KR102657910B1 - 개선된 안정성, 강화된 면역원성과 감소된 반응원성을 갖는 면역원성 조성물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디프테리아 톡소이드 항원(D), 파상풍 톡소이드 항원(T), B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg), 불활성화된 전세포 B. 백일해(wP) 항원, 운반 단백질에 접합된 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib) 협막 당류(capsular saccharide), 불활성화된 폴리오 바이러스(IPV) 항원, 및 부가적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 완전 액상 혼합백신은 개선된 면역원성, 감소된 반응원성 및 개선된 안정성을 나타낸다. 개선된 포름알데히드 불활성화 방법; 인산알루미늄 보조제에 개별적으로 흡착된, 디프테리아 톡소이드 항원(D), 파상풍 톡소이드(T) 항원 및 B형 간염(HepB) 표면항원의 개선된 흡착 프로파일; 최소의 총 알루미늄 함량(Al3+), 및 보존제로서의 2-페녹시에탄올(2-PE)의 최적화된 농도.

Description

개선된 안정성, 강화된 면역원성과 감소된 반응원성을 갖는 면역원성 조성물 및 그의 제조 방법
본 발명은 생명 공학 분야, 보다 구체적으로, 항원/면역원의 군을 포함하는 혼합백신 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 혼합백신 제조의 분야에서 개선된 방법론에 관한 것이다.
다수의 질병에 대한 면역원성을 제공할 수 있는 혼합백신은 단일백신보다 항상 유리한데, 그 이유는 주사 횟수의 감소, 다양한 근육내 주사와 관련된 합병증 감소, 투여 및 생산 비용의 감소, 재고 비용의 감소, 백신접종 지연 또는 누락 위험의 감소 및 개별적인 백신접종의 횟수 감소로 인한 환자의 수용태도 개선 때문이다. 게다가, 혼합백신의 완전 액상 제제는 재구성이 필요한 다른 백신에 비해 뚜렷한 이점을 갖는다. 평균 제조 시간은 비-완전 액상 백신에 비해 완전 액상 백신의 경우에 거의 절반인 것으로 밝혀졌다. 동일한 연구에서, 거의 모든 의료 종사 관계자들(97.6%)은 그들의 일상에서 완전 액상 백신의 사용을 선호한다고 하였다(참고문헌: Soubeyrand B, et al: Assessment of preparation time with fully-liquid versus non-fully liquid paediatric hexavalent vaccines. A time and motion study; Vaccine 2015, 33: 3976-82).
현재 널리 알려지고 입수가능한 혼합백신은, 한 번의 주사로 다수의 질병에 대해 민감한 인간 집단에서 요구되는 수준의 안전성, 효율성 및 면역원성을 달성하기 위한 적절한 면역원성의 형태로 적절한 항원의 적절한 제형을 포함하지 않을 수 있다. 몇가지의 부가적 항원과 함께 만들 수 있는 상이한 백신 조합의 수는 상당하다. 1종 내지 4종의 다른 항원 성분(예를 들어, HIB(동결건조 또는 액상), HBV, IPV, HAV)을 DTwP 또는 DTaP에 첨가함으로써, 발생될 수 있는 총 44가지의 가능한 상이한 종류의 혼합백신이 있다. 상이한 제조업체로부터의 개별적인 성분은 고려된다면, 상기 갯수는 수천 가지로 증가될 수도 있다. 새로 조합된 모든 개별적인 백신(소스에 따른 성분의 차이를 고려함)은 안전성, 안정성, 상용가능성 및 효능을 입증하기 위하여 반드시 별도로 개발되어야만 하므로, 이러한 모든 백신의 개발은 도전적인 과제가 된다.
혼합백신의 항원:
디프테리아 와 파상풍 항원
디프테리아와 파상풍은 각각 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium Diphtheria)와 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)에 의해 발생하는 급성 감염이다. 둘 다의 경우에서, 임상 질환을 일으키는 것은 이들 박테리아들의 강력한 외독소 때문이다. 이러한 박테리아들에 대한 보호를 제공하는 백신은 화학적으로 개질된 이들 독소들을 포함하고 있는데, 이들 독소들은 여전히 항원을 포함하고 있으나 더 이상의 독소는 포함하지 않는다. 디프테리아와 파상풍의 독소는 소의 추출물을 함유하는 배지에서, 코리네박테리움 디프테리아 및 클로스트리듐 테타니를 성장시킴으로써 제조된다. 톡소이드[디프테리아 톡소이드(D) 및 파상풍 톡소이드(T)]를 생성하기 위해 열, UV, 포르말린/포름알데히드, 글루타르알데히드 및 아세틸에틸렌이민 등을 포함하는 이후의 처리를 이용하여 이 독소들은 불활성화될 수 있다. 소 해면상 뇌증(BSE), 전염성 해면상 뇌증(TSE), 크로이츠펠트-야콥병(CJD 및 변이 CJD병)에 대한 우려는 백신 전반에 퍼져 있는 소 추출물을 함유하는 성장 배지에 사용되는 동물 성분에서 발생할 수 있다(참고문헌: WHO Guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies in relation to Biological and Pharmaceutical Products; 2003 & EMEA/CPMP/BWP/819/01; 24 April 2001).
백일해 항원
1940년대 화학적 및 열로 불활성화된 보르테텔라 백일해 유기체로 구성된 전세포 백신의 도입은 B.백일해균으로 인한 백일해(whooping cough) 발병률을 극적으로 감소시키는 원인이 되었다.
전세포 DTP 백신은 일반적으로 여러 국소적인 부작용(예: 홍반, 붓기 및 주사 부위의 통증 등), 발열 및 기타 가벼운 전신 작용(systemic event)(예: 졸음, 불안 및 식욕 부진 등)을 야기한다.(참고문헌: Cody CL, Baraff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; The nature and rate of adverse reactions associated with DTP and DT immunization in infants and children. Paediatrics 1981; 68:650-60) 및 (참고문헌: Long SS, DeForest A, Pennridge Pediatric Associates, et al. Longitudinal study of adverse reactions following Diphtheria-tetanus-pertussis vaccine in infancy. Paediatrics 1990; 85:294-302). 전세포 DTP 백신을 접종한 어린이들에게서 보다 심각한 부작용(예: 경련(열 동반 또는 열 동반하지 않음) 및 저긴장성 저반응 상태(hypotonic hyporesponsive episodes))는 덜 빈발하게(투여된 1,750회 용량에 대해 1의 비율로) 발생한다(참고문헌: Cody CL, Baraff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; The nature and rate of adverse reactions associated with DTP and DT immunization in infants and children. Paediatrics 1981; 68:650-60). 급성 뇌병증은 심지어 보다 희귀하게 발병한다(투여된 백만회 용량에 대해 0-10.5의 비율). 일부 희귀한 경우에 전세포 백일해 백신이 영구적인 뇌 손상을 유발한다는 점은 전문가들도 전적으로 동의한다(참고문헌: Institute of Medicine; DPT vaccine and chronic nervous system dysfunction, a new analysis; Washington D.C., National Academy Press, 1994).
전세포 백일해 백신접종, 반응원성과 심각한 부작용의 관계를 인용한 몇가지 보고서는 백신의 승인 저하 및 그로 인한 새로운 전염병을 유도하였다(Miller, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H., and Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization and serious acute neurological illness in children: Brit Med. J. 282: 1595-1599)
전세포 백일해(wP) 관련 부작용은 이들의 세계적으로 지속적인 사용에 문제가 될 수 있고, 따라서 wP계 혼합백신은 산업화된 세계에서 무세포 백일해계 혼합백신에 의해 점차적으로 대체되고 있다. 보다 최근에는, 한정된 요소 백일해 백신이 개발되고 있다. 모든 액상의 6가 무세포성 백일해계 백신(DTaP IPV PRP-T-HBsAg)은 이전부터 보고되어 왔다(EP1028750).
Infanrix® Hexa(GSK)는 현재 소크 IPK를 함유하는 전세계에서 유일한 상품화된 6가 소아과 혼합백신이다. 이 제품(DTaP3 -IPV-HBV//Hib)은, 사용 전에 백신의 나머지 부분과 재구성되도록 별도의 바이알에 동결건조된 Hib 항원 PRP-T 접합체와 함께 공동-포장된 5가 제품의 예비-충전된 주사기로서 판매된다. 두번째 6가 백신인 Hexyon®(또한, Hexacima® 또는 Hexaxim®으로 지칭됨)은 사노피 파스퇴르(Sanofi Pasteur)의 완전 액상 6가 제품이지만, 이 제품 역시 aP를 포함한다. 이 백신은 유럽과 전세계적으로 사금융 시장(private market)을 타겟으로 한다. 머크와 사노피 파스퇴르에 의해 공동개발된, aP를 포함하는 또다른 6가 백신이 현재 임상 3상 단계 연구에 있다.
7가 혼합백신은 바라트 바이오텍 인터네셔널(Bharat Biotech International)이 개발하고 있고, 상기 7가 혼합백신은 DT, 무세포성 백일해, 사빈 IPV(1형: 40 DU, 2형: 8 DU, 3형: 32DU), 단일 균주 불활성화된 로타바이러스(G9 균주, 즉, 116E 균주), TT에 대한 접합체 헤모필루스 인플루엔자 b형 PRP 접합체, 및 재조합 B형 백신이다.
그러나, 특히 개발 도상국 설정에서 무세포성 백일해(aP) 백신의 장기적 효과에 대한 우려가 제기되고 있다. 최근의 보고서는, 백일해에 대한 면역력이 사춘기에 감소한다는 점 및 이것이 완전히 예방접종을 마치기 전인, 6개월 미만의 영아인 경우의 증가의 원인임을 제안한다. 백신의 효능은 유아기에 aP 접종을 하면 8세에서 12세 사이에는 24% 정도가 되는 것으로 추산된다. 호주에서의 관찰 연구에 따르면, aP 백신을 접종받은 경우보다 유아기에 aP 백신을 접종받은 청소년의 경우에 보다 높은 경우를 보였다(상대 위험도 3.3, 95%, 신뢰 구간 2.4-4.5).
비용 관점에서는, aP 항원은 역사적으로, 제조과정 상이 및 로열티 비용 때문에 wP 항원 비용의 10배 내지 30배를 초과하였고, 따라서 이는 개발도상국에게 경제적 부담이 된다. 결과적으로, wP계 6가 백신의 가격이 사회적 기반이 부족한 국가들의 공공 부문에서의 사용을 위해 보다 적합할 수 있다.
따라서, 개발 도상국을 위해 의도된, 6가 백신에서의 전세포 백일해(wP)의 사용은, 특히 개발 도상국 설정에서의 aP 백신의 장기-효과에 대한 우려 및 가격 때문에 중요해지고 있다. 최상의 전세포 백일해(wP) 백신과 비교했을 때, aP 백신은 대량 예방접종 프로그램에 효과적이지 않다(Vickers et al.　2006; Cherry　2012).
예방 접종률이 높은(highly immunized) 집단에서의 발병에 대한 최근 연구는, aP 백신의 보호 지속 기간이 너무 짧고(Klein et al.　2012; Misegades et al.,　2012), 그 결과 성장한 어린이와 청소년의 면역력 감소 및 이 연령대에서의 상응하는 질병 증가를 유발함(Skowronski et al.; Klein et al.,　2012년)을 보여준다. 이는, 10년 동안 보호를 제공하는 wP 백신과는 대조적이다(Klein et al. 2012). 이러한 단점들 때문에, 1990년대에 aP 백신으로 전환한 국가에서는, 백일해에 대한 보호 수준이 낮을 뿐만 아니라 부스터(booster)에 대해 덜 반응하는 어린이 세대가 생겼는데, 이는 어린이들이 처음 맞는(prime) 백신이 이후의 추가되는 백신접종에 대한 이들의 면역 반응을 결정하기 때문인 것으로 판단될 수 있다(Podda　et　al.　1995; Mascart　et　al.　2007; Sheridan　et　al.　2012; Liko, Robison and Cieslak　2013; Smits　et　al.　2013).
wP의 반응원성에 기여하는 가장 중요한 요인 중의 하나는 박테리아 외막에서의 내독소인 리포-올리고사카라이드(LOS)의 존재이다.
wP 백신 내 독소의 불활성화는 다양한 방법을 통하여 이루어질 수 있는데, 활성 열 불안정한 독소가 최종 제품에서 검출불가능해야만 한다. 다수의 제조사에 의해 수행되는 wP 독소의 불활성화를 위한 전세포 백일해(wP) 벌크 방법은, 열 처리/포르말린을 사용한다. 몇몇의 보고서에서는 wP의 불활성화를 위해서 티메로살의 사용을 보고하고 있다. 그러나, 티메로살의 사용은 IPV의 항원성의 상실을 유발하고(Vaccine　1994 Volume 12 No. 9 851-856. Deleterious effect of thimerosal on the potency of inactivated poliovirus vaccine), 따라서 IPV를 함유하는 혼합백신의 경우에, 시간 경과에 따라 그의 효능을 유지하기 위해 티메로살-함유 wP과는 별도의 바이알에 존재하거나 소스 백일해 벌크를 불활성으로 바꿀 필요가 있다. 활성 PT와 같은 일부 항원은 면역 반응 조절제로서 역할을 할 수 있으며, 상이한 백신들 사이의 다양한 항원에 대한 면역 반응의 중요한 차이가 관찰되었다(WHO, 1993년).
LOS의 화학적 추출은 내독소 함량(20%)의 유의적인 감소로 이어지고, 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서의 용도에 따라, 내독성 관련 독소의 두드러진 감소로 이어진다. LOS의 추출은 제품의 일체성에 영향을 미치지 않고, 보다 중요하게는 낮은 DTP의 효능 및 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것이다. 게다가, 항체와 T 세포 반응의 임의의 차이는 거의 관찰되지 않았다(참고문헌: Waldely Oliveira Dias et. al; An improved whole cell pertussis vaccine with reduced content of endotoxin; Human Vaccines & Immunotherapeutics 9:2, 339-348; February 2012)
B형 간염 항원
간염 바이러스의 다양한 균주가 있다. B형 간염은 B형 간염 바이러스(HepB)에 의해 발생하는 질환이며, 이는 인간의 간을 감염시키고 간염이라 불리는 염증을 야기한다.　　이 질환에 대한 백신은, 바이러스막 단백질 중 하나인 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)을 포함한다.　대량 예방접종에 사용되고 있는 백신은 현재 머크(Merck)의 제품인 Recombivax HB® 및 Comvax®, 및 글락소 스미스클라인 바이올로지칼(Glaxo SmithKline Biologicals)의 Engerix-B® 및 Pediarix®로 시판중이다. B형 간염 성분을 갖는 혼합백신은 HepB 단일-항원백신에 비해 높은 완결성(completion)과 순응도(compliance)의 결과를 보였다(참고문헌: Kurosky. et. al; Effect of Combination Vaccines on Hepatitis B Vaccine Compliance in Children in the United States; The Pediatric Infectious Disease Journal. 36(7):e189-e196, JUL 2017). 몇몇의 참고 문헌은 다른 항원과 함께 인산알루미늄으로의 B형 간염 바이러스 표면항원의 흡착을 언급한다. B형 간염 성분에는 실질적으로 티메로살이 없어야 한다(티메로살이 없는 HBsAg의 제조 방법은 EP1307473에 이미 공개되어 있다). Hexavac®은 B형 간염 성분의 낮은 면역원성으로 인하여 시장에서 철수한 혼합백신이다.　적절하거나 개선된 면역원성을 갖는 B형 간염 항원을 포함하는 혼합백신의 조성물에 대한 수요가 있다.
헤모필루스 인플루엔자(Hib) 항원
헤모필루스 인플루엔자는 상기도 상재균(upper respiratory tract flora) 중 정상 파트인 그램-음성 코코바실루스이다. 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib b)은 소아의 수막염 침습성 혈액 매개 감염의 주요 원인이며, 생후 첫 2년 동안의 수막염의 주요 원인이다. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 예방접종은 1987년 캐나다에서 다당류 백신[폴리리보스 리비톨 포스페이트(PRP)]을 사용하며 시작되었다. Hib의 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP) 캡슐은 유기체의 주요 발병 인자이다. PRP에 대한 항체는 혈청 세균성 활성의 주요 원인제공자이며, 항체의 증가는 침습성 질환의 위험 감소와 관련된다. PRP는 T-세포 독립 항원이며, 따라서 a) 18개월 미만의 유아 및 아동에서의 불량한 항체 반응의 유도, b) T-세포 의존 항원에 의해 보이는 것보다 가변적이고 정량적으로 적은 항체 반응, c) 면역글로불린 M(IgM)의 높은 비율의 생성, 및 d) 부스터 반응의 유도 불가능성을 특징으로 한다.
PRP 성분에만 기초한 초기 백신은 유아에게 효과가 없는 것으로 판명되었다. PRP 접합체 백신을 향하여 추가 노력이 이루어졌는데, 여기서 PRP는 수막구균, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 CRM 197의 외막 단백질과 같은 운반 단백질이라고 불리는 단백질에 접합된다. 혼합백신에 Hib-접합체 성분을 포함시키는 것은 감소된 Hib 면역원성과 관련되어 있다. 게다가, Hib-접합체는 수성 매질에서 불안정하며 이러한 형태로 장기간 저장할 수 없다. 따라서, 헤모필로스 인플루엔자 b(Hib)의 PRP 다당류는 건조된 고체로서 종종 배합되고, 이는 다른 항원들의 액상 제형과 함께 전달 시에 재구성된다. 예를 들어, Infanrix® hexa(WO99/48525)에.
소아마비 항원
상이한 종류의 백신이 입수가능하다:
·1961년에 앨버트 사빈(Albert Sabin) 박사가 개발한 약독화된(약화된) 구강 폴리오 생백신(OPV). 사빈 균주를 포함하는 OPV는 경구 투여한다.
·1955년에 조나스 소크(Jonas Salk) 박사가 개발한 불활성화된 폴리오 (사)백신(IPV). 솔크 균주를 포함하는 IPV는 주사제로서 제공된다.
·최근에, 사빈 균주 폴리오-바이러스를 포르말린으로 불활성화하여 제조된 사빈 불활성화된 폴리오-바이러스가 주사용으로 개발되었고 또한 상업용 제품으로 시판중이다.
약독화된 폴리오 생백신(OPV) 및 불활성화된 폴리오 백신(IPV)은 둘 다 전 세계적으로 폴리오 질환을 억제하는 데에 효과적이다. 폴리오 백신은, 소크 또는 사빈 균주를 포함할 수 있다.
1955년에, 조나스 솔크 박사는 야생형 폴리오-바이러스의 불활성화에 성공하여, 이는 주사형 제형으로 사용가능하고 이것을 소크 균주로 명명하는데, 이는 소아마비 질환에 대한 백신에 사용되어 온 마호니 1형, MEF 2형, 및 소켓(Saukett) 3형을 포함한다. 사빈 균주는 사빈 1 균주 및 사빈 2 균주를 포함한다.
현재 허용가능한 폴리오 백신, 예를 들어, Infanrix-hexa®(WO99/48525)의 표준 용량은 40D 항원 단위의 불활성화된 폴리오-바이러스 1형(마호니), 8D 항원 단위의 불활성화된 폴리오-바이러스 2형(MEF-I) 및 32D 항원 단위의 불활성화된 폴리오-바이러스 3형(소켓)이다.
IPV는 현재 비-보조용 표준-독립형 제형으로서 또는 DT-IPV(디프테리아와 파상풍 톡소이드 포함) 및 6가 IPV 백신(추가적으로 백일해, B형 간염, 헤모필루스 인플루엔자 b), 예를 들어, Infanrix® hexa (WO99/48525)을 포함하는 다양한 조합에서 사용할 수 있다.
그러나, OPV와 비교하여, IPV에 대한 전체 생산 비용은 상당히 크다. 이것은 주로 다음 요구사항 때문이다: (i) 용량 당 보다 많은 바이러스; (ii) 부가적인 다운스트림 가공(즉, 농축, 정제 및 불활성화)과 관련 QC-테스트, (iii) 다운스트림에서의 항원 손실 또는 불량한 회수, 및 (iv) 오염. 지금까지는, 재정적인 문제가 하위- 및 중위-소득 국가에서 IPV 혁신 및 시행의 주요 장애물이었다.
폴리오-바이러스 퇴치 이후의 IPV에 대한 미래의 세계적인 수요는 현재 8천만 용량의 현 수준에서 매년 4억 5천만 용량으로 증가할 수 있다. 결과적으로, IPV의 (스트레치(stretch)) 공급에 대한 접근법이 필요하다.
저-용량의 IPV 항원을 사용하여 감염에 대한 보호를 제공하는 감소된-용량의 효과적인 백신 제형은, 종래의 백신의 공급이 전 세계적 요구를 충족시키기에 불충분한 경우 또는 종래의 백신의 제조 비용이, 개발도상국의 경우에 상기 백신이 입수가능한 가격으로 팔리는 것을 방해하는 상황에서 바람직하다. 또한, 저-용량의 IPV에 대한 노출은 현존하는 판매된 제형과 비교하여 더 안전할 수 있다. 따라서 IPV를 보다 입수가능한 가격으로 제공할 수 있는 다양한 전략이 평가될 필요가 있다. 결과적으로 용량 감소된 IPV를 포함하는 혼합백신은 더욱 저렴하고 투여하기 쉽게 만들 수 있다.
유행성 인플루엔자 백신의 경우, 보조제의 사용으로 용량 감소가 가능하도록 하고 백신의 입수가능성을 높이며, 백신의 비용을 절감해 왔다. 따라서, IPV의 보조 백신 제형은 비용을 줄이고 전 세계적으로 IPV 가용 용량의 수를 증가시킬 것으로 예상된다.
추가로, 알루미늄 염은 안전하다고 여겨지고, IPV를 함유하는 혼합백신에 이미 사용되고 있으며, 개발 장벽이 가장 낮고, 제조하기에 저렴하다. 그러나, 알루미늄 보조제는 유의한 용량-감소를 허용하기 위한 것으로 공지되어 있지 않다.
항원
혼합백신에 포함될 수 있는 다른 항원들로는 헤모필루스 인플루엔자(a, c, d, e, f 혈청형 및 비캡슐화된 균주), 간염(A, C, D, E, F 및 G 균주), 뇌수막염 A, B 또는 C, 인플루엔자, 폐렴구균, 연쇄구균, 탄저병, 뎅기, 말라리아, 홍역, 볼거리, 풍진, BCG, 일본 뇌염, 로타바이러스, 천연두, 황열병, 장티푸스, 싱글(singles), 수두 바이러스 등이 있다.
혼합백신에 사용되는 항원의 범위와 유형은 영아, 유아, 어린이, 청소년 및 성인과 같이 사용할 대상 집단 연령에 따라 좌우되다. 보르데텔라 백일해, 클로스트리듐 테타니, 코리네박테리움 디프테리아, 및 선택적 불활성화된 폴리오바이러스(IPV) 및/또는 B형 간염 바이러스 및/또는 헤모필루스 인플루엔자 b형 감염을 예방할 수 있었던 가장 초기의 혼합백신들이 공지되어 있다(예를 들어, WO 93/24148, WO97/00697, WO2000/030678, WO 2008/028956, US 6013264 & WO2005089794 참고).
한편, 다회-용량 백신 주사는 미생물에 의한 오염을 피하기 위해 보존제를 사용해야만 한다. U.N.등에 의해 덜-개발된 국가에 수출하는 복합백신 제품의 경우, 백신이 사용되는 국가의 환경, 유통 방법, 비용 등을 고려하여 보존제를 함유한 다회 용량 백신이 선호된다. 백신 제품에 사용되는 보존제의 예로는 티메로살, 2-PE, 페놀, 포름알데히드를 포함할 수 있고 종래 용량의 보존제가 당업계에 공지되어 있다.
발명자들은, 혼합백신 조성물에서의 항원의 면역원성, 반응원성, 안정성 및 올바른 형태의 유지가, 개별적인 항원의 제조 과정을 포함하는 조성물을 배합되는 방식, 항원의 첨가 순서, 특정 항원에 대한 특정 양에서의 특정 보조제의 사용, 보조제로의 항원의 개별적인 흡착 또는 조합된 흡착, 보조제로의 항원의 흡착도, 총 백반 함량, 사용된 보존제의 농도와 유형, 교반, 온도 및 pH를 포함한 다양한 매개변수의 사용에 좌우된다는 것을 발견하였다.
발명의 요약
개선된 면역원성 및 감소된 반응원성을 나타내는 안정한 액상 혼합백신 조성물 및 이의 제조 방법이 개시된다.
본 개시내용은 다음을 포함하는 혼합백신 조성물에 관한 것이다:
a) 쎄미(semi)-합성 배지를 이용하여 제조하고 그 후에 독성제거한 고도로 순수한 디프테리아 톡소이드(D)와 파상풍 톡소이드(T),
b) 특정 비율의 B. 백일해 균주를 열과 화학적 불활성화의 조합을 이용하여 제조하여 감소된 반응원성 및 증가된 효능을 유발하는, 불활성화된 전세포 B. 백일 해(wP) 성분,
c) 운반 단백질(CP)에 접합된 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib) 협막 다당류 항원(PRP),
d) 포름알데히드 불활성의 개선된 방법을 사용하여 제조되고 수산화알루미늄에 추가로 흡착될 수 있는 표준 용량 또는 감소된 용량의 소크 또는 사빈(불활성화된 폴리오 바이러스) IPV,
e) B형 간염(HepB) 표면항원이 인산알루미늄 보조제에 개별적으로 흡착되고 D 및 T 항원이 인산알루미늄 보조제에 개별적으로 흡착되어 개선된 면역원성이 유발되도록 하는 항원(들)의 최적의 흡착 프로파일,
f) 감소된 반응원성을 보장하는 최소 백반 함량,
g) 최적 농도의, 보존제로서의 2-페녹시에탄올(2-PE).
목적
본원에서 하나 이상의 실시양태를 만족시키는 본 개시내용의 일부 목적은 다음과 같다:
본 개시내용의 목적은 종래 기술의 하나 이상의 문제를 완화하거나 적어도 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 또 다른 목적은 하나 초과의 질병 상태의 예방 및 치료에 적합한 액상의, 안정적이고, 반응원성이 적으며, 면역원성이 보다 큰, 혼합백신 조성물/제형을 제공하고, 상기 면역원성 성분 각각에 대한 혈청 방어율 기준을 충족시키는 것이다.
본 개시내용의 또 다른 목적은 이러한 혼합백신의 조성물/제형을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 다른 목적 및 이점은 하기의 서술로부터 보다 분명해질 것이며, 이는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 밝혀둔다.
상세한 설명
본 개시내용의 제1 실시양태에 따르면, 상기 혼합백신 조성물은 이로서 한정하는 것은 아니지만, 디프테리아 톡소이드(D), 파상풍 톡소이드(T), 전세포 B.백일해(wP), 헤모필루스 인플루엔자 B(Hib) PRP-CP 접합물, B형 간염(HepB), 불활성화된 폴리오 바이러스(IPV)로부터 선택된 항원/면역원의 군을 포함하고 추가적으로 알루미늄계 보조제 및 보존제를 포함한다.
본 개시내용의 제2 실시양태에 따르면, 상기 혼합백신 조성물은, 각각 헤모필루스 인플루엔자(a, c, d, e, f 혈청형 및 캡슐화되지 않은 균주), 간염(A, C, D, F 및 G 균주), 뇌수막염 A, B, C, Y, W-135 또는 X, 인플루엔자, 황색포도구균, 장티푸스균 항원(들), 세포성 백일해 항원, 변형 아데닐산 사이클라제, 말라리아 항원(RTS,S), 폐렴구균, 연쇄구균, 탄저병, 뎅기열, 말라리아, 홍역, 볼거리, 풍진, BCG, 인체 유두종 바이러스, 일본 뇌염, 뎅기열, 지카, 에볼라, 치쿤구니야, 로타바이러스, 천연두, 황열병, 플라비바이러스, 대상포진, 수두바이러스 항원으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 항원을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 제3 실시양태에 따르면, 혼합백신 조성물에 사용되는 IPV 균주는 1형, 2형 및 3형 군에서 선택되는 불활성된 사빈 균주 또는 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형에서 선택되는 불활성 소크 균주이다.
제3 실시양태에 따른 하나의 양태에서, 폴리오 바이러스는 하기 방법에 의해 성장될 수 있다:
·CCL81-VERO(원숭이 신장) 세포주가 폴리오 바이러스, 즉 사빈 및 소크 균주를 성장시키기 위한 숙주 세포로서 사용되었다.
·폴리오 바이러스의 목적하는 균주로 숙주 세포를 감염시키고 72시간 동안 항온처리한 후, 바이러스와 세포 파편(debris)을 함유한 배지를 단일 용기에 모아 수집하였다.
·여과액(filtrate)을 100KDa 카세트로 접선 유동 여과(tangential flow filtration)시키고, 포스페이트 완충액을 사용하여 투석여과(diafilter)시키고, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
·환자에게 투여하기 전에, 바이러스는 적절한 불활성화 방법을 사용하여 불활성화되어야만 한다.
그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 포름알데히드 불활성화 이후의 D 항원의 높은 비율의 손실이, 폴리오 바이러스 입자의 원치않는 응집을 예상하지 못하게 일으키는 포스페이트 완충액의 존재 때문일 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 개시내용의 중요한 양태는 하기 단계를 포함하는 포르말린 불활성화의 개선된 방법을 포함한다:
a) 정제된 바이러스 풀(pool)을, 포스페이트 완충액으로부터 7 내지 7.5의 pH를 갖는 범위(30 내지 50 mM)의 트리스 완충액으로 완충액 교환하는 단계,
b) 상기 혼합물에, 글리신(5 gm/l) 함유 M-199 배지를 첨가하는 단계,
c) 0.025% 포름알데히드를 첨가하고, 이어서 혼합하는 단계,
d) 이어서, 혼합물을 자기 교반기 위에서 바이러스 벌크를 연속적으로 교반 하면서 5 내지 13일 동안 37℃에서 항온처리하는 단계,
e) 항온처리-후 혼합물을, 7일째에 중간 TFF 시스템(100 KDa, 0.1㎡)에 적용하고 불활성화 이후의 최종 여과에 적용하는 단계,
f) 이어서, 여과된 벌크를 2 내지 8 ℃에서 저장하는 단계,
g) D-Ag 단위 결정을 위해 D-Ag ELISA를 수행하는 단계.
본 개시내용의 제4 실시양태에 따르면, 혼합백신 조성물에 사용되는 IPV 균주는 1형, 2형, 3형의 군에서 선택되는 저-용량 불활성화된 사빈 균주 또는 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형의 군에서 선택되는 불활성화된 소크 균주를 포함한다.
본 개시내용의 제5 실시양태에 따르면, IPV(사빈 & 소크 균주)는 임의의 보조제에 흡착되지 않는다(예컨대, 만약 있다면, 다른 구성요소와 혼합하기 전)
본 개시내용의 제6 실시양태에 따르면, IPV(사빈 & 소크 균주) 구성요소(들)은 수산화알루미늄(Al(OH)3) 또는 인산알루미늄(AlPO4)과 같은 알루미늄 염(Al3+), 백반, 인산칼슘, MPLA, 3D-MPL, QS21, CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 보조제, 리포솜, 수중유적형 유화액 또는 이들의 조합물의 군에서 선택되는 보조제에 흡착될 수 있다. (예컨대, 만약 있다면, 다른 구성요소와 혼합하기 전 또는 후). 흡착된 경우, 하나 이상의 IPV 구성요소는 수산화알루미늄 위에 함께 혼합물로서 또는 개별적으로 흡착될 수 있다.　
IPV(사빈 & 소크 균주) 구성요소(들)은 다음 절차에 의해 알루미늄 염에 흡착될 수 있다:
·50ml 용기에 0.1 내지 0.8mg/투여의 최종 백반(Al+++) 농도를 얻기 위해 목적하는 체적의 오토클레이브된 Al(OH)3을 취한다.
·D-Ag 단위(unit)를 조정하여 IPV 벌크를 추가하고 희석제(10x M-199 + 0.5% 글리신)로 체적을 맞춘다.
·최종 제형의 pH를 조정하고 pH 6 내지 6.8 사이의 최종 제형을 얻는다.
제6 실시양태의 하나의 양태에서, 포르말린 불활성화된 IPV의 흡착은 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7 내지 6.8에서 선택되는 pH에서, 바람직하게는 6.50의 pH에서, 혈청형 당 1mg/투여, 0.2mg/투여, 0.3mg/투여, 0.4mg/투여, 0.5mg/투여, 0.6mg/투여, 0.7mg/투여 및 0.8mg/투여, 바람직하게는 0.1mg/투여 내지 1.25mg/투여의 농도를 갖는 백반(Al3+) 위에 행해질 수 있다.
제6 실시양태의 또 다른 양태에서, 트리스 존재 하에서 포르말린 불활성화된 이후의 D-항원의 복구율은 50%, 60%, 70% 또는 80%일 수 있고, 수산화알루미늄 흡착 후 흡착율은 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 99%, 또는 95% 내지 99%일 수 있다.
본 개시내용의 제7 실시양태에 따르면, 코리네박테리움 디프테리아 및 파상풍균으로부터 각각 디프테리아 독소(외독소) 및 파상풍 독소(외독소)를 수득하고, 이어서 적절한 불활성화 방법을 사용하여 독성제거하였다. 이렇게 수득된 디프테리아 톡소이드(D) 및 파상풍 톡소이드(T)를 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하였다. 이렇게 수득한 정제된 DT를 혼합백신의 제형을 위해 추가로 사용하였다.
제7 실시양태에 따른 하나의 양태에서, 하기 조합물 중의 임의의 하나에서 최적의 농도로 하기 성분으로 이루어진 쎄미-합성 배지에서 코리네박테리움 디프테리아를 성장시킴으로써 디프테리아 독소가 제조된다:
조합물 1:
카세인 가수분해물, 말토스 일수화물, 빙초산, 젖산나트륨, 황산마그네슘, β-알라닌, 피멜산, 니코틴산, 황산제2구리, 황산아연, 염화망간, L-시스틴, 염화칼슘 이수화물, 칼륨 2수소 오르쏘포스페이트, 인산2칼륨수소, 황산제1철 및 주사용 증류수(WFI).
조합물 2:
카세인 가수분해물, 말토스 일수화물, 빙초산, 젖산나트륨, 황산마그네슘, β-알라닌, 피멜산, 니코틴산, 염화망간, L-시스틴, 염화칼슘 이수화물, 칼륨 2수소 오르쏘포스페이트, 인산2칼륨수소, 황산제1철 및 주사용 증류수.
조합물 3:
카세인 가수분해물, 말토스 일수화물, 빙초산, 젖산나트륨, β-알라닌, 피멜산, 니코틴산, 황산제2구리, 황산아연, 염화망간, L-시스틴, 염화칼슘 이수화물, 칼륨 2수소 오르쏘포스페이트, 인산2칼륨수소 및 주사용 증류수.
조합물 4:
효모 추출물, 말토스 일수화물, 빙초산, 젖산나트륨, 황산마그네슘, β-알라닌, 피멜산, 니코틴산, 황산제2구리, 황산아연, 염화망간, L-시스틴, 염화칼슘 이수화물, 칼륨 2수소 오르쏘포스페이트, 인산2칼륨수소, 황산제1철 및 주사용 증류수.
제7 실시양태의 제2 양태에 따르면, 하기 조합물 중 임의의 하나에서 최적의 농도로 하기 성분으로 이루어진 쎄미-합성 배지에서 클로스트리디움 테타너스(clostridium tetanus)를 성장시킴으로써 파상풍 독소가 제조된다:
조합물 1:
카세인 소화물, 염화칼슘, 인산2칼륨수소, 무수 덱스트로스, 염화나트륨, 황산마그네슘, 리보플라빈, 염산티아민, 염산피리독신, 판토텐산칼슘, 니코틴산, L-시스틴, 염화제2철, 비타민 B12 용액, 비오틴, 진한 HCl, NaOH, 무수 에탄올 및 주사용 증류수.
조합물 2:
카세인 소화물, 염화칼슘, β-알라닌, 인산2칼륨수소, 무수 덱스트로스, 염화나트륨, 황산마그네슘, 황산철, 리보플라빈, 염산티아민, 염산피리독신, 판토텐산칼슘, 니코틴산, L-시스틴, 염화제2철, 비타민 B12 용액, 비오틴, 진한 HCl, NaOH, 무수 에탄올 및 주사용 증류수.
조합물 3:
카세인 소화물, 염화칼슘, 인산2칼륨수소, 무수 덱스트로스, 염화나트륨, 황산아연, 리보플라빈, 염산티아민, 염산피리독신, 판토텐산칼슘, 니코틴산, L-시스틴, 염화제2철, 비타민 B12 용액, 비오틴, 진한 HCl, NaOH, 무수 에탄올 및 주사용 증류수.
조합물 4:
카세인 가수분해물, 염화칼슘, 인산2칼륨수소, 무수 덱스트로스, 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화망간, 리보플라빈, 염산티아민, 염산피리독신, 판토텐산칼슘, 니코틴산, L-시스틴, 염화제2철, 비타민 B12 용액, 비오틴, 진한 HCl, NaOH, 무수 에탄올 및 주사용 증류수.
제7 실시양태의 또 다른 양태에서, 열, UV, 포르말린/포름알데히드, 아세틸에틸렌이민 등을 포함하는 전술한 불활성화 방법의 하나 또는 그 조합을 이용함으로써 디프테리아 및 파상풍 독소를 독성제거하였다.
본 개시내용의 제8 실시양태에 따라, 혼합백신 조성물에 사용되는 간염(Hep) 항원은 B형 간염 균주의 표면으로부터 유래된 Hep 항원(HBsAg)을 포함한다.
제9 실시양태의 하나의 양태에서, HBsAg는 하기의 방법을 이용하여 만들 수 있다.
·다량의 HBsAg가 간에서 합성되고 HBV 감염 동안 혈류로 방출되기 때문에, 만성 B형 간염 환자(carrier)의 혈장으로부터의 미립자 형태의 항원을 정제하는, 방법.
·재조합 DNA 방법에 의해 단백질을 발현하는 방법.
본 개시내용의 제9 실시양태에 따르면, 디프테리아 톡소이드(D), 파상풍 톡소이드(T) 및 B형 간염 표면항원(HBsAg)은 수산화알루미늄(Al(OH)3) 또는 인산알루미늄(AlPO4)와 같은 알루미늄 염(Al3+), 백반, 인산칼슘, MPLA, 3D-MPL, QS21, CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 보조제, 리포솜, 수중유적형 유화액 또는 이들의 조합물의 군에서 선택되는 보조제에 개별적으로 흡착된다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D), 파상풍 톡소이드(T) 및 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)은 인산알루미늄에 개별적으로 흡착된다.
제9 실시양태의 하나의 양태에서, 디프테리아 톡소이드(D) 항원은 50% 이상의 흡착율을 갖는 인산알루미늄에 흡착된다.
제9 실시양태의 또 다른 양태에서, 파상풍 톡소이드(T) 항원은 적어도 40%의 흡착율을 갖는 인산알루미늄에 흡착된다.
제9 실시양태의 또 다른 양태에서, B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)은 70% 이상의 흡착율을 갖는 인산알루미늄에 흡착된다.
본 개시내용의 제10 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 혼합백신 조성물에 사용되는 Hib 항원은 Hib b 균주 760705의 협막 다당류로부터 유래될 수 있다.
제10 실시양태에 따른 하나의 양태에서, Hib B PRP 항원은 이로서 한정하는 것은 아니지만, CRM197, 디프테리아 톡소이드, 수막구균 외막 복합체, 파상풍 톡소이드의 단편 C, 백일해 톡소이드, H. 인플루엔자의 단백질 D, 대장균 LT, 대장균 ST; 및 슈도모나스 에루지노사의 외독소 A, 외막 복합체 c(OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 용혈소, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 표면 부착분자 A(PsaA), 폐렴구균 PhtD, 폐렴구균 표면 단백질 BVH-3 및 BVH-11, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 보호항원(PA) 및 바실루스 안트라시스의 독성제거 부종 인자(EF)와 치사 인자(LF), 오브알부민, 키홀-림펫 헤모사이아닌(KLH), 사람 혈청 알부민, 소혈청 알부민(BSA)과 튜버큘린의 정제된 단백질 유도체(PPD), 합성 펩티드, 열충격 단백질, 백일해 단백질, 사이토카인, 림포카인, 호르몬, 성장인자; N19와 같은 다양한 병원체 유래된 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질, 철-흡수 단백질, C. 디피실(C. difficile)로부터의 독소 A 또는 B, 및 S.아갈락티아 단백질로 이루어진 운반 단백질로 이루어진 운반 단백질의 군에서 선택된 운반 단백질에 접합된다.
더욱 바람직하게는, CNBr 화학, 환원적 아미노화 화학, 시아닐화 화학 또는 임의의 기타 화학에 의해 HIb b PRP는 파상풍 톡소이드(TT)에 접합된다. 이는“Kniskern et al., "Conjugation:design, chemistry, and analysis" in Ellis et al., Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines. New York:Marcel Dekker, 1994:37-69에 개시된다.
제10 실시양태의 제2 양태에 따르면, 운반 단백질은 본 개시내용의 조성물에서 유리 형태 및 접합된 형태 둘 다로 존재하며, 비접합된 형태는 바람직하게는 전체 조성물 중 운반 단백질의 총량의 20% 이하이고, 보다 바람직하게는 5중량% 미만으로 존재한다.
제10 실시양태의 제3 양태에 따르면, Hib 항원은 실질적으로 어떠한 보조제 위에도 흡착되지 않는다.
제10 실시양태의 제4 양태에 따르면, Hib 항원은 어떠한 보조제 위에도 계획적 또는 의도적 흡착에 적용되지 않는다.
본 개시내용의 제11 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 혼합백신 조성물에 사용되는 전세포 백일해(wP) 항원 제제는 바람직하게는, 특정 비율로 혼합된 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229로 만들어지고 이어서 티메로살이 없는 개선된 불활성화 방법을 사용하여 불활성화되어 감소된 반응원성 및 증가된 효능을 유도하고, 알루미늄계 보조제에 흡착될 수도 아닐 수도 있다.
제11 실시양태의 제1 양태에 따르면, 본 개시내용의 혼합백신 조성물에 사용되는 전세포 백일해(wP) 항원 제제는 바람직하게는, 1:1:0.25:0.25의 비율로 혼합된 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229로 만들어진다.
제11 실시양태의 제2 양태에 따르면, 혼합백신 조성물에 사용되는 전세포 백일해(wP) 항원 제제는 열, UV, 포르말린/포름알데히드, 아세틸에틸렌이민 등을 포함하는 불활성화 처리 중 하나 이상을 사용하여 불활성화되었다.
더욱 바람직하게는, 이러한 혼합백신 조성물에 사용되는 전세포 백일해(wP) 항원 제제는 열과 화학적 처리의 조합을 이용하여 불활성화되었다. 더욱 바람직하게는, 포름알데히드 존재 하에서 56±2℃, 10 내지 15분 동안 불활성화되고, 여기서 wP 벌크는 뭉치지 않고 쉽게 균질화되어 감소된 반응원성을 유도하고 장기간 동안 더 나은 wP 효능을 제공한다.
제11 실시양태의 제3 양태에 따르면, 혼합백신 조성물에 사용되는 전세포 백일해(wP) 항원 제제는, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 그의 조합과 같은 알루미늄계 보조제에 (예컨대, 다른 성분이 존재한다면 다른 성분과 혼합하기 전 또는 후에) 흡착되거나 흡착되지 않을 수 있다. 흡착되면, 하나 이상의 wP 균주(즉, 134, 509, 25525 및 6229)는 개별적 또는 혼합물로서 함께 흡착될 수 있다.　
본 개시내용의 제12 실시양태에 따르면, 디프테리아 톡소이드(D)는 1-40 Lf의 범위의 양으로 존재하고; 파상풍 톡소이드(T)는 4-25 Lf의 범위의 양으로 존재하고; wP는 0.5 ml 당 4-30 IOU의 범위의 양으로 존재하고; H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 PRP 1-20 μg 함량의 범위의 양으로 존재하고; HBsAg 항원은 0.5 ml 당 1-20 μg의 범위의 양으로 존재하고; 1형, 2형 및 3형을 포함하는 사빈 IPV은, 1형은 1-50 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 2형은 1-20DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 3형은 1-50 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 추가적으로 최종 혼합백신 조성물/제형에서는 알루미늄계 보조제 및 보존제를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 25Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 20Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 4Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 2Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 16 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 14 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 12 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 13 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 10 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 8 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 15 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 10 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 8 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 1형, 2형 및 3형 균주를 포함하는 사빈 불활성화된 폴리오 백신(sIPV)은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 40 DU, 8 DU 및 32 DU의 양으로 존재한다.
본 개시내용의 제13 실시양태에 따르면, 디프테리아 톡소이드(D)는 1-40 Lf의 범위의 양으로 존재하고; 파상풍 톡소이드(T)는 4-25 Lf의 범위의 양으로 존재하고; wP는 0.5 ml 당 4-30 IOU의 범위의 양으로 존재하고; H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 1-20μg의 PRP 함량의 범위의 양으로 존재하고; HBsAg 항원은 0.5 ml 당 1-20 μg의 범위의 양으로 존재하고; 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형 균주를 포함하는 소크 불활성화된 폴리오 바이러스 IPV는, 마호니 1형은 1-50 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, MEF 2형은 1-20 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 소켓 3형은 1-50 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 추가적으로 최종 혼합백신 조성물/제형에서는 알루미늄계 보조제 및 보존제가 포함된다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 25Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 20Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 4Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 2Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 16 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 14 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 12 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 13 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 10 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 8 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 15 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 10 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 약 0.5 ml 당 8 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형 균주를 포함하는 소크 불활성화된 폴리오 백신은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 40 DU, 8 DU 및 32 DU의 양으로 존재한다.
본 개시내용의 제14 실시양태에 따르면, 디프테리아 톡소이드는 1-40 Lf의 범위의 양으로 존재하고; 파상풍 톡소이드는 4-25 Lf의 범위의 양으로 존재하고; wP는 0.5 ml 당 4-30 IOU의 범위의 양으로 존재하고; H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 1-20 μg의 PRP 함유량의 범위의 양으로 존재하고; Hep 항원은 0.5 ml 당 1-20 μg의 범위의 양으로 존재하고; 혼합백신 조성물에 사용되는 것으로서, 1형, 2형 및 3형을 포함하는, 용량 감소된 사빈 불활성화된 폴리오 백신(slPV)은, 1형은 2.5-10 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 2형은 5-20 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 3형은 1-20 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 추가적으로 최종 혼합백신 조성물/제형에서는 알루미늄계 보조제 및 보존제가 포함된다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 25Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 20Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 4Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 2Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 16 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 14 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 12 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 13 μg의 PRP 함량의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 10 μg의 PRP 함량의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 8 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 15 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 10 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 8 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 1형, 2형 및 3형 균주를 포함하는, 용량 감소된 사빈 불활성화된 폴리오 백신(sIPV)은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 각각 약 5 DU, 16 DU 및 10 DU의 양으로 존재한다.
본 개시내용의 제15 실시양태에 따르면, 디프테리아 톡소이드는 1-40 Lf의 범위의 양으로 존재하고; 파상풍 톡소이드는 4-25 Lf의 범위의 양으로 존재하고; wP는 0.5 ml 당 4-30 IOU의 범위의 양으로 존재하고; H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 1-20 μg의 PRP 함유량의 범위의 양으로 존재하고; Hep 항원은 0.5 ml 당 1-20 μg의 범위의 양으로 존재하고; 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형 균주를 포함하는, 낮은 용량의 소크 불활성화된 폴리오 백신은, 마호니 1형이 5-15 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, MEF 2형이 1-18 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 소켓 3형이 5-15 DU/0.5ml의 양으로 함유되고, 추가적으로 최종 혼합백신 조성물/제형에서는 알루미늄계 보조제 및 보존제가 포함된다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 25 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 20 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 디프테리아 톡소이드(D)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 10 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 4 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 파상풍 톡소이드(T)는 최종 혼합백신 조성물에서 약 2 Lf의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 16 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 14 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, wP는 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 12 IOU의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 13 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 10 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, H. 인플루엔자 B PRP-TT 접합체는 0.5 ml 당 약 8 μg의 PRP의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 15 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 10 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, HBsAg 항원은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 약 8 μg의 양으로 존재한다.
더욱 바람직하게는, 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓 3형 균주를 포함하는, 감소된 용량의 소크 불활성화된 폴리오 백신은 최종 혼합백신 조성물에서 0.5 ml 당 각각 약 10 DU, 2 DU 및 10 DU의 양으로 존재한다.
본 개시내용의 제16 실시양태에 따르면, 최종 혼합백신 조성물의 하나 이상의 항원은 실질적으로 어떠한 보조제에도 흡착되지 않을 수 있다.
본 개시내용의 제17 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 수산화알루미늄(Al(OH)3) 또는 인산알루미늄(AlPO4)과 같은 알루미늄 염(Al3+), 백반, 인산칼슘, MPLA, 3D-MPL, QS21, CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 보조제, 리포솜 및 수중유적형 유화액의 군에서 선택되는 하나 이상의 보조제를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 인산알루미늄(AlPO4)을 보조제로서 포함한다.
제17 실시양태의 하나의 양태에서, 최종 제형의 항원은 인-시튜(in-situ) 인산알루미늄 겔 또는 기성품(ready made) 인산알루미늄 겔 또는 이들의 조합에 흡착될 수 있다.
제17 실시양태의 하나의 양태에서, 본 개시내용의 조성물은 2.5 mg/0.5 ml 이하, 특히 1.5 mg/0.5 ml 내지 0.1 mg/0.5 ml의 양으로 보조제를 포함할 수 있다.
더욱, 제17 실시양태의 또다른 바람직한 양태에서, 최종 혼합백신 조성물/제형에서의 알루미늄 함량(Al3+)은 0.5 ml 당 1.25 mg 이하, 바람직하게는 0.5 ml 당 1 mg 이하, 가장 바람직하게는 0.5 ml 당 0.1 mg 내지 0.5 ml 당 0.63 mg 이상의 양일 수 있다.
본 개시내용의 제18 실시양태에 따르면, 상기 혼합백신 조성물/제형은 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드(Phemerol), 페놀, 티오메르살, 포름알데히드, 메틸 및 프로필 파라벤, 또는 벤질 알코올 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 보존제를 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 혼합백신 조성물/제형은 2-페녹시에탄올(2-POE)을 보존제로서 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 혼합백신 내 2-페녹시에탄올의 양은 바람직하게는 3.5 mg/0.5 ml 이하, 보다 바람직하게는 3.0 mg/0.5 ml 이하, 및 가장 바람직하게는 2.5 mg/0.5 ml 이하일 수 있다.
본 개시내용의 제19 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 혼합백신 조성물/제형은 당류 및 폴리올, 계면활성제, 중합체, 염, 아미노산, pH 개질제(백신 조성물의 pH를 조절한다) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 사용되는 당류 및 폴리올의 예로는 수크로스, 트레할로스, 락토오스, 말토스, 갈락토스, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 등과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 중합체의 예로는 덱스트란, 카복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 사이클로덱스트린 등을 포함할 수 있다. 염의 예로는 NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 등을 포함할 수 있다. 아미노산의 예로는 아르기닌, 글리신, 히스티딘 등을 포함할 수 있다. pH 개질제의 예로는 수산화나트륨, 염산 등을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 제20 실시양태에 따르면, 상기 혼합백신은 동결건조 또는 액상 제형, 바람직하게는 액상 제형일 수 있다.
본 개시내용의 제21 실시양태에 따르면, 상기 혼합백신은 28℃에서 12 내지 36개월, 25℃에서 2 내지 6개월, 37℃에서 1 내지 4주 동안, pH 6.0 내지 pH 7.0의 범위의 최종 pH에서, 보다 바람직하게는 pH 6.2 내지 pH 6.8의 범위의 최종 pH에서, 가장 바람직하게는 pH 6.3 내지 pH 6.7의 범위의 최종 pH에서 안정적일 수 있다.
본 개시내용의 제22 실시양태에 따르면, 출원인은, i) 개별 항원의 제조 방법, ii) 항원의 첨가 순서, iii) 특정 항원에 대한 특정 양의 특정 보조제의 사용, iv) 보조제로의 항원의 개별 흡착 또는 합동 흡착, v) 보조제로의 항원의 흡착 정도, vi) 최소의 백반 농도의 사용, vii) 최적의 농도 및 유형의 보존제 사용, 및 viii) 교반, 온도 및 pH를 포함한 다양한 매개변수의 사용 등을 고려하여, 개시된 방법에 의해 백신을 생성하면, 개선된 면역원성 및 감소된 반응원성을 갖는 안정한 다가 백신이 수득될 수 있음을 발견하였다.
SIIPL 혼합백신에 사용되는 균주의 생물학적 소스:
디프테리아 톡소이드:
균주 코리네박테리움 디프테리아 PW8 CN2000은 1973년에, 동결건조된 형태로 인도 국가통제청 중앙연구소(National Control Authority Central Research Institute C.R.I; 인도 히마찰 프라데쉬 카사울리 소재)에 의해 웰컴 연구소(the Wellcome Research Laboratory; 영국 런던 소재)에서 수득하였다. 카사울리 소재의 C.R.I.에서 균주를 소생시키고 마스터 시드 로트-C.디프테리아 CN2000 A1 하에서 추가로 동결건조하였다.
파상풍 톡소이드
균주 클로스트리듐 테타니 하바드 균주(Harvard Strain) No.49205은 동결건조된 형태로 인도 국가통제청 C.R.I(인도, 카사울리 소재)에 의해 리즈크스 인스티튜트 보르 드 볼크스게존드하이드(Rijks Institute Voor de Volksgezondheid; 네덜란드)에서 수득하였다.
백일해
SIIPL에서의 백일해 백신 대량 제조는 보르데텔라 백일해의 4가지 균주, 즉 균주 134, 509, 6229 및 25525의 사용을 포함한다. 균주 134 및 509의 원종균(master seed)은 원래 인도 국가통제청 중앙연구소(인도 히마찰 프라데쉬 카사울리 소재)를 통해 수득된 것으로서, 리즈크스 연구소(네덜란드 소재)로부터의 것이다. 균주 6229와 25525의 원종균은 원래 리스터 연구소(Lister Institute; 영국 소재)에서 유래되었다.
B형 간염
라인 바이오텍(Rhein Biotech, 독일)은 HBsAg 표면항원 유전자를 함유하는 재조합 한세눌라폴리모르파 균주를 만들었다. 라인 바이오텍은 또한 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank)(MCB 한세눌라폴리모르파 K3/8-1 균주 ADW, 12/94)를 만들었고 이 은행에서 모든 특성 검사를 수행하였다.
헤모필루스 인플루엔자 B형
상기 세포 기질의 발생을 위한 소스 유기체는 헤모필루스 인플루엔자 b형, 균주 760705이다. 이 균주는 원래 1976년 11월에 2년 2개월된 남아(1974년 8월 14일생)로부터 분리되었다. 이 균주의 3회 계대 배양이 수행되고, 암스테르담 대학의 학술 의료 센터(AMC)에서 -70 ℃로 보관되었다. 이 균주는 SIIPL과 네덜란드 백신 연구소(Netherlands Vaccines Institute, NVI; 네덜란드) 간의 협력의 일환으로 SIIPL로 이전되었다.
IPV:
폴리오바이러스의 균주 및 소스는 아래와 같다.
폴리오바이러스 1형:
균주:마호니
소스:J.소크 박사(피트만 앤드 무어 캄파니(Pitman & Moore company))
폴리오바이러스 2형:
균주:MEF1
소스: 스테이튼 세럼 연구소(Statens Serum Institute, 코펜하겐 소재)
폴리오바이러스 3형:
균주: 소켓
소스: 스테이튼 세럼 연구소(코펜하겐 소재)
이 명세서 전반에 걸쳐 용어 "포함하다", 또는 "포함하는"과 같은 용어의 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 내표를 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 임의의 다른 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 배제를 의미하는 것은 아니다.
“적어도” 또는 “하나 이상”과 같은 표현의 사용은 하나 이상의 요소 또는 성분 또는 양의 사용을 제안하는데, 이러한 사용이 하나 이상의 원하는 목적 또는 결과를 달성하기 위한 발명의 실시양태일 수 있기 때문이다. 본 발명의 특정 실시양태가 설명되어 있지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제시되어 있을 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 범위 내에서의 본 발명의 제형의 변형 또는 개질은 본 개시내용의 검토 시에 당업계의 숙련자에 허용할 수 있다. 이러한 변형 또는 개질은 본 발명의 진의에 포함된다.
다양한 물리적 매개변수, 치수 및 양에 대해 주어진 수치 값은 단지 근사 값일 뿐이며, 상반되게 명세서에서 언급되지 않는 한, 상기 물리적 매개변수, 치수 및 양에 할당된 수치보다 높은 값은 발명의 범위 내에 속할 것으로 예상된다.
바람직한 실시양태의 특이적인 특징에 대해 많은 역점을 두었지만, 본 개시내용의 원리에서 벗어나지 않으면서 많은 부가적인 특징이 부가될 수 있다는 점 및 바람직한 실시양태에서 많은 변형이 만들어질 수 있다는 점이 인식될 것이다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태의 이러한 변형 및 다른 변형은 본 개시내용으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이며, 이로서 앞에서 서술한 내용들은 단지 개시의 예시로 해석되어야지 제한으로서 해석되지 않아야 함이 이해되어야 한다.
이점
앞서 본원에서 기술된 본 개시내용은 비제한적으로 D, T, wP, HBsAg, Hib PRP-TT 접합 및 IPV를 포함하는 혼합백신 조성물 및 그의 제조 방법의 실현을 포함하는 몇몇의 기술적 진보 및 이점을 갖는다. 다른 혼합백신 조성물에 비해, 본 개시내용은 다음과 같은 이점을 제공한다:
1. 완전한 액상 혼합백신
2. 개선된 면역원성
3. 감소된 반응원성
4. 12개월 동안 실험된, 2-8℃ 및 상온에서의 개선된 안정성
5. 전염성 해면상 뇌증(TSE) 또는 소 해면상 뇌증(BSE)이 없는 쎄미-합성 배지를 사용하여 제조된 고도로 정제된 디프테리아 톡소이드(D) 및 파상풍 톡소이드(T).
6. 전세포 B. 백일해(wP) 항원이 1:1:0.25:0.25의 비율로 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229를 포함하여 B. 백일해에 대한 효능과 면역원성을 향상시킨다.
7. 열 및 포름알데히드 불활성화의 조합을 이용한 전세포 B. 백일해(wP)의 불활성화의 개선된 방법. 이 방법에는 티메로살이 없고 불활성화된 전세포 백일해 항원은 뭉치지 않고 균질하게 남아 있어서, 이에 의해 감소된 반응원성을 유도하고 보다 장기간 동안 보다 우수한 효능을 제공하도록 한다.
8. 총 헤모필루스 인플루엔자 b형 PRP-TT 접합 벌크에서의 낮은 유리 PRP(7% 미만)
9. 인산알루미늄 보조제에 개별적으로 흡착되어 효능과 면역원성을 개선시킨 것으로서, 디프테리아 톡소이드 항원(D), 파상풍 톡소이드 항원(T) 및 B형 간염(HepB) 표면항원의 개선된 흡착 프로파일.
10. 최소의 총 백반 함량(Al3+)으로 인한 감소된 반응원성 보장.
11. 보존제로서 2-페녹시에탄올(2-PE)의 최적 농도.
실시예
본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 하기 실시예가 포함된다. 하기 실시예에 개시된 조성물 및 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것으로 인식되어야만 하고 따라서 이들 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 당업자는, 본 개시에 비추어 개시된 특정 실시양태에서 많은 변형이 이루어질 수 있고 본 발명의 진의 및 범주를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1:
[표 1]
[표 2]
실시예 2:
이 예는 다양한 혼합백신 조성물에 대한 간략한 설명을 제공한다:
혼합백신 조성물 1
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 10-25 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 02-10 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 12-16 IOU
4 HBs 항원 7-15 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 7-13 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 2-페녹시에탄올 2.5 mg
9 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물 2
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 10-25 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 02-10 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 12-16 IOU
4 HBs 항원 7-15 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 7-13 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물 3
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 10 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 02 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 12 IOU
4 HBs 항원 8 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 8 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 2-페녹시에탄올 2.5 mg
9 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물 4
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 10 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 02 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 12 IOU
4 HBs 항원 8 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 8 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 20 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 04 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 14 IOU
4 HBs 항원 15 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 10 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 2-페녹시에탄올 2.5 mg
9 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물 6
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml
1회 투여
1 디프테리아 톡소이드(D) 20 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 04 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 14 IOU
4 HBs 항원 15 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 10 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 염화나트륨 4.5 mg
혼합백신 조성물 7
일련번호 제형 성분 항원 단위/0.5ml 용량
1 디프테리아 톡소이드(D) 25 Lf
2 파상풍 톡소이드(T) 10 Lf
3 불활성화 B. 백일해 항원(wP) 16 IOU
4 HBs 항원 15 μg
5 Hib PRP-TT 접합체 항원 PRP 13 μg
6 IPV 1형(D항원 단위) 40
2형(D항원 단위) 8
3형(D항원 단위) 32
7 인산알루미늄(Al3+)에 흡착 0.6 mg 이하
8 염화나트륨 4.5 mg
이 백신은 제조 공정 중에 사용되는 글루타르알데히드, 포름알데히드, 네오마이신, 스트렙토마이신 및 폴리믹신 B의 극미량을 포함할 수 있다.
실시예 3:
헤모필루스 인플루엔자 b형 접합체 벌크의 제조 공정
헤모필루스 인플루엔자 b형 접합체 벌크의 제조 방법의 광범위한 단계는 하기에 간략히 설명된 53개 단계의 공정으로 나타내었다.
제1 단계: 접종 단계 1 진탕 플라스크(S1):
0.22μm 여과된 종자 배지를 함유하는 접종 단계 진탕 플라스크를 접종하기 위하여 제조용 시드 로트(Working Seed Lot) 바이알을 사용한다. 25mL 작업 용적(working volume)을 갖는 일회용 PETG 125mL 플라스크가 사용된다. 이 단계는 온도(36±2℃) 및 제어되는 교반(200±50rpm)을 갖는 인큐베이터 진탕기에서 수행된다. 적절한 박테리아 성장이 달성된 후(OD590≥1.0), 배양물을 제2 단계로 기술된 다음 접종 단계(제2 단계)로 이동시킨다. 배양 순도(그램 음성 코코바실리)를 보장하기 위하여, 인-프로세스(in-process) 대조군으로서 그램 염색을 수행한다.
제2 단계: 접종 단계 2 진탕 플라스크(S2):
S2 접종 단계는 800mL의 작업 용적을 갖는 2L 페른바흐(fernbach) 플라스크(S2A 및 S2B)로 구성된다. OD590이 허용 기준 내에 있을 때까지, S2A 플라스크는 OD590 측정을 위해 사용하고, S2B 플라스크는 S3 단계의 접종을 위해 사용된다. 플라스크 둘 다는, S1 접종 단계와 동일한 필터-살균된 배지로 배칭(batch)되었다. 제2 단계 진탕 플라스크를 접종하기 위하여 S1 단계 플라스크가 사용되었다. 이 단계는 온도(36±2℃) 및 제어되는 교반(200±50 rpm)을 갖는 인큐베이터 진탕기에서 수행한다. 적절한 박테리아 성장이 달성된 후(OD590≥1.0), 배양물을 제3단계로 기술된 다음 접종 단계(S3 단계)로 이동시킨다. 배양 순도(그램 음성 코코바실리)를 보장하기 위하여, 인-프로세스 대조군으로서 그램 염색을 수행한다.
제3 단계: 접종 단계 3 발효기:
S3 접종 단계는 35 L의 작업 용적을 갖는 120 L 발효기로 구성된다. 발효기는 이전 접종 단계와 동일한 배지로 배칭된다. 접종 발효기를 접종하기 위하여 S2 단계 플라스크를 이용한다. 성장은 접종 발효기 내에서 온도(36±2℃), DO(10% 설정점), 교반(300-600 rpm), 폭기(1-5 LPM) 및 배압(0.2 bar)에서 수행된다. 적절한 박테리아를 적당히 성장시킨 후(OD590 ≥ 1.0), 배양물을 제4 단계로 기술된 다음 생성 단계(S3 단계)로 이동시킨다. 배양 순도(그램 음성 코코바실리)를 보장하기 위하여, 인-프로세스 대조군으로서 그램 염색을 수행한다.
제4 단계: 1200 L 스케일 생성 발효:
1200L 생성 발효기는 800L의 작업 용적을 갖는다. 이것은 기본 배지 성분으로 배칭되고 인-시튜에서 증기 살균된다. 이어서, 0.22μm 필터를 통과시킨 후, 다양한 배지 보충제가 첨가된다. 발효기는, 제3 단계에서 수득한 S3 단계 배양액으로 접종된다. 발효는 제어된 용존 산소(20%-설정점), 온도(36±2℃), pH(7.1-7.4), 교반(40-400 rpm), 폭기(50-300 LPM) 및 배압(0.2 bar) 하에서 수행된다. 발효 과정 동안 2개의 개별적인 영양소 스파이크를 첨가한다. OD590(OD590 ≥ 3.5)을 측정하여 성장을 모니터링하고, 발효는 정체기가 완료된 후에 완료된 것으로 간주된다. 성장 및 정체기 동안, 다당류 생성물이 분비되고 배양액에 축적된다. 배양 순도(그램 음성 코코바실리)를 보장하기 위해 그람 염색이 인-프로세스 대조군으로서 수행된다.
제5 단계: 포르말린 처리:
이 단계에서는 화학 작용제(포르말린)를 사용하여 바이오버든(bioburden)을 감소시킨다. 0.1% 포르말린을 첨가하고 발효액(fermented broth)은 37℃에서 NLT 2 시간 동안 항온처리한다. 포르말린 처리 후, 용기를 <15℃로 급속하게 냉각시킨다. 포르말린 첨가는 바이오버든을 감소시키기 위해 승인된다. 이는 항온처리 기간 후 배양 플레이트에 의해 확인된다. 제6 단계로 기술된 수확(harvesting)을 위해 바이오버든 감소액을 준비한다.
제6 단계: 연속 원심분리 수확:
1차 수확 단계로서 연속 원심분리를 사용한다. 이 단계는 불활성화된 바이오매스로부터 다당류-함유 원액을 분리하기 위해 수행된다. OD590 감소에 의해 측정한 바와 같이, 바이오매스의 90% 초과를 제거할 목적으로 연속 원심분리기가 사용된다. 원심분리기는 대략 15000g에서 200-500 L/h의 액체 유속으로 작동된다. 원심분리된 상청액은 제7 단계에서 기술되는 바와 같이, 추가로 가공된다.
제7 단계: 50 LP 심층 여과:
원심분리된 상청액을 50Lp 심층 필터를 통과시켜 세포 파편과 같은 거친 물질을 제거한다. 이 단계는 생성물이 여과액을 통과하게 하고, 제8 단계에서 기술된 추가의 심층 필터와 인-라인(in-line)에 있다.
제8 단계: 90LP 심층 여과:
50LP 심층 필터로부터의 여과액은 90LP 심층 필터(공칭 0.22 ㎛ 등급)를 통해 추가로 통과되어, 이전의 심층 필터에 의해 걸러지지 못했을 수 있는 임의의 불용성 물질을 추가로 제거한다. 이 단계는, 여과액에서 본질적으로 세포-파편이 제거되고 0.22 ㎛ 필터를 견고하게 통과할 수 있음을 보정한다. 후속 여과 단계는 9단계에서 기술된다.
제9 및 제10 단계: 0.22μm 여과:
90LP 심층 필터로부터의 여과액을 0.22㎛ 필터를 통해 추가로 통과시키고, 여과액을 보유 탱크(hold tank)에 수집한다.
제11 및 제12 단계: 100kD 농축 및 투석여과:
이 단계는 배지 성분 및 저 분자량 불순물을 제거하기 위해 수행한다. 또한, 작업 용적을 감소시키기 위한 농축을 수행한다. Hib 다당류(PRP)의 분자량이 500kD 이상이기 때문에, 100kD 분자량 컷오프가 선택된다. 상기 배양액을 약 10배로 농축하고, 이어서 0.01 M PBS 완충액(pH 7.2)을 사용하여 NLT 5 용적에 대해 투석여과한다. 생성된, 투석유물(retentate) 내 생성물은 "조질의 PRP"로 지칭하고, 제13 단계에 기술된 바와 같이 추가로 가공된다. 이 농축된 배양액은 0.22㎛ 필터를 통해 트랜스퍼 포트를 통해 DSP 영역으로 전달되어, 어떠한 박테리아도 DSP 영역으로 전달되지 않음을 보장한다.
제13 단계: CTAB 침전:
CTAB(세틸-트리메틸 암모늄 브로마이드)는 다당류 침전에 사용되는 양이온성 세정제이다. CTAB는 친수성 영역 뿐만 아니라 소수성 부분으로 이루어지고 단백질, 핵산 및 다당류를 침전시킨다. 제12 단계로부터 수득된 조질의 PRP를 1% CTAB 농도로 침전시키고, 2시간 이상 항온처리하였다. CTAB 펠렛 수확은 제14 단계에서 기술한다.
제14, 제15 및 제16 단계: CTAB 펠렛 원심분리, 수집 및 저장:
SEZ-3, FF에서, CTAB 펠렛은 15,000rpm에서 연속 원심분리를 사용하여 원심분리한다. CTAB 펠렛을 수확하고, 계량하고, 분취하고, 추가 가공을 위해 -20℃ 이하에 저장한다. 이것이 제1 인-프로세스 보유 단계이다.
제17 및 제18 단계: CTAB 페이스트 해동 및 용해
동결된 CTAB 페이스트를 상온에서 해동한다. 해동된 펠렛을 5.85% NaCl 용액에 용해시킨다. 상기 용액을 교반 탱크로 옮기고 다당류 생성물을 수상에 용해시킨다. 상기 탱크는 침전된 단백질 및 핵산으로부터의 용해되지 않은 물질을 함유한다. 이 현탁액은 제19 단계에 기술한 바와 같이 추가로 가공된다.
제19 단계: 원심분리:
제18 단계로부터 수득된 물질을 2-8℃에서 5000-6500 rpm에서 20-30 분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 물질을 제거한다. 원심분리된 상청액을 수집하고, 제20 단계에 기술한 바와 같이 추가로 가공된다.
제20 단계: 72% 에탄올 침전:
72% 에탄올을 사용하여 PRP를 침전한다. 96% 에탄올을 사용하여 제19 단계에서 수득된 상청액에 대해 72% 에탄올의 최종 농도를 만든다. 이 침전을 2-8℃에서 밤새도록 진행한다. 생성된 침전물을 제21 단계에 기술한 바와 같이 수확한다.
제21 및 제22 단계: 원심분리 및 펠렛 용해:
2-8 ℃에서 5000-6500rpm으로 20-30분 동안 원심분리함으로써 72% 에탄올 침전물을 수집한다. 생성된 펠렛을, 시각적 투명성이 확보될 때까지 W.F.I에 용해시킨다. 용해된 펠렛의 후속 처리를 제23 단계에서 기술하였다.
제23 단계: DOC 및 32% 에탄올 침전:
제22 단계로부터 수득한 물질에, 6% 아세트산나트륨 및 1% 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)를 첨가한다. 96% 에탄올을 사용하여 최종 농도 32% 에탄올을 생성한다. DOC 및 32% 알코올 둘 다 단백질 불순물의 침전을 유도하면서, 다당류는 액상 형태로 존재하게 한다. 이 침전을 2-8℃에서 밤새(NLT 8 시간) 수행한다.
제24 단계: 원심분리:
제23 단계로부터 수득한 물질을 2-8℃에서 5000-6500rpm으로 20-30분 동안 원심분리하여 침전물을 제거한다. 원심분리된 상청액을 수집하고, 제25 단계에 기술한 바와 같이 추가로 가공하였다.
제25 단계: 심층 및 탄소 여과:
제24 단계에서 수득한 상청액은 가용성 PRP를 함유하며, 심층여과 및 그 이후의 탄소 여과에 적용하여 핵산 및 착색 물질(coloring matter)를 제거한다. 260nm에서 간헐적으로 흡광도(A260)를 측정하여 핵산 제거를 모니터링한다. 목표 A260에 도달한 후, 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 이 여과된 용액을 제26 단계에 기술한 바와 같이 추가로 가공한다.
제26 단계: 64% 에탄올 침전:
제25 단계에서 수득한 여과 물질을, 64% 에탄올의 최종 농도인 96% 에탄올로 추가로 침전시킨다. 이 침전은 2-8 ℃에서 밤새 수행한다. 생성된 침전물을 원심분리를 통해 수확하고, 제27 단계에서 기술한 바와 같이 추가로 가공한다.
제27 단계: 펠렛 수집 및 용해:
상청액을 따라내어 폐기하여 펠렛을 수집한다. 펠렛을 상온에서 W.F.I에 용해시킨다.
제28 단계: 300kD 농축 및 투석여과:
용해된 펠렛 용액을, 300kD NMWCO 막을 사용하여 농축한다. 이것을, W.F.I.를 사용하여 (NLT) 8X 이상으로 추가로 투석여과한다. 생성된 투석유물을, 제29 단계에서 기술한 바와 같이 추가로 가공한다.
제29, 제30 단계: 0.22 ㎛ 여과 및 정제된 PRP 저장:
300kD UF 투석유물을, 정화 단계로서 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시켜 바이오버든을 최소화한다. 생성된 정제된 PRP를 분취하고, 제31단계에 기술한 바와 같이 추가 사용시까지 20℃ 이하에 저장한다. 정제된 PRP 샘플을 Q.C.분석을 위해 내보낸다.
제31 단계: 해동 및 풀링(pooling):
접합체 배치 크기에 기초하여, 제30 단계로부터 수득된 적절한 양의 천연 다당류를 해동한다. 풀링된 물질은 PRP 함량에 대해 분석하고, 이는 제32 단계에서 기술한 바와 같이 추가 처리를 위해 필요하다.
제32 단계: 100kD 농축:
풀링된 정제된 다당류는 추가 가공을 위해 최소 농도(8-12mg/mL)가 되도록 요구된다. 풀 다당류 농도가 목표보다 낮은 경우, 풀링된 다당류 용액는, 100kD UF NMWCO 막을 사용하여 농축한다. 후속적인 단계(제33 단계)를 위해 최소 농도에 도달한 것을 보장하기 위해서 농축 후 샘플은 채취한다.
제33 단계: 알칼리성 해중합:
제32 단계에서 수득된 농축된 다당류(74g/110g와 동등함)를 카보네이트-바이카보네이트 완충액을 사용하여 순한 알칼리성 조건 하에서 해중합시킨다. 목표 다당류 크기에 도달한 후, 해중합된 다당류는, 제34 단계에서 기술된 바와 같이 활성화된다.
제34 단계: 다당류 활성화:
제33 단계에서 수득된 해중합된 다당류는, 시아노겐 브로마이드를 사용하여 활성화된다. 이러한 활성화는 질소 환경 하에서 수행된다. 시아노겐 브로마이드는 매우 독성이어서, 이러한 화학물질을 취급할 때는 적절히 주의한다.
제35 단계: 링커 부착:
새롭게 제조된 아디프산 디히드라지드(ADH) 용액을, 6-10분 내에 제34 단계로부터 수득된 반응 혼합물에 첨가한다. 반응은 2-10℃에서 NLT 16 시간 동안 수행된다. ADH 링커의 역할은 접합체 반응에 필요한 다당류에 아민기를 제공하는 것이다.
제36 단계: 농축 및 투석여과:
제35 단계로부터 수득된 반응 혼합물을 농축하고, 10 kD NMWCO UF막을 사용하여 포스페이트 완충액 생리식염수(PBS)를 사용하여 용적별로 투석여과하여, 유리 ADH를 제거한다. ADH의 제거는 HPLC 위에서 모니터링되고, 유리 ADH 수준이 5% 미만에 도달할 때까지 투석여과가 계속된다. 생성된 투석유물을 NLT 5X MES-NaCl 완충액으로 추가로 투석여과한다. 이는 추가로 농축되어 NLT 20 mg/mL의 농도를 달성한다. 이 농축된 가공된 PRP는 제37 단계에서 기술한 바와 같이 추가로 사용될 때까지 2-8 ℃로 유지한다.
제37 및 제38 단계: 0.22㎛ 여과 및 가공된 PRP 저장:
제36 단계로부터의 투석유물을, 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시키고, 이는 정화 단계로서 작용한다. 이것은 또한, C등급의 영역에서 수행되는 공정 동안 바이오버든 수준이 제어됨을 보장한다. 여과된 활성화된 다당류를 수집하고, 샘플링하고, 분취하고, 추가 가공 시까지 2-8 ℃에서 저장한다. PRP 분자 크기(kD), PRP 함량, 및 PRP 활성화도를 포함하는 분석을 위해, 가공된 다당류 풀로부터 샘플을 채취한다. 가공된 PRP의 추가 가공을 제24 단계에서 기술한다.
제39 단계: TT 10kD 농축 및 투석여과:
접합 반응은 2개의 성분, 즉, 가공된 다당류 및 운반 단백질(TT)을 요구한다. 운반 단백질을 농축하고 10 kD UF NMWCO 막을 사용하여 MES-NaCl 완충액으로 투석여과한다. 이어서, 이 투석여과된 운반 단백질을 동일한 막을 사용하여 NLT 20mg/mL으로 더 농축한다.
제40 단계: 접합:
접합체 반응은 2 개의 성분을, 즉 가공된 다당류 및 운반 단백질(TT)을 요구한다. 활성화된 다당류 성분은 제38 단계로부터 수득된다. 운반 단백질은 제39 단계로부터 수득한다. 두 성분을, 교반 하에서 EDC의 존재 하에서 PRP:TT = 1:1(w/w)의 비율의 적정한 양으로 혼합한다. 접합체 반응은 HPLC에서 모니터링하여, 단백질의 85% 이상의 전환(유리 단백질의 접합체로의 전환에 기초한다)에 도달할 때까지 계속된다.
제41 단계: 퀀칭:
접합체 반응을 전환에 대한 그의 허용 기준까지 진행한 후(제40 단계), 반응은 퀀칭에 의해 종료된다. 포스페이트 EDTA 완충액을 사용하여 접합 반응을 퀀칭한다. 이 접합 반응은 제42 단계에서 기술한 바와 같이 추가로 가공된다.
제42 단계: 30SP 및 0.22μm 여과:
제41 단계에서 수득된 접합체는 30SP 필터를 통해 여과되고 그 후 0.22μm 여과한다. 이것은 임의의 큰 응집체의 제거를 보장한다. 이 여과된 접합체를 제43 단계에서 기술한 바와 같이 가공한다.
제43 단계: 300kD 초여과 및 투석여과:
제42단계에서 수득한 접합 반응 혼합물을 300 kD UF NMWCO 막을 사용하여 0.05% 생리식염수로 투석여과한다. 투석여과는 접합 시약과 미반응 TT를 제거하기 위해 수행한다. 생성된 투석유물은 제44 단계에 기술한 바와 같이 추가로 처리한다.
제44, 제45 단계: 0.22 ㎛ 여과 및 조질의 접합체 저장
제43 단계로부터의 투석유물은 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시키며, 이는 정화 단계로서 작용한다. 이것은 또한, C등급의 영역에서 수행되는 공정 동안 바이오버든 수준을 제어함을 보장한다. 여과된 조질의 접합체는 수집되고 샘플링되고, 추가 가공 시까지 2-8oC에 저장된다. 조질의 접합체의 추가 가공은 제48 단계에서 기술된다.
제46 단계: 조질의 접합체 희석:
필요한 경우, 제45 단계로부터의 조질의 접합체를 W.F.I.로 4±1mg/m의 목표 농도로 희석시키고, 제47 단계에 기술된 침전 단계에 의해 추가로 가공한다.
제47 단계: 황산암모늄 침전:
희석된 접합체 반응 혼합물을 황산암모늄(50%w/v 스탁 용액)을 사용하여 추가로 가공하여, 유리 PRP를 제거한다. 침전 단계는 교반 하에 15℃ 미만의 온도로 수행한다. 침전 단계는 침전물에 접합체를 밀어 넣고 상청액에 유리 PRP를 남긴다. 황산암모늄을 첨가한 후, NLT 12 시간 동안 교반하지 않으면서 생성된 현탁액을 15℃ 미만의 온도로 저장한다.
제48 단계: 펠렛 수집 및 용해:
제47 단계로부터 수득한 현탁액을 2-8℃에서 40±10 분 동안 약 7000g에서 원심분리한다. 상청액을 기울여 따라 버리고, 수득한 펠렛을 트리스-식염수에 용해시킨다.
제49 단계: 300kD 투석여과:
제48 단계로부터의 생성된 용액을, 30 SP 심층 필터를 통해 여과하고, 300 kD NMWCO 막을 사용하여 20 mM 트리스-식염수로 투석여과한다.
제50 단계: GPC 크로마토그래피 정제:
제49 단계로부터의 생성된 용액을 크기 배제 크로마토그래피를 위한 토요펄(Toyopear) HW-65F 하이드록실화 메타크릴산 중합체 비드 겔을 함유하는 약 70 L GPC 컬럼 위에 로딩하였다. 가공된 접합체(황산암모늄 이후)에 대해 GPC 크로마토그래피를 사용하면, 생성된 물질에서의 유리 PRP의 수준을 감소시킨다. 컬럼은 20mM 트리스 0.9% 염화나트륨으로 용출되고, 분획은 A280를 기반으로 수집된다. 유리 PRP, 비율 및 분자 크기에 대한 허용 기준에 기초하여 적절한 분획을 풀링하고, 상기 풀은 제51 단계에 기술된 바와 같이 추가로 가공한다.
제51 단계: 300 kD 투석여과:
제 50 단계로부터의 생성된 풀링된 접합체 용출액을 300 kD UF NMWCO 막을 사용한 20mM 트리스로 투석여과한다. 투석유물 내 PRP 함량이 약 1 mg/mL가 되도록, 이 투석유물 체적을 목표로 한다.
제52 및 53 단계: 0.22μm 여과:
제51 단계로부터 수득된 벌크 접합체를 A등급 환경 하에서 0.22㎛ 필터를 통해 여과하여 무균성을 보장한다. 0.22㎛ 필터는 일체성(integrity) 시험을 거친다. 여과된 벌크 접합체로부터의 샘플을 완벽히 분석하기 위해 Q.C.로 보낸다. 여과된 접합체는 “무균 Hib 벌크 접합체”로 표지하고, 2-8℃에서 저장한다. 벌크 접합체는 최대 3개월까지 2-8℃에서 저장될 수 있고, 만약 재사용된다면, -70℃에서 최대 1년까지의 총 지속기간 동안 저장될 수 있다.
수득한 Hib PRP-TT 접합체 항원의 품질 특성은 다음과 같다,
PRP 함량(μg/0.5ml): 8.1
비율(PRP:TT): 0.5
유리 PRP(%): 4.8%
PMW(kD): 983
평균 MW(kD): 752
실시예 4:
전세포 백일해(wP) 항원의 불활성화 방법:
불활성화 방법의 최적화는, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃에서 10분 동안, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃ 온도에서 15분 동안, 히민(hymine)의 존재 하에서 56℃에서 10분 동안, 히민의 존재 하에서 56℃에서 15분 동안의 불활성화를 포함하는 다양한 시험을 수행하고 56℃에서 30분 동안 가열한 후에, 수행된다. 이 방법들에서 효능에 대한 어떠한 유의적인 차이도 관찰되지 않았다. 이들 방법 중에서, 포름알데히드의 존재 하에서 10분 동안 56℃에서 10분 동안이 선택되었는데, 그 이유는 이 방법을 사용하여 생성된 백일해 세포 덩어리가 언급된 다른 방법과 비교했을 때 보다 균질하기 때문이다.
불활성화된 wP 항원의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 보르데텔라 백일해 균주 134를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃ 온도에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계,
b) 보르데텔라 백일해 균주 509를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃ 온도에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계,
c) 보르데텔라 백일해 균주 25525와 6229를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃ 온도에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계,
c) 보르데텔라 백일해 균주 6229를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃ 온도에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계,
d) 이어서, 불활성화된 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229를 1:1:0.25:0.25의 비율로 혼합하는 단계,
e) 선택적으로, 알루미늄계 보조제에 흡착시키는 단계.
상기 방법에는 티메로살이 없고, 불활성화된 전세포 백일해 항원이 뭉치지 않고 균질하게 남아서, 감소된 반응원성을 유도하고 장기간 동안 우수한 효능을 제공한다.
실시예 5: 불활성화된 폴리오 바이러스(IPV)의 제조 방법
폴리오 바이러스는 하기 방법에 의해 성장될 수 있다:
·CCL81-VERO(원숭이 신장) 세포주를 폴리오 바이러스, 즉 사빈 및 소크 균주를 성장시키기 위한 숙주 세포로서 사용하였다.
·폴리오 바이러스의 목적하는 균주로 숙주 세포를 감염시키고 72시간 항온처리한 후, 바이러스 및 세포 파편을 함유한 배지를 단일 용기에 풀링하고 수집하였다.
·여과액을 100KDa 카세트로 접선 유동 여과(tangential flow filtration)시키고, 포스페이트 완충액을 사용하여 투석여과(diafilter)시키고, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
·환자에게 투여하기 전에, 바이러스는 적절한 불활성화 방법을 사용하여 불활성화되어야만 한다.
하기 단계를 포함하는 포르말린 불활성화:
a) 정제된 바이러스 풀을, pH가 7-7.5인 (30-50mM) 범위에서 인산염 완충액에서 트리스 완충액으로 완충액을 교환하는 단계,
b) 상기 혼합물에, 글리신(5 gm/l) 함유 M-199 배지를 첨가하는 단계,
c) 0.025% 포름알데히드를 첨가하고, 이어서 혼합하는 단계,
d) 이어서, 혼합물을 자기 교반기 위에서 바이러스 벌크를 연속적으로 교반하면서 5-13 일 동안 37℃에서 항온처리하는 단계,
e) 항온처리 후 혼합물을 7일째의 중간 TFF 시스템(100KDa, 0.1㎡) 및 불활성화 후, 최종 여과에 적용하는 단계,
f) 이어서, 여과된 벌크를 2-8 ℃에 저장하는 단계,
g) D-Ag 단위 결정을 위해 D-Ag ELISA를 수행하는 단계.
실시예 6:
본 실시예는 D, T, wP, HBsAg, Hib PRP-TT 접합체 및 IPV를 포함하는 혼합백신 조성물의 제조 방법의 지침을 제공한다:
1. 성분 I의 배합 절차:
a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄 옮기기,
b) 디프테리아 톡소이드 첨가,
c) 아세트산/수산화나트륨으로 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하기,
d) 안정화를 위해 기다리기,
e) 수산화나트륨/탄산나트륨으로 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하기,
f) 안정화를 위해 기다리기.
2. 성분 II의 제형화 절차:
a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄 옮기기,
b) 파상풍 톡소이드 첨가,
c) 아세트산/수산화나트륨으로 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하기,
d) 안정화를 위해 기다리기,
e) 수산화나트륨/탄산나트륨으로 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하기,
f) 안정화를 위해 기다리기.
3. 성분 III의 제형화 절차:
a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄 옮기기,
b) B형 간염 바이러스 표면항원 첨가,
c) 아세트산/수산화나트륨으로 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하기,
d) 안정화를 위해 기다리기,
e) 수산화나트륨/탄산나트륨으로 pH를 5.8 내지 6.8로 조절하기,
f) 안정화를 위해 기다리기.
4. 성분 I을 성분 II에 혼합하고 상온에서 교반하였다.
5. 불활성화된 wP 항원을 상기 혼합물에 첨가하고, 이어서 RT에서 교반하였다.
6. 성분 III을 제5 단계에서 수득된 혼합물에 상온에서 첨가하였다.
7. Hib PRP 접합체를, 6-16℃에서 제6 단계에서 수득된 혼합물에 첨가하였다.
8. IPV 항원을, 6-16℃에서 제6 단계에서 수득된 혼합물에 첨가하였다.
9. 2-페녹시에탄올을, 6-16℃에서 제7 단계에서 수득된 혼합물에 상온에서 첨가하였다.
10. pH를 확인하고, 필요한 경우, 수산화나트륨/탄산나트륨을 이용하여 pH를 6.0-7.0으로 조절하였다.
11. NaCl을, 제10 단계에서 수득된 혼합물에 첨가하고, 3시간 동안 교반하였다.
실시예 7:
6가 백신의 독성 연구
하기 독성 연구는, 우수 실험실 관리 기준의 OECD 원칙 및 백신의 비-임상 평가에 관한 WHO 지침 및 스케쥴 'Y' 에 부합하는 연구 계획을 따라 DTwP-HepB-IPV-Hib 백신을 사용하여 수행하였다.
1. 피하 경로를 통한 스프라그 다울리 래트(Sprague Dawley Rat)의 1회 투여 독성 연구
처치 시작 시 5-6주령의 총 20마리의 수컷과 20마리의 암컷 래트를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다. 각각의 그룹은 5마리의 수컷과 암컷으로 구성되어 있다. 사용-준비(ready to use) 플라세보, 보조제, DTwP-HepB-IPV-Hib 1회 용량 백신 및 다회 용량 백신을 피하 경로를 통해 투여하였다. 이 래트들을 투약 후 14동안 관찰하였다.
2. 근육내 경로를 통한 스프라그 다울리 래트의 반복 투여 독성 연구
총 100마리의 수컷과 100마리의 암컷 래트를 무작위로 주요군과 회복군으로 나누었다. 사용-준비 플라세보 대조군, 보조제 대조군, DTwP-HepB-IPT-Hib 1회 용량 백신 및 다회 용량 백신을 1, 29, 57 및 85 일째에 깊은 근육내 주사로 서서히 주입하였다. 회복군의 동물은 28일 동안 치료없이 관찰하였다.
3. 피하 경로를 통한 뉴질랜드 백색 토끼의 일회 투여 독성 연구
총 16마리의 수컷과 16마리의 암컷 토끼를 무작위로 4개의 군으로 나누었다. 사용-준비 플라세보, 보조제, DTwP-HepB-IPV-Hib 1회 용량 백신 및 다회 용량 백신을 피하 경로를 통해 각 그룹의 동물에게 투여하였다. 토끼에게 1회 피하 용량을 투여하고 15일 동안 관찰하였다.
4. 근육내 경로를 통한 뉴질랜드 백색 토끼의 반복 투여 독성 연구
총 40마리의 수컷과 40마리의 암컷 토끼를 무작위로 주요군과 회복군으로 나누었다. 사용-준비 플라세보 대조군, 보조제 대조군 및 상이한 용량의 1회 용량 및 다회 용량의 DTwP-HepB-IPT-Hib 백신을 1, 29, 57 및 85일째에 근육내 주사로 서서히 주입하였다. 회복군의 동물을 어떠한 치료도 하지 않고 28일 동안 관찰하였다.
이 결과에 따르면, 1회 용량 및 다회 용량의 6가 백신[디프테리아, 파상풍, 백일해(전세포), B형 간염, 폴리오(불활성화) 및 헤모필루스 인플루엔자 b형 접합체 백신(흡착형)]은, 사용된 시험 조건 하에서 1회 인간 용량(0.5 mL)이 피하 또는 근육내 경로에 의해 투여될 때, 스프라그 다울리 래트 및 뉴질랜드 백색 토끼에게 어떠한 전신 부작용도 일으키지 않았다는 결론을 내릴 수 있었다. 백신 처리군에서 관찰된 면역 반응의 발견 및 국소 주사 부위 염증 반응은 알루미늄 보조된 백신 투여와 관련한 독성 연구에서 예상가능하고 일반적으로 관찰된다. 따라서, 시험 항목‘DTwP-HepB-IPT-Hib 백신의 최고 용량인 0.5mL/동물(인간 1회 용량)은 사용된 시험 조건 하 및 용량에서 “무-독성량”(No Observed Adverse Effect Level; NOAEL)으로 간주할 수 있다.
실시예 8
[표 10]

Claims (35)

  1. 면역원성 조성물이 0.5 ml 당,
    (i) 50% 이상의 흡착율로 알루미늄 염에 흡착된, 10 Lf 내지 25 Lf 범위의 디프테리아 톡소이드(D);
    (ii) 40% 이상의 흡착율로 알루미늄 염에 흡착된, 2 Lf 내지 10 Lf 범위의 파상풍 톡소이드(T);
    (iii) 불활성화된 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229를 1:1:0.25:0.25의 비율로 함유하는, 12 IOU 내지 16 IOU 범위의 불활성화된 전세포 백일해 항원(wP);
    (iv) 70% 이상의 흡착율로 알루미늄 염에 흡착된, 7 μg 내지 15 μg 범위의 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg);
    (v) 시아닐화제로서 CNBr을 이용하는 운반 단백질로서 파상풍 톡소이드에 접합된, 7 μg 내지 13 μg 범위의 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib) 협막 당류(capsular saccharide);
    (vi) 각각, 1-50 DU 범위의 IPV 항원 1형, 1-20 DU 범위의 2형 및 1-50 DU 범위의 3형을 함유하는, 불활성화된 폴리오 바이러스 항원(IPV);
    (vii) 인산알루미늄 보조제로서 0.1 mg 내지 0.5 mg 범위의 총 알루미늄 함량(Al3+);
    (viii) 보존제로서 1 mg 내지 3 mg 범위의 2-페녹시에탄올; 및
    (ix) 0.5% 내지 1.5% 범위의 완충액 또는 희석 매질로서 NaCl
    을 포함하고,
    개선된 면역원성, 감소된 반응원성 및 2-8℃와 상온에서의 개선된 안정성을 나타내는 완전 액상 혼합백신인 것인, 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    IPV 항원이 마호니 1형, MEF 2형 및 소켓(Saukett) 3형의 군에서 선택되는 소크(Salk) 균주 또는 1형, 2형 및 3형의 군에서 선택되는 사빈(Sabin) 균주인, 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    불활성화된 전세포 백일해 항원, Hib 항원 및 불활성화된 폴리오 바이러스 항원이 임의의 보조제에 실질적으로 흡착되지 않는 것인, 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    조성물이 0.5 ml 당,
    10 Lf의 양의 D 항원; 2 Lf의 양의 T 항원; 12 IOU의 양의 wP 항원; 8 μg의 양의 HBsAg; 8 μg의 양의 Hib 항원; 각각 40 DU의 양의 IPV 항원 소크 1형, 8 DU의 양의 소크 2형, 및 32 DU의 양의 소크 3형; 0.3 mg 내지 0.5 mg 이하의 인산알루미늄으로서 총 알루미늄 함량(Al3+); 2.5 mg의 2-페녹시에탄올; 및 0.9%의 양의 염화나트륨을 포함하는, 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    조성물이 0.5 ml 당,
    20 Lf의 양의 D 항원; 4 Lf의 양의 T 항원; 14 IOU의 양의 wP 항원; 15 μg의 양의 HBsAg; 10 μg의 양의 Hib 항원; 각각 40 DU의 양의 IPV 항원 소크 1형, 8 DU의 양의 소크 2형, 및 32 DU의 양의 소크 3형; 0.3 mg 이하의 인산알루미늄으로서 총 알루미늄 함량(Al3+); 2.5 mg의 양의 2-페녹시에탄올; 및 0.9%의 양의 염화나트륨을 포함하는, 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    조성물이 0.5 ml 당,
    25 Lf의 양의 D 항원; 10 Lf의 양의 T 항원; 16 IOU의 양의 wP 항원; 15 μg의 양의 HBsAg; 13 μg의 양의 Hib 항원; 각각 40 DU의 양의 IPV 항원 소크 1형, 8 DU의 양의 소크 2형, 및 32 DU의 양의 소크 3형; 0.3 mg 이하의 인산알루미늄으로서 총 알루미늄 함량(Al3+); 2.5 mg의 2-페녹시에탄올; 및 0.9%의 양의 염화나트륨을 포함하는, 면역원성 조성물.
  7. 개선된 면역원성, 감소된 반응원성 및 개선된 안정성을 나타내는 제1항에 따른 완전 액상 혼합백신 조성물의 제조 방법으로서,
    방법이,
    a) 혼합용기(blending vessel)/용기에 전체 중 80%의 일반 생리식염수(NaCl)를 첨가하는 단계;
    b) 혼합용기/용기에 디프테리아 톡소이드를 포함하는 성분 I를 첨가하는 단계;
    c) 단계 b)의 성분 I에 파상풍 톡소이드를 포함하는 성분 II를, 실온에서 교반하면서 첨가하는 단계;
    d) 단계 c)에서 수득된 혼합물에 불활성화된 전세포 백일해 항원을, 실온에서 교반하면서 첨가하는 단계;
    e) 단계 d)에서 수득된 혼합물에 B형 간염 바이러스 표면항원을 포함하는 성분 III을, 실온에서 첨가하는 단계;
    f) 단계 e)에서 수득된 혼합물에 Hib 항원을, 6-16℃에서 첨가하는 단계;
    g) 단계 f)에서 수득된 혼합물에 IPV 항원을, 6-16℃에서 첨가하는 단계;
    h) 단계 g)에서 수득된 혼합물에 2-페녹시 에탄올을, 6-16℃에서 첨가하는 단계;
    i) 수산화나트륨/탄산나트륨으로 단계 g)에서 수득된 혼합물의 pH를 6.0 내지 7.0으로 조절하는 단계; 및
    j) 전체 중 나머지 20%의 일반 생리식염수(NaCl)를 첨가하여, 교반하면서 용적을 채우는 단계
    를 포함하는, 완전 액상 혼합백신 조성물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    성분 I의 제조가,
    a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄을 옮기는 단계;
    b) 단계 a)의 용기/혼합용기에 디프테리아 톡소이드를 첨가하는 단계;
    c) 아세트산/수산화나트륨으로 단계 b)에서 수득된 혼합물의 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 단계;
    d) 단계 c)에서 수득된 혼합물을 33-37℃에서 적어도 48시간 동안 유지하는 단계;
    e) 온도를 2-8℃로 변화시키고, 7일 동안 유지하는 단계;
    f) 수산화나트륨/탄산나트륨/인산삼나트륨으로 단계 e)에서 수득된 혼합물의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계; 및
    g) 단계 f)에서 수득된 성분 I을 추가로 사용할 때까지 2-8℃에서 보관하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    성분 II의 제조가,
    a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄을 옮기는 단계;
    b) 단계 a)의 용기/혼합용기에 파상풍 톡소이드를 첨가하는 단계;
    c) 아세트산/수산화나트륨으로 단계 b)에서 수득된 혼합물의 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 단계;
    d) 단계 c)에서 수득된 혼합물을 33-37℃에서 적어도 48시간 동안 유지하는 단계;
    e) 온도를 2-8℃로 변화시키고, 7일 동안 유지하는 단계;
    f) 수산화나트륨/탄산나트륨/인산삼나트륨으로 단계 e)에서 수득된 혼합물의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계; 및
    g) 단계 f)에서 수득된 성분 II를 추가로 사용할 때까지 2-8℃에서 보관하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    성분 III의 제조가,
    a) 용기/혼합용기에 인산알루미늄을 옮기는 단계;
    b) 단계 a)의 용기/혼합용기에 B형 간염 바이러스 표면항원을 첨가하는 단계;
    c) 아세트산/수산화나트륨으로 단계 b)에서 수득된 혼합물의 pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 단계;
    d) 단계 c)에서 수득된 혼합물을 22-25℃에서 적어도 20-28시간 동안 유지하는 단계;
    e) 수산화나트륨/탄산나트륨/인산삼나트륨으로 단계 d)에서 수득된 혼합물의 pH를 5.8 내지 6.8로 조절하는 단계; 및
    f) 단계 e)에서 수득된 성분 III을 추가로 사용할 때까지 2-8℃에서 보관하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    불활성화된 전세포 백일해 항원의 제조가,
    a) 보르데텔라 백일해 균주 134를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계;
    b) 보르데텔라 백일해 균주 509를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계;
    c) 보르데텔라 백일해 균주 25525와 6229를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계;
    d) 보르데텔라 백일해 균주 6229를, 포름알데히드의 존재 하에서 56℃에서 10-15분 동안 불활성화하는 단계;
    e) 이어서, 단계 a), b), c) 및 d)에서 각각 수득된, 불활성화된 보르데텔라 백일해 균주 134, 509, 25525 및 6229를 1:1:0.25:0.25의 비율로 혼합하는 단계; 및
    f) 선택적으로, 알루미늄계 보조제에 흡착시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 제조에는 티메로살이 없고, 불활성화된 전세포 백일해 항원이 뭉치지 않고 균질하게 남아서, 장기간 동안, 감소된 반응원성 및 4.5 IU/투여량 초과의 효능을 유도하는, 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    Hib 항원의 제조가
    a) 헤모필루스 인플루엔자 b형을 발효시키는 단계;
    b) 단계 a)에서 수득된 헤모필루스 인플루엔자 b형을 0.1% 포름알데히드의 존재 하에서 37℃에서 2시간 동안 불활성화하는 단계;
    c) 단계 b)에서 수득된 Hib 폴리리보실리비톨 포스페이트(PRP) 다당류를 정제하는 단계;
    d) 단계 c)의 정제된 생성물을, 아디프산 디히드라지드(ADH) 링커의 존재 하에서 시아노겐 브로마이드 시아닐화 접합 화학반응을 사용하여 파상풍 톡소이드(TT)에 접합하는 단계;
    e) 단계 d)의 접합체를 정제하는 단계; 및
    f) 바람직하게는 단계 e)의 정제된 접합체를 0.22㎛ 필터를 통해 여과하는 단계
    를 포함하고, 유리 PRP의 백분율이 전체 정제된 Hib 벌크 접합체의 5% 이하인 것인, 방법.
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