CN108295252A - 一种制备狂犬病结合疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：（a）经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；（b）将步骤（a）制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原‑载体蛋白免疫原性结合物。（c）将步骤（b）制备的狂犬病病毒抗原‑载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。本发明还涉及根据上述狂犬病免疫原性结合物制备的一种新的狂犬病结合疫苗（Rabies Conjugate Vaccine RCV）及其制备方法。初步证明，本发明克服了现有技术的缺陷，具有较好的效果。

Description

一种制备狂犬病结合疫苗的方法
本申请是申请号为201710381237.2，申请日为2017年5月25日，发明名称为“一种狂犬病免疫原性结合物和疫苗及其制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体的涉及疫苗及疫苗的制备，尤其是一种狂犬病免疫原性结合物及其制备方法以及一种狂犬病结合疫苗及其制备方法。
背景技术
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染所致的急性传染病，是一种自然疫源性的人畜共患性急性传染病。狂犬病病毒主要通过被感染动物的唾液直接接触破损的皮肤或粘膜传染人。狂犬病一旦发病，其病死率几乎是100％。犬是狂犬病病毒最主要宿主，高达99％的人狂犬病是经犬传染的。蝙蝠是美洲人狂犬病死亡的主要来源，最近出现在澳大利亚和西欧的蝙蝠狂犬病成为公共健康威胁。除南极洲外所有大陆都有狂犬病发生，WHO估算全球每年因狂犬病死亡的人数高达59,000例，其中超过95％的人狂犬病病例发生在亚洲和非洲(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/)。中国人间狂犬病发病在2007年疫情高峰时，年报告病例数达3300例，2004‐2014年，狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡数的前3位(中国疾病预防控制中心.狂犬病预防控制技术指南.2016)。
狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdovividae)狂犬病病毒属(Lyssaviruses)。狂犬病病毒属包括12个种、4个血清型、7个基因型，狂犬病病毒是导致人类感染狂犬病最主要的种，属于Ⅰ型血清型Ⅰ型基因型。狂犬病病毒颗粒典型的形态是一端平坦式略凹状，另一端半圆型，酷似子弹故名弹状病毒(Rhabdoyivus)。病毒大小为75～80×170～180nm，病毒基因组是单股负链RNA，11162个核苷酸，编码5种结构蛋白，分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和依赖RNA的RNA多聚酶(RNA dependent RNA polymerase or Large protein，L)。狂犬病病毒遗传较稳定，从世界范围分离的狂犬病毒均可被单一抗血清中和。
目前在临床症状出现之前尚无检测手段诊断是否已感染了狂犬病病毒。迄今为止狂犬病仍是人类无法治愈的疾病，因为目前尚无治疗药物，一旦发病其病死率几乎是100％。使用抗病毒的药物、干扰素和大剂量的特异狂犬病免疫球蛋白仅能延长病程，仍不能避免死亡。与许多其他感染疾病不同的是，狂犬病是通过接种疫苗可以预防的疾病，而且即便在暴露于狂犬病病毒后及时接种疫苗并和狂犬病免疫球蛋白联合使用可有效防止死亡(Rabies vaccines:WHO position paper 2010)。
狂犬病的潜伏期通常是数周至数月，也可短至数天长至数年(ACIP.Use of aReduced(4‐Dose)Vaccine Schedule for Postexposure Prophylaxis to Prevent HumanRabies.2010)。黄少新报道桂林市狂犬病249例病例的潜伏期最短仅有1天，最长为3650天(黄少新.职业与健康.2013,29(17):2123‐2126)。刘富强等报道湖南省狂犬病1059例病例的潜伏期最短为2天，最长为4636天(刘富强等.中国自然医学杂志.2008,10(4):263‐268)。曹明华等报道安徽省狂犬病416例病例的潜伏期最短只有2天，最长为5606天(曹明华等.安徽预防医学杂志.2013,19(1):1‐4)。余春等报道贵州省狂犬病2065例病例的潜伏期最短仅为2天，最长13年(余春等.医学动物防治.2016(2):145‐147)。
狂犬病疫苗大部分是用于暴露后的免疫(Post Exposure Prophylaxis PEP)，通过被动免疫或主动免疫效应在狂犬病病毒侵入中枢神经系统(Central Nervous SystemCNS)之前被阻截，以发挥PEP的效力(Wilde H.Vaccine.2007,25(44):7605‐9)。既然存在狂犬病潜伏期仅为数天的病例，需要疫苗在人体内迅速诱导免疫应答反应，产生早期免疫保护，并提供持久的免疫保护效力。然而，对于潜伏期较短的病例，狂犬病病毒会迅速侵入神经系统，PEP措施不能阻断病毒复制，不能防止狂犬病病毒对大脑感染(Terryn S,etal.PLOS Neglected Tropical Diseases.2016,8,2:1‐15)。
自1885年路易巴斯德发明人用狂犬病疫苗以来，狂犬病疫苗经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，发展到目前的经原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞、原代鸭胚细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、恒河猴胎儿二倍体细胞、人二倍体细胞培养的纯化疫苗。无论早期的粗制疫苗还是现在的纯化疫苗，130年以来狂犬病疫苗抗原均是灭活的全病毒颗粒(Virus Particle)。灭活的全病毒颗粒疫苗刺激机体产生狂犬病病毒特异性CD4+T细胞、B细胞及抗体(Faber M et al.Proc Natl Acad Sci USA.2009,106(27):11300‐11305)。这些灭活的狂犬病全病毒颗粒抗原在体内主要由MHCⅡ类分子提呈，诱导CD4+ T细胞，产生抗体，属于以体液免疫为主的免疫应答机制(李茂光.乙型脑炎疫苗和狂犬病疫苗的细胞免疫研究.硕士研究生学位论文.2008)。在小鼠体内灭活的狂犬病全病毒颗粒疫苗以诱导Th2产生IgG1抗体的体液免疫为主要免疫应答(Ertl H.PlosNeglected Tropical Diseases,2009,3(9):1‐9)。美国免疫咨询委员会狂犬病工作委员会分析1976‐2008年间12个发表的疫苗临床研究，现有狂犬病灭活的全病毒颗粒疫苗在人体内全部产生中和抗体的时间需要14天以上(Rupprecht CE,et al.Vaccine.2009.27:7141‐8)。我国学者报道Vero细胞狂犬病疫苗首针接种后第7天中和抗体GMT仅为0.24‐0.27IU/ml、阳转率12.2‐28.9％，第14天中和抗体GMT达到2.52‐7.29IU/ml、阳转率100％(肖奇友等.中国人兽共患病学报.2009,25(5):493‐494；杨书宏等.疾病监测.2009,24(6):409‐411)。
在没有免疫球蛋白联合注射的情况下，仅靠疫苗的PEP是不能防止狂犬病死亡(Servat A,et al.Vaccine.2003.22(2):244‐9)。法国巴斯德研究所、武汉生物制品研究所和军事医学科学院军事兽医研究所应用小白鼠和Beagle犬三次独立暴露后试验即先皮下或肌肉感染狂犬病野毒株病毒，然后再用狂犬病疫苗免疫，结果均显示在没有联合应用抗血清情况下，国内外市售人用狂犬病疫苗保护率仅为0～30％(林海祥等.中华实验和临床病毒学杂志.2016.30(1):37‐40)。人感染狂犬病病毒后如不接受暴露后免疫很少能够通过诱导自身的免疫系统产生保护作用并清除病毒。灭活的全病毒颗粒疫苗由于不能诱导炎症反应从而不能有效激活Th1淋巴细胞及B淋巴细胞应答，免疫原性较差(Marciani DJ.DrugDiscovToday.2003.8(20):934‐943)。研究显示接种灭活的狂犬病全病毒颗粒疫苗诱导的体液免疫或者注射的被动免疫制剂仅能够清除外周的狂犬病病毒阻止其侵入神经末梢，细胞免疫的作用有限，而一旦病毒进入CNS则无法提供保护(Hooper DC,etal.J.Virol.1998.72(5):3711‐3719；Lafon M.Human rabies vaccines.2nd ed.SanDiego:Academic Press.2007.p489‐504)。这是因为中和抗体穿过血脑屏障(Blood BrainBarrier BBB)的能力非常有限(Hooper DC et al.Future Virol.2011.6(3):387‐397)。
由此可见，现有灭活的全病毒颗粒疫苗基于其不产生细胞免疫或细胞免疫微弱以及产生体液免疫速度慢的致命缺陷，抗体产生显然落后于狂犬病毒在局部肌肉繁殖和侵入末梢神经的速度和时间，特别对于咬伤严重、部位高度危险、潜伏期短的暴露者不能产生有效保护(王树声.应用预防医学.2010.16(1):1‐4)。
鉴于上述原因，需要对现有灭活的狂犬病全病毒颗粒疫苗进行革命性地改造，使新疫苗在人体中更快产生免疫应答反应、诱导更高的免疫水平，提供更持久的免疫保护效力，才能满足人在暴露后预防狂犬病的紧迫需要。
本发明将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，具体而言将载体蛋白和狂犬病全病毒颗粒抗原经化学键连接、或将载体蛋白和狂犬病病毒样颗粒(Virus Like Particle VLP)抗原经化学键连接、或将载体蛋白和狂犬病全病毒颗粒裂解后的病毒外膜片段(Fragment of Virus Envelope)抗原经化学键连接、或将载体蛋白和狂犬病病毒糖蛋白(G)抗原经化学键连接形成一种新的狂犬病免疫原性结合物。狂犬病免疫原性结合物中的载体蛋白诱导机体产生对狂犬病病毒抗原的细胞免疫反应，并使得细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
近年来有报道称狂犬病疫苗对于恶性黑色素瘤、宫颈癌、恶性胶质瘤有一定的治疗效果，进一步发现在所有恶性肿瘤患者的血液中均存在抗磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol PI)抗体，而磷脂酰肌醇是狂犬病病毒包膜中高含量的重要成分，认为是通过大剂量的狂犬病疫苗激发了淋巴细胞更大程度上的活性而影响癌细胞，并提出狂犬病疫苗可以作为一种新的治疗癌症的方法和提升现有癌症免疫治疗的效力(FaiderbeS,et al.C R Acad Sci III.1989；310(3):49‐52；Altinoz MA,et al.Clin TranslOncol.Published online:16 January 2017；Bongiorno E,et al.J Immunol.2013；190(1Supplement):126‐5.)。而本发明的一种新的狂犬病免疫原性结合物能够刺激机体产生细胞免疫应答，并与体液免疫实现协同，进而产生更强的免疫应答效力。因此，我们相信本发明的狂犬病免疫原性结合物还可以用于预防或治疗或辅助治疗包括恶性黑色素瘤、宫颈癌、恶性胶质瘤在内的癌症。
现有狂犬病疫苗及其制备方法中已公开的专利文本所述的含有破伤风类毒素和狂犬病病毒抗原的疫苗及制备方法的专利包括CN200910177427.8、CN201010607735.2、CN201110458972.1、CN201210137897.3、US9,296,796B2、US9,220,770B2、US9,200,042B2、US9,056,901B2、US8,956,812B2、US7,090,853B2，CN201210137897.3，然而以上专利的技术防范均具有以上的技术缺陷和不足。
综上所述，本发明的狂犬病免疫原性结合物重点解决了现有狂犬病全病毒颗粒疫苗不产生细胞免疫或细胞免疫微弱以及产生抗体慢的缺陷，在提高现有疫苗保护效力的同时极大地加快了疫苗早期免疫应答反应时间。
发明内容
为了克服现有狂犬病全病毒颗粒疫苗的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的狂犬病免疫原性结合物及其制备方法，以及根据上述免疫原性结合物制备的一种新的狂犬病结合疫苗及其制备方法。相对于现有技术其区别及有益效果在于：
(1)本发明狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗所含抗原结构与现有技术及文献不同。在现有文献报道和上述专利文本所公开的方案中，狂犬病病毒抗原和以破伤风类毒素为代表的蛋白是以混合形式存在，即狂犬病病毒抗原和破伤风类毒素之间没有化学键连接，狂犬病病毒抗原和破伤风类毒素也没有发生结构上的连接，狂犬病病毒抗原和破伤风类毒素以彼此完全独立形式存在。而在本发明的狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗中，狂犬病病毒抗原和包括破伤风类毒素在内的载体蛋白之间是经化学键连接，狂犬病病毒抗原和载体蛋白形成结构上的连接。
(2)本发明狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗所含载体蛋白功能与现有技术及文献不同。在现有文献报道和前面所述的专利文本所公开的方案中，以破伤风类毒素为代表的蛋白更多是扮演佐剂的功能，以达到增强狂犬病病毒抗原的免疫原性为目的。而在本发明的狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗中，载体蛋白的功能是刺激机体产生针对狂犬病抗原的细胞免疫，既产生体液免疫又产生细胞免疫，从而达到更快产生免疫应答反应、增强免疫原性、提升免疫持久性之目的。
(3)本发明狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗制备方法与现有技术及文献不同。在现有文献报道和上述专利文本所公开的方案中，以破伤风类毒素为代表的蛋白是在疫苗半成品原液配制时加入到狂犬病病毒原液中，破伤风类毒素与狂犬病病毒抗原之间不发生化学键结合，彼此独立存在半成品原液及成品中。而在本发明的狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗中，载体蛋白与狂犬病病毒抗原经过化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，再将狂犬病免疫原性结合物作为原液配制成狂犬病结合疫苗，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
(4)本发明狂犬病免疫原性结合物以及根据此狂犬病免疫原性结合物制备的狂犬病病毒结合疫苗制备方法与现有技术及文献不同。在现有技术中狂犬病疫苗中需要加入人白蛋白作为保护剂或稳定剂。在本发明中，狂犬病病毒抗原经化学键结合的载体蛋白完全替代了现有狂犬病疫苗中需要加入人白蛋白作为保护剂或稳定剂的功能，因此本发明的狂犬病结合疫苗不包括人白蛋白。
本发明提供了一种狂犬病免疫原性结合物(Rabies Immunogenic Conjugate,RIC)，包括狂犬病病毒抗原(RabAg)和载体蛋白(Carrier Protein,CP),其特征在于，所述狂犬病病毒抗原至少包括与载体蛋白经化学键连接的狂犬病病毒抗原，所述载体蛋白至少包括与狂犬病病毒抗原经化学键连接的载体蛋白，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，首先，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体；其次，狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相对于狂犬病病毒抗原分子量增加，更加有利用快速的诱导体内的免疫应答反应；此外，将狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键直接相连与利用融合表达的方式制备狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相比，具有如下的作用及技术效果并克服了以下缺陷：1)由于狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键之间相连，保留了狂犬病病毒抗原和载体蛋白各自的蛋白结构及有效的作用位点，保持了狂犬病病毒抗原的免疫原性；2)克服了较大的融合蛋白难于表达、纯化以及纯化过程中易于失活的缺陷；3)狂犬病病毒抗原和载体蛋白更易获得，节约了生产成本及时间。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
优选的是，所述狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接的狂犬病病毒抗原，所述载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接的载体蛋白，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病病毒样颗粒、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的狂犬病病毒外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的狂犬病病毒糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白和经重组表达的狂犬病病毒多聚酶中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病全病毒颗粒是狂犬病病毒经细胞培养、灭活、纯化的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒样颗粒是经重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒外膜片段是狂犬病全病毒颗粒经裂解制备的含刺突和基质蛋白的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒糖蛋白是从狂犬病病毒中分离纯化的或经重组表达的含糖蛋白的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物包括单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP、RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg和(RabAg‐CP)n‐RabAg‐RabAg至少一种形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，所述单个独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过与载体蛋白之间的化学键与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原建立结构上的连接，n≥1，所述2个以上的狂犬病病毒抗原通过与载体蛋白之间的化学键彼此建立结构上的连接。单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物为单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物(RabAg‐CP)，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中只含有单个狂犬病病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP的形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，单个独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过与载体蛋白之间的化学键与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原建立结构上的连接。单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物为2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物((RabAg‐CP)n‐RabAg，n≥1)，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有2个以上的狂犬病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、(RabAg‐CP)n‐RabAg至少一种形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，n≥1，所述2个以上的狂犬病病毒抗原通过与载体蛋白之间的化学键彼此建立结构上的连接。2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)和氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原是根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中的至少一种狂犬病病毒固定毒株制备的狂犬病病毒抗原，或根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中至少一种狂犬病病毒固定毒株基因重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接方法包括碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲基异丁酯法)、N‐羟琥珀酰亚胺酯法、戊二醛法、重氮化法、琥珀酸酐法、羰基二咪唑法、马来酰亚胺法、二硫键法、过碘酸氧化法、羧甲基羟胺法的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接剂包括1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1‐环己基‐3‐(2‐N‐吗啉基乙基)碳二亚胺(CMC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'‐二异丙基碳二亚胺(DIC)、2‐乙基‐5‐苯基异恶唑‐3'‐磺酸盐(Woodward’s reagent K)、N,N'‐羰基二咪唑(CDI)、希夫碱生成和还原胺化反应的试剂如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、硼氢化钠(NaBH4)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是直接连接，所述直接连接至少不包括连接臂(Linker Arm)、间隔臂(Spacer Arm)和桥联分子(Bridging Molecule)，所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白是零长度连接(Zero‐LengthLinking)或零长度交联(Zero‐Length Crosslinking)或零长度桥联(Zero‐LengthBridging)，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间不包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是通过连接臂、间隔臂或桥联分子至少一种方式进行的连接，新创建的连接臂或间隔臂或桥联分子将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述连接臂或间隔臂或桥联分子包括二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo‐DST)、双(2‐(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2‐(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo‐BSOCOES)、乙二醇‐双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇‐双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo‐EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'‐二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'‐二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4‐二(3'‐(2'‐二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β‐(4‐叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4‐丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(SPDP)、长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(LC‐SPDP)、磺基长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(sulfo‐LC‐SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链‐琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(sulfo‐LC‐SMPT)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‐羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷‐1‐羧酸3‐硫代‐N‐琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‐SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M‐马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo‐MBS)、N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基‐N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo‐SIAB)、4‐(4‐马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo‐SMPB)、4‐马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(sulfo‐GMBS)、琥珀酰亚胺基‐6‐((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基‐6‐(6‐(((4‐碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基‐4‐(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐1‐羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基‐6‐((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐为‐1‐羰基)氨基)己酸(SIACX)、4‐硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4‐(4‐N‐马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4‐N‐马来酰亚胺甲基环己烷‐1‐羧基酰肼(M2C2H)、3‐(2‐吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N‐羟基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(NHS‐ASA)、N‐羟基磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(sulfo‐NHS‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮水杨基氨基己酸(sulfo‐NHS‐LC‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(P‐叠氮基‐水杨酰氨基)乙基‐1,3'‐二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(sulfo‐HSAB)、N‐琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo‐SANPAH)、5‐叠氮基‐2‐硝基苯甲酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(ANB‐NOS)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(M‐硝基叠氮基‐苯甲酰胺基)‐乙基‐1,3'‐二硫代二丙酸酯(SAND)、N‐琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SADP)、N‐磺基琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(sulfo‐SADP)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐叠氮苯基)丁酸(Sulfo‐SAPB)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(7‐叠氮‐4‐甲基甲基香豆素‐3‐乙酰胺)乙基‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺‐7‐叠氮基‐4‐甲基香豆素‐3‐乙酸酯(Sulfo‐SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基‐2‐重氮3,3,3‐三氟丙酸(PNP‐DTP)、1‐(p‐叠氮水杨酰氨基)‐4‐(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N‐(4‐(p‐叠氮水杨酰胺基)丁基)‐3'‐(2'‐吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮‐4‐碘乙酰胺、二苯甲酮‐4‐马来酰亚胺、p‐叠氮苯甲酰肼、4‐(P‐叠氮水杨酰氨基)‐丁胺(ASBA)、P‐叠氮苯基乙二醛(APG)、4‐叠氮‐2‐硝基苯基生物素‐4‐硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(6‐(生物素酰胺基)‐2‐(p‐叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基‐1,3‐二硫基丙酸酯(sulfo‐SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟‐长链‐生物素(MTS‐ATF‐biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS‐ATF‐LC‐biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原经活化后再与载体蛋白通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白经活化后再与狂犬病病毒抗原通过化学键连接。
上述任一项优选的是，狂犬病病毒抗原和载体蛋白分别经活化后再通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述的狂犬病免疫原性结合物用于狂犬病诊断、预防和治疗。
上述任一项优选的是，所述的狂犬病免疫原性结合物用于预防、治疗或辅助治疗癌症。
本发明还提供了一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步 骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接，然后经纯化制成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，首先，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体；其次，狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相对于狂犬病病毒抗原分子量增加，更加有利用快速的诱导体内的免疫应答反应；此外，将狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键直接相连与利用融合表达的方式制备狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相比，具有如下的作用及技术效果并克服了以下缺陷：1)由于狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键之间相连，保留了狂犬病病毒抗原和载体蛋白各自的蛋白结构及有效的作用位点，保持了狂犬病病毒抗原的免疫原性；2)克服了较大的融合蛋白难于表达、纯化以及纯化过程中易于失活的缺陷；3)狂犬病病毒抗原和载体蛋白更易获得，节约了生产成本及时间。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
优选的是，所述狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病病毒样颗粒、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的狂犬病病毒外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的犬病病毒糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白、经重组表达的狂犬病病毒多聚酶中的至少一种。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为经重组表达、纯化制成狂犬病病毒样颗粒原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为按照如下步骤获得的狂犬病病毒外膜片段原液，狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化而制成的狂犬病全病毒颗粒原液；上述步骤中制备的狂犬病全病毒颗粒原液经裂解、纯化制成狂犬病病毒外膜片段原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为经纯化制成狂犬病病毒糖蛋白原液。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原是根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中的至少一种狂犬病病毒固定毒株制备的狂犬病病毒抗原，或根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中至少一种狂犬病病毒固定毒株基因重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)和氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接方法包括碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲基异丁酯法)、N‐羟琥珀酰亚胺酯法、戊二醛法、重氮化法、琥珀酸酐法、羰基二咪唑法、马来酰亚胺法、二硫键法、过碘酸氧化法、羧甲基羟胺法中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接剂包括1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1‐环己基‐3‐(2‐N‐吗啉基乙基)碳二亚胺(CMC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'‐二异丙基碳二亚胺(DIC)、2‐乙基‐5‐苯基异恶唑‐3'‐磺酸盐(Woodward’s reagent K)、N,N'‐羰基二咪唑(CDI)、希夫碱生成和还原胺化反应的试剂如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或硼氢化钠(NaBH4)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是直接连接，所述直接连接至少不包括连接臂(Linker Arm)、间隔臂(Spacer Arm)和桥联分子(Bridging Molecule)，狂犬病病毒抗原和载体蛋白是零长度连接(Zero‐Length Linking)或零长度交联(Zero‐Length Crosslinking)或零长度桥联(Zero‐Length Bridging)，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间并不包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是通过连接臂、间隔臂或桥联分子的连接，新创建的连接臂、间隔臂或桥联分子将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述连接臂或间隔臂或桥联分子包括二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo‐DST)、双(2‐(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2‐(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo‐BSOCOES)、乙二醇‐双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇‐双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo‐EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'‐二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'‐二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4‐二(3'‐(2'‐二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β‐(4‐叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4‐丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(SPDP)、长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(LC‐SPDP)、磺基长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(sulfo‐LC‐SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链‐琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(sulfo‐LC‐SMPT)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‐羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷‐1‐羧酸3‐硫代‐N‐琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‐SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M‐马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo‐MBS)、N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基‐N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo‐SIAB)、4‐(4‐马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo‐SMPB)、4‐马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(sulfo‐GMBS)、琥珀酰亚胺基‐6‐((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基‐6‐(6‐(((4‐碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基‐4‐(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐1‐羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基‐6‐((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐为‐1‐羰基)氨基)己酸(SIACX)、4‐硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4‐(4‐N‐马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4‐N‐马来酰亚胺甲基环己烷‐1‐羧基酰肼(M2C2H)、3‐(2‐吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N‐羟基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(NHS‐ASA)、N‐羟基磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(sulfo‐NHS‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮水杨基氨基己酸(sulfo‐NHS‐LC‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(P‐叠氮基‐水杨酰氨基)乙基‐1,3'‐二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(sulfo‐HSAB)、N‐琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo‐SANPAH)、5‐叠氮基‐2‐硝基苯甲酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(ANB‐NOS)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(M‐硝基叠氮基‐苯甲酰胺基)‐乙基‐1,3'‐二硫代二丙酸酯(SAND)、N‐琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SADP)、N‐磺基琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(sulfo‐SADP)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐叠氮苯基)丁酸(Sulfo‐SAPB)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(7‐叠氮‐4‐甲基甲基香豆素‐3‐乙酰胺)乙基‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺‐7‐叠氮基‐4‐甲基香豆素‐3‐乙酸酯(Sulfo‐SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基‐2‐重氮3,3,3‐三氟丙酸(PNP‐DTP)、1‐(p‐叠氮水杨酰氨基)‐4‐(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N‐(4‐(p‐叠氮水杨酰胺基)丁基)‐3'‐(2'‐吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮‐4‐碘乙酰胺、二苯甲酮‐4‐马来酰亚胺、p‐叠氮苯甲酰肼、4‐(P‐叠氮水杨酰氨基)‐丁胺(ASBA)、P‐叠氮苯基乙二醛(APG)、4‐叠氮‐2‐硝基苯基生物素‐4‐硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(6‐(生物素酰胺基)‐2‐(p‐叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基‐1,3‐二硫基丙酸酯(sulfo‐SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟‐长链‐生物素(MTS‐ATF‐biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS‐ATF‐LC‐biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原经活化后再与载体蛋白通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白经活化后再与所述狂犬病病毒抗原通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白分别经活化后再通过化学键连接。
上述任一项优选的是，制备得到的狂犬病免疫原性结合物用于狂犬病诊断、预防和治疗。
上述任一项优选的是，制备得到的狂犬病免疫原性结合物用于预防、治疗或辅助治疗癌症。
本发明还提供了一种狂犬病结合疫苗(Rabies Conjugate Vaccine RCV)，包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，所述狂犬病病毒抗原至少包括与载体蛋白经化学键连接的狂犬病病毒抗原，所述载体蛋白至少包括与狂犬病病毒抗原经化学键连接的载体蛋白，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，首先，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体；其次，狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相对于狂犬病病毒抗原分子量增加，更加有利用快速的诱导体内的免疫应答反应；此外，将狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键直接相连与利用融合表达的方式制备狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相比，具有如下的作用及技术效果并克服了以下缺陷：1)由于狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键之间相连，保留了狂犬病病毒抗原和载体蛋白各自的蛋白结构及有效的作用位点，保持了狂犬病病毒抗原的免疫原性；2)克服了较大的融合蛋白难于表达、纯化以及纯化过程中易于失活的缺陷；3)狂犬病病毒抗原和载体蛋白更易获得，节约了生产成本及时间。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
优选的是，所述狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接的狂犬病病毒抗原，所述载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接的载体蛋白，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病病毒样颗粒、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的狂犬病病毒外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的狂犬病病毒糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白和经重组表达的狂犬病病毒多聚酶中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病全病毒颗粒是狂犬病病毒经细胞培养、灭活、纯化的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒样颗粒是经重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒外膜片段是狂犬病全病毒颗粒经裂解制备的含刺突和基质蛋白的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒糖蛋白是从狂犬病病毒中分离纯化的或经重组表达的含糖蛋白的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包括佐剂。
上述任一项优选的是，所述佐剂包括铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、百日咳毒素(PT)、百日咳毒素B亚单位(PTB)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、皁角素QS‐21、α‐生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体(liposomes)、单磷酸类脂A(MPL‐A)、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体(Virosomes)、聚乙交酯(PLA)微球、聚乳酸‐乙醇酸(PLGA)微球、脂质‐胆固醇(DC‐Chol)、二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、Montanide ISA51、Montanide ISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽(MDP)、细菌脂多糖(OM‐174)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、IL‐1、IL‐2、IL‐6、IL‐12、IL‐15、IL‐18、IFN‐γ、GM‐CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、含有聚次黄嘌呤核苷酸(Poly I)和/或聚胞嘧啶核苷酸(Poly C)的皮卡佐剂的物质中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物包括单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP、RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg和(RabAg‐CP)n‐RabAg至少一种形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，所述单个独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过与载体蛋白之间的化学键与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原建立结构上的连接，n≥1，所述2个以上的狂犬病病毒抗原通过与载体蛋白之间的化学键彼此建立结构上的连接。单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物为单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物(RabAg‐CP)，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中只含有单个狂犬病病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP的形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，单个独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过与载体蛋白之间的化学键与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原建立结构上的连接。单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原以狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物的形式存在于所述狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物为2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物((RabAg‐CP)n‐RabAg，n≥1)，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有2个以上的狂犬病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、(RabAg‐CP)n‐RabAg至少一种形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键，n≥1，所述2个以上的狂犬病病毒抗原通过与载体蛋白之间的化学键彼此建立结构上的连接。2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物有效增加了所得到的疫苗的免疫原性，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原是根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中的至少一种狂犬病病毒固定毒株制备的狂犬病病毒抗原，或根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中至少一种狂犬病病毒固定毒株基因重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接方法包括碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲基异丁酯法)、N‐羟琥珀酰亚胺酯法、戊二醛法、重氮化法、琥珀酸酐法、羰基二咪唑法、马来酰亚胺法、二硫键法、过碘酸氧化法、羧甲基羟胺法的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接剂包括1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1‐环己基‐3‐(2‐N‐吗啉基乙基)碳二亚胺(CMC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'‐二异丙基碳二亚胺(DIC)、2‐乙基‐5‐苯基异恶唑‐3'‐磺酸盐(Woodward’s reagent K)、N,N'‐羰基二咪唑(CDI)、希夫碱生成和还原胺化反应的试剂如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、硼氢化钠(NaBH4)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是直接连接，所述直接连接至少不包括连接臂(Linker Arm)、间隔臂(Spacer Arm)和桥联分子(Bridging Molecule)，所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白是零长度连接(Zero‐LengthLinking)或零长度交联(Zero‐Length Crosslinking)或零长度桥联(Zero‐LengthBridging)，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间不包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是通过连接臂、间隔臂或桥联分子至少一种方式进行的连接，新创建的连接臂或间隔臂或桥联分子将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述连接臂或间隔臂或桥联分子包括二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo‐DST)、双(2‐(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2‐(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo‐BSOCOES)、乙二醇‐双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇‐双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo‐EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'‐二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'‐二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4‐二(3'‐(2'‐二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β‐(4‐叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4‐丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(SPDP)、长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(LC‐SPDP)、磺基长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(sulfo‐LC‐SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链‐琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(sulfo‐LC‐SMPT)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‐羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷‐1‐羧酸3‐硫代‐N‐琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‐SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M‐马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo‐MBS)、N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基‐N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo‐SIAB)、4‐(4‐马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo‐SMPB)、4‐马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(sulfo‐GMBS)、琥珀酰亚胺基‐6‐((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基‐6‐(6‐(((4‐碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基‐4‐(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐1‐羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基‐6‐((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐为‐1‐羰基)氨基)己酸(SIACX)、4‐硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4‐(4‐N‐马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4‐N‐马来酰亚胺甲基环己烷‐1‐羧基酰肼(M2C2H)、3‐(2‐吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N‐羟基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(NHS‐ASA)、N‐羟基磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(sulfo‐NHS‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮水杨基氨基己酸(sulfo‐NHS‐LC‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(P‐叠氮基‐水杨酰氨基)乙基‐1,3'‐二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(sulfo‐HSAB)、N‐琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo‐SANPAH)、5‐叠氮基‐2‐硝基苯甲酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(ANB‐NOS)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(M‐硝基叠氮基‐苯甲酰胺基)‐乙基‐1,3'‐二硫代二丙酸酯(SAND)、N‐琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SADP)、N‐磺基琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(sulfo‐SADP)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐叠氮苯基)丁酸(Sulfo‐SAPB)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(7‐叠氮‐4‐甲基甲基香豆素‐3‐乙酰胺)乙基‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺‐7‐叠氮基‐4‐甲基香豆素‐3‐乙酸酯(Sulfo‐SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基‐2‐重氮3,3,3‐三氟丙酸(PNP‐DTP)、1‐(p‐叠氮水杨酰氨基)‐4‐(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N‐(4‐(p‐叠氮水杨酰胺基)丁基)‐3'‐(2'‐吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮‐4‐碘乙酰胺、二苯甲酮‐4‐马来酰亚胺、p‐叠氮苯甲酰肼、4‐(P‐叠氮水杨酰氨基)‐丁胺(ASBA)、P‐叠氮苯基乙二醛(APG)、4‐叠氮‐2‐硝基苯基生物素‐4‐硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(6‐(生物素酰胺基)‐2‐(p‐叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基‐1,3‐二硫基丙酸酯(sulfo‐SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟‐长链‐生物素(MTS‐ATF‐biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS‐ATF‐LC‐biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原经活化后再与载体蛋白通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白经活化后再与狂犬病病毒抗原通过化学键连接。
上述任一项优选的是，狂犬病病毒抗原和载体蛋白分别经活化后再通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗的效价单位标示为≥2.5IU/剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包括保护剂和/或稳定剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗的保护剂和/或稳定剂包括人白蛋白。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包括保护剂和/或稳定剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包括人白蛋白。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包含任何防腐剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包含防腐剂。
上述任一项优选的是，所述防腐剂包括硫柳汞、2‐苯氧乙醇、苯甲醇中的至少一种。
上述任一项优选的是，狂犬病结合疫苗用于狂犬病诊断、预防和治疗。
上述任一项优选的是，狂犬病结合疫苗用于预防、治疗或辅助治疗癌症。
本发明还提供了一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，首先，能够促使Th1细胞识别载体蛋白，刺激B细胞对狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物产生更强的免疫应答，并能诱导Th1细胞介导的免疫回忆反应，促进更多的B细胞产生特异性抗体；其次，狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相对于狂犬病病毒抗原分子量增加，更加有利用快速的诱导体内的免疫应答反应；此外，将狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键直接相连与利用融合表达的方式制备狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物相比，具有如下的作用及技术效果并克服了以下缺陷：1)由于狂犬病病毒抗原与载体蛋白通过化学键之间相连，保留了狂犬病病毒抗原和载体蛋白各自的蛋白结构及有效的作用位点，保持了狂犬病病毒抗原的免疫原性；2)克服了较大的融合蛋白难于表达、纯化以及纯化过程中易于失活的缺陷；3)狂犬病病毒抗原和载体蛋白更易获得，节约了生产成本及时间。将载体蛋白和狂犬病病毒抗原经化学键连接形成狂犬病免疫原性结合物，使细胞免疫反应和体液免疫反应在体内达到协同，进而使得新的狂犬病免疫原性结合物在人体中更快产生早期免疫应答反应、诱导更高的免疫水平、提供更持久的免疫保护效力。
优选的是，所述狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病病毒样颗粒、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的狂犬病病毒外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的狂犬病病毒糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白、经重组表达的狂犬病病毒多聚酶中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原原液为将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为经重组表达、纯化制成狂犬病病毒样颗粒原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为按照如下步骤获得的狂犬病病毒外膜片段原液，狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化而制成的狂犬病全病毒颗粒原液；上述步骤中制备的狂犬病全病毒颗粒原液经裂解、纯化制成狂犬病病毒外膜片段原液。
上述任一项优选的是，步骤(a)中，所述狂犬病病毒抗原原液为经纯化制成狂犬病病毒糖蛋白原液。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包含佐剂。
上述任一项优选的是，所述佐剂包含铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、百日咳毒素(PT)、百日咳毒素B亚单位(PTB)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、皁角素QS‐21、α‐生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体(liposomes)、单磷酸类脂A(MPL‐A)、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体(Virosomes)、聚乙交酯(PLA)微球、聚乳酸‐乙醇酸(PLGA)微球、脂质‐胆固醇(DC‐Chol)、二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、Montanide ISA51、Montanide ISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽(MDP)、细菌脂多糖(OM‐174)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、IL‐1、IL‐2、IL‐6、IL‐12、IL‐15、IL‐18、IFN‐γ、GM‐CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、含有聚次黄嘌呤核苷酸(Poly I)和/或聚胞嘧啶核苷酸(Poly C)的皮卡佐剂的物质中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原是根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中的至少一种狂犬病病毒固定毒株制备的狂犬病病毒抗原，或根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株中至少一种狂犬病病毒固定毒株基因重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)和氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白含有一个或两个以上与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接方法包括碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲基异丁酯法)、N‐羟琥珀酰亚胺酯法、戊二醛法、重氮化法、琥珀酸酐法、羰基二咪唑法、马来酰亚胺法、二硫键法、过碘酸氧化法、羧甲基羟胺法中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接剂包括1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1‐环己基‐3‐(2‐N‐吗啉基乙基)碳二亚胺(CMC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'‐二异丙基碳二亚胺(DIC)、2‐乙基‐5‐苯基异恶唑‐3'‐磺酸盐(Woodward’s reagent K)、N,N'‐羰基二咪唑(CDI)、希夫碱生成和还原胺化反应的试剂如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或硼氢化钠(NaBH4)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是直接连接，所述直接连接至少不包括连接臂(Linker Arm)、间隔臂(Spacer Arm)和桥联分子(Bridging Molecule)，狂犬病病毒抗原和载体蛋白是零长度连接(Zero‐Length Linking)或零长度交联(Zero‐Length Crosslinking)或零长度桥联(Zero‐Length Bridging)，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间并不包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白的化学键连接是通过连接臂、间隔臂或桥联分子的连接，新创建的连接臂、间隔臂或桥联分子将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键在狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间包含新增原子或分子。
上述任一项优选的是，所述连接臂或间隔臂或桥联分子包括二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo‐DST)、双(2‐(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2‐(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo‐BSOCOES)、乙二醇‐双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇‐双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo‐EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'‐二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'‐二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4‐二(3'‐(2'‐二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β‐(4‐叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4‐丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(SPDP)、长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(LC‐SPDP)、磺基长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(sulfo‐LC‐SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链‐琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(sulfo‐LC‐SMPT)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‐羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷‐1‐羧酸3‐硫代‐N‐琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‐SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M‐马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo‐MBS)、N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基‐N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo‐SIAB)、4‐(4‐马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo‐SMPB)、4‐马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(sulfo‐GMBS)、琥珀酰亚胺基‐6‐((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基‐6‐(6‐(((4‐碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基‐4‐(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐1‐羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基‐6‐((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐为‐1‐羰基)氨基)己酸(SIACX)、4‐硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4‐(4‐N‐马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4‐N‐马来酰亚胺甲基环己烷‐1‐羧基酰肼(M2C2H)、3‐(2‐吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N‐羟基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(NHS‐ASA)、N‐羟基磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(sulfo‐NHS‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮水杨基氨基己酸(sulfo‐NHS‐LC‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(P‐叠氮基‐水杨酰氨基)乙基‐1,3'‐二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(sulfo‐HSAB)、N‐琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo‐SANPAH)、5‐叠氮基‐2‐硝基苯甲酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(ANB‐NOS)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(M‐硝基叠氮基‐苯甲酰胺基)‐乙基‐1,3'‐二硫代二丙酸酯(SAND)、N‐琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SADP)、N‐磺基琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(sulfo‐SADP)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐叠氮苯基)丁酸(Sulfo‐SAPB)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(7‐叠氮‐4‐甲基甲基香豆素‐3‐乙酰胺)乙基‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺‐7‐叠氮基‐4‐甲基香豆素‐3‐乙酸酯(Sulfo‐SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基‐2‐重氮3,3,3‐三氟丙酸(PNP‐DTP)、1‐(p‐叠氮水杨酰氨基)‐4‐(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N‐(4‐(p‐叠氮水杨酰胺基)丁基)‐3'‐(2'‐吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮‐4‐碘乙酰胺、二苯甲酮‐4‐马来酰亚胺、p‐叠氮苯甲酰肼、4‐(P‐叠氮水杨酰氨基)‐丁胺(ASBA)、P‐叠氮苯基乙二醛(APG)、4‐叠氮‐2‐硝基苯基生物素‐4‐硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(6‐(生物素酰胺基)‐2‐(p‐叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基‐1,3‐二硫基丙酸酯(sulfo‐SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟‐长链‐生物素(MTS‐ATF‐biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS‐ATF‐LC‐biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原经活化后再与载体蛋白通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述载体蛋白经活化后再与所述狂犬病病毒抗原通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述狂犬病病毒抗原和所述载体蛋白分别经活化后再通过化学键连接。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗的效价单位标示为≥2.5IU/剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包括保护剂和/或稳定剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗的保护剂和/或稳定剂包括人白蛋白。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包括保护剂和/或稳定剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包括人白蛋白。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗不包含任何防腐剂。
上述任一项优选的是，所述狂犬病结合疫苗包含防腐剂。
上述任一项优选的是，所述防腐剂包含硫柳汞、2‐苯氧乙醇、苯甲醇中的至少一种。
上述任一项优选的是，制备得到的狂犬病结合疫苗用于狂犬病诊断、预防和治疗。
上述任一项优选的是，制备得到的狂犬病结合疫苗用于预防、治疗或辅助治疗癌症。
本发明一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，所述狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒抗原连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。本发明又包括狂犬病病毒抗原通过化学键将载体蛋白连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。本发明还包括化学键将载体蛋白和狂犬病病毒抗原连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。本发明的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物用于人狂犬病诊断、预防和治疗。本发明的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物还可以用于预防或治疗或辅助治疗包括恶性黑色素瘤、宫颈癌、恶性胶质瘤在内的癌症。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白，所述单个独立存在的狂犬病病毒抗原分别与载体蛋白经化学键连接，与载体蛋白经化学键连接的单个独立存在的狂犬病病毒抗原与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原之间并不建立结构上的连接，以单个独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中只含有单个狂犬病病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP、RabAg‐CP、RabAg‐CP、…形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键。因此，本发明包括单个独立存在的狂犬病病毒抗原经化学键与载体蛋白连接形成狂犬病免疫原性结合物，所述单个独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过与载体蛋白之间的化学键与其它单个独立存在的狂犬病病毒抗原建立结构上连接的形式存在于狂犬病免疫原性结合物中。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白，所述2个以上的狂犬病病毒抗原共同与载体蛋白经化学键连接，载体蛋白通过化学键连接2个以上的狂犬病病毒抗原，与载体蛋白经化学键连接的狂犬病病毒抗原与其它狂犬病病毒抗原之间建立结构上的连接，以2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有2个以上的狂犬病病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP‐RabAg、和/或RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、和/或RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、…形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键。因此，本发明包括2个以上的狂犬病病毒抗原经化学键与载体蛋白连接形成狂犬病免疫原性结合物，所述2个以上的狂犬病病毒抗原通过与载体蛋白之间的化学键在结构上彼此建立连接的形式存在于狂犬病免疫原性结合物中。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白，单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原分别和/或共同与载体蛋白经化学键连接，载体蛋白不通过和/或通过化学键连接单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原，与载体蛋白经化学键连接的独立存在的狂犬病病毒抗原与其它独立存在的狂犬病病毒抗原之间并不建立和/或建立结构上的连接，以单个和/或2个以上独立存在的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，所述狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物中含有单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原，即狂犬病病毒抗原以RabAg‐CP、和/或RabAg‐CP‐RabAg、和/或RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、和/或RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg‐CP‐RabAg、…形式存在于狂犬病免疫原性结合物中，其中“RabAg”为狂犬病病毒抗原、“CP”代表载体蛋白、“‐”为连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键。因此，本发明包括单个独立存在的和/或2个以上的狂犬病病毒抗原经化学键与载体蛋白连接形成狂犬病免疫原性结合物，所述单个独立存在的和/或2个以上独立存在的狂犬病病毒抗原并不通过和/或通过与载体蛋白之间的化学键在结构上建立连接的形式存在于狂犬病免疫原性结合物中。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，所述狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上可以与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团，所述功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，所述载体蛋白含有一个或两个以上可以与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团，所述功能性基团包括羟基(‐OH)、羧基(‐COOH)、醛基(‐CHO)、氨基(‐NH2)。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病全病毒颗粒和载体蛋白，所述狂犬病全病毒颗粒与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病全病毒颗粒经化学键连接，所述化学键将狂犬病全病毒颗粒和载体蛋白连接形成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物。因此，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病全病毒颗粒连接所形成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物。所述狂犬病全病毒颗粒是狂犬病病毒经细胞培养、灭活、纯化的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病VLP和载体蛋白，所述狂犬病VLP与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病VLP经化学键连接，所述化学键将狂犬病VLP和载体蛋白连接形成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物。因此，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病VLP连接所形成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物。所述VLP是经重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒外膜片段和载体蛋白，所述狂犬病病毒外膜片段与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒外膜片段经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒外膜片段和载体蛋白连接形成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物。因此，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒外膜片段连接所形成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物。所述狂犬病病毒外膜片段是狂犬病全病毒颗粒经裂解制备的含刺突和基质蛋白的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒糖蛋白(G)和载体蛋白，所述狂犬病病毒糖蛋白与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒糖蛋白经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒糖蛋白和载体蛋白连接形成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物。因此，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒糖蛋白连接所形成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物。所述狂犬病病毒糖蛋白是从狂犬病病毒中分离纯化的或经重组表达的含糖蛋白的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病结合疫苗(Rabies Conjugate Vaccine RCV)，所述狂犬病结合疫苗包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，所述狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒抗原连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病结合疫苗。本发明又包括狂犬病病毒抗原通过化学键将载体蛋白连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病结合疫苗。本发明还包括化学键将载体蛋白和狂犬病病毒抗原连接所形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病结合疫苗。本发明的狂犬病结合疫苗用于人狂犬病预防和治疗。
本发明又一方面提供一种狂犬病结合疫苗，所述狂犬病结合疫苗包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病全病毒颗粒和载体蛋白，所述狂犬病全病毒颗粒与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病全病毒颗粒经化学键连接，所述化学键将狂犬病全病毒颗粒和载体蛋白连接形成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病全病毒颗粒连接所形成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病全病毒结合疫苗。所述狂犬病全病毒颗粒是狂犬病病毒经细胞培养、灭活、纯化的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病结合疫苗，所述狂犬病结合疫苗包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病VLP和载体蛋白，所述狂犬病VLP与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病VLP经化学键连接，所述化学键将狂犬病VLP和载体蛋白连接形成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病VLP连接所形成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病VLP结合疫苗。所述VLP是经重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病结合疫苗，所述狂犬病结合疫苗包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒外膜片段和载体蛋白，所述狂犬病病毒外膜片段与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒外膜片段经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒外膜片段和载体蛋白连接形成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒外膜片段连接所形成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病裂解结合疫苗。所述狂犬病病毒外膜片段是狂犬病全病毒颗粒经裂解制备的含刺突和基质蛋白的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种狂犬病结合疫苗，所述狂犬病结合疫苗包括狂犬病免疫原性结合物，所述狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒糖蛋白(G)和载体蛋白，所述狂犬病病毒糖蛋白与载体蛋白经化学键连接，所述载体蛋白与狂犬病病毒糖蛋白经化学键连接，所述化学键将狂犬病病毒糖蛋白和载体蛋白连接形成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，本发明包括载体蛋白通过化学键将狂犬病病毒糖蛋白连接所形成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物再经配制而成的狂犬病糖蛋白结合疫苗。所述狂犬病病毒糖蛋白是从狂犬病病毒中分离纯化的或经重组表达的含糖蛋白的狂犬病病毒抗原。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病全病毒颗粒原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经重组表达、纯化制成狂犬病VLP原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病VLP原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病全病毒颗粒原液经裂解、纯化制成狂犬病病毒外膜片段原液；
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒外膜片段原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病免疫原性结合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒糖蛋白原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒糖蛋白原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病全病毒颗粒原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经重组表达、纯化制成狂犬病VLP原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病VLP原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病VLP‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病全病毒颗粒原液经裂解、纯化制成狂犬病病毒外膜片段原液；
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒外膜片段原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物。
(d)将步骤(c)制备的狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
本发明又一方面提供一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)经纯化制成狂犬病病毒糖蛋白原液；
(b)将步骤(a)制备的狂犬病病毒糖蛋白原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物。
(c)将步骤(b)制备的狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
在本发明术语中，狂犬病免疫原性结合物(Rabies Immunogenic Conjugate RIC)是特异指针对狂犬病病毒的具有免疫原性的结合物。狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，狂犬病病毒抗原与载体蛋白之间经化学键连接，载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接，化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，狂犬病免疫原性结合物系狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物。
在本发明术语中，狂犬病结合疫苗(Rabies Conjugate Vaccine RCV)是特异预防或治疗狂犬病病毒感染的疫苗。狂犬病结合疫苗的抗原是狂犬病免疫原性结合物，狂犬病免疫原性结合物包括狂犬病病毒抗原和载体蛋白，狂犬病病毒抗原与载体蛋白之间经化学键连接，载体蛋白与狂犬病病毒抗原经化学键连接，化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。换言之，狂犬病结合疫苗系狂犬病病毒抗原与载体蛋白经化学键连接形成的狂犬病病毒抗原‐载体蛋白结合物再经配制而成。
在本发明术语中，狂犬病病毒抗原(RabAg)是指能产生特异针对狂犬病病毒免疫反应的物质，狂犬病病毒抗原含有一个或两个以上可以与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团。狂犬病病毒抗原与载体蛋白进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)和/或羧基(‐COOH)和/或醛基(‐CHO)和/或氨基(‐NH2)。狂犬病病毒抗原可以是天然的，例如来自经培养的狂犬病全病毒颗粒，也可以是重组表达的物质，还可以是半合成的或合成的物质。狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、或包括经重组表达的狂犬病VLP、或包括狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的外膜片段、或包括从狂犬病病毒分离纯化的糖蛋白、或包括从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、或包括从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、或包括从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、或包括从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、或包括经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、或包括经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、或包括经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、或包括经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白、或包括经重组表达的狂犬病病毒多聚酶。
在本发明术语中，载体蛋白(Carrier Protein CP)是与半抗原或抗原以化学键连接并具有免疫原性的蛋白类物质，半抗原或抗原连接到载体蛋白上增强半抗原或抗原的免疫原性和T细胞依赖性免疫应答反应。载体蛋白含有一个或两个以上可以与半抗原或抗原进行化学键连接的功能性基团。载体蛋白与狂犬病病毒抗原进行化学键连接的功能性基团包括羟基(‐OH)和/或羧基(‐COOH)和/或醛基(‐CHO)和/或氨基(‐NH2)。载体蛋白可以是天然的，例如来自细菌或病毒的蛋白，也可以是重组表达的物质，还可以是半合成的或合成的物质。载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、或包括白喉类毒素(DT)、或包括白喉毒素无毒变异体(CRM197)、或包括B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、或包括肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、或包括肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、或包括肺炎球菌溶血素(Ply)、或包括流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、或包括百日咳毒素(PT)、或包括百日咳丝状血凝素(FHA)、或包括百日咳粘附素(PRN)、或包括霍乱毒素(CT)、或包括胞壁酰二肽(MDP)、或包括大肠杆菌LT、或包括大肠杆菌ST、或包括结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、或包括铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、或包括卵白蛋白、或包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、或包括牛血清白蛋白(BSA)、或包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、或包括乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、或包括破伤风毒素C片段(TetanusToxin Fragment C,TTC)。
在本发明术语中，化学键连接是指狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物中的狂犬病病毒抗原和载体蛋白是以化学键连接(Linking)或交联(Crosslinking)或桥联(Bridging)形式存在。换言之，化学键将狂犬病病毒抗原和载体蛋白连接或交联或桥联成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物。因此，在本发明术语中，化学键连接等同或相同化学键交联，化学键连接还等同或相同化学键桥联。
在本发明术语中，连接臂(Linker Arm)是狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物中以化学键连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白的物质，是狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间创建的新原子或新分子。因此，在本发明术语中，连接臂等同或相同间隔臂(SpacerArm)，连接臂还等同或相同桥连分子(Bridging Molecule)。
本发明提供一种狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成的狂犬病免疫原性结合物，本发明又提供一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，制备狂犬病病毒抗原的狂犬病病毒固定毒株选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo‐32株、CTN‐1V株、aGV株或其它狂犬病病毒固定毒株中任一株。狂犬病病毒固定毒株更优选PV株、PM株、Flury株、CTN‐1V株、aGV株。狂犬病病毒固定毒株最优选PM株、Flury株、CTN‐1V株。美国标准生物收藏中心(ATCC)、中国食品药品检定研究院出售狂犬病病毒固定毒株。
本发明提供一种狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成的狂犬病免疫原性结合物，本发明又提供一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，所述狂犬病病毒抗原选自狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病VLP、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白、经重组表达的狂犬病病毒多聚酶。狂犬病病毒抗原更优选狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病VLP、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白。狂犬病病毒抗原最优选狂犬病全病毒颗粒。如果满足需要，也可采用其它狂犬病病毒抗原，此处给出的狂犬病病毒抗原仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明提供一种狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成的狂犬病免疫原性结合物，本发明又提供一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗。在本发明优选的实施方案中，所述载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)。载体蛋白更优选TT、DT、CRM197、PD和OMP。载体蛋白最优选TT和CRM197。如果满足需要，也可采用其它蛋白载体，此处给出的蛋白载体仅仅是为了例示性说明本发明。
在本发明中，狂犬病病毒抗原的制备以及质量控制方法和标准是本领域技术人员公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可根据文献(李志强等.微生物学杂志.2010.30(1):96‐99；乐威等.中国病毒学.2004.19(4):373‐375)、世界卫生组织颁布的人用狂犬病灭活疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series No 941,2007)和中华人民共和国药典三部(2015年版)等技术文件制备狂犬病病毒全病毒颗粒原液并进行质量检定。
在本发明中，狂犬病病毒抗原的制备以及质量控制方法和标准是本领域技术人员公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可根据文献(Fontana D,etal.Vaccine.2014.32:2799‐2804；Fontana D,et al.Vaccine.2015.33:4238‐4246；齐瑛 琳.狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价.长春.吉林大学.2015)、世界卫生组织颁布的人用狂犬病灭活疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series No 941,2007)和中华人民共和国药典三部(2015年版)等技术文件制备狂犬病VLP原液并进行质量检定。
在本发明中，狂犬病病毒抗原的制备以及质量控制方法和标准是本领域技术人员公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可根据本发明人另一项发明技术方案(CN100413536C)、世界卫生组织颁布的人用狂犬病灭活疫苗制造及检定规程(WHOTechnical Report Series No 941,2007)和《中华人民共和国药典》(三部2015年版)等技术文件制备狂犬病病毒外膜片段原液并进行质量检定。
在本发明中，狂犬病病毒抗原的制备以及质量控制方法和标准是本领域技术人员公知的。在本发明优选的实施方案中，技术人员可根据文献(Amann R,et al.Journal ofVirology.2013.87(3):1618‐1630；王晓蕾等.南京医科大学学报(自然科学版).2015.35(6):772‐776；阚海萍等.生物技术通讯.2015.26(4):493‐496；张建明等.海峡预防医学杂志.2009,15(2):1‐4)、世界卫生组织颁布的人用狂犬病灭活疫苗制造及检定规程(WHOTechnical Report Series No 941,2007)和中华人民共和国药典三部(2015年版)等技术文件制备狂犬病病毒糖蛋白原液并进行质量检定。
在本发明中，将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接的原理及方法可参考生物大分子与生物大分子之间的共价键偶联反应技术(Hermanson G.(2008)BioconjugateTechnigues,2nd Edition.Academic Press,London and New York.)。在本发明优选的实施方案中，狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接方法选自碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲基异丁酯法)、N‐羟琥珀酰亚胺酯法、戊二醛法、重氮化法、琥珀酸酐法、羰基二咪唑法、马来酰亚胺法、二硫键法、过碘酸氧化法、羧甲基羟胺法等。化学键连接方法更优选碳二亚胺法、戊二醛法、重氮化法、二硫键法、过碘酸氧化法。化学键连接方法最优选碳二亚胺法、过碘酸氧化法。如果满足需要，也可采用其它化学键连接方法，此处给出的化学键连接方法仅仅是为了例示性说明本发明。
在本发明中，狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是没有连接臂(LinkerArm)或间隔臂(Spacer Arm)或桥联分子(Bridging Molecule)的直接连接，又称为零长度连接(Zero‐Length Linking)或零长度交联(Zero‐Length Crosslinking)或零长度桥联(Zero‐Length Bridging)，即连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间的化学键并不包含新增原子或分子。在本发明优选的实施方案中，狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是没有连接臂或间隔臂的直接连接，连接剂选自1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1‐环己基‐3‐(2‐N‐吗啉基乙基)碳二亚胺(CMC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'‐二 异丙基碳二亚胺(DIC)、2‐乙基‐5‐苯基异恶唑‐3'‐磺酸盐(Woodward’s reagent K)、N,N'‐羰基二咪唑(CDI)以及希夫碱生成和还原胺化反应的试剂如氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或硼 氢化钠(NaBH4)。连接剂更优选EDC、CMC、DCC、NaBH3CN、NaBH4。连接剂最优选EDC、NaBH3CN。如果满足需要，也可采用其它连接剂，此处给出的连接剂仅仅是为了例示性说明本发明。
在本发明中，狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是通过连接臂或间隔臂或桥联分子的连接，新创建的连接臂或间隔臂或桥联分子将狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，即连接狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间的化学键包含新增原子或分子。在本发明优选的实施方案中，狂犬病病毒抗原和载体蛋白的化学键连接是通过连接臂或间隔臂或桥联分子的连接，连接臂或间隔臂或桥联分子选自二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo‐DST)、双(2‐(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2‐(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo‐BSOCOES)、乙二醇‐双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇‐双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo‐EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'‐二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'‐二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4‐二(3'‐(2'‐二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β‐(4‐叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4‐丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(SPDP)、长链‐氮‐ 琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫代)‐酸酯(LC‐SPDP)、磺基长链‐氮‐琥珀星氩氨‐3(2‐吡啶二硫 代)‐酸酯(sulfo‐LC‐SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链‐琥珀酰亚胺基氧代羰基‐甲基‐(2‐吡啶基硫代)苯(sulfo‐LC‐SMPT)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N‐羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4‐(N‐马来酰亚胺基甲基)环己烷‐1‐羧酸3‐硫代‐N‐琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo‐SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M‐马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo‐MBS)、N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基‐N‐琥珀酰亚胺(4‐碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo‐SIAB)、4‐(4‐马来酰亚 胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo‐SMPB)、4‐马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(sulfo‐GMBS)、琥珀酰亚胺基‐6‐((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基‐6‐(6‐(((4‐碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基‐4‐(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐1‐羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基‐6‐((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷‐为‐1‐羰基)氨基)己酸(SIACX)、4‐硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4‐(4‐N‐马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4‐N‐马来酰亚胺甲基环己烷‐1‐羧基酰肼(M2C2H)、3‐(2‐吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N‐羟基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(NHS‐ASA)、N‐羟基磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮基水杨酸(sulfo‐NHS‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺‐4‐叠氮水杨基氨基己酸(sulfo‐NHS‐LC‐ASA)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(P‐叠氮基‐水杨酰氨基)乙基‐1,3'‐二硫基丙酸酯(SASD)、琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(HSAB)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐叠氮基苯甲酸酯(sulfo‐HSAB)、N‐琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基‐6‐(4'‐叠氮基‐2'‐硝基苯基氨基)己酸酯(sulfo‐SANPAH)、5‐叠氮基‐2‐硝 基苯甲酸‐N‐琥珀酰亚胺酯(ANB‐NOS)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(M‐硝基叠氮基‐苯甲酰胺基)‐乙基‐1,3'‐二硫代二丙酸酯(SAND)、N‐琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SADP)、N‐磺基琥珀酰亚胺基‐(4‐叠氮基苯基)‐1,3'‐二硫代丙酸酯(sulfo‐SADP)、磺基琥珀酰亚胺基‐4‐(P‐叠氮苯基)丁酸(Sulfo‐SAPB)、磺基琥珀酰亚胺‐2‐(7‐叠氮‐4‐甲基甲基香豆素‐3‐乙酰胺)乙基‐1,3'‐二硫代丙酸酯(SAED)、磺基琥珀酰亚胺‐7‐叠氮基‐4‐甲基香豆素‐3‐乙酸酯(Sulfo‐SAMCA)、对硝基苯基重氮丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基‐2‐重氮3,3,3‐三氟丙酸(PNP‐DTP)、1‐(p‐叠氮水杨酰氨基)‐4‐(碘乙酰胺基)丁烷(ASIB)、N‐(4‐(p‐叠氮水杨酰胺基)丁基)‐3'‐(2'‐吡啶基二硫)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮‐4‐碘乙酰胺、二苯甲酮‐4‐马来酰亚胺、p‐叠氮苯甲酰肼、4‐(P‐叠氮水杨酰氨基)‐丁胺(ASBA)、P‐叠氮苯基乙二醛(APG)、4‐叠氮‐2‐硝基苯基生物素‐4‐硝基苯基酯(ABNP)、磺基琥珀酰亚胺基‐2‐(6‐(生物素酰胺基)‐2‐(p‐叠氮苯甲酰氨基)已酰氨基)乙基‐1,3‐二硫基丙酸酯(sulfo‐SBED)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟‐长链‐生物素(MTS‐ATF‐biotin)、甲烷硫代磺酸叠氮基四氟生物素(MTS‐ATF‐LC‐biotin)、三(羟基甲基)磷化氢(THP)、三(羟基甲基)磷基丙酸(THPP)。连接臂或间隔臂或桥联分子更优选DTSSP、BS3、sulfo‐DST、sulfo‐BSOCOES、sulfo‐EGS、DSG、DSC、DMA、DMP、BMH、戊二醛、ADH、碳酰肼、sulfo‐LC‐SPDP、sulfo‐LC‐SMPT、sulfo‐SMCC、sulfo‐MBS、Sulfo‐SIAB、sulfo‐SMPB、Sulfo‐GMBS、MPBH、M2C2H、PDPH、Sulfo‐NHS‐LC‐ASA、Sulfo‐HSAB、Sulfo‐SANPAH、Sulfo‐SADP、ASIB、ABH、ASBA、sulfo‐SBED。连接臂或间隔臂或桥联分子最优选DTSSP、DMP、ADH、碳酰肼、sulfo‐LC‐SPDP、sulfo‐SMCC、sulfo‐MBS、MPBH、PDPH、sulfo‐SBED。如果满足需要，也可采用其它连接臂或间隔臂或桥联分子，此处给出的连接臂或间隔臂或桥联分子仅仅是为了例示性说明本发明。
在本发明优选的一个实施方案中，先用氰化剂(1‐氰基‐4‐二甲基氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)或溴化氰(CNBr))对载体蛋白进行活化处理，再以已二酸二酰肼(ADH)为同源双功能连接臂加入已活化的载体蛋白中，形成载体蛋白‐ADH衍生物，再加入狂犬病病毒抗原，经过碳二亚胺介导的缩合作用载体蛋白‐ADH衍生物与狂犬病病毒抗原通过化学键结合，形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，再进一步经纯化获得用于配制狂犬病结合疫苗的抗原组分。在本发明优选的另一个实施方案中，先用氰化剂(1‐氰基‐4‐二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)或溴化氰(CNBr))对狂犬病病毒抗原进行活化处理，再以已二酰肼(ADH)为同源双功能连接臂加入已活化的狂犬病病毒抗原中，形成狂犬病病毒抗原‐ADH衍生物，再加入载体蛋白，经过碳二亚胺介导的缩合作用狂犬病病毒抗原‐ADH衍生物与载体蛋白通过化学键结合，形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，再进一步经纯化获得用于配制狂犬病结合疫苗的抗原组分。在本发明优选的另一个实施方案中，先用氰化剂(1‐氰基‐4‐二甲基氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)或溴化氰(CNBr))分别对载体蛋白和狂犬病病毒抗原进行活化处理，再以已二酸二酰肼(ADH)为同源双功能连接臂分别加入已活化的载体蛋白和狂犬病病毒抗原中，分别形成载体蛋白‐ADH衍生物和狂犬病病毒抗原‐ADH衍生物，再将载体蛋白‐ADH衍生物和狂犬病病毒抗原‐ADH衍生物混合，经过碳二亚胺介导的缩合作用载体蛋白‐ADH衍生物与狂犬病病毒抗原‐ADH衍生物通过化学键结合，形成狂犬病病毒抗原‐载体蛋白免疫原性结合物，再进一步经纯化获得用于配制狂犬病结合疫苗的抗原组分。狂犬病病毒抗原与载体蛋白的化学键连接可以有多种方法，在此所述的连接方法仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的连接，因此任何用于狂犬病病毒抗原与载体蛋白化学键连接的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。
在本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗中包括有效剂量的并与载体蛋白经化学键结合的狂犬病病毒抗原。根据世界卫生组织颁布的人用狂犬病灭活疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series No 941,2007)、欧洲药典人用狂犬病疫苗制造检定规程(European Pharmacopoeia.Rabies vaccine forhuman use in prepared cell cultures)和《中华人民共和国药典》(三部2015年版)人用狂犬病疫苗制造检定规程的要求，一个剂量的人用狂犬病疫苗包括≥2.5IU的狂犬病病毒抗原。WHO、欧洲药典和中国药典均颁布了人用狂犬病疫苗效力测定的NIH方法及标准。在本发明优选的实施方案中，狂犬病免疫原性结合物以及狂犬病结合疫苗的效价是经NIH效力试验方法测定，效价单位标示为≥2.5IU/剂，每剂为0.5ml或1ml。
本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗，在本发明优选的实施方案中，狂犬病结合疫苗包括人白蛋白作为保护剂或稳定剂。在本发明优选的另一实施方案中，与狂犬病病毒抗原经化学键结合的载体蛋白完全替代了现有狂犬病疫苗中需要加入人白蛋白作为保护剂或稳定剂的功能。在现有技术中人白蛋白最主要功能之一是通过阻止狂犬病病毒颗粒聚集，进而避免了疫苗中狂犬病病毒抗原位点的减少，从而实现作为狂犬病病毒抗原的保护剂或稳定剂的功能。本发明中的狂犬病病毒抗原由于是经化学键结合了载体蛋白的抗原，经化学键结合了载体蛋白的狂犬病病毒抗原因为载体蛋白的空间阻隔，阻止了狂犬病病毒抗原的聚集，进而避免了疫苗中狂犬病病毒抗原位点的减少，因此本发明的狂犬病结合疫苗不包括人白蛋白。在本发明优选的另一实施方案中，狂犬病结合疫苗也不包括与人白蛋白功能类似的保护剂或稳定剂。
本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗，在本发明优选的实施方案中，狂犬病结合疫苗还可包含本领域常用的佐剂。优选的佐剂有铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、百日咳毒素(PT)、百日咳毒素B亚单位(PTB)、百日咳丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)、皁角素QS‐21、α‐生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体(liposomes)、单磷酸类脂A(MPL‐A)、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体(Virosomes)、聚乙交酯(PLA)微球、聚乳酸‐乙醇酸(PLGA)微球、脂质‐胆固醇(DC‐Chol)、二甲基双十八基季铵溴化物(DDA)、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、MontanideISA51、Montanide ISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽(MDP)、细菌脂多糖(OM‐174)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)、IL‐1、IL‐2、IL‐6、IL‐12、IL‐15、IL‐18、IFN‐γ、GM‐CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、含有聚次黄嘌呤核苷酸(Poly I)和/或聚胞嘧啶核苷酸(Poly C)的皮卡佐剂。更优选的佐剂是QS‐21、MPL‐A、MF59、Virosomes、Montanide ISA50、Montanide ISA51、Montanide ISA206、Montanide ISA720、AS01、AS02、AS03、AS04、CpG、皮卡佐剂。最优选的佐剂是MF59、Virosomes、Montanide ISA51、AS03、AS04、CpG、皮卡佐剂。
本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗，在本发明优选的实施方案中，狂犬病结合疫苗包含防腐剂，优选的防腐剂是硫柳汞、2‐苯氧乙醇、苯甲醇。更优选的防腐剂是2‐苯氧乙醇。在本发明优选的另一实施方案中，狂犬病结合疫苗是不包含任何无防腐剂的疫苗。
在本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗中，狂犬病结合疫苗的剂型和配伍按照药学领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。在本发明优选的实施方案中，狂犬病结合疫苗剂型优选是液体剂型、冻干剂型、丸剂、片剂、胶囊剂型，更优选是液体剂型或冻干剂型，最优选是冻干剂型。
在本发明提供的一种将狂犬病免疫原性结合物再经配制制成的狂犬病结合疫苗中，狂犬病结合疫苗接种途径包括皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，还包括经鼻腔、口腔、肛门、阴道、黏膜途径给药。
说明：
本发明所述的新创建的连接臂或间隔臂或桥联分子，是指在狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接的反应过程中形成的连接臂或间隔臂或桥联分子；所述新增原子或分子是指在狂犬病病毒抗原和载体蛋白经化学键连接的反应过程中狂犬病病毒抗原和载体蛋白之间新形成的原子或分子。
本发明所述狂犬病病毒固定毒株、佐剂、化学键连接剂、蛋白类试剂等生物或化学制剂除特殊说明制备方法及工艺外，均为现有的通过商业购买的产品。在本发明中，所述狂犬病病毒固定毒株可购自中国药品食品检定研究院或美国标准生物收藏中心(ATCC)或美国疾病预防控制中心(CDC)。
以上公开的内容对本发明进行了一般性描述，可以通过如下实施例，但非限制，举例进一步理解本发明的核心内容或精神。所述实施例仅用于阐述本发明的概念和几个优选的实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解本发明并不限于如下具体实施方案，并且对如下实施例进行的多种变化、调整、修饰、修改、改变、改良、改进、减少、简化、增加、增添等可以由本领域技术人员实施，而不背离本发明的范围或精神。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。
附图说明
图1为本发明优选实施例3的狂犬病免疫原性结合物柱层析纯化图谱
具体实施方式
本发明可通过结合如下实施例进一步论述，将狂犬病病毒抗原和载体蛋白进行化学键结合，制成狂犬病免疫原性结合物，再经配制成狂犬病结合疫苗，狂犬病结合疫苗经动物试验和实验室检定证明具有良好的安全性和优秀的免疫原性和卓越的保护效力。所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好阐述本发明，而非对发明内容进行限制。
实施例1
狂犬病全病毒颗粒抗原原液制备及疫苗配制：
取Vero细胞工作库细胞于37℃进行复苏、扩增培养，并经连续传3‐5代，细胞密度达到1.0×105～1.0×106/ml，接种至含1～25g/L微载体的生物反应器进行罐流培养。微载体高密度悬浮培养5～7天，细胞密度达到1.0×106～1.0×107/ml，换用维持液。按0.001～0.1MOI接种病毒滴度为不低于7.5lg LD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN‐1V株。换用维持液，于33～35℃罐流培养。第3天开始连续收获病毒液，可连续收获病毒液20天以上。收获的病毒液经澄清过滤、100～300KD膜超滤浓缩10～30倍。按1:2000～1:8000加入β‐丙内酯，置4℃18～24小时灭活病毒，再经37℃水浴2小时使得残留的β‐丙内酯完全水解，并经进行病毒灭活验证。灭活后的病毒液用Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化，收集含全病毒颗粒的V0峰，纯化后的病毒液加入抗原稳定剂1～10％人血白蛋白即为狂犬病全病毒颗粒抗原原液。
用ELISA测定狂犬病全病毒颗粒抗原原液中狂犬病毒抗原含量，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、注射用水，经配制、调pH7.0～8.0、分装，即为疫苗。按世界卫生组织颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series,No.941,2007)、《中华人民共和国药典》(2015年版)颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程规定方法和标准进行检定，检定合格后为人用狂犬病全病毒颗粒疫苗(RV‐Vero)。
实施例2
载体蛋白‐破伤风类毒素(TT)的制备
将低温保存的破伤风冻干菌种启开，接种至含胰胨牛肉浸液琼脂半固体培养基，于33～37℃培养24～48小时。转种至半固体培养基，于33～37℃培养24～48小时。再转种至含胰胨牛肉浸液液体培养基的菌种瓶内进行增菌培养，于33～37℃培养24～48小时。将菌种瓶内培养物转种至双胨液体培养基的发酵罐内，于33～37℃培养60～80小时。发酵完毕，加入终浓度0.1～0.5％的甲醛灭菌处理，经离心收集上清液。上清液经0.45～1.2μm滤器澄清过滤，再经50～100KD膜超滤浓缩。分别加入NaHCO3至终浓度0.2～0.8％、(NH4)2SO4至终浓度15.0～20.0％，搅拌30分钟，置室温静置12～48小时。离心收集上清液。于收集的上清液中再增加终浓度6.0～12.0％的(NH4)2SO4，搅拌30分钟，置室温静置12～24小时。离心收集沉淀并溶于0.1％NaHCO3溶液中，用50～100KD膜超滤去除铵。加入NaCl至终浓度0.85％，再加入甲醛至终浓度0.15～0.25％，置37℃脱毒15～31天。用50～100KD膜超滤去除甲醛，经Sephacryl S‐300凝胶柱层析纯化，再经0.22μm滤器除菌过滤即为原液。脱毒纯化后的原液按《中华人民共和国药典》(2015年版)《吸附破伤风疫苗》规定项目和方法检定，检定合格后即为破伤风类毒素原液，置2～8℃保存备用。
实施例3
狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物制备及疫苗配制：
量取破伤风类毒素原液，用pH为7.5的0.1M PBS稀释至1～10mg/ml。加入100mg/mlCDAP(1‐氰基‐4‐二甲基氨基‐吡啶四氟硼酸)乙腈溶液至终浓度0.5～1.5mg/mgTT，反应30秒后，加入0.2M TEA(三乙基胺)，TEA加入量与CDAP加入量比为1～3:1(v/v)，调节pH至9.0，维持反应2～5分钟。加入ADH(已二酰肼)NaHCO3(0.1M)溶液至终浓度2.0～4.0mg/mgTT，维持反应120分钟。用50～100KD膜超滤去除残留化学试剂，即为破伤风类毒素‐ADH衍生物原液。量取按照本实施例1方法制备的且未加人血白蛋白的狂犬病全病毒颗粒纯化原液，按狂犬病全病毒颗粒原液蛋白含量与破伤风类毒素‐ADH衍生物原液蛋白含量比为1～5:1(w/w)的比例，混合狂犬病全病毒颗粒纯化原液和破伤风类毒素‐ADH衍生物原液。pH调节至5.0～5.8，加入终浓度为10～25mM的sulfo‐NHS(N‐羟基硫代琥珀酰亚胺)，再加入EDAC(碳二亚胺)至终浓度25～100mM，维持反应240分钟。反应结束，调节pH至6.8～7.5，静置过夜。用Sepharose4FF凝胶柱层析纯化，收集含全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物的V0峰，经0.22μm滤器除菌过滤即为狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物原液，置2～8℃保存备用。
图1显示了狂犬病毒全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物经Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化280nm图谱，在结合后观察到载体蛋白信号前移与狂犬病全病毒颗粒抗原形成结合物，载体蛋白在与狂犬病全病毒颗粒结合形成免疫原性结合物后几乎没有留下未结合的游离蛋白。
用ELISA测定狂犬病全病毒颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物原液中狂犬病毒抗原含量，加入聚山梨酯80(50‐300μg/ml)、琥珀酸盐缓冲(300‐800μg/ml)、氯化钠(7.5～9.5mg/ml)、注射用水，经配制、调节pH至5.0～7.0、分装0.5‐1.0ml/剂，即为疫苗。按世界卫生组织颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series,No.941,2007)、《中华人民共和国药典》(2015年版)颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程规定方法和标准进行检定，检定合格后为人用狂犬病全病毒颗粒结合疫苗(RCV‐VP)。
实施例4
狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物制备及疫苗配制：
将本实施例1方法制备的且未加人血白蛋白的狂犬病全病毒颗粒纯化原液按发明者另一发明所述方法(CN200610152928.7)经终浓度0.2～1.0％的Triton‐100裂解、10～60％蔗糖密度梯度离心或Sepharose 4FF凝胶柱层析方法纯化、50～100KD膜超滤浓缩，制备含刺突和基质蛋白的狂犬病病毒外膜片段原液。再将狂犬病病毒外膜片段原液按本实施例3方法与破伤风类毒素‐ADH衍生物在EDAC缩合作用下制备出狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物原液。
进一步将狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物原液按实施例3方法用ELISA测定狂犬病病毒外膜片段‐载体蛋白免疫原性结合物原液中狂犬病毒抗原含量，加入聚山梨酯80(50‐300μg/ml)、琥珀酸盐缓冲(300‐800μg/ml)、氯化钠(7.5～9.5mg/ml)、注射用水，经配制、调节pH至5.0～7.0、分装0.5‐1.0ml/剂，即为疫苗。按世界卫生组织颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series,No.941,2007)、《中华人民共和国药典》(2015年版)颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程规定方法和标准进行检定，检定合格后为人用狂犬病裂解结合疫苗(RCV‐split)。
实施例5
狂犬病病毒样颗粒(VLP)‐载体蛋白免疫原性结合物制备及疫苗配制：
参考齐瑛琳方法(齐瑛琳.狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价.长春.吉林大学.2015)制备狂犬病病毒样颗粒原液，再将狂犬病病毒样颗粒原液按本实施例3方法与破伤风类毒素‐ADH衍生物在EDAC缩合作用下制备出狂犬病病毒样颗粒原液‐载体蛋白免疫原性结合物原液。
进一步将狂犬病病毒样颗粒原液‐载体蛋白免疫原性结合物原液按实施例3方法用ELISA测定狂犬病病毒样颗粒‐载体蛋白免疫原性结合物原液中狂犬病毒抗原含量，加入聚山梨酯80(50‐300μg/ml)、琥珀酸盐缓冲(300‐800μg/ml)、氯化钠(7.5～9.5mg/ml)、注射用水，经配制、调节pH至5.0～7.0、分装0.5‐1.0ml/剂，即为疫苗。按世界卫生组织颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series,No.941,2007)、《中华人民共和国药典》(2015年版)颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程规定方法和标准进行检定，检定合格后为人用狂犬病病毒样颗粒结合疫苗(RCV‐VLP)。
实施例6
狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物制备及疫苗配制：
参考张建明方法(张建明等.海峡预防医学杂志.2009,15(2):1‐4)制备重组表达的狂犬病病毒糖蛋白(GP)原液，再将狂犬病病毒糖蛋白原液按本实施例3方法与破伤风类毒素‐ADH衍生物在EDAC缩合作用下制备出狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物原液。
进一步将狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物原液按实施例3方法用ELISA测定狂犬病病毒糖蛋白‐载体蛋白免疫原性结合物原液中狂犬病毒抗原含量，加入聚山梨酯80(50‐300μg/ml)、琥珀酸盐缓冲(300‐800μg/ml)、氯化钠(7.5～9.5mg/ml)、注射用水，经配制、调节pH至5.0～7.0、分装0.5‐1.0ml/剂，即为疫苗。按世界卫生组织颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程(WHO Technical Report Series,No.941,2007)、《中华人民共和国药典》(2015年版)颁布的人用狂犬病疫苗制造及检定规程规定方法和标准进行检定，检定合格后为人用狂犬病糖蛋白结合疫苗(RCV‐G)。
实施例7
狂犬病结合疫苗特异性毒性检查、毒性逆转检查
分别取样实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所制备的4种狂犬病病毒‐载体蛋白免疫原性结合物原液和4种人用狂犬病结合疫苗并等量合并成8份试验样品。每份试验样品注射250～350g体重的豚鼠4只，注射途径为腹部皮下，注射剂量为2ml/只，于注射后第7天、第14天及第21天进行观察豚鼠症状。观察期所有试验样品注射局部无化脓、无坏死、无脱皮、无脱毛，无晚期麻痹等破伤风症状，并且每只豚鼠体重比注射前有所增加。
分别取样实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所制备的4种狂犬病病毒‐载体蛋白免疫原性结合物原液和4种人用狂犬病结合疫苗并等量合并成8份试验样品，置37℃放置42天。每份试验样品注射250～350g体重的豚鼠4只，注射途径为腹侧皮下，注射剂量为5ml/只，于注射后第7天、第14天及第21天进行观察豚鼠症状。观察期所有试验样品注射局部无化脓、无坏死、无脱皮、无脱毛，无晚期麻痹等破伤风症状，并且每只豚鼠体重比注射前有所增加。
说明本发明制备的4种狂犬病病毒‐载体蛋白免疫原性结合物原液和4种人用狂犬病结合疫苗中所使用的破伤风类毒素载体经过一系列特殊结合工艺步骤处理后没有发生破伤风毒素特异性毒性反应，也没有出现毒性逆转现象。
实施例8
狂犬病结合疫苗安全性检查
分别取样实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所制备的4种狂犬病病毒‐载体蛋白免疫原性结合物原液和4种人用狂犬病结合疫苗并等量合并成8份试验样品。每份试验样品分别选用体重18～22g小鼠5只和体重250～350g豚鼠2只，每只小鼠腹腔注射样品0.5ml，每只豚鼠腹腔注射5.0ml，观察7天，记录体重变化。结果显示观察期内所有小鼠、豚鼠均键存，且无异常反应，到期时每只小鼠、豚鼠体重比注射前均有增加。
说明本发明制备的4种狂犬病病毒‐载体蛋白免疫原性结合物原液和4种人用狂犬病结合疫苗中没有污染外源性毒性物质，也没有存在意外的不安全因子。
实施例9
狂犬病结合疫苗免疫原性‐抗体动态测定
分别取样实施例1和实施例3所传统技术制备的人用狂犬病全病毒颗粒疫苗(RV‐Vero)和人用狂犬病全病毒结合疫苗(RCV‐VP)及生理氯化钠溶液免疫6～8周龄BALB/c小鼠，每个样品免疫6只小鼠，免疫剂量0.1ml/只，免疫途径皮下，免疫程序0、3、7、14天，于3、7、14、28天经腹主动脉采血，离心分离血清。用ELISA方法测定血清抗RabAg特异IgG、IgG1、IgG2a抗体，用RFFIT法测定抗狂犬病病毒中和抗体滴度(Virus NeutralizationAntibody,VNA)，结果分别见表1、表2、表3、表4，其中的数据表明在人用狂犬病全病毒结合疫苗(RCV‐VP)早期的IgG GMT水平及阳转率、IgG1GMT水平及阳转率、IgG2a GMT水平及阳转率、VNA GMT水平及阳转率均高于现有传统技术制备的Vero细胞人用狂犬病疫苗(RV‐Vero)。狂犬病结合疫苗抗体动态试验结果显示人用狂犬病全病毒结合疫苗(RCV‐VP)早期产生抗体滴度及抗体阳转率优于传统技术制备的Vero细胞人用狂犬病疫苗。因此，本发明提供的狂犬病免疫原性结合物及疫苗，以及利用本发明所述方法制备的狂犬病免疫原性结合物及疫苗具有有益的技术效果，能够在接种早期更加快速的诱导体内的免疫应答，有利于实现在患者感染狂犬病毒后在潜伏期早期或疾病发病之前发挥药效，挽救患者的生命。
表1.狂犬病结合疫苗与Vero细胞狂犬病疫苗产生IgG GMT(阳转率)比较
表2.狂犬病结合疫苗与Vero细胞狂犬病疫苗产生IgG1 GMT(阳转率)比较
表3.狂犬病结合疫苗与Vero细胞狂犬病疫苗产生IgG2a GMT(阳转率)比较
表4.狂犬病结合疫苗与Vero细胞狂犬病疫苗产生VNA GMT(阳转率)比较
实施例10
狂犬病结合疫苗保护效力测定
分别取样实施例1、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所制备的5种人用狂犬病结合疫苗和人用狂犬病参考疫苗按1:25、1:125、1:625稀释，用不同稀释度的人用狂犬病结合疫苗和人用狂犬病参考疫苗分别免疫14～16g小鼠16只，每只小鼠腹腔免疫0.5ml，免疫两次，间隔7天。初免14天后，用含5‐100LD50病毒量的狂犬病毒株CVS进行脑内攻击，每只0.03ml。观察14日，统计第5日后死亡和呈典型狂犬病脑症状的小鼠，计算ED50值，再计算疫苗效价。由表5中的数据可知，与现有传统方法制备的RV‐Vero相比，狂犬病结合疫苗具有更高的效价。
表5.狂犬病结合疫苗效价测定结果

Claims (10)

1.一种制备狂犬病结合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）经纯化制成狂犬病病毒抗原原液；
（b）将步骤（a）制备的狂犬病病毒抗原原液与载体蛋白进行化学键连接并纯化，制成狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物；
（c）将步骤（b）制备的狂犬病病毒抗原-载体蛋白免疫原性结合物进行稀释、配制、分装成为成品疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述狂犬病病毒抗原包括狂犬病全病毒颗粒、经重组表达的狂犬病病毒样颗粒、狂犬病全病毒颗粒经裂解后制备的狂犬病病毒外膜片段、从狂犬病病毒分离纯化的狂犬病病毒糖蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的核蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的磷蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的基质蛋白、从狂犬病病毒分离纯化的多聚酶、经重组表达的狂犬病病毒糖蛋白、经重组表达的狂犬病病毒核蛋白、经重组表达的狂犬病病毒磷蛋白、经重组表达的狂犬病病毒基质蛋白、经重组表达的狂犬病病毒多聚酶中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述狂犬病病毒抗原原液为将狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化制成狂犬病全病毒颗粒原液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述狂犬病病毒抗原原液为经重组表达、纯化制成狂犬病病毒样颗粒原液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述狂犬病病毒抗原原液为按照如下步骤获得的狂犬病病毒外膜片段原液，狂犬病病毒固定毒种接种细胞、培养、收获病毒液、灭活、纯化而制成的狂犬病全病毒颗粒原液；上述步骤中制备的狂犬病全病毒颗粒原液经裂解、纯化制成狂犬病病毒外膜片段原液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述狂犬病病毒抗原原液为经纯化制成狂犬病病毒糖蛋白原液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白选自破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT）、白喉毒素无毒变异体（CRM197）、B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）、肺炎球菌表面蛋白A（PspA）、肺炎球菌表面粘附素A（PsaA）、肺炎球菌溶血素（Ply）、流感嗜血杆菌D蛋白（PD）、百日咳毒素（PT）、百日咳丝状血凝素（FHA）、百日咳粘附素（PRN）、霍乱毒素（CT）、胞壁酰二肽（MDP）、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）、铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）、破伤风毒素C片段（TTC）中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述狂犬病结合疫苗包含佐剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素（CT）、霍乱毒素B亚单位（CTB）、百日咳毒素（PT）、百日咳毒素B亚单位（PTB）、百日咳丝状血凝素（FHA）、百日咳粘附素（PRN）、皁角素QS-21、α-生育酚、角鲨烯、类脂体、脂质体（liposomes）、单磷酸类脂A（MPL-A）、MF59、类病毒颗粒脂蛋白体（Virosomes）、聚乙交酯（PLA）微球、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球、脂质-胆固醇（DC-Chol）、二甲基双十八基季铵溴化物（DDA）、免疫刺激复合物(ISCOM)、Montanide ISA50、Montanide ISA51、MontanideISA206、Montanide ISA720、Montanide ISA系列佐剂、AS01、AS02、AS03、AS04、AS系列佐剂、胞壁酰二肽（MDP）、细菌脂多糖（OM-174）、大肠杆菌不耐热毒素（LT）、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CpG寡核苷酸、海藻糖二霉菌酸酯（TDM）、含有聚次黄嘌呤核苷酸（Poly I）和/或聚胞嘧啶核苷酸（Poly C）的皮卡佐剂的物质中的至少一种。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述狂犬病病毒抗原是根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo-32株、CTN-1V株、aGV株中的至少一种狂犬病病毒固定毒株制备的狂犬病病毒抗原，或根据选自PAS株、PV株、PM株、CVS株、Nishigara株、Flury株、Vnukovo-32株、CTN-1V株、aGV株中至少一种狂犬病病毒固定毒株基因重组表达制备的狂犬病病毒抗原。
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