 6-8주 간격으로 필요로 하는 것은 매우 명확하게 잘 알려져 있다. 그러나, 이러한 ViPs-TT 백신 또한 살모넬라 타이피에 대해 2세 이하 어린이를 면역화할 수 없다.
따라서, 컨쥬게이션 방법을 변경할 필요가 있으며, 이것은 비용을 줄이고 충분한 면역반응과 보다 더 간단할 수 있는 컨쥬게이션 화학 영역의 다른 관련된 기술적 사건을 유도할 수 있는 단 1회 주사로 주입수를 감소하고, 시간 소모를 줄이며 비용 효과적이고 안전할 수 있다. 효율적인 백신은 양호한 면역반응을 촉발할 수 있어야 하며, 특히 2세 이하 유아의 사용에 적용할 수 있어야 한다. 본 발명에 기재된 내용은 Vi-폴리사카라이드를 특이적 담체 단백질 파상풍 톡소이드 (TT)와 함께 본 원에 기술된 방식으로 컨쥬게이트하는 신규한 대안적 방법에 따른 것으로, 고유 폴리사카라이드 백신 및 담체 단백질에 컨쥬게이트된 다른 ViPs 백신을 포함하는 현 컨쥬게이션 방법의 단점을 잠재적으로 극복한다. 본 원에 기재된 특정한 방법으로 생산된 Vi-폴리사카라이드-단백질 컨쥬게이트 백신은 어린이와 2세 이하의 연령을 포함하는 유아의 면역화에 더 적합하고 2차적 메모리 반응은 모든 연령군의 인간을 포함하여 살모넬라 타이피 감염에 대한 고친화성 항체를 생산한다. 또한, 백신 접종 스케쥴을 완성하기 위한 장티푸스 컨쥬게이트 백신의 주입수를 단 1회로 줄이고, 동시에 이전에 시행된 장티푸스 컨쥬게이트 백신의 2 또는 3회 주사의 백신 접종 스케쥴로 생성되는 면역반응과 비교하여 더 양호한 면역반응을 유도하는 것이 본 원에 기재된 발명의 또다른 이점이다. 장티푸스 컨쥬게이트 백신의 단일 투여는 유아와 어린이에게 항상 바람직하며, 왜냐하면 이것은 백신 접종의 반복된 주사로 어린이 또는 유아가 고통을 받고 병원에 추가 방문하는 것을 줄일 수 있기 때문이다. 40%의 주사가 세계적으로 멸균되지 않은 재사용 시린지와 니들로 투여되며, 특히 표적이 되는 개발도상국에서 이 비율이 70%를 넘어서 수백만 명의 사람들이 주사하는 동안 병원균이 신체 조직으로 들어가는 감염에 노출되는 것으로 이미 보고되었다. 또한, 지저분한 주입 장비의 불량한 수거와 처리는 의료 종사자와 지역사회를 니들 스틱 손상의 위험에 노출되게 한다. 불행하게도, 일부 국가에서 불안전한 처리는 사용된 장비의 재판매를 암시장에서 유도하기도 한다. 시린지의 개방 연소는 WHO 하에서 불안전한 것이지만, 세계적으로 산업화되지 않은 국가의 절반이 이러한 관행을 따르고 있다. ("Injection safety", Health Topics A to Z. World Health Organization. Retrieved 2011-05-09). 안전하지 않은 주사는 매해 130만으로 추정되는 조기사망을 유발한다. (M.A. Miller & E. Pisani. "The cost of unsafe injections". Bulletin of the World Health Organization 77 (10): 1808-811). 주입 안전성을 개선하기 위해서 WHO는 주입 대상에 대한 가용성의 특정한 대안이나, 폐기물을 안전하고 적절하게 관리하여 장비와 공급물의 가용성을 보장하여 의료 종사자와 환자의 활동, 백신을 조절 및 규제하는 것을 권고하였지만; 이러한 방법이 항상 철저하게 지켜볼 수 있는 것은 아니다. 이러한 환경에서, 단 1회 주입의 장티푸스 컨쥬게이트와 홍역 백신의 조합은 국가적 면역 프로그램에서 주입 안전성과 관련한 걱정을 줄이는데 있어서 분명히 실질적인 역할을 할 것이다. 많은 나라들은 의료 전문가들이 안전 시린지(안전 조작 니들) 또는 언제든지 가능한 의약 투여의 대안적 방법을 사용하는 것을 지시하는 의무화 법률 또는 정책을 가지고 있지만, 유아에서 단 1회 주입으로 장티푸스와 홍역에 대한 예방을 보장하는 주입 횟수의 감소는 공중 위생 전망에서 높은 순응도를 확실하게 나타내는데, 왜냐하면 장티푸스(최소 2회 주입) 및 홍역(1회 주입) 백신을 주입하기 전에 적어도 3회 주입이 필요하기 때문으로, 이제 이것은 단 1회 주입으로 달성된다.
본 발명의 1차 목적은 T-독립성 폴리사카라이드가 T-세포 의존성이 되어 모든 연령, 특히 2세 이하 어린이, 및 성인에서도 효율적인 면역반응을 생성할 수 있도록 하는, 인간에서 살모넬라 타이피 감염의 예방 및 치료를 위한 백신 제제를 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 2세 이하의 어린이에게 방어를 제공하는 백신 항원으로서 적합한 컨쥬게이트 폴리사카라이드를 갖는 살모넬라 타이피로 유발된 열병에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 Vi 피막 폴리사카라이드를 생산하는 유가(fed-batch) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나 이상의 목적은 담체 단백질에 크기 감소가 있거나 없는 Vi 피막 폴리사카라이드를 컨쥬게이션하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 담체 단백질과 컨쥬게이션하기 전에 살모넬라 타이피의 ViPs의 크기 감소에 의해 시간을 줄이고, 그리하여 Vi 폴리사카라이드와 담체 단백질 사이의 컨쥬게이션 비율을 증가하는, 효과적 컨쥬게이션 방법을 대안적 방법으로 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 링커 분자를 갖거나 갖지 않는 최종 폴리사카라이드 컨쥬게이트된 거대 가공 백신으로서 살모넬라 타이피의 Vi 피막 폴리사카라이드 및 담체 단백질 파상풍 톡소이드의 컨쥬게이션 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 유아와 성인에서 살모넬라 타이피에 대한 예방을 제공하는데 효과적인 적절한 농도로 투여될 적절한 단일 투여 및 다회 투여용 바이알로 Vi-폴리사카라이드-단백질의 결합된 폴리사카라이드-단백질 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 백신 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드의 배양 및 처리를 기술하였다. 이것은 다양한 후속 처리단계에 의해 추가 정제되어 순수한 Vi-폴리사카라이드를 얻는다.
본 발명의 다른 일 구체예에 따라, 파상풍 톡소이드 단백질과 컨쥬게이트하는 순수한 Vi-폴리사카라이드의 컨쥬게이션 방법을 링커 분자인 아디프산 디하이드라지드 (ADH)의 존재하에 기술하였다. 얻어진 순수한 ViPs-TT 컨쥬게이트의 수율은 70%-80% 정도이다.
본 발명의 다른 일 대안적 구체예에 따라, 파상풍 톡소이드 단백질과 컨쥬게이트하는 Vi-폴리사카라이드의 컨쥬게이션 방법을 링커 분자의 존재 없이 기술하였다. 링커가 없는, 얻어진 순수한 ViPs-TT 컨쥬게이트의 수율은 70%-80% 정도이다.
본 발명의 다른 구체예는 단 1회 주입으로 완전한 백신 접종 스케쥴을 보장하는, ViPs-TT와 보존제인 2-페녹시에탄올을 갖거나 갖지 않는 적절한 ViPs-TT 농도의 안정한 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 일 구체예는 완전한 백신 접종 스케쥴을 포함하는 단 1회 주입에 의해 2세 이하(6개월 내지 2년)의 유아를 포함하는 사람, 및 다른 연령군의 대상에서 강력한 혈청방어(sero-protection)를 나타내고 살모넬라 타이피 감염에 대한 바람직한 면역원성을 유발하는 안정한 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신 제제에 대한 임상적으로 확립된 실험 데이터를 제공한다.
도 1: 링커가 없는 것(우측)과 링커 ADH가 있는(좌측) ViPs 생성 및 컨쥬게이션의 개략적 순서도
도 2: Vi 폴리사카라이드의 혈청학적 확인 시험
도 3: 장티푸스 고유 Vi-폴리사카라이드의 HPLC (RI 검출기), 정제된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 13.185분의 피크는 고유 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~900kDa의 분자량을 의미한다.
도 4: 약 45 회(passes) 동안 균질기를 사용한 크기 감소된 ViPs. 크기 감소된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 16.04분의 피크는 크기 감소 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~200kDa의 분자량을 의미한다.
도 5: 전자레인지를 사용한 크기 감소된 ViPs. 크기 감소된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 15.18분의 피크는 크기 감소 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~250kDa의 분자량을 의미한다.
도 6: ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.83분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT를 나타낸다.
도 7: ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.66분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT를 나타낸다.
도 8: 링커가 없는 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.98분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 9: 링커가 없는 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.662분의 피크는 링커가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 10: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.82분의 피크는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 11: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.72분의 피크는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 12: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 25 μg 단일 주사의 1회 주사 후 상이한 연령군의 기하평균 역가의 비교
도 13: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 25 μg 단일 주사의 1회 주사 후 상이한 연령군의 혈청전환율(%)의 비교
도 2: Vi 폴리사카라이드의 혈청학적 확인 시험
도 3: 장티푸스 고유 Vi-폴리사카라이드의 HPLC (RI 검출기), 정제된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 13.185분의 피크는 고유 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~900kDa의 분자량을 의미한다.
도 4: 약 45 회(passes) 동안 균질기를 사용한 크기 감소된 ViPs. 크기 감소된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 16.04분의 피크는 크기 감소 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~200kDa의 분자량을 의미한다.
도 5: 전자레인지를 사용한 크기 감소된 ViPs. 크기 감소된 Vi-폴리사카라이드의 HP-GPC 컬럼 프로파일을 RI 검출기로 분석하였다. 15.18분의 피크는 크기 감소 Vi-폴리사카라이드를 나타내며, 이것은 ~250kDa의 분자량을 의미한다.
도 6: ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.83분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT를 나타낸다.
도 7: ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.66분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT를 나타낸다.
도 8: 링커가 없는 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.98분의 피크는 링커 분자가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 9: 링커가 없는 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.662분의 피크는 링커가 없는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 10: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 HPLC (RI), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 RI 검출기로 검출하였다. 12.82분의 피크는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 11: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 HPLC (UV), Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신의 HPLC 프로파일을 HP-GPC 컬럼을 사용하는 UV 검출기로 검출하였다. 12.72분의 피크는 컨쥬게이트 ViPs-TT 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 12: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 25 μg 단일 주사의 1회 주사 후 상이한 연령군의 기하평균 역가의 비교
도 13: ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 25 μg 단일 주사의 1회 주사 후 상이한 연령군의 혈청전환율(%)의 비교
살모넬라 타이피를 적절한 배지에서 배양하고 활성적으로 증식된 세포를 미리 멸균된 배지를 함유하는 발효기에 옮겼다. 먼저, 뱃치 방식 발효공정을 수행하고, 배양이 초기 정지상에 이르면 탄소 공급원을 고농도로 함유하는 공급 배지(feed medium)를 발효기 내로 점진적으로 펌핑하였다. 유가(Fed-batch) 방식 발효공정을 원하는 광학밀도가 얻어질 때까지 수행하였다. 배양물을 저농도 포르말린으로 불활성화하여 수확한 다음, 원심분리하여 세포 상청액을 얻었다. 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Cetavlon)를 세포 상척액에 첨가하여 숙주 세포 성분으로부터 미정제 Vi-폴리사카라이드를 침전시켰다. 순차적 정제 단계, 즉 에탄올 침전, 농축 및 상이한 분자량 컷오프 멤브레인과 멸균 여과방법을 사용한 투석여과 (diafiltration)를 수행하여 숙주 세포 불순물, 예를 들어 핵산, 단백질 및 리포-폴리사카라이드로부터 정제된 Vi-폴리사카라이드를 단리하였다.
폴리사카라이드와 단백질의 결합에 영향을 주는 인자는 작용그룹의 분자량과 활성화에 따라 달라진다. 폴리사카라이드의 저분자량은 효율적인 결합을 생성할 수 있다. 상이한 단백질, 예를 들어 파상풍 톡소이드, 디프테리아 CRM 197, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 독소의 B 서브유니트(LT-B), 슈도모나스 아에루기노사의 재조합 엑소단백질(exoprotein) A (rEPA) 및 Horseshoe rab Haemocyanin (HCH)이 컨쥬게이션에 주로 사용되고 있다. 박테리아성 폴리사카라이드의 폴리사카라이드와 폴리사카라이드-단백질 컨쥬게이트의 분자 크기를 결정하는 것은 컨쥬게이트 백신을 설계하는데 있어서 중요한 측면이다. 폴리사카라이드-단백질 컨쥬게이트의 물리화학적 특성 평가는 특이적 면역반응의 유도에서 중요한 역할을 한다. 컨쥬게이션 전후에 폴리사카라이드의 분자 크기를 결정하는 것은 효율적인 컨쥬게이션을 야기한다. 컨쥬게이션과 정제 후에 적용된 2가지 중요한 결정적 품질관리 시험은 '폴리사카라이드 (PS) 대 단백질 비율'과 '비컨쥬게이트 폴리사카라이드(자유 폴리사카라이드) 백분율'이다.
Podda 등(2010)은 2세 이하의 어린이에서 백신 접종의 역학과 중요성을 보고하였다. 현재 사용가능한 백신은 약간의 관련 제한성을 가지며, 그에 따라 장티푸스 질환의 과중한 부담이 영향을 주는 연령군인 2세 이하의 어린이에서 사용할 수 없다. 컨쥬게이트 백신의 도입은 모든 연령군의 효율적 면역화의 효과적 도구가 될 것으로 기대하지만, 2세 이하에서 장티푸스 컨쥬게이트 백신의 백신 접종을 가능하게 하는 현재 입수가능한 실험적 데이터는 없다. 본 발명은, 2세 이하의 어린이 또는 유아에게 이 어린 연령군에서 장티푸스를 유발하는 살모넬라 타이피 감염을 예방하도록 백신 접종하는 것이 가능한 이점을 갖는 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 독특한 컨쥬게이션 방법에 따른 것으로, 이것은 실험적 임상시험 데이터에 의해 지지되고, 또한 주입 횟수를 감소하여 2세 이하의 유아에서 장티푸스 컨쥬게이션 백신의 단 1회 투여로 완전한 백신 접종 스케쥴을 달성한다.
실시예
1:
에스
.
타이피
(
S.
typhi
)
Vi
폴리사카라이드의
배양 및 처리
살모넬라 타이피(Ty2) 균주를 미국, National institutes of Child Health and Human Development(NICHD)의 Dr. John Robbins로부터 입수하였다. 배양물 접수양식 NICHD, USA를 확인하고 다음 특성들의 표시에 의해 살모넬라 혈청형 타이피(Salmonella serovar typhi)로서 동정하였다: 그램 염색, 글루코스 양성(가스 생성 없음), 자일로스 라이신 데옥시콜레이트 아가(XLD 아가)에서 H2S 양성, 및 Vi-폴리사카라이드와의 양성 혈청학. 균주의 순도를 상이한 선택배지, 예컨대 Bismuth Sulfite Agar(BSA), Triple Sugar Iron (TSI) 아가에서 확인하였다. 균주의 순도를 상이한 선택배지, 예컨대 Xylose Lysine Deoxycholate 아가(XLD 아가), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Iron (TSI) 아가에서 확인하였다.
살모넬라 타이피 Ty2를 Soyabean Casein Digest (SCDM) 배지에서 37±1℃로 12시간 동안 배양하였다. 박테리아 배양물을 원심분리하여 펠릿을 멸균 글리세롤 (50%)에 재현탁하였다. 0.5mL의 글리세롤 현탁액 분액을 1mL 저온유리병에 준비하여 -70℃에서 보관하였다. 종균(master seed)의 생균수를 계수하였다. 종균의 저온유리병 중 내용물을 SCDM 브로쓰(broth)에 접종하여 37±1℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 배양물을 원심분리하고 펠릿을 멸균 글리세롤(50%)에 재현탁하였다. 생균수를 계수하였다. 글리세롤 현탁액의 분액을 저온유리병에 준비하여 -70℃에서 보관하였다. Master 및 Working 세포 뱅크를 그램 염색, 글루코스 활용(Durham 방법), 옥시다제 시험, 응집 시험 및 생균수로 특성화하였다. 이것을 Tryptone Soya Agar (TSA)에 도포하여 37℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니를 콜로니 계수기를 사용하여 계수하였다.
1.1. 발효 공정:
접종원 증식: 워킹 시드 로트(working seed lot)의 하나의 저온유리병 중의 내용물을 냉동고에서 꺼내어 실온에서 항온수조를 사용하여 해동하였다. 살모넬라 타이피의 워킹 세포 뱅크 중 하나의 저온유리병을 10 mL Soybean Casein Digest Medium (SCDM)에 접종하여 37±1℃에서 12시간 동안 배양하고(스테이지-I), 37±1℃에서 12시간 동안 각각 50 mL SCDM을 함유하는 2개 플라스크에 옮기고(스테이지-II), 최종적으로 각각 400 mL SCDM을 함유하는 4개 플라스크에 옮겨서 37±1℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다(스테이지-III). 배양물 이동의 모든 스테이지에서 순도와 형태학적 특성을 그램 염색으로 확인하였다. OD는 600 nm에서 확인하였다. 상이한 종균 증식 스테이지에서 기록된 살모넬라 타이피 배양물의 OD는 1.2에서 3.8까지 변화하였다.
먼저, 85 L의 SCDM을 lOOL S.S 용기에 준비한 다음, 발효기로 옮겼다. 이것을 제자리에서 121℃로 15분 동안 멸균하였다. 배지를 37℃까지 냉각하였다. 이 스테이지에서 보충 믹스를 발효기 내에 추가 포트를 통해 펌핑하였다. pH를 유지하기 위해 보틀 내의 50% 암모니아 용액을 추가 포트에 질소 공급원으로서 연결하였다.시드 접종원을 발효기로 옮기고 발효 공정을 6.9±0.2의 pH, 37±2℃의 온도로 수행하였고, 용존 산소는 70-90%로 22 내지 24시간 동안 유지하였다. 증식을 600 nm에서의 OD값을 먼저 0시간과 2시간마다 최대 24시간까지 취하여 확인하였다.
유가 방식(Fed batch mode) 발효: 살모넬라 타이피의 유가 발효공정으로 Vi 폴리사카라이드 생산이 증가하였다. OD600이 3.8인 스테이지 III 배양물이 발효에 이상적이었다. pH를 6.90으로 유지하였고 용존 산소 농도는 40% 내지 60%였다. 초기 정지상 배양물에 무기염 및 미네랄과 함께 탄소 공급원을 함유하는 공급 배지를 점진적으로 발효기에 발효 공정 전체에 걸쳐 펌핑하였다. 유가 발효공정은 본 원에서 글루코스를 1 내지 2 mg/mL 농도의 범위로 함유하는 용액을 공급하여 바이오매스를 증가하기 위해 채택하였다. pH를 6.90 내지 7.20의 범위로 유지하고 용존 산소 농도는 40%-60%로 유지하였다. 암모니아 용액(50%)을 질소 공급원으로서 공급 배지와 함께 공급하였다. 추가 포트를 통해서 소포액을 무균적으로 펌핑하여 거품 발생을 제어하였다. 유지된 최적 pH는 7.2로 10% NH4OH를 사용하였고, 용존 산소 농도는 35% 공기 포화로 유지하였다. 글루코스 농도를 30분마다 관찰하였고, 유가 공정에 의해 글루코스 농도를 약 1 g/L로 공정 전체에서 유지하였다.
공정을 최대 24시간 지속한 다음, 박테리아 배양물을 0.5% 포름알데히드로 불활성화하여 약한 교반 하에 냉기 조건(15℃ 미만)에서 유지하였다. 증식을 600 nm에서의 OD값을 0시간과 24시간 동안 2시간마다 취하여 확인하였다. 이러한 공급 전략으로 바이오매스의 증가를 광학밀도의 측면에서 약 120 내지 130까지 얻었다. 증가된 바이오매스는 더 많은 Vi 폴리사카라이드 생산으로 전환되어 현재 공정에서 리터당 약 1000 mg의 유가 배양으로 얻어진 Vi-폴리사카라이드의 최종 수율을 달성하고, 여기에서 하부 공정의 완료 후에 리터당 400 mg의 정제된 ViPS가 최종적으로 얻어진다. 따라서, 배양의 유가 방식으로 적어도 40%의 최종 수율을 얻었다.
1.2. 정제된 Vi
폴리사카라이드
벌크 (
ViPs
)의 하부 공정:
발효 세포 상청액을 상이한 정제단계를 수행하여 정제된 Vi-폴리사카라이드를 단리하였다. Vi-폴리사카라이드는 부분적으로 α-(1→4) 결합을 갖는 2-아세틸아미노-2-데옥시-d-갈락토피라누론산의 3-0-아세틸화 반복단위로 구성된다. 따라서, O-아세틸 함량의 측정은 Vi-폴리사카라이드의 양과 연관시킬 수 있다. 최종 순수 Vi-폴리사카라이드 분획은 Vi-폴리사카라이드 그람당 2 mM의 O 아세틸을 함유하여야 한다(WHO TRS 840). 상청액은 일반적으로 다량의 단백질, 핵산 및 리포폴리사카라이드를 포함한다. 여과 방법은 숙주 세포 불순물로부터 박테리아 폴리사카라이드 정제의 하부 공정에서 중요한 역할을 한다. 용해된 물질에서 원하는 분자의 유지는 크기에 기초하여 수행되며; 크기가 더 큰 입자들이 표면에 유지되고 멤브레인의 공칭 중량 한계(NMWL)보다 더 적은 것들은 투과액으로 흘러나온다(Jagannathan et al, 2008). 100 kDa 컷오프 멤브레인 카세트를 세포 상청액 농축의 초기 단계에 사용하였고, 300 kDa 컷오프 멤브레인 카세트는 최종 농축 단계에서 사용하였으며 주사용 멸균수(WFI)를 사용하여 투석여과하였다.
세포 분리: 수집된 배양물을 보울(bowl) 원심분리기에서 9000 rpm (8000g)으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 멸균 용기에 모았다. 샘플을 상청액에서 취하여 O-아세틸 함량을 어세이하였다.
농축 및 투석여과: 상청액을 100 kDa 멤브레인을 사용하는 접선유동여과 (TFF) 시스템으로 투석여과하였다. 상청액을 원래 부피의 1/10로 농축한 다음, 필요한 농축물을 얻을 때까지 주사용수(WFI)로 다시 투석여과하였다. 농축물의 O-아세틸 함량을 어세이하였다.
세트리미드 ( Cetrimide ) 침전: 농축물에 0.4M 세트리미드를 첨가하고 (5°±1℃)에서 3±1 시간 동안 인큐베이션하였다. 내용물을 9000 rpm으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 모아진 펠릿을 필요한 부피의 1 M NaCl에 현탁하였다. 펠릿 현탁액의 O-아세틸 함량을 측정하였다.
에탄올 침전: 1부피의 에탄올과 2% 소듐 시트레이트를 재현탁된 세트리미드 침전에 첨가하고; 내용물을 20±5분 동안 자석식 교반기를 사용하여 교반하였다. 내용물을 4200 rpm (8000 g)으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 멸균 보틀에 모으고 펠릿은 폐기하였다. 상청액에 2배의 에탄올(100%)을 60±10분 동안 연속 교반하면서 첨가하였다. 2%의 소듐 아세테이트를 연속 교반하에 상기한 내용물에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 내용물을 4200 rpm (8000 g)으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고; 펠릿을 멸균 냉 WFI에 현탁하여 멸균 보틀에 옮겼다. 샘플에 대해 O 아세틸 함량을 확인하였다.
여과: 농축된 ViPs 벌크를 0.22 μ 캡슐 필터(Sartopore, Sartorius)에 통과시켰다. 멸균 여과 정제된 ViPs 벌크에 대해 O 아세틸 함량을 어세이하였다. 이렇게 얻어진 ViPs 벌크를 세트리미드로 재추출하여 에탄올로 침전시켰다. 최종적으로, 벌크를 농축하고 상기한 바와 같이 300 kDa 카세트를 사용하여 투석여과하였다(농축 벌크로 알려짐). O-아세틸 함량을 각각의 공정 이후에 어세이하였다. 하기 표 1.2에 제공된 바와 같이 하부 공정의 상이한 단계에서 다음 O-아세틸 함량을 얻었다. O-아세틸 함량은 하기한 바와 같이 Hestrin 방법으로 분석하였다.
O-아세틸 함량 어세이: Hestrin 방법(Hestrin, 1949)으로 O-아세틸 함량을 측정하였다. 샘플 중의 O-아세틸 양은 mg/mL로 표시된 Vi-내용물의 양에 비례한다. 0.5 mL의 3.6 N HCl과 1 mL의 알칼리성 하이드록실아민 용액을 시험 샘플에 첨가하여 완전히 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 2분 동안 유지하고, 0.5 mL의 염화제2철 용액을 첨가하여 잘 혼합하였다. 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. O-아세틸 함량은 다음과 같이 계산하였다:
O-아세틸 대 Vi 함량 전환율의 인자 = O-아세틸(μmoles/mL) x 0.294
(25/0.085/1000) = Vi 함량 (mg/mL)
최종 멸균 여과(0.22μ)된 Vi-폴리사카라이드 벌크를 저온 진공 건조기(Lyophilizer - FTS system)로 동결건조하였다. 동결건조된 분말은 Ouchterlony 방법에 의한 혈청학적 동정, 수분 함량, 단백질 함량, 핵산, 분자크기분포 및 박테리아성 내독소 함량에 대해 시험하였다. 본 시험에서, 정제된 Vi-폴리사카라이드와 상응하는 동종 항혈청으로 메니스커스가 사라질 때까지 웰을 채웠다. 겔 플레이트를 항온항습기에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 밝은 빛 배경에 대해 보았을 때 침강소(precipitin) 라인이 육안으로 관찰되었다. 그 사진을 도 2에 나타내었으며, 선명한 침강소 아크(arc)가 관찰되는 것을 보이고 있다.
Vi-폴리사카라이드의 분자크기분포는 고정상으로 Sepharose CL-4B를 사용하는 겔 투과 컬럼에 의해 측정하였다. 허공부피(void volume, Vo)가 0.25 kDa에 상응하면 분획을 모아서 함께 합하였다. 75%의 폴리사카라이드가 0.25 kDa에서 용출되었다. 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드 벌크의 분자크기 분포를 하기 표 4.5에 나타내었다. Vi의 특성화에 따르면, Vi는 H-NMR에 의해 86% 수준의 O-아세틸화, 0.3%의 단백질 및 1%의 핵산을 갖는 것으로 나타났다.
단일 뱃치에서 얻어진 건조 ViPs 벌크의 결과를 하기한 표 1.2에 표로 만들었다:
상기한 결과들은 모두 WHO TRS 840, 영국 약전(2010) 및 인도 약전(2010) 기준의 요건을 만족하였다. WHO TRS 840 (1994)의 요건을 본 시험의 표준 규격으로 간주하였다. WHO의 표준 요건은 단백질 10 mg/g, 핵산 20 mg/g, Vi-폴리사카라이드 중 2 mmol/g 이상의 O-아세틸 함량이고, 50% 폴리사카라이드의 분자 크기가 0.25 kDa 이전에 용출되어야 하고, 면역침전법에 의한 동일성(Identity) 및 멸균성 시험을 통과하는 것이다. 영국 및 유럽 약전(2007)에 따라 건조 Vi-폴리사카라이드 규격은 다음과 같다: 단백질 10 mg/g, 핵산 10 mg/g, O-아세틸 그룹 2 mmol/g, 0.25 kDa 이전에 용출된 분획을 함유하는 풀(pool)에서 발견된 50 퍼센트 이상의 폴리사카라이드, 면역침전법을 사용한 동정, 및 박테리아 내독소 시험. 이러한 규격은 WHO TRS 840, 영국 약전(2010) 및 인도 약전(2010)과 유사하다.
실시예
2:
컨쥬게이션
방법
본 발명에서는 박테리아 단백질 또는 바이러스 단백질, 예컨대 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 아에루기노사 톡소이드, 백일해 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프링겐스(Clostridium perfringens) 톡소이드, 슈도모나스 엑소프로테인 A, CRM197에서 선택된 담체 단백질에 정제된 Vi 폴리사카라이드(ViPs)를 컨쥬게이션하는 효과적인 방법을 기술하였다. 바람직하게 정제된 ViPs는 본 발명에서 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션한다. 높은 수율의 컨쥬게이션은 다양한 대안적 컨쥬게이션 방법들을 사용하여 얻어진다. 정제된 ViPs는 컨쥬게이션 전에 크기 감소를 수행할 수 있다. 본 발명에서, (크기 감소가 없는)분자 크기가 크거나 (크기 감소된)분자 크기가 작은 ViPs를 사용한 컨쥬게이션 효율은 양 방법에서 수행되어 고수율의 정제된 ViPs-TT 컨쥬게이트를 얻는다. 분자 크기가 큰 ViPs와 파상풍 톡소이드의 컨쥬게이션에서, 최종 반응 혼합물 내의 (크기 감소가 없는)ViPs의 농도는 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 범위에서 최대 70%-80%로 ViPs-TT 컨쥬게이트의 바람직한 수율을 얻는 한편, 분자 크기가 작은 ViPs와 파상풍 톡소이드의 컨쥬게이션에서는 최종 반응 혼합물 내의 (크기 감소된)ViPs의 농도가 5 mg/ml 내지 10 mg/ml의 범위에서 최대 70%-80%로 ViPs-TT 컨쥬게이트의 바람직한 수율을 얻는다. 정제된 ViPs의 대안적인 크기 감소 방법을 이하에 기술하였다.
본 발명의 신규성은 Vi-폴리사카라이드의 변성과 가교제 존재하에 링커를 갖거나 링커 분자를 갖지 않는 Vi-폴리사카라이드를 활성화하는 것이다. 본 발명에 따르면, 컨쥬게이트 단백질을 활성화할 필요가 없다. 활성화된 폴리사카라이드와 담체 단백질 간의 컨쥬게이션은 EDAC 같은 가교제 존재하에 일어난다. 국제출원공개 WO2009/150543에서는 컨쥬게이션을 위한 단백질 유도를 기술하였으며, 여기에서 Vi-폴리사카라이드는 C. freundi로부터 단리되어 담체 단백질로서 CRM197 및/또는 파상풍 톡소이드와 추가 컨쥬게이트된다. 이들의 연구에서는 Vi와 EDAC를 0.9-1.4의 적절한 몰비(EDAC/Vi)로 혼합하고, 경우에 따라 CRM197 및/또는 TT를 ADH와 EDAC를 사용한 처리로 유도하였다. Vi를 CRM197과 TT에 별도로 컨쥬게이션하고 컨쥬게이션 혼합물을 Sephacryl S-1000으로 정제하여; 분획들을 SDS-PAGE로 분석하고 자유 단백질을 함유하지 않는 것들을 모았다(Micoli et al., 2011). 그러나, 국제출원공개 WO2009/150543에 따라, 과량의 링커는 투석에 의해 제거되지만, 본 발명에서 Vi-폴리사카라이드는 임의로 크기 감소(균질화 또는 마이크로파 방법)를 수행한 다음, 컨쥬게이션하여 임의로 링커 분자에 또는 링커 분자가 전혀 없이 결합된다. 그러므로, 링커 분자를 사용하지 않는 경우, 과량의 링커 분자를 제거하는 추가 단계가 필요하지 않다. 또한, 링커 분자와의 컨쥬게이션을 포함하는 공정에서, 과량의 링커는 국제출원공개 WO2009/150543에서 언급된 투석과는 달리 탈염 및 투석여과에 의해 제거되었다.
2.1. 고압
균질화를
사용한
ViPs의
크기 감소:
ViPs는 거의 1000 kDa에 달하는 거대 분자이다. 그러므로, 분자의 크기는 바람직하게 저농도의 파상풍 톡소이드를 포함하는 담체 단백질과 컨쥬게이션할 수 있도록 거대 분자의 약 1/4까지 감소된다. 따라서, 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs에 대해 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화를 수행하고, 동일한 작업을 적어도 45 회 반복하였다. 이후, 감소된 ViPs의 분자 크기는 상응하는 도면에 나타낸 바와 같이 크기배제 겔투과 크로마토그래피에 의해 확인하였다. ViPs의 체류시간은 크기배제 이전에 13.185분이고(도 3), 크기배제크로마토그래피 이후에 ViPs의 체류시간은 16.04분이었으며(도 4), 이는 ViPs가 약 200 kDa의 상응하는 분자 크기로 감소된 것을 의미한다. 크기 감소된 ViPs의 O-아세틸 함량은 hestrin 방법으로 입증된 균질화 처리 후에 동일하였다. 이후, 크기 감소된 ViPs에 대해 이하에서 언급된 후속 컨쥬게이션 단계를 추가로 수행하였다.
2.2. 전자레인지를 사용한
ViPs의
크기 감소:
컨쥬게이션 이전에 ViPs의 크기를 감소하는 다른 방법은 전자레인지를 사용하여 수행하였다. 유리병 중의 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 전자레인지 내에 50%-100% 전력으로 5-10분 동안 두었다. 전자레인지 내부에서 발생한 마이크로파는 장쇄의 Vi 폴리사카라이드의 글리코실 결합을 분해하여 이들을 담체 단백질에 컨쥬게이션하는데 필요한 더 짧은 분자로 감소시킨다. 이후, 감소된 ViPs의 분자 크기는 상응하는 도면에 나타낸 바와 같이 크기배제 겔투과 크로마토그래피에 의해 확인하였다. ViPs의 체류시간은 크기배제 이전에 13.185분이고(도 3), 크기배제크로마토그래피 이후에 ViPs의 체류시간은 15.18분이었으며(도 5), 이는 ViPs가 약 250 kDa의 상응하는 분자 크기로 감소된 것을 의미한다. 크기 감소된 ViPs의 O-아세틸 함량은 hestrin 방법으로 입증된 마이크로파 처리 후에 동일하였다. 이후, 크기 감소된 ViPs에 대해 이하에서 언급된 후속 컨쥬게이션 방법을 추가로 수행하였다.
2.3. Vi
폴리사카라이드와
파상풍
톡소이드의
링커를 사용한
컨쥬게이션
정제된 (크기 감소가 없거나 크기가 감소된)Vi-폴리사카라이드를 중탄산나트륨 존재하에 부분적으로 탈-O-아세틸화하고 pH 6.0-7.5의 범위에서 EDAC 매개 반응을 사용하여 ADH와 결합시켰다. 서서히 교반하면서, 반응을 2-8℃로 유지하였다. 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 인산염 완충액-EDTA 완충액에 의해 pH를 8.0이 되게 하여 퀀칭하고, 다시 저분자량 컷오프 멤브레인을 사용하여 먼저 인산염, 이후 MES 완충액으로 투석하였다. 최종 혼합물을 농축하고 O-아세틸 함량, Vi Ps-ADH 비율, 자유 ADH에 대해 시험하였다.
파상풍 톡소이드를 농축하고 저분자량 컷오프 멤브레인을 사용하여 MES 완충액으로 투석여과하였다. 최종 농축된 파상풍 톡소이드에 대해 단백질 함량을 시험하였다. 컨쥬게이션에 있어서, 변성 Vi-폴리사카라이드와 단백질을 카보디이미드 축합 존재하에 EDAC를 사용하여 결합하였다. 최종 결합된 분자를 농축하고 1000 kDa 컷오프 멤브레인, 바람직하게 PES(폴리에테르 설폰) 멤브레인을 사용하여 투석여과하고, 이어서 20 투석부피의 인산염 완충 식염수를 사용하여 연속 완충액 교환하였다. 정제된 ViPs-TT를 함유하는 투석잔류물(retentate)에 대해 0.5% 내지 1.5%의 비율 내에 있어야 하는 폴리사카라이드-단백질 비율, Vi-함량, 단백질 함량 및 분자크기분포를 확인하였다. 최종 컨쥬게이트 벌크를 0.22μ 멤브레인을 사용하여 멸균여과하여 2-8℃에서 보관하였다.
경우에 따라, 최종 결합된 분자를 농축하고, 1000 kDa 컷오프 멤브레인, 바람직하게 PES(폴리에테르 설폰) 멤브레인으로 인산염 완충 식염수를 사용하여 투석여과한 다음, 겔투과 컬럼(Sepharose 가교 비즈(beads))에 적재하였다. 0.5% 내지 1.5%의 비율 내에 있는 모아진 분획을 함께 합하여 농축하고 폴리사카라이드-단백질 비율, Vi-함량, 단백질 함량 및 분자크기분포를 확인하였다. 최종 컨쥬게이트 벌크를 0.22μ 멤브레인을 사용하여 멸균여과하여 2-8℃에서 보관하였다.
본 발명의 Vi 폴리사카라이드 컨쥬게이트 벌크의 분자크기분포를 표 2.1에 나타내었다. 본 발명에서 얻어진 ViPs-TT 컨쥬게이트의 분자 크기는 0.3 kDa이고; 컨쥬게이트 ViPs-TT의 이전 연구에서 얻어진 결과와 비교했을 때 제공된 컨쥬게이트의 분자크기분포는 <0.1 kDa였다. 이것은 0.3 kDa의 분자크기분포가 ViPs-TT의 '적절한' 여과를 허용하는 최적의 여과가능한 크기임을 나타내는 동시에, 종래기술에서 제공된 다른 낮은 분자크기분포(들)와 비교하여 컨쥬게이트 백신에 더 양호한 면역원성을 제공하는 것을 의미한다. 분자 크기가 클수록 면역원성이 더 양호한 것을 의미하는 한편, 분자 크기를 ViPs-TT의 여과를 허용하는 적절한 크기로 제한하는 것도 필수적이다. 그러므로, 이러한 0.3 kDa의 분자크기분포로 인해 본 발명에서 정해진 장티푸스 컨쥬게이트 백신은 단 1회 주입만으로 살모넬라 타이피로 유발된 장티푸스에 대한 완전한 백신 접종 스케쥴을 포함하는 것이 충분하다. 종래기술에서는 장티푸스에 대한 낮은 분자크기분포 컨쥬게이트 백신의 경우에 1회 초과 주입, 바람직하게 3회 투여를 처방하고 있다.
총 자유(미결합) Vi 폴리사카라이드의 평가를 HPAEC-PAD 분석으로 측정하였다. 본 방법에서 Vi 컨쥬게이트는 0.30 kDa에서 용출된 75%의 Vi 폴리사카라이드 컨쥬게이트를 얻어서 더 양호한 분산성을 제공하였고, Vi 함량 0.56 mg/ml, 자유 ViPs 5%, 단백질 함량 0.25 mg/mL, Vi Ps-단백질 비율-1.05, 검출할 수 없는 자유 단백질 피크를 얻었으며, 무균성(sterility)이 허용가능한 것을 확인하였다(표 2.1 참조). 본 방법을 10 gms의 ViPs를 초기 뱃치 크기로 수행하여 0.9 mg/ml - 1.0 mg/ml의 Vi 컨쥬게이트 농도에서 8리터의 ViPs 컨쥬게이트 벌크를 수득하여 7-8 gms의 ViPs-TT를 얻어 70%-80%의 수율을 제공하였다.
도 6 내지 7은 Vi-폴리사카라이드 및, 링커를 갖는 다른 스테이지의 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 제공된 HPLC 프로파일은 모두 본 방법의 컨쥬게이션 효율을 분명하게 나타내고 있다.
상기한 바와 같이 살모넬라 타이피로 유발된 장티푸스에 대한 컨쥬게이트 백신 제제의 제조를 위한 정제 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신 항원을 얻는 링커 분자 ADH와의 컨쥬게이션 방법은 다음 단계들로 요약할 수 있다:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양, 공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공된다;
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소, 여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다;
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. EDAC 존재하에 링커 분자 ADH로 단계 (c)의 ViPs 활성화;
e. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (d)의 링커 분자 ADH에 결합된 활성 ViPs를 담체 단백질로 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
f. 단계 (f)의 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 ViPs-담체 단백질 백신 항원을 수득.
2.4. Vi-
폴리사카라이드와
파상풍
톡소이드의
링커가 없는
컨쥬게이션
정제된 (크기 감소가 없거나 크기가 감소된)Vi-폴리사카라이드를 MES (2-모폴리노 에탄 설폰산), 또는 PBS의 완충액, 또는 생리 식염수에 pH 5.0 내지 9.0의 범위(정확하게 pH 6-7.5)에서 취하였고, 폴리사카라이드의 농도는 1.0 mg 내지 20 mg/ml (5 mg/ml)였다. 단백질을 완충액, 예를 들어 MES, 또는 PBS, 또는 생리 식염수에 pH 6.0 내지 9.0의 범위(정확하게 pH 6-7.5)에서 2.0mg/ml 내지 20.mg/ml (10 mg/ml)의 상이한 농도로 취하였다. ViPs 대 단백질의 비율은 1:1 내지 1:3이어야 하고, 그렇게 함으로써 총 1 gm의 ViPs를 취할 경우, 1 gm 내지 3 gm 단백질의 등가물이 컨쥬게이트되는 것을 의미한다. 컨쥬게이션은 실온보다 효과적으로 반응속도를 조절하기 위해 2℃-8℃에서 수행하였다. 컨쥬게이션 속도는 고온에서 매우 빠르다. 폴리사카라이드를 고온에 노출하는 것은 바람직하지 않으며, 왜냐하면 고온에서 컨쥬게이트를 형성한 후, 컨쥬게이트된 폴리사카라이드-단백질 분자의 응집 가능성이 있기 때문이다. 이것은 분자 크기를 증가시켜서, 후속 단계에서 컨쥬게이트 단백질을 추가 정제하는 것이 어렵게 된다. 따라서, 2-8℃에서의 컨쥬게이션이 바람직하다. ViPs와 TT를 상이한 pH 조건의 상기한 완충액 중에서 상이한 농도로 함께 첨가하고 컨쥬게이션을 위해 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간은 실온(25℃)에서 15-45분의 범위이고 2-8℃에서 1시간 내지 2시간 이내이며, (링커로)ADH를 사용하는 컨쥬게이션 방법을 따르면 컨쥬게이션에 필요한 인큐베이션 시간은 2℃ 내지 8℃에서 최소 2-4시간이다. 그러므로, 총 반응시간은 또한 링커와의 컨쥬게이션과 비교하여 링커가 없는 이러한 컨쥬게이션 방법에 따라 감소된다.
최종 결합된 분자를 농축하고 1000 kDa 컷오프 멤브레인, 바람직하게 PES(폴리에테르 설폰) 멤브레인을 사용하여 투석여과하고, 이어서 20 투석부피의 인산염 완충 식염수를 사용하여 연속 완충액 교환하였다. 정제된 ViPs-TT를 함유하는 투석잔류물(retentate)에 대해 0.5% 내지 1.5%의 비율 내에 있어야 하는 폴리사카라이드-단백질 비율, Vi-함량, 단백질 함량 및 분자크기분포를 확인하였다. 최종 컨쥬게이트 벌크를 0.22μ 멤브레인을 사용하여 멸균여과하여 2-8℃에서 보관하였다.
경우에 따라, 최종 결합된 분자를 농축하고, 1000 kDa 컷오프 멤브레인, 바람직하게 PES(폴리에테르 설폰) 멤브레인으로 인산염 완충 식염수를 사용하여 투석여과한 다음, 겔투과 컬럼(Sepharose 가교 비즈)에 적재하였다. 0.5% 내지 1.5%의 비율 내에 있는 모아진 분획을 함께 합하여 농축하고 폴리사카라이드-단백질 비율, Vi-함량, 단백질 함량 및 분자크기분포를 확인하였다. 최종 컨쥬게이트 벌크를 0.22μ 멤브레인을 사용하여 멸균여과하여 2-8℃에서 보관하였다.
본 컨쥬게이션 방법은 링커 분자 없이 10 gms의 ViPs를 초기 뱃치 크기로 수행하여 0.9 mg/ml - 1.0 mg/ml의 Vi 컨쥬게이트 농도에서 8리터의 ViPs 컨쥬게이트 벌크를 수득하여 7-8 gms의 ViPs-TT 컨쥬게이트를 얻어 70%-80%의 수율을 제공하였다.
얻어진 미정제 컨쥬게이트를 GPC, TFF, 이온교환 또는 HIC로 정제하였다. 컨쥬게이트는 약전의 모든 요건에 부합하며 추가 멸균 여과하였다. 도 8 내지 9는 Vi-폴리사카라이드, 및 링커가 없는 상이한 스테이지의 ViPs-TT 컨쥬게이트 벌크의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 제공된 HPLC 프로파일은 모두 본 발명 방법의 컨쥬게이션 효율을 분명하게 나타내고 있다.
상기한 바와 같이 살모넬라 타이피로 유발된 장티푸스에 대한 컨쥬게이트 백신 제제의 제조를 위한 정제 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신 항원을 얻는 링커 분자 ADH가 없는 컨쥬게이션 방법은 다음 단계들로 요약할 수 있다:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양, 공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공된다;
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소, 여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다;
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (c)의 ViPs로 담체 단백질을 가교제 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
e. 단계 (d)의 ViPs-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 ViPs-담체 단백질 백신 항원을 수득.
링커 분자, 예를 들어 ADH는 양 말단에 터미널 아민 그룹을 함유한다. 컨쥬게이션 이전에 그의 크기가 추가로 감소되는 Vi 고유 폴리사카라이드는 원래 다량의 기능성 카복실 그룹(-COOH)을 함유한다. 담체 단백질, 예를 들어 파상풍 톡소이드는 아민(-NH2) 및 카복실 그룹(-COOH)을 모두 함유한다. 링커 분자 ADH에 의한 담체 단백질과 ViPs의 컨쥬게이션이 EDAC 같은 가교제 존재하에 일어나는 경우, 여기에서 ViPs의 -COOH 그룹은 ADH 링커의 하나의 -NH2 그룹과 그의 말단 중 하나를 통해 결합해야 한다. 활성화된 ViPs는 링커 ADH와 결합하며, ADH 분자의 한쪽 말단에서 -CONH 결합으로 연결된다. ADH 분자의 다른 말단은 자유롭게 남아서 적절한 농도와 온도 범위에서 담체 단백질 내에 존재하는 -COOH 그룹과 추후 결합한다. 따라서, 활성화된 ViPs-ADH는 다시 가교제 EDAC 존재하에 담체 단백질과 반응하고, ADH 분자의 다른 말단에 존재하는 -NH2가 담체 단백질 분자의 -COOH 그룹과 결합할 수 있고, 그에 따라 Vi-폴리사카라이드와 담체 단백질 사이에 효과적인 가교를 형성한다. 그러므로, 이 방법에서는 ViPs를 ADH로 처리한 후, 그리고 다시 ViPs-ADH를 담체 단백질에 처리한 후 과량의 링커를 제거할 필요가 있다. 또한 EDAC는 이 방법에서 2번 사용해야 한다.
한편, 링커 분자 없이 담체 단백질과 ViPs를 컨쥬게이트하는 방법에 따르면, ViPs가 자유 -COOH 그룹을 갖고 담체 단백질이 자유 -NH2 그룹을 갖기 때문에 EDAC 같은 가교제 존재하의 처리를 통해 담체 단백질의 -NH2에 ViPs의 -COOH를 직접 결합할 수 있다. 전체 반응이 하나의 단계 내에서 수행되어 ViPs와 담체 단백질의 컨쥬게이션을 달성하는 시간을 줄이고 과량의 EDAC 사용을 최소화한다. 모든 담체 단백질이 자유 -NH2 그룹을 함유하고, ViPs 또한 자유 -COOH를 갖기 때문에 담체 단백질, 예를 들어 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, CRM197 등을 Vi-폴리사카라이드와 이 방법에 의해 컨쥬게이트할 수 있다. 따라서, 담체 단백질에 ViPs를 컨쥬게이팅하는데 어떤 링커 분자(ADH)도 사용할 필요가 없다. 링커가 없는 컨쥬게이션의 이점은 ADH에 의한 ViPs와 담체 단백질 간 연결 분자 결합의 부재로 인하여 컨쥬게이트의 안정성으로 나타난다. 이것은 연결 결합의 부재하에 ViPs-담체 단백질 컨쥬게이트 (이 경우 ViPs-TT)의 향상된 강도 때문에 더 우수한 안정성을 보장한다. ViPs-TT의 추가 분해는 또한 상당한 범위까지 감소한다. 이 방법에서는 또한, 실험을 핸들링하고 수행하는 것이 매우 용이하다. 필요한 EDAC의 총량은 약 50%까지 감소하였고, ADH 링커 방법의 경우에 2회 사용하는 대신에 단 1회만 핸들링한다. (EDAC는 장시간 노출시 단백질 응고를 유발할 가능성이 있는 자극제이다.) 추가적으로, 과량의 링커를 제거하기 위한 GPC 컬럼 또는 TFF 시스템이 필요하지 않다. 단계가 감소하면 담체 단백질(예를 들어, TT)에 컨쥬게이션해야하는 ViPs의 손실을 최소화할 수 있으며, 왜냐하면 ViPs-ADH 결합과 관련한 정제단계를 생략하기 때문이다. 하기한 표에는 링커 분자가 있는 것과 없는 것을 비교하여 단계가 감소된 전체 컨쥬게이션 실험의 완료 및 소요된 총 시간을 예시하였다.
실시예
3: 백신 제제 및 안정성
본 발명에 따른 장티푸스 컨쥬게이트 백신 제제의 전형적 1회 투여는 완전 백신접종 스케쥴에서 1회 주사를 위한 최대 0.5 ml의 총 부피로 제조된 생리식염수에 용해된 15 마이크로그람(μg) 내지 25 μg의 Vi-TT 컨쥬게이트를 항원으로 포함한다.
본 발명에 따른 백신 제제는 또한 다회 투여용(multi-dose) 바이알 형태로도 사용할 수 있다. 다회 투여용 바이알은 (5명의 상이한 백신접종자(vaccinees)/대상/예정된 백신 수용자(recipients)용)5 투여, 또는 (10명의 상이한 백신접종자/대상/예정된 백신 수용자용)10 투여일 수 있다. 다회 투여용 바이알의 경우에, 동일한 백신 다회 투여용 바이알로부터 5-10명의 개별 어린이를 백신 접종하기 위해서 보존제를 백신 제제에 첨가하여 바이알의 다수 자침(pricking) 동안 백신 제제의 오염을 방지한다. 본 발명에 따른 ViPs-TT 장티푸스 컨쥬게이트 백신 제제의 다회 투여용 바이알은 독특한 보존제 2-페녹시 에탄올을 사용하며, 이것은 염화수은과 티오머살(thiomersal)이 없다. 발암성(carcinogenicity)에 기여하는 염화수은 및 티오머살 같은 일반 보존제를 사용하는 단점은 당분야의 현재 기술에 보고되어 있다. 그러므로, 이러한 독특한 보존제 2-페녹시 에탄올의 사용은 일반 보존제인 염화수은과 티오머살의 단점을 해결한다. 다회 투여용 바이알과 그 제제의 상세한 설명을 이하에 표로 기재하였다:
BBIL의 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 안정성을 3년 동안 상세하게 시험 및 확인하였다. Vi Ps 장티푸스 컨쥬게이트 ViPs-TT 백신을 6개월 동안의 가속 보관조건(25℃±2℃)과 36개월 동안의 실시간 보관조건(2℃ 내지 8℃)에 대한 안정성 시험을 수행하였고 얻어진 시험 결과가 제한 내에 있고 필요한 규격에 부합하는 것을 확인하였다(표 3.2 내지 3.5).
실시예
4: 임상시험
최종 Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 벌크를 제제화하고 면역원성에 대해 Balb/c 마우스에서 고유의 폴리사카라이드 백신과 비교하여 시험하였다. 백신의 예방효능을 평가하기 위해 과제 연구를 수행하였고, 비정상적, 급성 및 전신 독성을 실험동물에서 확보하기 위해 예비 임상시험을 수행하였다. 또한, 시험 백신 Vi 피막 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 (Vi-TT)의 유효성을 2가지 상이한 농도의 투여량(투여 당 15μg과 25μg)에서 시험하였고 두 농도 모두 유아, 어린이 및 성인에서 예방성 항체를 유도하는 것으로 나타났다. BBIL Vi-TT 컨쥬게이트 백신의 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 단백질 컨쥬게이트의 면역원성과 안전성을 참조 백신인 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드 백신 Typbar®와 비교하여 평가하였다.
임상 II상: 총 100명을 등록하여 13 내지 17세의 건강한 10대, 6-12세와 2-5세의 어린이에서 참조 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드 백신 Typbar®와 비교하여 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드-TT 단백질 컨쥬게이트 백신의 안전성과 면역원성을 평가하였다. 이 시험에서는 시험 백신 Vi 피막 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 (Vi-TT)가 모든 연령군에서 면역원성과 반응성원성(reactogenicity)과 관련하여 참조 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드 백신 Typbar®보다 월등한 것으로 입증되었다. Vi IgG의 기하평균은 밀리리터당 ELISA UNITS(EU/ml)로 플레인 (plain) Typbar®의 사전 백신 접종 혈청과 비교하여 각각 4배 초과 상승 80%, 100% 및 70% 증가하였다.
장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 백신 (Vi-TT)의 시험 백신을 13-17세의 10대 및 2-6세 연령군에 단일 주사로 투여당 25mcg를 투여하였다. Vi IgG의 기하평균(EU/ml)은 사전 백신 접종된 혈청과 비교하여 양 연령군에서 각각 4배 초과 상승 100% 증가하였다. 따라서, 2-5세의 연령군은 2회 주사에서 투여당 25 μg을 주사하였다. 2차 주사 투여를 위한 시간 간격은 각각 6주였다. Vi IgG의 기하평균(EU/ml)은 사전 백신 접종된 혈청과 비교하여 이 연령군에서 각각 4배 초과 상승 100% 증가하였다.
또다른 군은 2-5세의 연령군에서 2회 주사로 투여당 15 μg으로 디자인되었다. 2차 주사 투여를 위한 시간 간격은 각각 6주였다. Vi IgG의 기하평균(EU/ml)은 사전 백신 접종된 혈청과 비교하여 2-5세의 연령군에서 각각 4배 초과 상승 100% 증가하였다.
1회 주사로 25 μg, 2회 주사로 투여당 25 μg 및 2회 주사로 투여당 15 μg 주사된 모든 시험군은 100% 혈청전환율을 나타냈다. Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 단백질 컨쥬게이트 백신에 대한 항체 반응은 모든 연령군에서 참조 고유 폴리사카라이드 백신보다 월등하였다. 따라서, BBIL의 시험 백신 장티푸스 Vi 피막 폴리사카라이드 파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 (Vi-TT) 백신이 이미 상업적으로 입수가능한 BBIL의 참조 백신 Typbar®보다 면역성인 것으로 결론지을 수 있다.
임상 III상에서 대상수에 대한 상세: 장티푸스 Vi-폴리사카라이드-TT 컨쥬게이트 백신 ViPs-TT (Typbar-TCV™) Vs. 플레인(plain) 장티푸스 Vi-폴리사카라이드 백신 (Typbar®, 참조 백신)의 면역원성과 안전성을 평가하기 위해 총 981명의 대상을 장티푸스 컨쥬게이트 ViPs-TT 백신과 참조 백신 Typbar®에 할당하였다. BBIL의 장티푸스 컨쥬게이트 ViPs-TT 백신, 기하평균 역가(GMT) 및 혈청전환율-4-배(fold)(%)를 3 연령군(6개월 내지 2세, >2 내지 <15세 및 15 내지 45세) 사이에서 장티푸스 컨쥬게이트 시험 ViPs-TT 백신 (Typbar-TCV™)에 대해 분석하였다. 장티푸스-TT 컨쥬게이트 백신으로 42일째에 6개월 내지 2세, >2 내지 <15세 및 15 내지 45세 사이 연령군 대상의 GMT는 각각 ELISA에 의한 장티푸스 항 Vi IgG 항체 1952.03 EU/ml, 1555.51 EU/ml, 및 812.97 EU/ml였다. 장티푸스-TT 컨쥬게이트 백신의 6개월 내지 2세, >2 내지 <15세 및 15 내지 45세 사이 연령군 대상의 혈청전환율(4-배 역가 상승)은 42일째에 각각 98.05%, 99.17% 및 92.13% 였다(도 12).
2 내지 <15세 연령군에서, 42일째에 장티푸스-TT 컨쥬게이트 Typbar-TCV™ 백신 및 장티푸스 백신 Typbar® 군의 GMT는 각각 ELISA에 의한 장티푸스 항 Vi IgG 항체 1555.51 EU/ml 및 426.63 EU/ml였다(p=0.00001). 42일째에 Typbar-TCV™ 백신과 장티푸스 백신 Typbar® 사이의 혈청전환율(4-배 역가 상승)은 각각 99.17% 및 94.86%였다(p=0.0086).
15 내지 45세 연령군에서, 42일째에 Typbar-TCV™ 백신 및 장티푸스 백신 Typbar® 군의 GMT는 각각 ELISA에 의한 장티푸스 항 Vi IgG 항체 812.97 EU/ml 및 376.81 EU/ml였다(p=0.00001). 42일째에 Typbar-TCV™ 백신과 장티푸스 백신 Typbar® 군 사이의 혈청전환율(4-배 역가 상승)은 각각 92.13% 및 89.01%였다 (p=0.4737).
장티푸스-TT (ViPs-TT) 컨쥬게이트 백신의 우수성은 GMT 포스트(post) 백신 접종과 관련하여 플레인 폴리사카라이드 백신보다 3.16배 더 높다. 장티푸스 컨쥬게이트 백신(시험)의 포스트 대 프리(Pre) 역가비율의 추정 GMT는 플레인 폴리사카라이드 백신(참조)보다 3.53배 더 높았다. 혈청전환율과 관련하여, 장티푸스 컨쥬게이트 백신이 0.016%의 차이로 플레인 폴리사카라이드 백신보다 훨씬 월등하였다.
BBIL Typbar-TCV™의 ViPs-TT 컨쥬게이트 백신의 임상시험 III상 데이터의 요약을 이하에 참조 백신 Typbar®(도 12 및 13)와 비교하여 기술하였고, 또한 Peda Typh™와 비교하여 하기 표에 나타내었다:
실시예
5:
TCV와
홍역 간섭(Interference) 시험
Typbar-TCV™는 파상풍 톡소이드 담체 단백질에 컨쥬게이트된 Vi-폴리사카라이드 백신의 조제물이다. Vi 컨쥬게이트 백신을 접종한 어린이가 플레인 Vi-폴리사카라이드 백신을 접종한 어린이보다 높은 수준의 항-Vi IgG 혈청 항체를 얻어서 유지하는 것으로 입증되었다. Typbar-TCV™ (ViPs-TT 컨쥬게이트 백신)는 면역화 스케쥴에서 출생 후 6 내지 24개월 사이, 바람직하게 9개월 이내에 투여하는 것이 제안되었다. 홍역 백신 면역화 또한 동시에 수행되어야 하므로 두 백신을 조합하여 1회 주사로 투여하는 것이 부가적인 이점을 제공할 것이다. 이를 수행할 수 있도록 각각의 생물학적 및 화학적 특성에 대한 두 백신의 간섭을 연구하여야 한다. 상기한 제안에 따라, 동결건조된 홍역 백신과 액체 Typbar-TCV™ (ViPs-TT 컨쥬게이트 백신)를 재구성하여 25℃에서 인큐베이션한 후에 (Typbar-TCV™에 대한)O-아세틸 함량 시험과 (홍역 백신에 대한)세포병변효과를 0시간, 4시간, 8시간 및 12시간일 때 수행하는 시험을 디자인하였다. 두 백신의 이화학적 및 생물학적 파라미터가 상기한 온도 및 시점의 규격 내에 있는지 확인하였다. 이 시험은 단기간 동안의 재구성된 백신 제품에 대한 실험적 사실의 개요를 제공한다.
수행 시험:
Hestrin
방법에 의한 O-아세틸 함량
Vi-폴리사카라이드는 3번 탄소가 O-아세틸화된 (1-4)-20아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락투론산으로 구성된 선형 호모폴리머이다. 정제된 Vi-폴리사카라이드의 O-아세틸 함량은 Vi의 면역원성에 중요하며 이것은 Hestrin 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
결과:
Typbar-TCV™ (ViPs-TT 컨쥬게이트 백신)로 재구성된 홍역 백신을 25℃에서 인큐베이션하고 Hestrin 방법으로 O-아세틸 함량을 분석하였다. 대조군으로 Typbar-TCV™ (ViPs-TT 컨쥬게이트 백신)를 2-8℃에서 유지하였고, 출발시점에서 25℃의 Typbar-TCV™ (ViPs-TT 컨쥬게이트 백신) 또한 동시에 분석하였다. 예상된 바와 같이, 2-8℃와 25℃에서 대조 샘플들의 O-아세틸 함량은 초기값에 근사하였다. 조합 백신(홍역+TCV)의 O-아세틸 함량은 0시간일 때 허용기준보다 더 높았다(0.151 μmoles/투여). 이것은 시간에 따라 4시간과 8시간에 감소하였고(0.086 및 0.058 μmoles/투여), 허용기준 내에 있지만 2-8℃와 25℃의 값만 Typbar-TCV™와 비교했을 때 상이하였다.
수행된 시험:
세포병변효과
(
CPE
) 방법에 의한 효능 시험
홍역 백신은 생약독화 백신이다. 제조된 홍역 백신 대수적 희석물을 적정하기 위해 각각의 대수적 희석물을 베로(vero) 세포주에 8회 반복 접종하고 7-8일 동안 인큐베이션하여 세포병변효과를 확인하였다. 바이러스 역가를 Spearman Karber식으로 계산하였고, 결과를 이하에 나타내었다:
결과: 이 결과로부터, 홍역 백신은 그의 희석물로 재구성했을 때 12시간 동안 안정하고 Typbar-TCV™(ViPs-TT 컨쥬게이트 백신)와 재구성했을 때 4시간 동안 안정하고 4 내지 8시간 사이에 저하되는 것을 발견하였다.
Claims (20)
- 담체 단백질에 컨쥬게이트된 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)의 피막 Vi-폴리사카라이드 (ViPs)를 백신 항원으로 포함하고, 완전한 백신 접종 스케쥴을 포함하는 단 1회 주입으로 2세 이하의 어린이에서 필요한 T-의존성 면역반응을 유도하는 것이 충분한, 살모넬라 타이피로 인한 장티푸스를 예방하기 위한 백신 제제.
- 제1항에 있어서, 백신 항원이 투여당 5μg 내지 25 μg, 바람직하게 투여당 25 μg의 농도로 존재하는 것인 백신 제제.
- 제1항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 바람직하게 파상풍 톡소이드로부터 선택되는 것인 백신 제제.
- 제1항에 있어서, 백신 항원이 다음을 포함하는 방법으로 제조되는 것인 백신 제제:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양(공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공된다);
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소(여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다);
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. EDAC 존재하에 링커 분자 ADH로 단계 (c)의 ViPs 활성화;
e. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (d)의 링커 분자 ADH에 결합된 활성 ViPs를 담체 단백질로 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
f. 단계 (f)의 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 ViPs-담체 단백질 백신 항원을 수득. - 제1항에 있어서, 백신 항원이 다음을 포함하는 방법으로 제조되는 것인 백신 제제:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양(공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공된다);
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소(여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다);
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (c)의 ViPs로 담체 단백질을 가교제 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
e. 단계 (d)의 ViPs-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 ViPs-담체 단백질 백신 항원을 수득. - 제4항 또는 제5항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드인 것인 백신 제제.
- 다음 단계들을 포함하는 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트 백신 항원의 제조방법:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양(공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공된다);
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소(여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다);
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. EDAC 존재하에 링커 분자 ADH로 단계 (c)의 ViPs 활성화;
e. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (d)의 링커 분자 ADH에 결합된 활성 ViPs를 담체 단백질로 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
f. 단계 (f)의 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 백신 항원을 수득. - 다음 단계들을 포함하는 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신 항원의 제조방법:
a. 정제된 ViPs를 얻기 위해 공급 배지를 사용하는 유가 방식 배양(공급 배지는 6.90 내지 7.20 범위로 유지된 pH 및 40%-60%로 유지된 용존 산소 농도에서 1 내지 2 mg/mL 농도 범위로 글루코스를 함유하는 용액을 공급하는 것을 포함하고, 여기서 암모니아 용액(50%)이 질소 공급원으로 공급 배지와 함께 제공되고; 소포액을 추가 포트를 통해 무균적으로 펌핑하여 거품 발생을 제어한다);
b. 경우에 따라 ViPs의 크기 감소(여기서 5-7.5 mg/ml 농도의 ViPs를 1500 bar, 2-8℃에서 고압 균질화하고 동일한 작업을 적어도 45회 또는 전자레인지로 반복하여 약 250 kDa의 정제된 ViPs의 상응하는 분자 크기를 얻는다);
c. 단계 (a) 또는 단계 (b)의 정제된 ViPs를 가교제 EDAC로 처리;
d. ~900 kDa의 정제된 ViPs 1 mg/ml 내지 5 mg/ml 농도 또는 ~250 kDa의 정제된 ViPs 5 mg/ml 내지 7.5 mg/ml 농도에서 단계 (c)의 ViPs로 담체 단백질을 가교제 EDAC 존재하에 처리하여 Vi-폴리사카라이드-담체 단백질 컨쥬게이트를 형성;
e. 단계 (d)의 ViPs-담체 단백질 컨쥬게이트의 인산염 완충 식염수를 사용한 연속 완충액 교환을 통해 1000 kDa 멤브레인으로 투석여과하여 정제된 ViPs-담체 단백질 백신 항원을 수득. - 제7항 또는 제8항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드인 것인 백신 제제.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, ViPs-담체 단백질 컨쥬게이트 분자의 분자 크기가 0.25 kDa 내지 0.35 kDa의 범위인 것인 백신 제제.
- 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 컨쥬게이트 ViPs-담체 단백질 분자의 수율이 70% 내지 80%의 범위인 것인 백신 제제.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 컨쥬게이트 ViPs-담체 단백질 분자의 수율이 70% 내지 80%의 범위인 것인 백신 제제.
- 담체 단백질 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이트된 살모넬라 타이피 Vi 폴리사카라이드를 포함하고, 살모넬라 타이피에 대해 필요한 T-의존성 면역반응을 유도하는 것이 충분한 백신 제제를 투여하여 완전한 백신 접종 스케쥴을 포함하는 단 1회 주입으로 2세 이하의 어린이에서 살모넬라 타이피로 인한 장티푸스를 예방하는 방법.
- 제13항에 있어서, 백신 항원이 투여당 5μg 내지 25 μg, 바람직하게 투여당 25 μg의 농도로 존재하는 것인 백신 제제.
- 제1항 또는 제13항에 있어서, 2-8℃에서 3년 동안, 25℃에서 적어도 6개월 동안 안정한 것인 백신 제제.
- 제1항 또는 제13항에 있어서, 다회 투여용 바이알 경우에 안정화제로 2-페녹시에탄올을 추가로 포함하는 것인 백신 제제.
- 제1항 또는 제13항에 있어서, 백신 제제의 혈청전환율(%)이 6개월 내지 24개월의 연령군에서 98% 내지 100%, 2세 내지 15세의 연령군에서 99% 내지 100%, 백신 접종 후 42일째에 4배(four fold) 증가 혈청전환율을 92.13% 제공하는 연령군에서 90% 내지 100%인 것인 백신 제제.
- 제1항에 있어서, Vi 폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 컨쥬게이트 항원과 홍역 항원 간의 항원 간섭(interference) 없이 홍역 백신 제제와의 재구성물로서 사용되는 것인 백신 제제.
- a. 살모넬라 타이피 Vi-폴리사카라이드-파상풍 톡소이드 (ViPs-TT) 컨쥬게이트 항원;
b. 홍역 항원을 포함하고;
ViPs-TT와 홍역 항원의 항원 간섭이 없으며,
완전한 백신 접종 스케쥴을 포함하는 단 1회 주입으로 2세 이하의 어린이에서 살모넬라 타이피에 대해 필요한 T-의존성 면역반응을 유도하는 것이 충분한, 살모넬라 타이피로 인한 장티푸스 및 홍역 바이러스를 예방하는 조합된 백신 제제. - 제19항에 있어서, 백신 항원이 투여당 투여당 5μg 내지 25 μg, 바람직하게 투여당 25 μg의 농도로 존재하는 것인 백신 제제.
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