JP2011074087A - 髄膜炎菌血清群aおよびcに対する免疫方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のワクチンは、ワクチンの単回投与として調製される少なくとも2つの別個の多糖−タンパク質複合体を含む。髄膜炎菌血清群AおよびCの精製された莢膜多糖は、化学的に活性化され、共有化学結合により担体タンパク質に選択的に結合され、幼児において様々の髄膜炎菌株に対する長期間の免疫性を誘発することができる多糖−タンパク質複合体を形成する。
【選択図】 なし
Description
粗製粉末の調製
髄膜炎菌血清群AおよびCの湿式凍結種細胞を解凍し、液体ワトソン・シャープ(Watson Scherp)培地を用いて解凍および回収し、ミューラー・ヒントン寒天培地を含むブレークボトル(Blake bottle)に播いた。ブレークボトルを35℃から37℃でCO2雰囲気中において15時間から19時間インキュベートした。インキュベーション時間に続いて、ブレークボトルから増殖細胞を取り除き、ワトソン・シャープ培地を含む4Lフラスコに添加した。プラットフォームシェーカーにおいて、フラスコを35℃から37℃で3時間から7時間インキュベートした。4Lフラスコの内容物を、ワトソン・シャープ培地含有発酵容器に移した。栄養補助物質の供給および消泡剤の添加によって溶解酸素含量およびpHを制御しながら、発酵容器を35℃から37℃で7時間から12時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、発酵容器の内容物を500Lタンクに移し、セタブロン(Cetavlon)(登録商標)を添加し、さらに1時間混合した。セタブロン処理増殖細胞を、約15,000から17,000xgで、約30から70リットル/時間の流速で遠心した。第2のセタブロン沈殿で上清から粗多糖を沈殿させた。セタブロンを上清に添加し、室温で1時間以上混合した。材料を1℃から5℃で8時間から12時間保管した。約45,000から50,000xgで、300から400ml/分の流速で遠心して、沈殿多糖を採取した。集めたペーストをさらに加工するまで−60℃以下で保管した。不活性のペーストをいくつかのバッチで調製し結合してもよい。
不活化ペーストを解凍し、ブレンダーに移した。ペーストを0.9M塩化カルシウムと混合して、均一な懸濁液を得た。懸濁液を約10,000xgで15分間遠心した。上清をリントフリーのパッドを通して、第1抽出物として静かに容器に注いだ。第2容量の0.9M塩化カルシウムをペーストに添加し、さらに混合して均一懸濁液を得た。懸濁液を上記のように遠心して、その上清を第1抽出から得た上清と混ぜ合わせた。全体で4回の抽出を実施し、上清をプールした。10−30kDA MWCO渦巻状限外濾過ユニットを用いて限外濾過することによって、プールした抽出物を濃縮した。
調製に用いられる材料は、上記の実施例により調製された髄膜炎菌血清群AおよびC由来の精製莢膜多糖粉末、滅菌50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、滅菌1N塩酸、滅菌1N水酸化ナトリウム、30%過酸化水素、および滅菌生理食塩水(0.85%塩化ナトリウム)を含む。あるいは、酢酸ナトリウムバッファーに代えてクエン酸バッファーでもよい。
この調製で用いられる材料として、上記の実施例2により調製された髄膜炎菌血清群AおよびCの過酸化水素解重合莢膜多糖、アジピン酸ジヒドラジド、血清群Aのみに関して1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)、シアノボロ水素化ナトリウム (sodium cyanoborohydride)、滅菌1N塩酸、滅菌1N水酸化ナトリウム、滅菌塩化ナトリウム、および滅菌生理食塩水(0.85%塩化ナトリウム)が挙げられる。
粗ジフテリアトキソイドタンパク質の調製
凍結乾燥種細胞を再生させて16から18時間インキュベートした。培養液の一部を、増殖培地を含有する0.5リットルフラスコに移し、回転式振とう培養器において、34.5から36.5℃で7から9時間培養フラスコをインキュベートした。増殖培地を含有する4リットルフラスコに培養フラスコから一部を移し、回転式振とう培養器において、34.5から36.5℃で14から22時間培養フラスコをインキュベートした。4リットルフラスコからの培養液を用いて、増殖培地含有発酵槽に播種した。発酵槽を34.5から36.5℃で70から144時間インキュベートした。発酵槽の内容物を、デプスフィルターを通して回収容器に濾過した。0.2%濃度になるように、回収物に37%ホルムアルデヒド溶液を添加した。pHを7.4から7.6に調整した。0.2μmフィルターカートリッジを通して滅菌20リットルボトルに回収物を濾過した。34.5から36.5℃で7日間ボトルをインキュベートした。0.4%濃度になるように、各20リットルボトルに37%ホルムアルデヒド溶液を添加した。混合物のpHを7.4から7.6に調整した。振とう撹拌器において、34.5から36.5℃で7日間ボトルをインキュベートした。0.5%濃度になるように、各20リットルボトルに37%ホルムアルデヒド溶液を添加した。混合物のpHを7.4から7.6に調整した。34.5から36.5℃で8週間ボトルをインキュベートした。無毒化に関して粗トキソイドを試験した。試験期間の間、1から5℃でボトルを保管した。
粗トキソイドを室温まで暖め、20リットルボトルの内容物を合わせて精製タンクに入れた。トキソイドのpHを7.2から7.4に調整し、活性炭を粗トキソイドに添加して2分間混合した。活性炭−トキソイド混合物を1時間放置し、その後デプスフィルターカートリッジを通して第2精製タンクに濾過した。70%飽和になるように固形硫酸アンモニウムを濾液に添加した。pHを6.8から7.2に調整し、溶液を16時間放置した。沈殿したタンパク質を濾過によって回収し、70%飽和硫酸アンモニウム溶液(pH7.0)で洗浄した。沈殿物を滅菌蒸留水中に溶解させ、タンパク質溶液をステンレス回収容器に濾過した。pHを6.8から7.2に調整し、40%飽和になるように硫酸アンモニウムを添加した。溶液のpHを7.0から7.2に調整し、溶液を16時間放置した。濾過によって沈殿物を除去し、捨てた。60%飽和になるように濾液に硫酸アンモニウムを添加し、さらにpHを7.0から7.2に調整した。混合物を16時間放置し、沈殿したタンパク質を濾過によって回収した。沈殿物を滅菌蒸留水に溶解させ、溶けていないタンパク質を濾過によって除去し、さらに0.85%生理食塩水に対して限外濾過した。
15g/リットルまでタンパク質溶液を濃縮し、3000MWCO再生セルロースカートリッジを用いて、10容量の0.85%生理食塩水に対して限外濾過した。0.2μmメンブランを通して濾過することによって、濃縮タンパク質を滅菌した。複合体に加工するまで、タンパク質溶液を1から5℃で保管した。
この調製に用いられる材料として、上記の実施例により調製された髄膜炎菌血清群AおよびCのアジピン酸誘導体化多糖、上記の実施例により調製された滅菌ジフテリアトキソイドタンパク質、EDAC、硫酸アンモニウム、滅菌1N塩酸、滅菌1N水酸化ナトリウム、および滅菌生理食塩水(0.85%)が挙げられる。
髄膜炎菌AおよびC複合体の調製で使用される材料は、上記の方法により調製されてもよい。好ましくは、ワクチン組成物は、滅菌された発熱物質のない、リン酸緩衝生理食塩水中で形成される。生理食塩水濃度は、0.9%の15mM塩化ナトリウムおよび10mMリン酸ナトリウムにより達成されてもよい。好ましくは、ワクチン組成物はアルミニウムを含まない。
二価A/C多糖ワクチン対二価A/C複合体ワクチンに対する免疫応答を比較する臨床研究を、幼児の被験者で行った。この研究において、幼児の第3グループは対照群として機能するよう登録され、インフルエンザ菌タイプb複合体を受けた。全ての3つのワクチングループは、同じ小児ワクチンを受ける。二価A/C複合体グループは、6、10、および14週にジフテリア複合体ワクチン(投与量ごとに4μg多糖)の3回投与を受けた。二価A/C多糖グループは、10および14週にA/C多糖ワクチン(投与量ごとに50μg多糖)の2回投与を受けた。インフルエンザ菌タイプb複合体グループは、6、10、14週に複合体ワクチンの3回投与を受けた。6週、ワクチン接種前、およびワクチン接種後4週である18週に、血液標本を採取する。子供が11-12ヶ月である時、血液標本を採取し、二価AC複合体または二価AC多糖ワクチンを受けた子供は、AC多糖の追加免疫投与を受けた。多糖の追加免疫投与の理由は、被験者が既往(anemestic)反応を誘発するか否かを評価するためである。
通常の幼児免疫と同時にジフテリアトキソイドに結合された多糖AおよびCのワクチン(A/C複合体)または標準的なA/C多糖(A/C PS)ワクチンの1-4投与を受けるニジェールにおける618人の幼児の非盲検無作為化対照臨床試験における臨床研究が示される。24ヶ月において、A/C PSワクチンが与えられ、記憶反応を1週間後に測定した。ELISAにより、血清殺菌活性(SBA)およびIgG抗体を測定する。
EPIワクチン接種に対する反応
6つのグループ間で、EPIワクチン(ジフテリア、破傷風、ポリオウィルス1、2および3、百日咳)に対する抗体濃度において違いはない。結果は、以下の表7−18に示される。A/C複合体は、EPIプログラムに含まれる他の抗原に対する免疫原性に影響を与えない。
Claims (17)
- 患者中で髄膜炎菌の莢膜多糖AおよびCに対する免疫応答を誘発するアルミニウムを含まない免疫組成物であって、前記組成物が2つのタンパク質−多糖複合体を含み、第1の複合体が1つ以上の担体タンパク質に結合した髄膜炎菌の血清群Aの莢膜多糖を含み、第2の複合体が1つ以上の担体タンパク質に結合した髄膜炎菌の血清群Cの莢膜多糖を含むことを特徴とする免疫組成物。
- 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイドであることを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記担体タンパク質および多糖が、リンカーと共有結合していることを特徴とする請求項2記載の免疫組成物。
- 前記リンカーが、アジピン酸ジヒドラジドであることを特徴とする請求項3記載の免疫組成物。
- 前記莢膜多糖AおよびCが、5から100kDaまでの平均サイズを有することを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記莢膜多糖AおよびCが、10から75kDaまでの平均サイズを有することを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記莢膜多糖AおよびCが、10から50kDaまでの平均サイズを有することを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記莢膜多糖AおよびCが、10から30kDaまでの平均サイズを有することを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記莢膜多糖AおよびCが、10から25kDaまでの平均サイズを有することを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記組成物が、アジュバントを含むことを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記免疫組成物が、単回投与で患者に投与されることを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記患者が、前記免疫組成物が投与される際に12ヶ月未満であることを特徴とする請求項11記載の免疫組成物。
- 前記免疫組成物が、ジフテリア、破傷風、ポリオウィルス、または百日咳に対するワクチンの投与と同日にまたは6ヶ月以内に投与されることを特徴とする請求項1記載の免疫組成物。
- 前記免疫組成物が、ジフテリア、破傷風、ポリオウィルス、または百日咳に対するワクチンの投与と同日にまたは3ヶ月以内に投与されることを特徴とする請求項13記載の免疫組成物。
- 前記免疫組成物が、ジフテリア、破傷風、ポリオウィルス、または百日咳に対するワクチンの投与と同日にまたは1ヶ月以内に投与されることを特徴とする請求項14記載の免疫組成物。
- 前記免疫組成物が、ジフテリア、破傷風、ポリオウィルス、または百日咳に対するワクチンの投与と同日に投与されることを特徴とする請求項15記載の免疫組成物。
- 前記ワクチンが、ポリオウィルスタイプ1、2または3であることを特徴とする請求項14記載の免疫組成物。
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