CN105744951B - 细菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于针对伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的保护的稳定的缀合物疫苗制剂，以及将伤寒沙门氏菌的Vi‑多糖缀合至作为载体蛋白的破伤风类毒素的方法，所述缀合导致产生改善的抵抗由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症的T‑依赖性免疫应答。在本发明中公开的方法以及得到的制剂能够通过构成完整的疫苗接种时间表的仅单次注射引起抵抗伤寒症的免疫，包括在小于2岁的儿童中。

Description

细菌疫苗及其制备方法
发明领域
本发明涉及特征为在婴幼儿、儿童和成年中引起充足的抵抗伤寒症的免疫应答的细菌疫苗的领域。特别地，本发明涉及缀合物疫苗及其制备方法，其中伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的天然多糖被缀合至载体蛋白并被配制为预防性缀合物疫苗。此外，本发明还涉及用于针对伤寒沙门氏菌和麻疹病毒的保护的组合疫苗制剂的领域。
发明背景
伤寒沙门氏菌，人类伤寒症的致病细菌，是非洲、亚洲和中东的主要地方性疾病。被伤寒沙门氏菌污染的食物和水被认为是该疾病传播的主要来源。多个研究已经表明，伤寒症的全球负担在世界的不同部分有所不同。在中南亚和东南亚，在100,000人口中每年报道超过100个病例；估计亚洲、非洲、拉丁美洲和加勒比海具有伤寒症的中等发生率，即，在100,000人口中每年10至100个病例；新西兰、澳大利亚和欧洲具有低到非常低的发生率(Crump等人,2004)。这表明，伤寒症在世界的区域内、特别是在具有低的资源配置的发展中国家中具有强的地方性。
沙门氏菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，肠杆菌科包括志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)和弧菌属(Vibrio)。沙门氏菌属包括两个不同的种，肠道沙门氏菌(S.enterica)和邦戈尔沙门氏菌(S.bongori)。肠道沙门氏菌被进一步分为包括2443个血清型的六个亚种(肠道(enterica)、萨拉姆(salamae)、亚利桑那(arizonae)、双亚利桑那(diarizonae)、豪顿(houtenae)和因迪卡(indica))。因此，引起伤寒症的媒介物是肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型(通常被称为肠道沙门氏菌伤寒血清型)和甲型、乙型和丙型副伤寒血清型。血清变型(serovar)或血清型(serotype)可以被定义为具有负责产生特异性抗体的独特表面分子的菌株。每种血清型在它们的抗原区具有细微的化学差异(Brenner等人，2000)。
伤寒沙门氏菌具有使其成为有效病原体的特征组合。该物种含有革兰氏阴性生物体特有的内毒素，以及被认为增加毒力的Vi多糖抗原。它还产生并分泌被称为“侵袭素”的蛋白质，所述蛋白质允许非吞噬细胞摄入该细菌，允许该细菌在细胞内生存。它还能够抑制白细胞的氧化爆发，使先天性免疫应答失效。在近十年期间，已经发现沙门氏菌物种获得越来越多的抗生素抗性。原因似乎是在人类和动物的沙门氏菌病的治疗中增加和随意使用抗生素，以及向饲养的动物(breeding animal)的食物中添加促进生长的抗生素。质粒携带的抗生素抗性在小儿流行病中涉及的沙门氏菌菌株中非常常见。常观察到对氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮和磺胺类的抗性。尚未观察到粘菌素抗性。应该系统地检查沙门氏菌菌株的抗生素抗性，以当需要时帮助选择有效药物，并检测(来自动物来源或人类来源的)菌株的抗生素敏感性的任何变化。直到1972年，伤寒沙门氏菌菌株还保持着对抗生素的敏感性，所述抗生素包括氯霉素(最常被用来抵抗伤寒的抗生素)；但是在1972年，在墨西哥的广泛流行病由伤寒沙门氏菌的氯霉素抗性菌株引起。自此在印度、泰国和越南分离到了其他的氯霉素抗性菌株。
由伤寒沙门氏菌导致的的抵抗伤寒症的疫苗对于由于抗生素抗性增加导致的这些威胁生命的病症是至关重要的。对于人们到具有地方性伤寒症的地区旅行，它也是重要的保护手段。由于细菌具有获得多药物抗性能力的能力，抗生素可能无法提供完全的保护。到现在为止，目前已经制备出了可用于使用的三种类型的伤寒疫苗：(1)胃肠外灭活全细胞疫苗；(2)口服减毒活疫苗；(3)用于胃肠外使用的伤寒-Vi荚膜多糖疫苗。在早期清楚地研究了生物体的细胞和分子的复杂性，设计了抵抗伤寒症的疫苗。最初，通过热-苯酚-灭活法灭活的胃肠外施用的全细胞伤寒沙门氏菌被用作疫苗，以两个剂量施用。由于全细胞灭活的疫苗含有‘O’抗原(内毒素)，所以它们倾向于在接种疫苗的个体内产生局部和全身反应，并且这些类型的疫苗每两年需要加强剂量。口服减毒活Ty21a疫苗被认为是第二代疫苗，所述第二代疫苗使用缺少腺苷酸环化酶和AMP受体蛋白的突变伤寒沙门氏菌菌株以及对对氨基苯甲酸盐/酯和腺嘌呤营养缺陷的突变体制成。这些减毒活疫苗报告出差的效力，并且被发现不适合用于对小于6岁的儿童施用。另外，每5年还需要加强剂量。后来，伤寒沙门氏菌的荚膜Vi-多糖被鉴定为能够在人类中引起充足的免疫应答的保护性免疫原，并因此在常规免疫时间表中被用作潜在的疫苗候选者。注射25μg/0.5mL的剂量的纯化的荚膜Vi-多糖(ViP)能够产生最大的血清转变，即抗体升高至四倍。但是，在许多临床试验中，已经报道了Vi-多糖的局限性，天然多糖疫苗不能或不产生第二免疫应答。该现象是由于细菌多糖实际上是T细胞非依赖性的，并因此不能产生细胞介导的免疫应答。因此为了解决所述问题，进一步缀合伤寒沙门氏菌的多糖和载体蛋白以形成多糖-蛋白分子，以使其成为T细胞依赖性抗原。存在多种影响多糖和蛋白结合的因素，所述结合取决于选择的ViP和载体蛋白的分子量以及官能团的活化。低分子量多糖能够导致与载体蛋白的有效结合。多种载体蛋白像破伤风类毒素、白喉CRM197、大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定毒素的B亚基(LT-B)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的重组胞外蛋白A(rEPA)和马蹄rab血蓝蛋白(Horseshoe rab Haemocyanin)(HCH)已常被用于缀合。
WO1996/011709公开了一种O-乙酰化的寡核苷酸或多半乳糖醛酸酯果胶，其与缀合至载体蛋白破伤风类毒素的Vi多糖亚基结构基本上相同，其中所述载体蛋白是由胱胺衍生而来。该特定专利教导了使用不同的衍生剂(derivatizer)即胱胺将相同的多糖而非Vi-多糖缀合至载体蛋白。后来，WO1998/026799公开了一种来自甲型副伤寒沙门氏菌的分离的脂多糖，所述脂多糖已经通过解毒去除了其脂质A，并保留了其70％至80％的O-乙酰含量，并且然后通过己二酸二酰肼(ADH)缀合至载体蛋白破伤风类毒素。WO2000/033882公开了通过己二酸二酰肼共价结合至铜绿假单胞菌的蛋白的伤寒沙门氏菌的Vi-多糖(Vi-rEPA)缀合物。WO2007/039917公开了共价/非共价结合至热激蛋白的伤寒沙门氏菌的外源性抗原。
WO2009/150543描述了一种缀合的Vi-多糖，其被用作抵抗引起伤寒症的伤寒沙门氏菌的疫苗组合物，其中所述Vi-多糖共价缀合至选自CRM197或破伤风类毒素的蛋白质。如在WO2009/150543中公开的缀合方法包括首先在2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES缓冲液)的存在下将载体蛋白(所述载体蛋白优选为CRM197或破伤风类毒素)同时添加至接头(诸如己二酸二酰肼(ADH))以及碳二亚胺(诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC))，以得到衍生的载体蛋白。碳二亚胺EDAC与载体蛋白的重量比率在0.1至0.15之间。它还公开了较高量的碳二亚胺/蛋白比率可引起聚集体形成。在衍生化载体蛋白之后还进行Vi-多糖(ViP)的活化。Vi-多糖也用碳二亚胺来活化，其中混合多种比率的ViP和碳二亚胺(EDAC)以活化Vi-多糖。提到Vi活化可在室温在两分钟之内进行，其中可使用在1.5:1至200:1之间的较高比率。然后使衍生的载体蛋白CRM197或破伤风类毒素和伤寒沙门氏菌的活化的Vi-多糖彼此相互反应，以得到缀合的ViP-CRM197或ViP-TT缀合物，然后去除过量的接头。
在1999年Zuzana Kossaczka等人评价了ViP缀合物疫苗在越南的成年人、青少年和2至4岁儿童中的安全性和免疫原性。在这项研究中，在2至4岁儿童中抗Vi-rEPA(缀合物疫苗)的几何平均水平比在5至14岁儿童中由Vi荚膜多糖疫苗引起的高。在2至4岁儿童中，重新注射缀合物疫苗引起抗体滴度的升高(T细胞依赖的)。Konadu等人(2000)制备了甲型副伤寒沙门氏菌O-特异性多糖(O-SP)，并结合至破伤风类毒素。这些缀合物在小鼠中引起IgG抗体，并且在越南成年人、青少年和2-4岁儿童中评价了所述缀合物的安全性和免疫原性。该研究得出结论，在成年人、青少年和2-4岁儿童中这些实验性缀合物更加安全并且被证实引起IgG抗体。Feng Ying C等人评价了伤寒沙门氏菌ViP缀合物疫苗在2至5岁儿童中的功效。在这项研究中，发现缀合物伤寒疫苗是安全的且是免疫原性的，并且在2至5岁儿童中具有超过90％的功效。在36个评价的儿童中，在六周的第二剂量水平之后，血清IgG Vi抗体增加至10倍。这些案例持续27个月的时间段。在该研究中未观察到由于接种疫苗而引起的严重不良反应。Do Gia Canh等人研究了剂量对两次注射到2至5岁越南儿童中的ViP缀合物疫苗的免疫原性的影响。在这项研究中，评价了相距6周两次注射5μg、12.5μg和25μg缀合物疫苗的剂量免疫原性研究。这项研究还证实了安全性以及在这次试验和以前的试验中四组缀合物疫苗的一致的免疫原性。Novartis全球健康疫苗研究所(Novartis vaccineinstitute for global health)实施了三种不同剂量相关的ViP-CRM197制剂。他们实施的不同剂量为25μg/剂、12.5μg/剂、5μg/剂和1.25μg/剂。在第28天，这些浓度的GMT分别为304U(单位)、192U、111U和63U。在单次注射后第28天，25μg/剂的GMT引起最高的抗体水平(304U)。
虽然本领域的现状包括具有Vi-多糖和载体蛋白的缀合物疫苗，但是，现存的天然Vi-多糖缀合物疫苗在许多人类临床试验中测试时显示出，这些疫苗在成年人中是安全的且是免疫原性的，但是在小于2岁的儿童中不能引起任何保护性免疫应答。因此，证实了这种天然的伤寒沙门氏菌多糖疫苗对于在小于2岁儿童中的致死性伤寒沙门氏菌感染无法找到任何特别的解决方案，这需要能够使小于2岁的儿童免疫抵抗负责引起伤寒的伤寒沙门氏菌感染的新疫苗。小于2岁的年龄组最易于被伤寒沙门氏菌感染，但是似乎目前到现在为止对于人类来说对于小于2岁的婴幼儿没有任何可用的保护性疫苗抵抗伤寒沙门氏菌。如上文所讨论的，多种载体蛋白诸如CRM-197、r-EPA，已经被缀合至Vi-多糖，其中所述Vi-多糖可能尚未从伤寒沙门氏菌分离出，或者尚未从任何其他来源描述。因此，产生伤寒缀合物疫苗对于在缀合方法以及得到的缀合物疫苗中涉及的特定载体蛋白和天然多糖是特异性的。每种载体蛋白-多糖缀合使得其自身成为不同的缀合物疫苗身份。在伤寒缀合物疫苗领域中公开的现有技术、方法以及目前使用的那些现有技术和方法，具有它们自身的缺点，这可能是目前没有任何可用的能够保护小于2岁的儿童的缀合物疫苗背后的可能原因。
现在的伤寒缀合物疫苗需要具有6-8周时间间隔的至少2次或更多次注射构成完整的疫苗接种时间表，这也是本领域的目前状态非常明显且熟知的。BioMed制备了公众可得的伤寒Vi荚膜多糖-破伤风类毒素(ViP-TT)缀合物疫苗，所以缀合物疫苗需要2次注射，每次5μg，时间间隔为6-8周，以完成单个疫苗接种时间表。但是，该ViP-TT疫苗也不能够免疫小于两岁的儿童抵抗伤寒沙门氏菌。
发明概述
因此，对改变缀合方法将降低成本并使注射次数降低至仅一次注射就能够引起足够的免疫应答以及缀合化学领域中将较简单、消耗较少时间、具有成本效益且安全的其他相关技术问题存在需求。有效的疫苗必须能够引发良好的免疫应答，并且必须适用于在婴幼儿、特别地小于两岁的婴幼儿中使用。如本发明中所述的公开内容归根于以本申请中示出的创造性的方式将Vi-多糖与特定的载体蛋白破伤风类毒素(TT)一起缀合的新颖的可选的方法，所述方法潜在地克服了天然多糖疫苗、还有当前的缀合方法、包括缀合至载体蛋白的其他ViP疫苗的缺点。由在本专利申请中示出的该特定方法产生的Vi-多糖-蛋白缀合物疫苗使得其更加适于在儿童和包括小于两岁的婴幼儿中进行免疫，具有二次记忆应答(secondary memory responses)，产生高亲和性抗体抵抗伤寒沙门氏菌感染，包括任何年龄组的人类。本申请中提出的发明的又另一个优势是，注射伤寒缀合物疫苗以完成疫苗接种时间表的次数也已经被降低到只有一次，与此同时，当与由以前实践的2次或3次注射伤寒缀合物疫苗的疫苗接种时间表产生的免疫应答相比时，引起了较好的免疫应答。单次注射伤寒缀合物疫苗对于婴幼儿和儿童来说一直是优选的，因为它会减少另外的到诊所访问、为了疫苗接种而重复注射而使儿童或婴幼儿遭受的痛苦。已报道全世界40％的注射是使用未灭菌的、重复使用的注射器和针头施用的，并且特别是在为攻击对象的发展中国家，该比例高于70％，将数百万人暴露于感染，其中在注射期间病原体进入身体的组织。此外，脏的注射装置的差的收集和处理，使医护工作者和社区暴露于针刺伤的风险。不幸的是，在一些国家，不安全的处理还导致使用过的装置在黑市的重新出售。在WHO下，露天焚烧注射器是不安全的，可是世界上一半的非工业化国家仍施行该实践。(“Injection safety”,Health Topics A to Z.世界卫生组织(World Health Organization).2011-05-09检索.)。不安全的注射每年引起估计一百三十万早逝。(M.A.Miller&E.Pisani."The cost ofunsafe injections".世界卫生组织公告(Bulletin of the World HealthOrganization)77(10):1808–811)。虽然为了提高注射安全性，WHO通过以安全且适当地管理废弃物来辅助确保装置和物资的可用性，建议了根据情况采用注射的某些可选的选择，否则控制并调节医护工作者和患者、疫苗接种者的活动；但是这些措施并不总是可能完全地被观察到。在这样的情况下，伤寒缀合物和麻疹疫苗在单次注射中的结合肯定会在国家免疫计划的降低与注射安全有关的困扰方面发挥重要作用。许多国家确实具有命令医护专业人员在任何有可能时使用安全的注射器(安全性设计的针头)或施用药物的可选方法的法律或政策，但是，从公众健康观点，减少注射的次数，来确保在婴幼儿中以单次注射保护使免于伤寒和麻疹，无疑地预示了高依从性，因为以前需要至少3次注射来注射伤寒(最少2次注射)和麻疹(一次注射)疫苗，现在通过仅一次注射就能完成相同目标。
发明目标
本发明的首要目标是开发出用于在人类中预防和治疗伤寒沙门氏菌感染的疫苗制剂，以使T-非依赖性多糖可成为T细胞依赖性的，从而促进在所有年龄组、特别是小于2岁的儿童中并且还包括成年人中产生有效的免疫应答。
本发明的另一目标是提供抵抗由伤寒沙门氏菌引起的发热的疫苗组合物，所述疫苗组合物具有合适的缀合物多糖作为疫苗抗原，所述疫苗抗原会对小于2岁的儿童给予保护。
本发明的一个目标是提供产生Vi荚膜多糖的分批进料方法。
本发明的又一目标是提供大小减小的或大小未减小的Vi荚膜多糖与载体蛋白缀合的方法。
本发明的又另一目标是提供可选的方法，在缩减的时间内通过在与载体蛋白缀合之前伤寒沙门氏菌的ViP的大小减小，从而增加Vi多糖和载体蛋白之间的缀合百分比的有效的缀合方法。
本发明的又另一目标是提供使用或不使用接头分子缀合伤寒沙门氏菌的Vi荚膜多糖和载体蛋白破伤风类毒素作为最终的多糖缀合原液和成品疫苗的方法。
本发明的另外的目标是提供免疫原性疫苗制剂，所述疫苗制剂包含在适当的单一剂量和多剂量小瓶中的Vi-多糖-蛋白的偶联的多糖-蛋白缀合物，所述疫苗制剂将以有效给予预防伤寒沙门氏菌的适当浓度在婴幼儿和成年中施用。
根据本发明的一个实施方案，公开了伤寒沙门氏菌Vi-多糖的培养和处理。通过若干下游处理步骤对其进一步纯化以获得纯的Vi-多糖。
根据本发明的另外一个实施方案，公开了在接头分子己二酸二酰肼(ADH)的存在下将纯的Vi-多糖缀合至带有蛋白破伤风类毒素的缀合物的方法。获得的纯ViP-TT缀合物的产量高达70％-80％。
根据本发明的另外一个可选的实施方案，公开了在任何接头分子的不存在下将Vi-多糖缀合至带有蛋白破伤风类毒素的缀合物的方法。获得的不带有接头的纯ViP-TT缀合物的产量高达70％-80％。
本发明的另外的实施方案公开了ViP-TT缀合物疫苗的稳定制剂，所述制剂具有适当浓度的ViP-TT，以确保通过仅一次注射的完整的疫苗接种时间表，伴随ViP-TT，具有或不具有2-苯氧乙醇作为防腐剂。
本发明的另一实施方案提供了稳定的ViP-TT缀合物疫苗制剂的临床确定的实验数据，所述稳定的ViP-TT缀合物疫苗制剂表现出强的血清保护，并且通过构成完整的疫苗接种时间表的仅一次注射在人类中引发所需的抵抗伤寒沙门氏菌感染的免疫原性，所述人类包括小于2岁的婴幼儿(6个月至2岁)以及其他年龄组的受试者。
附图简述
图1：使用接头AHD(左侧)和不使有接头(右侧)的ViP产生和缀合的一般流程图。
图2：Vi多糖的血清学鉴定测试。
图3：伤寒天然Vi-多糖的HPLC，通过RI检测器分析纯化的Vi-多糖的HP-GPC柱谱图。在13.185分钟处的峰代表天然的Vi-多糖，其表示～900kDa的分子量。
图4：使用均质器进行约45次操作(passes)减小大小的ViP。通过RI检测器分析大小减小的Vi-多糖的HP-GPC柱谱图。在16.04分钟处的峰代表大小减小的Vi-多糖，其表示～200kDa的分子量。
图5：使用微波炉的减小大小的ViP。通过RI检测器分析大小减小的Vi-多糖的HP-GPC柱谱图。在15.18分钟处的峰代表大小减小的Vi-多糖，其表示～250kDa的分子量。
图6：ViP-TT缀合物原液的HPLC(RI)。使用HP-GPC柱通过RI检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物的HPLC谱图。在12.83分钟处的峰代表带有接头分子的缀合物ViP-TT。
图7：ViP-TT缀合物原液的HPLC(UV)。使用HP-GPC柱通过UV检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物的HPLC谱图。在12.66分钟处的峰代表带有接头分子的缀合物ViP-TT。
图8：不带有接头的ViP-TT缀合物原液的HPLC(RI)。使用HP-GPC柱通过RI检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物疫苗的HPLC谱图。在12.98分钟处的峰代表不带有接头的缀合物ViP-TT缀合物。
图9：不带有接头的ViP-TT缀合物原液的HPLC(UV)。使用HP-GPC柱通过UV检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物疫苗的HPLC谱图。在12.662分钟处的峰代表不带有接头的缀合物ViP-TT缀合物。
图10：ViP-TT缀合物疫苗的HPLC(RI)。使用HP-GPC柱通过RI检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物疫苗的HPLC谱图。在12.82分钟处的峰代表缀合物ViP-TT缀合物。
图11：ViP-TT缀合物疫苗的HPLC(UV)。使用HP-GPC柱通过UV检测器检测Vi-多糖-破伤风类毒素缀合物疫苗的HPLC谱图。在12.72分钟处的峰代表缀合物ViP-TT缀合物。
图12：在单次注射25μg单次注射的ViP-TT缀合物疫苗后，不同年龄组的几何平均滴度的比较。
图13：在单次注射25μg单次注射的ViP-TT缀合物疫苗后，不同年龄组的血清转变％的比较。
发明详述
使伤寒沙门氏菌在合适的培养基中生长，并将活跃生长的细胞转移到含有预先灭菌的培养基的发酵罐中。最初，进行分批模式的发酵过程，并且在培养物达到早期稳定阶段后，将含有高浓度碳源的进料培养基递增地泵到发酵罐中。进行分批进料模式的发酵过程直至得到期望的光密度。通过用低浓度的福尔马林灭活来收获培养物，并且然后离心以获得细胞上清液。将十六烷基三甲基溴化铵(Cetavlon)添加到细胞上清液以从宿主细胞组分中沉淀粗Vi-多糖。进行依序的纯化步骤即乙醇沉淀、使用不同分子量截留膜以及无菌过滤技术来浓缩和渗滤，以将纯化的Vi-多糖与宿主细胞杂质如核酸、蛋白质和脂多糖分离。
影响多糖和蛋白质的偶联的因素取决于分子量和官能团的活化。低分子量的多糖可导致有效偶联。不同的蛋白如破伤风类毒素、白喉CRM197、大肠杆菌的热不稳定毒素的B亚基(LT-B)、铜绿假单胞菌的重组外蛋白A(rEPA)和马蹄rab血蓝蛋白已常被用于缀合。确定细菌多糖的多糖和多糖-蛋白缀合物的分子大小在设计缀合物疫苗中是重要的方面。多糖-蛋白缀合物的物理-化学性质的评价在引发特异性免疫应答中发挥着重要的作用。在缀合之前和之后确定多糖的分子大小导致有效缀合。在缀合和纯化之后采用的两个重要的关键的质量控制测试是‘多糖(PS)与蛋白的比率’和‘未缀合的多糖(游离多糖)的百分数’。
Podda等人(2010)报道了在小于两岁的儿童中免疫接种的流行病学和重要性。目前可得的疫苗具有一些相应的局限性，并且因此不能在受伤寒病重大负担影响的年龄组小于两岁的儿童中使用。预期引入缀合物疫苗是有效免疫所有年龄组的有效手段，但是目前没有能够在小于2岁的年龄免疫接种伤寒缀合物疫苗的可用实验数据。本发明，依赖于其ViP-TT缀合物疫苗的独特缀合方法，所述独特缀合方法具有以下优势：可能免疫接种小于两岁的儿童或婴幼儿成以在该幼年组中免受引起伤寒症的伤寒沙门氏菌感染，这相应地得到了实验性临床试验数据的支持，并且还在小于两岁的婴幼儿中减少了注射的次数，以通过仅一个剂量的伤寒缀合物疫苗就完成完整的疫苗接种时间表。
实施例1：伤寒沙门氏菌Vi多糖的培养和处理
菌株伤寒沙门氏菌(Ty2)获取自National institutes of Child Health andHuman Development(NICHD),USA的John Robbins博士。通过以下特征的鉴定，从NICHD,USA得到的培养物被确认并鉴定为沙门氏菌伤寒血清型：革兰氏染色、不产气的葡萄糖阳性、在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD琼脂)上H2S阳性和Vi-多糖的阳性血清学。在诸如亚硫酸铋琼脂(BSA)、三糖铁(TSI)琼脂的不同选择性培养基上验证菌株的纯度。在诸如木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD琼脂)、亚硫酸铋琼脂(BSA)、三糖铁(TSI)琼脂的不同选择性培养基上验证菌株的纯度。
使伤寒沙门氏菌Ty2在大豆酪蛋白消化(SCDM)培养基上在37±1℃生长12小时。离心细菌培养物，将团块(pellet)重悬在无菌甘油(50％)中。制备在1mL的冷冻管中的0.5mL等分试样的甘油悬浮液，并在-70℃贮存。还进行了主种子的活细胞计数。将主种子批的冷冻管的内容物接种到SCDM液体培养基中，并在37±1℃孵育12小时。离心细菌培养物，并将团块重悬在无菌甘油(50％)中。进行活细胞计数。制备冷冻管中的甘油悬浮液等分试样，并在-70℃贮存。通过革兰氏染色、葡萄糖的利用(Durham法)、氧化酶测试、凝集测试和活细胞计数来表征主细胞库和工作细胞库。将其涂布(plate)到胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上，并在37℃孵育48至72小时。使用菌落计数仪进行菌落计数。
1.1发酵过程：
接种物培育：从冰箱中取出一个冷冻管的工作种子批的内容物，并使用水浴在室温解冻。将来自伤寒沙门氏菌的工作细胞库的一个冷冻管接种到10mL大豆酪蛋白消化培养基(SCDM)中，并在37±1℃培养12小时(阶段-I)，转移到各自含有50mL SCDM的两个烧瓶中，37±1℃持续12小时(阶段-II)，并且最后转移到各自含有400mL SCDM的四个烧瓶中并在37±1℃孵育12小时(阶段-III)。在培养物转移的每个阶段，通过革兰氏染色检查纯度和形态学特征。在600nm检查OD。在种子生长的不同阶段记录的伤寒沙门氏菌培养物的OD从1.2变化至3.8。
分批模式发酵：
Figure GDA0002289289850000111
Figure GDA0002289289850000121
表1.1发酵参数和规格限制
首先在100L S.S容器中制备85L的SCDM，并转移至发酵罐。在121℃对其原位灭菌15分钟。将培养基冷却至37℃。在该阶段将补充混合物通过加样口泵到发酵罐中。为了保持pH，将瓶子中的50％氨溶液连接至加样口作为氮源。将种子接种物转移到发酵罐中，并在6.9±0.2的pH、37±2℃的温度进行发酵过程，并且溶解氧保持在70-90％，持续多达22至24小时的时间段。通过初始在0小时以及每2个小时直至24小时测量在600nm处的OD值来检查生长。
进料分批模式发酵：伤寒沙门氏菌的进料分批发酵过程导致增加的Vi多糖的产生。OD600为3.8的阶段III培养物对于发酵是理想的。pH维持在6.90，并且溶解氧水平在40％至60％之间。贯穿发酵过程，直至早期稳定阶段培养，将含有碳源的进料培养基连同无机盐和矿物质一起递增地泵到发酵罐中。本文采用进料分批发酵方法通过进料含有1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液来增加生物质。pH维持在6.90至7.20的范围内，并且溶解氧水平维持在40％-60％之间。伴随进料培养基，供应氨溶液(50％)作为氮源。通过通过加样口无菌地泵入止泡剂溶液来控制发泡。使用10％NH4OH维持最适pH为7.2，并且溶解氧的浓度维持在35％空气饱和。每30分钟监控葡萄糖水平，并且通过分批进料方法贯穿该过程葡萄糖浓度维持在约1g/L。
过程持续直至24小时，并且然后用0.5％甲醛使细菌培养物失活，并在温和搅拌下在冷藏条件下(低于15℃)保持。通过在0小时以及每2个小时测量在600nm处的OD值来检查生长，持续24小时。该进料策略导致生物质的增加，在光密度方面达到约120至130。增加的生物质转化成较大的Vi多糖产生，在本过程中这实现了在进料分批培养中获得约每升1000mg的Vi-多糖终产量，在完成下游过程之后从所述过程最终获得每升400mg的纯化的ViP。因此，分批进料培养模式导致至少40％的最终产率。
1.2.纯化的Vi多糖原液(ViP)的下游过程
使发酵细胞上清液经历不同的纯化步骤以分离纯化的Vi-多糖。Vi-多糖由以α-(1→4)键的部分3-O-乙酰化的2-乙酰氨基-2-脱氧-d-半乳糖醛酸的重复单位组成。因此，确定O-乙酰基含量可与Vi-多糖的量关联。最终的纯Vi-多糖级分应该每克Vi-多糖含有2mM的O乙酰基(WHO TRS 840)。上清液通常含有大量的蛋白、核酸和脂多糖。过滤技术在从宿主细胞杂质纯化细菌多糖中的下游过程中发挥着重要作用。基于大小实现从溶解的物质中保留期望的分子；尺寸较大的颗粒将保留在表面，并且比膜的标称分子量限值(NMWL)低的那些颗粒在渗透过程中流出(Jagannathan等人,2008)。在初始的细胞上清液浓缩步骤中使用100kDa截留的膜盒，并且在最后的浓缩步骤使用300kDa截留的膜盒，并且使用注射用无菌水(WFI)进行渗滤。
细胞分离：在碗式离心机(bowl centrifuge)中在4℃以9000rpm(8000g)离心收获的培养物，持续30分钟。将上清液收集在无菌容器中。从上清液获得样品并测定O-乙酰含量。
浓缩和渗滤：通过使用切向流动过滤(TFF)系统使用100kDa膜来渗滤上清液。将上清液浓缩至初始体积的1/10，并进一步用注射用水(WFI)渗滤直至获得所需浓度。测定浓缩物的O-乙酰基含量。
溴棕三甲铵沉淀：向浓缩物中加入0.4M溴棕三甲铵，并在(5℃±1℃)孵育3±1小时。在4℃以9000rpm离心内容物30分钟。将收集的团块悬浮在所需体积的1M NaCl中。确定团块悬浮液的O-乙酰基含量。
乙醇沉淀：将一体积的乙醇和2％的乙酸钠加入到重悬的溴棕三甲铵沉淀物中；使用磁力搅拌器搅拌内容物20±5分钟。在4℃以4200rpm(8000g)离心内容物30分钟。将上清液收集到无菌瓶中，并弃掉团块。在连续搅拌下向上清液中添加2体积的乙醇(100％)，持续60±10分钟的时间段。在连续搅拌下向以上内容物中添加2％的乙酸钠。孵育1小时后，在4℃以4200rpm(8000g)离心内容物30分钟。弃掉上清液；将团块悬浮在无菌的冷WFI中，并转移至无菌瓶。检测样品的O乙酰基含量。过滤：使浓缩的ViP原液通过0.22μ胶囊式过滤器(Sartopore,Sartorius)。测定该无菌过滤的纯化的ViP原液的O-乙酰基含量。用溴棕三甲铵对由此获得的ViP原液再提取，并用乙醇沉淀。最后，如上文所提及的将原液浓缩并使用300kDa盒渗滤(被称作浓缩原液)。每个过程之后测定O-乙酰基含量。获得如在以下表1.2中给出的下游过程的不同步骤的以下O-乙酰基含量。通过如下文所描述的赫氏方法(Hestrinmethod)分析O-乙酰基含量。
测定O-乙酰基含量：通过赫氏的方法(Hestrin,1949)进行O-乙酰基含量的确定。样品中O-乙酰基的量与以mg/mL表示的Vi含量的量成比例。向测试样品中加入0.5mL的3.6NHCl和1mL的碱性羟胺溶液并彻底混合。在室温保持混合物2分钟并添加0.5mL氯化铁溶液并良好地混合。在540nm处测量吸光度。如下计算O-乙酰基含量：
Figure GDA0002289289850000141
O-乙酰基到Vi含量的转换的因子＝O-乙酰基(μmol/mL)x 0.294(25/0.085/1000)＝Vi含量(mg/mL)
将最终的无菌过滤的(0.22μ)Vi-多糖原液在低温真空干燥仪(冷冻干燥仪–FTS系统)中冷冻干燥。测试冻干的粉末的通过Ouchterlony方法的血清学鉴定、含湿量、蛋白含量、核酸、分子大小分布和细菌外毒素含量。在本研究中，用纯化的Vi-多糖和相应的同源抗血清填充孔直至弯液面刚好消失。在湿度箱中孵育凝胶板。当对照亮光背景看到板时，通过裸眼观察沉淀素线。在图2中示出了其照片，显示出观察到清晰的沉淀素弧。
通过使用凝胶渗透柱用琼脂糖凝胶CL-4B作为固定相确定Vi-多糖的分子大小分布。在相应于kDa 0.2 5的孔隙体积(Vo)之后收集级分并合并在一起。75％的多糖在0.25的kDa处洗脱。伤寒沙门氏菌Vi-多糖原液的分子大小分布在以下的表4.5中给出。通过H-NMR，Vi的表征表明其具有1％核酸、0.3％的蛋白和86％的水平的O-乙酰化。
单批次获得的干燥的ViP原液的结果列表于以下表1.2中：
测试 结果
血清学鉴定(Ouchterlony) 观察到清晰的沉淀素弧
含湿量 1.80％
蛋白 2.5mg/g Vi多糖粉末
核酸 5mg/g Vi多糖粉末
O-乙酰基含量(赫氏) 2.1mmol/g Vi多糖粉末
分子大小分布 75％的多糖在0.25kDa处洗脱
外毒素 小于150EU/μg Vi多糖粉末
表1.2：干燥的Vi-多糖原液的结果
以上结果符合WHO TRS 840、英国药典(British pharmacopeia)(2010)和印度药典(Indian pharmacopeia)(2010)标准的所有要求。在本研究中WHO TRS 840(1994)的要求被视为标准规范。WHO的标准要求是蛋白10mg/g，核酸20mg/g，O-乙酰基含量不小于2mmol/gVi-多糖，50％多糖的分子大小应在0.25kDa之前洗脱、通过免疫沉淀方法的同一性和通过无菌测试。根据英国和欧洲药典(British and European pharmacopeia)(2007)，干燥的Vi-多糖的规范是：蛋白10mg/g、核酸10mg/g、O-乙酰基2mmol/g，将在含有级分的混合物(pool)中发现的多糖的不少于50％在kDa 0.25之前洗脱，使用免疫沉淀方法鉴定，以及细菌外毒素测试。这些规范与WHO TRS 840、英国药典(2010)和印度药典(2010)相似。
实施例2：缀合方法
在本发明中公开了将纯化的Vi多糖(ViP)缀合到载体蛋白的有效方法，所述载体蛋白诸如白喉类毒素、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌类毒素、百日咳类毒素、产气荚膜梭菌类毒素、假单胞菌胞外蛋白A、CRM197。在本发明中优选地将纯化的ViP缀合至破伤风类毒素。采用多种可选的缀合方法实现高产率的缀合。纯化的ViP可以在缀合之前经受大小减小。在本发明中，以两种方法进行使用高分子大小(未减小大小)ViP或低分子大小(减小大小)ViP的缀合效率，以实现纯化的ViP-TT缀合物的高产率。对于高分子大小的ViP和破伤风类毒素的缀合，在最终反应混合物中ViP(未减小大小的)的浓度应该在1mg/ml至10mg/ml的范围内，以获得高达70％-80％的ViP-TT缀合物的期望产率，而对于低分子大小ViP和破伤风类毒素的缀合，在最终反应混合物中ViP(减小大小的)的浓度应该在5mg/ml至10mg/ml的范围内，以获得高达70％-80％的ViP-TT的期望产率。在以下部分中公开了减小纯化的ViP的大小的可选方法。
本发明的新颖性是在交联剂的存在下使用接头或不使用接头分子修饰Vi多糖并活化它们。根据本发明，不需要活化缀合物蛋白。活化的多糖和载体蛋白之间的缀合在诸如EDAC的交联剂的存在下发生。WO2009/150543教导了衍生化蛋白用于缀合，其中Vi-多糖分离自弗氏枸橼酸杆菌(C.freundi)，并进一步与作为载体蛋白的CRM197和/或破伤风类毒素缀合。在他们的研究中，Vi和EDAC以0.9-1.4的适当摩尔比率(EDAC/Vi)混合，可选地使CRM197和/或TT用ADH和EDAC处理来衍生化。将Vi分别缀合至CRM197和TT，并且使用聚丙烯酰胺葡聚糖S-1000纯化缀合混合物；通过SDS-PAGE分析级分，并收集不含有游离蛋白的那些级分(Micoli等人,2011)。但是，根据WO2009/150543，过量的接头已经通过透析被去除，而在本发明中，Vi-多糖任选地经受大小减小(均质化或通过微波方法)，并且然后任选地偶联至接头分子或者根本无任何接头分子来完成缀合。因此，其中不使用接头分子，不需要另外的去除过量接头分子的步骤。另外，在涉及使用接头分子的缀合的方法中，通过脱盐和渗滤去除过量接头，不同于在WO2009/150543中提及的透析。
2.1.利用高压均质化减小ViP的大小
ViP是接近1000kDa的非常大的分子。因此，分子的大小优选减小到该大分子的大约四分之一，以使能够在低浓度下与包括破伤风类毒素的载体蛋白缀合。因此，使5-7.5mg/ml浓度的ViP在2-8℃、1500巴经受高压均质化，并且重复相同的活动至少45次。如在相应的图中示出的，之后通过尺寸排阻凝胶渗透色谱术验证减小的ViP的分子大小。尺寸排阻之前ViP的保留时间是13.185分钟(图3)，而尺寸排阻色谱术之后ViP的保留时间为在16.04分钟时被洗脱(图4)，这表明ViP已经被减小到大约200kDa的相应分子大小。通过赫氏方法验证得出，均质化处理之后大小减小的ViP的O-乙酰基含量保持相同。之后，大小减小的ViP另外经受后续的缀合步骤，如以下部分所讨论的。
2.2.使用微波炉减小ViP的大小：
另一种在缀合之前减小ViP的大小的方法使用微波炉完成。将玻璃瓶中的浓度为5-7.5mg/ml的ViP放在50％-100％功率的微波炉内，持续5-10分钟。炉内部产生的微波导致裂解Vi多糖的长链的糖基键(glycosyl bond)，以将其减小为将它们缀合至载体蛋白所需的较短的分子。如在相应的图中示出的，之后通过尺寸排阻凝胶渗透色谱术验证减小的ViP的分子大小。尺寸排阻之前ViP的保留时间是13.185分钟(图3)，而尺寸排阻色谱术之后ViP的保留时间为在15.18分钟时被洗脱(图5)，这表明ViP已经被减小到大约200kDa的相应分子大小。通过赫氏方法验证得出，在微波处理之后大小减小的ViP的O-乙酰基含量保持相同。之后，使大小减小的ViP经受另外的缀合技术，如在以下部分所讨论的。
2.3.使用接头缀合Vi多糖和破伤风类毒素
在碳酸氢钠的存在下使纯化的Vi多糖(大小减小的或大小未减小的)部分脱O-乙酰化，并且利用EDAC介导的反应在pH6.0-7.5的范围与ADH偶联。使反应在2-8℃维持，伴随温和的搅拌。孵育后，通过使用磷酸盐缓冲液-EDTA缓冲液将pH变为8.0来淬灭反应混合物，并初始使用磷酸盐并随后通过MES缓冲液使用低分子截留膜进一步透析。浓缩最终的混合物，并测试O-乙酰基含量、ViP-ADH比率、游离ADH。
使用MES缓冲液使用低分子量截留膜浓缩并渗滤破伤风类毒素。测试最终的浓缩破伤风类毒素的蛋白含量。为了缀合，在碳二亚胺缩合物的存在下使用EDAC偶联修饰的Vi-多糖和蛋白。浓缩最终的偶联的分子，并使用1000kDa截留膜、优选地PES(聚醚砜)膜渗滤，随后使用20个渗滤体积(diavolume)的磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换。检测含有纯化的ViP-TT的保留物的多糖-蛋白比率、Vi含量、蛋白含量和分子大小分布，所述多糖-蛋白比率应在0.5％至1.5％的比率内。使用0.22μ膜无菌过滤最终的缀合物原液，并贮存在2-8℃。
任选地，利用1000kDa截留膜、优选地PES(聚醚砜)膜使用磷酸盐缓冲盐水来浓缩并渗滤最终的偶联的分子，并随后装载到凝胶渗透柱(琼脂糖交联的珠)中。将收集到的在0.5％至1.5％的比率内的级分混合在一起，浓缩并检测多糖-蛋白比率、Vi含量、蛋白含量和分子大小分布。使用0.22μ膜无菌过滤最终的缀合物原液，并贮存在2-8℃。
在表2.1中给出了本发明Vi多糖缀合物原液的分子大小分布。在本发明中获得的ViP-TT缀合物的分子大小是0.3kDa；当与在以前的缀合物ViP-TT的研究中获得的结果相比，给出的缀合物的分子大小分布<0.1kDa。这意味着，0.3kDa的分子大小分布指示最佳的可过滤大小，其允许ViP-TT的恰当过滤，同时与现有技术中提供的其他较低的分子大小分布相比为缀合物疫苗提供较好的免疫原性。较大的分子大小预示了较好的免疫原性，而将分子大小限制在允许过滤ViP-TT的适当大小也是至关重要的。因此，由于该0.3kDa的分子大小分布，如本发明主张的，仅一次单次注射伤寒缀合物疫苗足以构成完整的疫苗接种时间表抵抗由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症。现有技术规定了在较低分子大小分布的抵抗伤寒症的缀合物疫苗的情况下，多于一次注射、优选地三个剂量。
通过HPAEC-PAD分析来测量确定总的和游离的(未结合的)Vi多糖。在本方法中，Vi缀合物当在kDa 0.30处洗脱时产生75％的Vi多糖缀合物，从而给出较好的多分散性，并且产生Vi含量0.56mg/ml、游离的ViP 5％、蛋白含量0.25mg/ml、ViP-蛋白比率1.05、未检测到游离蛋白峰以及无菌性被发现可接受(参考表2.1)。本方法以10gm的初始分批规模的ViP进行，产生8升的0.9mg/ml-1.0mg/ml的Vi缀合物浓度的ViP缀合物原液，所述ViP缀合物原液产生7-8gm的ViP-TT缀合物，从而给出70％-80％的产率。
Figure GDA0002289289850000181
Figure GDA0002289289850000191
表2.1：带有接头的ViP-TT缀合物原液的结果
图6至7表示Vi-多糖和在不同阶段带有接头的ViP-TT缀合物原液的HPLC色谱。所有给出的HPLC谱图清楚地证实了本方法的缀合有效性。
如上文所描述的，使用接头分子ADH获得用于制备抵抗由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症的缀合物疫苗制剂的纯化的ViP-TT缀合物疫苗抗原的缀合方法可以归纳为以下步骤：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的ViP，所述进料培养基包括进料含有1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供应氨溶液(50％)作为氮源；
b.任选地减小ViP的尺寸，其中使浓度为5-7.5mg/ml的ViP在1500巴、2-8℃经受高压均质化并且重复相同的活动至少45次，或者通过微波炉，以使得获得大约250kDa的相应分子大小的纯化的ViP；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的纯化的ViP；
d.在EDAC的存在下用接头分子ADH活化步骤(c)的ViP；
e.在EDAC的存在下，以1mg/ml至5mg/ml的～900kDa的纯化的ViP的浓度或以5mg/ml至7.5mg/ml的～250kDa的纯化的ViP的浓度，用载体蛋白处理步骤(d)的连接至接头分子ADH的活化的ViP，以形成Vi-多糖-载体蛋白缀合物；
f.通过使用1000kDa膜使步骤(e)的Vi-多糖-载体蛋白缀合物与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤，以获得纯化的ViP-载体蛋白疫苗抗原。
2.4.不使用接头的Vi-多糖和破伤风类毒素的缀合：
将纯化的Vi多糖(大小减小的或大小未减小的)置于MES(2-吗啉代乙烷磺酸)或PBS的缓冲液中或生理盐水中，pH在5.0至9.0变化(准确来说pH 6-7.5)，多糖的浓度在1.0mg至20mg/ml变化(5mg/ml)。将蛋白以2.0mg/ml至20.mg/ml(10mg/ml)的不同浓度置于MES或PBS之类的缓冲液中，或生理盐水中，pH在6.0至9.0变化(准确的说pH 6-7.5)。ViP与蛋白的比率应该在1:1至1:3之间，从而意味着如果置入总计1gm的ViP，那么应该有相当于1gm至3gm的蛋白经受缀合。使缀合在2℃-8℃进行，以与室温相比有效地控制反应速率。在较高温度下，缀合的速率非常快。不优选将多糖暴露于较高的温度，因为在较高的温度下形成缀合物后，存在缀合的多糖-蛋白分子聚集的可能性。这将增加分子的大小，这将使在后续步骤中进一步纯化缀合物蛋白变的困难。因此，缀合优选在2-8℃。以在以上描述的不同pH条件的任一缓冲液中的不同浓度将ViP和TT添加在一起，并孵育用于缀合。在室温(25℃)孵育的时间在15-45分钟之间变化，并且在2-8℃孵育的时间在1小时到2小时内，然而当按照使用ADH(使用接头)的缀合方法时，缀合所需要的孵育时间为在2℃-8℃最少2-4小时。因此，与使用接头的缀合相比，按照不使用接头的该缀合方法还减少了总的反应时间。
利用1000kDa截留膜、优选地PES(聚醚砜)膜，随后使用20个渗滤体积的磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来浓缩并渗滤最终的偶联的分子。检测含有纯化的ViP-TT的保留物的多糖-蛋白比率、Vi-含量、蛋白含量和分子大小分布，所述多糖-蛋白比率应该在0.5％-1.5％的比率内。使用0.22μ膜无菌过滤最终的缀合物原液，并贮存在2-8℃。
任选地，利用1000kDa截留膜、优选地PES(聚醚砜)膜使用磷酸盐缓冲盐水浓缩并渗滤最终的偶联的分子，并随后装载到凝胶渗透柱(琼脂糖交联的珠)中。将收集的比率在0.5％至1.5％内的级分混合在一起，浓缩并检测多糖-蛋白比率、Vi含量、蛋白含量和分子大小分布。使用0.22μ膜无菌过滤最终的缀合物原液，并贮存在2-8℃。
不使用任何接头分子的本缀合方法使用10gm的初始分批规模的ViP进行，产生8升的0.9mg/ml-1.0mg/ml的Vi缀合物浓度的ViP缀合物原液，所述ViP缀合物原液产生7-8gm的ViP-TT缀合物，从而给出70％-80％的产率。
Figure GDA0002289289850000211
表2.2.:不带有接头的ViPs-TT缀合物原液的结果
然后通过GPC、TFF、离子交换或HIC获得粗缀合物。缀合物符合全部所需的药典规范，并进一步无菌过滤。图8至9表示Vi-多糖和在不同阶段的不带有接头的ViP-TT缀合物原液的HPLC色谱。所有给出的HPLC谱图清楚地证实了本方法的缀合效率。
如上文所描述的不使用任何接头分子ADH获得用于制备抵抗由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症的缀合物疫苗制剂的纯化的ViP-TT缀合物疫苗抗原的缀合方法可以用以下步骤总结：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的ViP，所述进料培养基包括进料含有1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液，pH保持在6.90至7.20的范围内，并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与进料培养基一起，供应氨溶液(50％)作为氮源；
b.任选地减小ViP的大小，其中使5-7.5mg/ml浓度的ViP在1500巴、2-8℃经受高压均质化并且重复相同的活动至少45次，或者通过微波炉，以获得大约250kDa相应分子大小的纯化的ViP；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的纯化的ViP；
d.在交联剂EDAC的存在下，以1mg/ml至5mg/ml的～900kDa的纯化的ViP的浓度或以5mg/ml至7.5mg/ml的～250kDa的纯化的ViP的浓度，用步骤(c)的ViP处理载体蛋白，以形成Vi-多糖-载体蛋白缀合物；
e.通过使用1000kDa膜使步骤(d)的ViP-载体蛋白缀合物与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤。
接头分子例如ADH，在两个末端含有末端氨基。在缀合之前被进一步减小其大小的Vi天然多糖天然地含有丰富的功能性羧基(-COOH)。载体蛋白例如破伤风类毒素含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)两者。在借助于接头分子ADH使ViP缀合至载体蛋白的情况中，在交联剂诸如EDAC的存在下实现，其中ViP的-COOH基团应通过ADH接头的末端中的一个与ADH接头的一个-NH2基团结合。活化的ViP与接头ADH偶联，在ADH分子的一个末端通过-CONH键连接。ADH分子的另一末端保持游离，以在合适的浓度和温度范围下与载体蛋白中存在的-COOH基团进一步键合。因此，活化的ViP-ADH在交联剂EDAC的存在下再次与载体蛋白反应，这使得在ADH分子的另一末端存在的-NH2能够与载体蛋白分子的-COOH基团结合，从而在Vi-多糖和载体蛋白之间形成有效的桥。因此在该方法中，有必要在用ADH处理ViP之后去除过量接头，并在处理ViP-ADH至载体蛋白之后再次去除过量接头。另外，在该方法中EDAC需要被使用两次。
另一方面，当按照不使用任何接头分子使ViP与载体蛋白缀合的方法时，由于ViP具有游离的-COOH基团并且载体蛋白具有游离的–NH2基团，所以在诸如EDAC的交联剂的存在下通过处理使ViP的-COOH与载体蛋白的–NH2直接结合是可能的。整个反应在一个步骤内完成，这使EDAC的过量使用最小化并且减少了完成ViP到载体蛋白的缀合的时间。由于所有的载体蛋白含有游离的–NH2基团，并且ViP还具有游离的-COOH，所以通过该方法使例如白喉类毒素、破伤风类毒素、CRM197等的任何载体蛋白与Vi-多糖缀合是可能的。因此，对于将ViP缀合至载体蛋白，不需要使用任何接头分子(ADH)。不使用接头的缀合的优势反映在缀合物的稳定性方面，因为在ViP和载体蛋白之间不存在借助ADH的任何连接分子桥。由于在任何连接桥的不存在下ViP-载体蛋白缀合物(在该情况中ViP-TT)分子的强度提高，这确保了较好的稳定性。ViP-TT的另外的降解也被非常高的程度地降低。并且在该方法中，操作并执行实验相当容易。所需的总EDAC量减少至约50％，并且仅操作一次而不是在ADH接头方法的情况中使用两次。(EDAC是可能在长时间暴露后导致蛋白凝固的刺激物)。另外，不需要GPC柱或TFF系统来去除过量的接头。随着步骤数减少，我们能够最小化用于缀合至任何载体蛋白(例如TT)的ViP的损失，因为与ViP-ADH连接有关的纯化步骤被省略。以下表列举了以减少的步骤完成整个缀合实验以及使用和不使用接头分子相比耗费的总时间。
在整个缀合实验中耗费的总时间：
Figure GDA0002289289850000231
Figure GDA0002289289850000241
表2.3：完成缀合过程耗费的时间的比较.
实施例3：疫苗制剂和稳定性.
基于本发明请求保护的伤寒缀合物疫苗制剂的典型的单个剂量包含从15微克(μg)至25μg的Vi-TT缀合物作为抗原，所述Vi-TT缀合物被溶解在生理盐水中制成0.5ml的总体积，用于一次注射，所述一次注射作为完整的疫苗接种时间表。
基于本发明请求保护的疫苗制剂还可以多剂量小瓶的形式供使用。多剂量小瓶可以是5个剂量(用于5个不同的受接种者/受试者/预期的疫苗接受者)或10个剂量(用于10个不同的受接种者/受试者/预期的疫苗接受者)。在多剂量小瓶的情况中，防腐剂被添加到疫苗制剂，以避免用于多次刺穿小瓶以由同一疫苗多剂量小瓶疫苗接种5-10个不同的儿童的疫苗制剂的污染。本发明的ViP-TT伤寒缀合物疫苗制剂的多剂量小瓶使用独特的防腐剂2-苯氧乙醇，其不含氯化汞和硫柳汞。在本领域的当前状况已经报道了使用诸如氯化汞和硫柳汞的对致癌性起作用的常规防腐剂的缺陷。因此，该独特的防腐剂2-苯氧乙醇的使用克服了常规防腐剂氯化汞和硫柳汞的缺陷。多剂量小瓶和它们的制剂的详情在以下被制成表：
Figure GDA0002289289850000242
表3.1：单个剂量和多剂量小瓶的疫苗制剂BBIL的ViP-TT缀合物疫苗的稳定性已经被详细研究并证实了3年。ViP伤寒缀合物ViP-TT疫苗经受了加速贮存条件(25℃±2℃)持续6个月和实时贮存条件(2℃至8℃)持续36个月两者的稳定性研究，并发现获得的测试结果在限制内并符合所需的规范(表3.2至3.5)。
Figure GDA0002289289850000251
表3.2：(使用接头分子缀合的)Typbar-TCVTM在2℃至8℃的稳定性研究(25μg每剂0.5ml的Vi-TT)
Figure GDA0002289289850000252
Figure GDA0002289289850000261
表3.3：(使用接头分子缀合的)Typbar-TCVTM在25℃±2℃的稳定性研究(25μg每剂0.5ml的Vi-TT)
Figure GDA0002289289850000262
表3.4：(不使用接头分子缀合的)Typbar-TCVTM在2℃至8℃的稳定性研究(25μg每剂0.5ml的Vi-TT)
Figure GDA0002289289850000263
Figure GDA0002289289850000271
表3.5：(不使用接头分子缀合的)Typbar-TCVTM在25℃±2℃的稳定性研究(25μg每剂0.5ml的Vi-TT)
实施例4：临床试验
对最终的Vi-多糖-破伤风毒素缀合物原液进行配制并在Balb/c小鼠中测试与天然放入多糖疫苗比较的免疫原性。进行攻击研究以评价疫苗的保护功效，并在实验室动物中进行临床前试验以确定异常、急性和系统毒性。此外，以两种不同的浓度剂量(每剂15μg和25μg)研究试验疫苗Vi荚膜多糖-破伤风类毒素缀合物(Vi-TT)的效力，并且显示两种浓度均在婴幼儿、儿童和成年人中引发保护性抗体。评价了与参考疫苗(伤寒沙门氏菌Vi-多糖疫苗
Figure GDA0002289289850000272
)相比BBIL的Vi-TT缀合物疫苗的伤寒Vi荚膜多糖-破伤风类毒素蛋白缀合物的免疫原性和安全性。
阶段-II：招收总共100名受试者来评价在13至17岁的健康青少年、6-12岁和2-5岁的儿童中，与参考伤寒Vi荚膜多糖疫苗
Figure GDA0002289289850000273
相比伤寒Vi荚膜多糖-TT蛋白缀合物疫苗的安全性和免疫原性。研究表明在所有的年龄组中试验疫苗Vi荚膜多糖-破伤风类毒素缀合物(Vi-TT)在免疫原性和反应原性方面优于参考伤寒Vi荚膜多糖疫苗
Figure GDA0002289289850000274
当与先前的接种普通
Figure GDA0002289289850000275
的血清相比，以ELISA单位每毫升(EU/ml)计Vi IgG的几何平均数分别80％、100％和70％提高至多于四倍增加。
作为单次注射对13-17岁青少年和2-6岁的年龄组施用25微克/剂的伤寒Vi荚膜多糖-破伤风类毒素缀合物疫苗(Vi-TT)的试验疫苗。当与先前的接种疫苗的血清相比，在两个年龄组中，Vi IgG EU/ml的几何平均数100％各自提高至多于四倍增加。相对地，用25μg/剂以两次注射注射2-5岁年龄组。施用第二次注射的时间间隔各自是6周。当与先前的接种疫苗的血清相比，在该年龄组中，Vi IgG EU/ml的几何平均数100％各自提高至多于四倍增加。
另一组被设计为作为两次注射对2-5岁之间的年龄组施用15μg/剂。施用第二次注射的时间间隔各自是6周。当与先前的接种疫苗的血清相比，在2-5岁年龄组中，Vi IgG EU/ml的几何平均数100％各自提高至多于四倍增加。
用25μg作为单次注射、每剂25μg作为两次注射以及每剂15μg作为两次注射的所有测试组表现出100％的血清转变。在所有的年龄组中，响应于Vi-多糖-破伤风类毒素蛋白缀合物疫苗的抗体优于参考天然的多糖疫苗。因此，能够得出结论，BBIL的测试疫苗伤寒Vi荚膜多糖破伤风类毒素缀合物(Vi-TT)疫苗是比已经商购可得的参考疫苗BBIL的
Figure GDA0002289289850000282
优异的。
阶段-III受试者数目详情：将总共981位受试者分配至伤寒缀合物ViP-TT疫苗和参考疫苗
Figure GDA0002289289850000283
以评价伤寒Vi-多糖-TT缀合物疫苗ViP-TT(Typbar-TCVTM)相对于普通伤寒Vi-多糖疫苗(
Figure GDA0002289289850000284
参考疫苗)的免疫原性和安全性。分析了BBIL伤寒缀合物ViP-TT疫苗与普通伤寒Vi-多糖疫苗(
Figure GDA0002289289850000285
参考疫苗)相比在三个年龄组(6个月至2岁、>2至<15岁和15至45岁)之间的几何平均滴度(GMT)和4倍血清转变百分比。在6个月至2岁、>2岁至<15岁和15岁至45岁中的年龄组的受试者中伤寒-TT缀合物疫苗的GMT在第42天，通过ELISA分别为1952.03EU/ml、1555.51EU/ml和812.97EU/ml伤寒抗Vi IgG抗体。在6个月至2岁、>2岁至<15岁和15岁至45岁中的年龄组的受试者中伤寒-TT缀合物疫苗的血清转变(4倍滴度升高)百分比在第42天血清转变分别为98.05％、99.17％和92.13％(图13)。
Figure GDA0002289289850000281
表4.1：Typbar-TCVTM阶段III临床试验数据
在2至<15岁年龄组中，伤寒-TT缀合物Typbar-TCVTM疫苗和伤寒疫苗
Figure GDA0002289289850000291
组的GMT在第42天通过ELISA分别为1555.51EU/ml和426.63EU/ml伤寒抗Vi IgG抗体(p＝0.00001)。在Typbar-TCVTM疫苗和伤寒疫苗
Figure GDA0002289289850000292
中在第42天的血清转变(4倍滴度升高)百分比分别为99.17％和94.86％(p＝0.0086)。
在15至45岁年龄组中，Typbar-TCVTM疫苗和伤寒疫苗
Figure GDA0002289289850000293
组的GMT在第42天通过ELISA分别为812.97EU/ml和376.81EU/ml伤寒抗Vi IgG抗体(p＝0.0001)。在Typbar-TCVTM疫苗和伤寒疫苗
Figure GDA0002289289850000294
组中在第42天的血清转变(4倍滴度升高)百分比分别为92.13％和89.01％(p＝0.4737)。
伤寒-TT(ViP-TT)缀合物疫苗的优势是在疫苗接种后GMT为普通多糖疫苗的3.16倍。接种伤寒缀合物疫苗(测试)之后与之前评估的GMT的滴度比率是普通多糖疫苗(参考)的3.53倍。对于血清转变，伤寒缀合物疫苗以0.016％的幅度(margin)显著优于普通多糖疫苗。
在以下描述了与参考疫苗
Figure GDA0002289289850000295
比较BBIL Typbar-TCVTM的ViP-TT缀合物疫苗的阶段III临床试验数据的概况(图12和13)，并且还在以下表中提供了与Peda TyphTM的比较：
Figure GDA0002289289850000296
表4.2：Typbar-TCVTM与
Figure GDA0002289289850000297
实施例5：TCV和麻疹的干扰研究
Typbar-TCVTM是缀合至破伤风类毒素载体蛋白的Vi-多糖疫苗的制品。已经证实与接受普通Vi-多糖疫苗的那些儿童相比，接受Vi缀合物疫苗的儿童达到并维持较高水平的抗-Vi IgG血清抗体。在免疫时间表中提议在从儿童出生第6个月至第24个月之间、并且优选地在第9个月内施用Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)。由于麻疹疫苗免疫也在相同的时间完成，联合两种疫苗并作为单次注射施用将提供另外的益处。为了能够完成这个目的，需要探究两种疫苗对彼此的生物学和化学性质的干扰。根据以上提议，设计研究以用液体Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)重构冻干的麻疹疫苗，并且在25℃孵育后的0小时、4小时和12小时进行O-乙酰基含量测试(对于Typbar-TCVTM)和细胞病变效应法(对于麻疹病毒)。检查在所述温度和时间点处两种疫苗的生理化学和生物学参数是否在规范内。该研究提供了重构的疫苗制品在短的时间段内的实验室发现的概况。
Figure GDA0002289289850000301
表5.1：伤寒缀合物疫苗和麻疹疫苗的规格
进行的试验：通过赫氏方法的O-乙酰基含量
Vi-多糖是由碳-3处被O-乙酰化的(1-4)-20乙酰氨基-2-脱氧-α-D-半乳糖醛酸构成的线性同聚物。纯化的Vi-多糖的O-乙酰基含量对于Vi的免疫原性是重要的，并且其可通过利用赫氏方法测量。
Figure GDA0002289289850000302
表5.2：通过赫氏方法的O-乙酰基含量
结果：
通过赫氏方法分析在25℃孵育的用Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)重构的麻疹疫苗的O-乙酰基含量。作为对照，还同时分析了保持在2-8℃的Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)和在时间点的开始25℃的Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)。如所预期的，在2-8℃和25℃的对照样品的O-乙酰基含量接近初始值。在0小时时组合疫苗(麻疹+TCV)的O-乙酰基含量高于接受标准(0.151μmol/剂)。在4小时和8小时时其随着时间降低(0.086μmol/剂和0.058μmol/剂)，它们在接受标准内，但是与在2-8℃和25℃的仅Typbar-TCVTM的值相比不同。
进行的试验：通过细胞病变效应(CPE)方法的效力测试
麻疹疫苗是减毒活疫苗。为了测定麻疹疫苗的滴度，制备对数稀释物，将每种对数稀释物接种到vero细胞系，一式8份，并孵育7-8天，并检查细胞病变效应的存在或不存在。通过斯皮尔曼卡勃(Spearman Karber)公式计算病毒滴度。结果如下：
Figure GDA0002289289850000311
表5.3：通过细胞病变方法的效力测试
结果：从结果观察到，当用麻疹疫苗的稀释物重构时，发现麻疹疫苗持续12小时是稳定的，并且当用Typbar-TCVTM(ViP-TT缀合物疫苗)重构时持续4小时是稳定的并在4和8小时之间下降。

Claims (14)

1.一种用于预防由伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒症的疫苗制剂，所述疫苗制剂包含部分脱O-乙酰化的伤寒沙门氏菌的荚膜Vi-多糖(ViP)作为疫苗抗原，所述荚膜Vi-多糖(ViP)缀合至作为载体蛋白的破伤风类毒素(TT)，形成Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合疫苗抗原，
其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合疫苗抗原包含活化的部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)，所述部分脱O-乙酰化荚膜Vi-多糖(ViP)在缀合之前用己二酸二酰肼(ADH)接头衍生化，所述衍生化的Vi-多糖(ViP)与破伤风类毒素(TT)缀合，其中作为载体蛋白的所述破伤风类毒素(TT)没有用ADH衍生化，并且没有游离的ADH附接至所述载体蛋白；
其中，所述疫苗制剂包含每剂5μg至25μg的所述缀合疫苗抗原；并且
其中，所述疫苗制剂的单个剂量引发所需要的针对伤寒沙门氏菌的T依赖性的免疫应答，所述引发包括在两岁以下的儿童中引发针对伤寒沙门氏菌的T依赖性的免疫应答；
其中，所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物疫苗抗原通过包括以下步骤的方法制备：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的ViP，所述进料培养基包括进料包含1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20的范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供给50％氨溶液作为氮源；
b.使5-7.5mg/ml浓度的步骤(a)的ViP在1500巴在2-8℃经受高压均质化并且重复该均质化步骤至少45次，或者通过微波炉，以获得分子量250-300kDa的纯化的ViP，使所述纯化的ViP在碳酸氢钠的存在下经受部分脱O-乙酰化；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的所述纯化的ViP；
d.在EDAC的存在下用接头分子ADH活化步骤(c)的ViP；
e.在EDAC的存在下，以5mg/ml至7.5mg/ml的分子量250-300kDa的纯化的部分脱O-乙酰化的ViP的浓度，用作为载体蛋白的破伤风类毒素(TT)处理步骤(d)的连接至接头分子ADH的活化的ViP，以形成Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物；以及
f.通过使用1000kDa膜与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤步骤(e)的所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物，以获得纯化的部分脱O-乙酰化的Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)疫苗抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述缀合疫苗抗原以每剂25μg的浓度存在于所述疫苗制剂中。
3.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的分子大小范围为0.25kDa至0.35kDa。
4.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的产率的范围为70％至80％。
5.一种制备伤寒沙门氏菌Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)疫苗抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的ViP，所述进料培养基包括进料包含1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20的范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供给50％氨溶液作为氮源；
b.使5-7.5mg/ml浓度的步骤(a)的ViP在1500巴、2-8℃经受高压均质化并且重复该均质化步骤至少45次，或者通过微波炉，以获得分子量250-300kDa的纯化的ViP，使所述纯化的ViP在碳酸氢钠的存在下经受部分脱O-乙酰化；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的所述纯化的ViP；
d.在EDAC的存在下用接头分子ADH活化步骤(c)的ViP；
e.在EDAC的存在下，以5mg/ml至7.5mg/ml的分子量250-300kDa的纯化的部分脱O-乙酰化的ViP的浓度，用作为载体蛋白的破伤风类毒素(TT)处理步骤(d)的连接至接头分子ADH的活化的ViP，以形成Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物；以及
f.通过使用1000kDa膜与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤步骤(e)的所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物，以获得纯化的部分脱O-乙酰化的Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合疫苗抗原。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的分子大小范围为0.25kDa至0.35kDa。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的产率的范围为70％至80％。
8.缀合至载体蛋白破伤风类毒素(TT)的部分脱O-乙酰化的伤寒沙门氏菌荚膜Vi-多糖(ViP)在制备用于包括在小于2岁的儿童中预防由伤寒沙门氏菌引起的伤寒症的疫苗制剂中的用途，所述预防通过构成完整的疫苗接种时间表的仅一次注射，其中所述缀合疫苗抗原以每剂5μg至25μg的浓度存在，其中所述ViP在缀合形成活化的ViP之前用己二酸二酰肼(ADH)接头衍生化，使得所述缀合在活化的ViP和载体蛋白破伤风类毒素(TT)之间发生，所述载体蛋白破伤风类毒素(TT)没有用ADH衍生化，并且没有游离的ADH附接至所述载体蛋白，并且所述疫苗制剂引起所需的抵抗伤寒沙门氏菌的T依赖性免疫应答；
其中，所述缀合至载体蛋白破伤风类毒素(TT)的Vi-多糖(ViP)通过包括以下步骤的方法制备：
a.使用进料培养基进行分批进料模式的培养以获得纯化的ViP，所述进料培养基包括进料包含1mg/mL至2mg/mL浓度范围的葡萄糖的溶液、pH保持在6.90至7.20的范围内并且溶解氧水平保持在40％-60％之间，其中与所述进料培养基一起，供给50％氨溶液作为氮源；
b.使5-7.5mg/ml浓度的步骤(a)的ViP在1500巴在2-8℃经受高压均质化并且重复该均质化步骤至少45次，或者通过微波炉，以获得分子量250-300kDa的纯化的ViP，使所述纯化的ViP在碳酸氢钠的存在下经受部分脱O-乙酰化；
c.使用交联剂EDAC处理步骤(a)或步骤(b)的所述纯化的ViP；
d.在EDAC的存在下用接头分子ADH活化步骤(c)的ViP；
e.在EDAC的存在下，以5mg/ml至7.5mg/ml的分子量250-300kDa的纯化的部分脱O-乙酰化的ViP的浓度，用作为载体蛋白的破伤风类毒素(TT)处理步骤(d)的连接至接头分子ADH的活化的ViP，以形成Vi-多糖(Vip)-破伤风类毒素(TT)缀合物；以及
f.通过使用1000kDa膜与磷酸盐缓冲盐水进行连续的缓冲液交换来渗滤步骤(e)的所述Vi-多糖(Vip)-破伤风类毒素(TT)缀合物，以获得纯化的部分脱O-乙酰化的Vi-多糖(Vip)-破伤风类毒素(TT)疫苗抗原。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述Vi-多糖(Vip)-破伤风类毒素(TT)缀合疫苗抗原以每剂25μg的浓度存在。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的分子大小范围为0.25kDa至0.35kDa。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述Vi-多糖(ViP)-破伤风类毒素(TT)缀合物分子的产率的范围为70％至80％。
12.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂在2℃-8℃持续3年是稳定的，并且在25℃持续至少6个月是稳定的。
13.根据权利要求1所述的疫苗制剂，所述疫苗制剂对于多剂量制剂还包含2-苯氧乙醇作为稳定剂。
14.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂的血清转变百分比(％)在6个月至24个月的年龄组的情况中在98％至100％之间，在2岁至15岁的年龄组的情况中在99％至100％之间，在15岁至45岁的年龄组的情况中在90％至100％之间，从而提供在疫苗接种后第42天四倍增加的血清转变。
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