TW202038995A - 多價疫苗組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包含抗原混合物之穩定的免疫原性組合疫苗，其用於防治和預防由輪狀病毒、小兒麻痺病毒、流感嗜血桿菌、白喉桿菌、破傷風梭菌、百日咳博德氏桿菌和B型肝炎病毒引起的感染。本發明尤其提供了一種多價組合疫苗，其包含i)顯著劑量減少的沙克(Salk) IPV或沙賓(Sabin) IPV (IPV)抗原，其係藉由利用改良之甲醛滅活和氫氧化鋁吸附方法製備，該方法能使D-抗原的回收最大化，及ii)獲自輪狀病毒(CDC-9)病毒株之可注射的熱滅活輪狀病毒抗原，其提供針對人類輪狀病毒株的廣泛交叉保護免疫性，iii)具有改良之穩定性和免疫原性的Hib PRP-載體蛋白結合物，其中所述Hib PRP-載體蛋白結合物最初是藉由使用新穎結合方法製備，並隨後在穩定劑存在下於低溫混合以最小化游離PRP釋放，iv)具有改進的免疫原性和穩定性的全細胞型百日咳抗原，其藉由在混合後期添加全細胞型百日咳抗原獲得，從而最小化基於水解的降解，v)藉由使用凝膠滲透層析除去非所欲之聚集體而獲得之白喉類毒素和破傷風類毒素的均質級分(homogenous fractions)。本發明亦揭露製備這種穩定且具免疫原性之疫苗組合物的方法，其係藉由i)各別將劑量減少的IPV、IRV抗原吸附在氫氧化鋁上，並且保持其他抗原不被吸附或吸附在磷酸鋁、氫氧化鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁的組合上，以及ii)在混合過程中使用特定順序添加抗原。

Description

多價疫苗組合物

本發明係關於包含抗原混合物之穩定的組合疫苗，其用於防治和預防由輪狀病毒、小兒麻痺病毒、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis)(全細胞型)和B型肝炎病毒引起的感染。本發明尤其係關於穩定的多價組合疫苗，其包含顯著劑量減少的沙克(Salk) IPV或沙賓(Sabin) IPV (IPV)抗原和獲自輪狀病毒(CDC-9)病毒株之可注射的熱滅活輪狀病毒抗原。

小兒麻痺病毒侵入神經系統，並能在數小時內引起不可逆轉的麻痺。全球存在三種類型的小兒麻痺病毒，即第1型、第2型和第3型。

藉由使用基於活減毒之沙賓小兒麻痺病毒株的口服小兒麻痺疫苗(OPV)，小兒麻痺病毒的流行率已大大降低。然而，OPV對根除後時代有限度。OPV含有流傳性疫苗衍生的小兒麻痺病毒(cVDPV)，其具可傳播性並且能成為具有神經毒力(類似於野生型小兒麻痺病毒)，導致疫苗相關的麻痺性小兒麻痺症。此等病毒株可能使小兒麻痺病毒重新播向世界並使根除的成就無效。為防止流傳性疫苗衍生的小兒麻痺病毒(cVDPV)的出現，WHO策略諮詢專家小組(Strategic Advisory Group of Experts, SAGE)在目前使用OPV的國家建議至少一劑IPV伴隨口服小兒麻痺疫苗(OPV)。(參考：World Health Organization. Meeting of the Strategic Advisory Group of Experts on Immunization, November 2012 - conclusions and recommendations. Wkly Epidemiol Rec 2013; 88:1-16; PMID:23311010)。

目前，IPV之製備係使用野生型小兒麻痺病毒株，即沙克病毒株和較新的沙賓病毒株，其由與活減毒OPV中所使用者相同的減毒沙賓病毒株製備。藉由肌肉注射(IM)或深部皮下(SC)注射遞送的批准的標準劑量的小兒麻痺疫苗含有D抗原，即40單位滅活小兒麻痺病毒第1型(Mahoncy)、8單位滅活小兒麻痺病毒第2型(MEF-I)和32單位滅活小兒麻痺病毒第3型(Saukett) (例如Infanrix-IPV^TM )。但與OPV相比，IPV的生產成本較高，主要由於每劑量需要更多的病毒；額外的下游處理(即濃縮、純化和滅活)和相關的QC測試；下游中抗原損失或恢復不良；和遏制政策。

目前IPV的生產成本估計比OPV貴約20倍。根除小兒麻痺病毒後未來全球對IPV的需求可從目前的每年8000萬劑增加到45000萬劑。因此，為了降低IPV的最終成本，正在努力減少抗原組分的量，即產生劑量減少的IPV製劑。

在全球範圍內，輪狀病毒是嚴重急性腹瀉的主要原因，並且疫苗被認為是減輕疾病負擔的有希望的解決方案。據估計，自從在多於60個國家引入輪狀病毒疫苗後，自2000年至2013年的13年期間，全世界輪狀病毒死亡人數從528,000減少到215,000。出於這一點，據估計於2013年印度有47,100 (22％)例輪狀病毒死亡發生。印度、奈及利亞、巴基斯坦和剛果民主共和國這四個國家占2013年估計的輪狀病毒死亡的約一半(49％)。

在世界上進行的最近研究中，觀察到4種輪狀病毒血清型(即G1、G2、G3和G4)占超過88％的全球分析的病毒株。輪狀病毒A的G1血清型是在世界上導致疾病的最常見病毒形式之一，而相關的血清型G9病毒自1990年代後期以來已經出現，並且現在占全球分離株的約4％。針對輪狀病毒介導的疾病的疫苗接種是解決這一重大健康問題的一種策略。目前獲得許可的兩種口服輪狀病毒疫苗RotaTeq和Rotarix在已開發和中等收入國家於兒童嚴重腹瀉病例方面非常有效，但在非洲和亞洲的低收入國家則效果較差(~50％)。[參閱Tate JE et al. "Sustained decline in rotavirus detections in the United States following the introduction of rotavirus vaccine in 2006. Pediatr Infect Dis J 2011; 30:S30-4; and Yen C et al. "Decline in rotavirus hospitalizations and health care visits for childhood diarrhea following rotavirus vaccination in El Salvador". Pediatr Infect Dis J 2011; 30:S6-10]，此外，目前的兩種輪狀病毒疫苗都與接種疫苗的嬰兒的腸套疊的風險相關。[參考Patel MM et al. "Intussusception risk and health benefits of rotavirus vaccination in Mexico and Brazil. N Engl J Med 2011; 364:2283-92 and Buttery JP et al. "PAEDS/APSU Study Group. Intussusception following rotavirus vaccine administration: post-marketing surveillance in the National Immunization Program in Australia". Vaccine 2011; 29:3061-6]。

Bharat Biotech International的候選輪狀病毒疫苗之一是基於116E輪狀病毒株G9P[11]，其是含有一個牛輪狀病毒基因P[11]和10個人類輪狀病毒基因的天然存在的重組株。由此疫苗在出生後的前兩年提供的保護係針對一系列流傳性基因型，包括G1P[8]、G2P[4]、G12P[6]、G12P[8]和G9P[4]。因此，其不能為其他病毒株(如G3、G4、G5、G6、G8、G10、G11、G13和G14)提供交叉保護。此外，基於116E的疫苗在出生後的前兩年中的效力如同其他許可疫苗一樣屬適中(48％至55％)。[參閱Nita Bhandari et al. "Efficacy of a monovalent human-bovine (116E) rotavirus vaccine in Indian children in the second year of life"; Vaccine. 2014 Aug U；32 Suppl 1 :A110-6]。此外，基於G1、G3或G6的幾種其他肌內投藥的候選IRV的臨床前測試僅顯示出部分保護。

此外，用β-丙內酯(BPL)(一種常用於滅活許多病毒的試劑)滅活輪狀病毒也已經顯示出對輪狀病毒顆粒的完整性和生化組成造成嚴重損害。此外，經BPL處理的輪狀病毒顯示出降低的病毒血球凝集活性，並且用這種物質在小鼠中肌內注射引起的中和抗體比用活病毒免疫化引起的中和抗體更少。[參考Offit PA et al "Noninfectious rotavirus (strain RRV) induces an immune response in mice which protects against rotavirus challenge". J Clin Microbiol 1989; 27:885-8]。

在世界許多地方，用IPV免疫化已經取代了OPV，因此在幾年內，輪狀病毒疫苗將成為唯一的口服疫苗，其更增加遞送成本。因此，若干運營和物流方面的考量偏向IRV在開發中國家和工業化國家的使用。

D/T中二聚體的出現似乎是以福馬林解毒之過程的結果。二聚體的存在可影響結合方法的效率(推測藉由在蛋白質表面的空間位阻)而導致活性損失，並且認為單體位準不應低於80％是期望的。先前據報導，藉由使用HIC然後進行離子交換能獲得具有至少60％單體的T；藉由僅使用HIC苯基瓊脂糖凝膠能獲得具有73％單體含量的T，藉由僅使用硫酸銨能獲得具有55％單體含量的T。因此，需要另外的單一步驟方法來獲得具有至少80％單體的D/T。

組合疫苗包含兩種或更多種疫苗，它們能各別被提供並將它們置於單一組合物中。疫苗接種者可獲得與分開給予單獨疫苗相同的保護，但注射次數較少。因此組合疫苗提供針對大量疾病的免疫原性，並且總是優於單價疫苗，因為藉由減少分開的疫苗接種數量增加了依從性。

Bharat Biotech International正在開發一種七價組合疫苗，其由D、T、非細胞型百日咳、沙賓IPV (第1型：40 DU、第2型：8 DU，第3型：32DU)、單株滅活輪狀病毒(G9病毒株，即116E病毒株)、與TT結合的b型流感嗜血桿菌PRP結合物和重組B型肝炎疫苗組成。如前所述，這種包含基於116E之疫苗的七價組合疫苗不能為其他如G3、G4、G5、G6、G8、G10、G1l、G13和G14之病毒株提供交叉保護。此外，組合疫苗之所述IRV組分在出生後的最初2年內的效力與其他許可疫苗一樣為適中(48％至55％)。

來自Sanofi Pasteur的另一種組合疫苗Hexyon® (也稱為Hexacima®和Hexaxim®)含有aP。這種疫苗很可能目標在於歐洲和全球之私人市場。另一種由Merck和Sanofi Pasteur聯合開發的具有aP抗原的六價組合疫苗目前正在進行第III期臨床研究。

目前，GSK的Infanrix Hexa®是唯一行銷全球的含有IPV的六價兒童組合疫苗。這種疫苗含有非細胞型百日咳(aP)組分，並且由於Hib組分的不穩定性而以注射器加冷凍乾燥的小瓶(vial)形式呈現。在開發中國家環境中使用Infanrix Hexa® (GSK)的主要障礙是疫苗產品的價格、冷凍乾燥形式復水(reconstitution)的要求、以及開發中國家對aP疫苗有效性的擔憂。從成本的角度來看，由於製造差異和權利金成本，aP抗原在歷史上已超過wP抗原的成本10倍至30倍以上。因此，因為成本和對aP疫苗的長期有效性出現的擔憂(特別是在開發中國家的環境中)，在意圖用於開發中國家的多價組合疫苗中使用全細胞型百日咳(wP)已經變得重要。

幾種具有wP和IPV的多價組合疫苗正在開發中。然而，IPV抗原與常見的疫苗防腐劑硫柳汞(thimerosal)不相容，硫柳汞是一種具有抗菌活性的含汞化合物，其導致小兒麻痺衣殼失去其抗原性。硫柳汞被許多疫苗生產商用於滅活活百日咳博德氏桿菌生物體以製造wP疫苗原液(vaccine bulk)，這種原液進入最終產品但也導致IPV的抗原性損失，因此IPV可能需要呈現在與含硫柳汞的wP分開的小瓶中以隨時間保持其效力。

GSK的全細胞型組合疫苗(DTwP-IPV-HBV//Hib)據報導已進入幾個早期臨床試驗中。然而，該產品的小兒麻痺免疫原性不如比較疫苗好，並且發現IPV劑量的最小量需與目前的標準IPV劑量疫苗相同或可能需要增加。

在傳統疫苗的供應不足以滿足全球需求或傳統疫苗的製造成本阻止疫苗在開發中國家以可負擔的價格出售的情況下，使用較低劑量的IPV抗原來提供針對感染的保護的減少劑量之有效疫苗製劑是期望的。此外，暴露於較低劑量的IPV；與現有市售製劑相比可能更安全。多價組合疫苗可以簡化複雜的兒科常規免疫計畫、改善依從性並降低遞送成本。然而，自始於1990年代初的組合兒科疫苗的工作以來，含IPV的多價疫苗對疫苗生產商來說一直是一項技術挑戰。

在鋁佐劑(更具體地是氫氧化鋁)存在下Hib抗原的不穩定性是主要的技術問題。因此，如果要用到組合物中的疫苗原液已經是基於不同的鋁化反應者，生產商須解決的技術挑戰將是避免不同的鋁佐劑。因此，添加抗原的順序成為重要因素，因為不相容的抗原或佐劑的混合可能導致最終產品非所欲的物理外觀(例如額外的沉澱物和難以再懸浮)，進一步導致無法接受的最終組合疫苗產品[參考Malecker et al 1996, "Factors affecting the ability of experimental vaccines to protect guinea pigs against lethal challenge with Diphtheria Toxin"; presented at WHO/IABS/NIBSC International meeting on the control and standardization of Acellular pertussis Vaccines, UK, Sep 26-27 1996]。

目前已知且可用的組合疫苗可能不包含適當免疫原形式的適當抗原的適當製劑，以在易感人群中實現期望水準的效力和免疫原性，以在一次注射中針對多種疾病。最重要的是，沒有具有劑量減少的IPV (IPV)、廣泛交叉保護的IRV和全細胞型百日咳(wP)的多價組合是可商購的。鑒於上面討論的關於組合疫苗的情況，仍然明顯需要適用於開發中國家的可負擔的全液體多價組合疫苗，其為缺乏抗原性干擾的各個抗原提供等同或改進的血清保護作用。

本發明涉及包含抗原混合物之穩定的免疫原性組合疫苗，其用於防治和預防由輪狀病毒、小兒麻痺病毒、流感嗜血桿菌、白喉桿菌、破傷風梭菌、百日咳博德氏桿菌和B型肝炎病毒引起的感染。本發明特別提供了一種多價組合疫苗，其包含i)顯著劑量減少的沙克IPV或沙賓IPV (IPV)抗原，其係藉由利用改良的甲醛滅活和氫氧化鋁吸附的方法製備，導致D-抗原的最大回收，和ii)獲自輪狀病毒(CDC-9)病毒株之可注射的熱滅活輪狀病毒抗原，其提供針對人類輪狀病毒株的廣泛的交叉保護性免疫，iii)具有改良之穩定性和免疫原性的Hib PRP-載體蛋白結合物，其中所述Hib PRP-載體蛋白結合物最初是藉由使用新穎結合方法製備，並隨後在穩定劑存在下在低溫混合以最小化游離PRP釋放，iv)具有改良之免疫原性和穩定性的全細胞型百日咳抗原，其係藉由在混合後期添加全細胞型百日咳抗原獲得，從而最小化基於水解的降解，v)藉由使用凝膠滲透層析除去非所欲之聚集體而獲得的白喉類毒素和破傷風類毒素的均質級分(homogenous fractions)。本發明亦揭露製備這種穩定且具免疫原性的疫苗組合物的方法，其係藉由i)各別將劑量減少的IPV、IRV抗原吸附在氫氧化鋁上並保持其他抗原不吸附或吸附在磷酸鋁或氫氧化鋁、或兩者的組合上，以及ii)在混合期間使用特定的順序添加抗原。此外，本發明提供適用於開發中國家的可負擔的組合疫苗，其為缺乏抗原性干擾的各別抗原提供等同或改良之血清保護。

本發明係關於多價組合疫苗，其包含(i)選自沙賓或沙克病毒株的劑量減少的滅活小兒麻痺病毒疫苗；(ii)可注射之熱滅活輪狀病毒CDC-9病毒株；以及(iii)任選地，一種或多種選自以下的抗原：D、T、wP、HBsAg、Hib PRP-載體蛋白結合物、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis) A抗原、腦膜炎雙球菌C抗原、腦膜炎雙球菌W-135抗原、腦膜炎雙球菌Y抗原、腦膜炎雙球菌X抗原、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、腦膜炎雙球菌B小泡(bleb)或純化抗原、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、炭疽、BCG、A型肝炎抗原、B型肝炎抗原、人類乳突病毒、傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)抗原、非細胞型百日咳、經修飾的腺苷酸環化酶、瘧疾抗原(RTS,S)、麻疹、腮腺炎、風疹、登革熱、茲卡(Zika)、伊波拉(Ebola)、屈公熱(Chikungunya)、日本腦炎(Japanese encephalitis)、腹瀉抗原等。組合疫苗組合物的組分： •滅活的小兒麻痺病毒

小兒麻痺(Polio)(小兒麻痺症(Poliomyelitis))是一種高度傳染性的病毒。小兒麻痺病毒侵入神經系統，並能在數小時內引起不可逆轉的麻痺。全球存在三種類型的小兒麻痺病毒，即第1型、第2型和第3型。

本發明的第一實施方案包括在TRIS緩衝劑存在下藉由甲醛滅活小兒麻痺病毒(沙克或沙賓病毒株)的改良之方法，其導致D-抗原的最大回收。隨後在氫氧化鋁上吸附所述IPV提供了顯著劑量減少的IPV組合物。本發明提供了福馬林滅活和氫氧化鋁吸附的改良之方法，其中D-抗原滅活後的回收在50-80％的範圍內，並且氫氧化鋁的吸附百分比在70-99％的範圍內。

在第一實施方案的一方面中，CCL81-VERO (猴腎)細胞係用作宿主細胞用於生長小兒麻痺病毒，即沙賓和沙克病毒株。用所欲的小兒麻痺病毒株感染宿主細胞並孵育72小時後，合併含有病毒和細胞碎片的培養基並收集在單個容器中。

在第一實施方案的第二方面中，對收穫物進行一系列過濾(6 μ和0.45 μ組件(assembly))；並將濾液收集在玻璃容器中。將濾液用100kDa匣進行切向流過濾；使用磷酸鹽緩衝劑滲濾並使用陰離子交換層析純化。

在第一實施方案的第三方面中，用TFF系統(100k Da，0.1 m² )將純化的病毒庫(pool)進一步從磷酸鹽緩衝劑到Tris緩衝劑(30到50mM，pH：7到7.5)進行緩衝劑交換，然後加入M-199和0.1-1.0％甘胺酸。

在第一實施方案的第四方面中，將Tris緩衝劑中的純化病毒庫用0.01-1.0％福馬林滅活並連續攪拌病毒原液，並在環境溫度下孵育13天，在第7天進行中間過濾。此外，將滅活的原液進行最終過濾並然後儲存於2-8℃。

在第一實施方案的第五方面中，將最終純化的原液在Al(OH)₃ 上進行吸附，其中最終的明礬(Alum)(Al³⁺ )濃度為0.1-1.5 mg/劑，使用M-199 + 0.5％甘胺酸填充體積並且使用1N HCl/NaOH將pH調節至6-7，進一步在2-8℃攪拌過夜。

本案發明人出人意料之外地觀察到甲醛滅活後的D-抗原損失是由於磷酸鹽緩衝劑的存在意外地引起小兒麻痺病毒非所欲的聚集。本發明提供了在TRIS緩衝劑存在下甲醛滅活的改良方法，從而確保最小的表位修飾並隨後使D-抗原損失最小化。 •滅活的輪狀病毒：

輪狀病毒是全世界幼兒嚴重腹瀉疾病的最常見原因。口服活減毒輪狀病毒疫苗可在國際上獲得；並被認為在預防胃腸道疾病中是安全和有效的。

本發明的第二實施方案包括輪狀病毒的製備、純化和製劑。所述製備具有新穎病毒株(即CDC-9)的可注射之熱滅活輪狀病毒抗原的方法係利用熱滅活和吸附在氫氧化鋁佐劑上。

在第二實施方案的第一方面中，使用Vera細胞(CCL-81)作為宿主細胞培養輪狀病毒，並使用30 μ和2 μ過濾組件使收穫物澄清以除去細胞碎片。

在第二實施方案的第二方面中，用Benzonase (2000-10000單位/升)處理澄清的收穫物，在37℃孵育4小時並連續攪拌。更具體地，所用的benzonase濃度為5000單位/升。

在第二實施方案的第三方面中，使用具有100 kDa匣的'HBSS (Hanks平衡鹽溶液) + 10％山梨糖醇'將Benzonase處理的原液進一步濃縮10X並滲濾4X。

在第二實施方案的第四方面中，滲濾的原液可視情況使用稀釋緩衝劑透析，並使用親和層析進一步純化，較佳使用硫酸纖維素作為管柱層析樹脂。

在第二實施方案的第五方面中，使用改良的輪狀病毒熱滅活方法。該方法快速、簡單且能保持完整性並從而保持輪狀病毒顆粒的抗原性。用於熱滅活的溫度在60℃至70℃之間的範圍內；並且孵育時間在約10分鐘-24小時的範圍內(包括端點)。較佳地，所述孵育時間在約30分鐘至10小時的範圍內。更佳地，使用60℃加熱5小時滅活純化的CDC-9，兩小時後更換一次容器。將滅活的CDC-9原液儲存在-80℃直至進一步使用。

在第二實施方案的第六方面中，在氫氧化鋁上進行滅活的輪狀病毒抗原的吸附，其中最終的鋁(Al⁺⁺⁺ )濃度為0.2 mg/劑至0.8 mg/劑之間。 •流感嗜血桿菌b PRP-蛋白結合物：

b型流感嗜血桿菌是革蘭氏陰性細菌，其主要在兒童中引起腦膜炎和急性呼吸道感染。b型流感嗜血桿菌的最外層結構由多核糖基-核糖醇-磷酸(PRP)組成，PRP是一種負責毒力和免疫力的多糖。PRP是半抗原，其在性質上被認為免疫原性不良，因此PRP與載體蛋白共價連接以產生高免疫原性Hib抗原。該過程將多糖從T非依賴性抗原改變為T依賴性抗原並且極大地改良了免疫原性，特別是在幼兒中。

本發明的第三實施方案包括製備Hib PRP-蛋白質結合物。可以注意到，用於結合Hib抗原的載體蛋白可以選自以下：CRM₁₉₇ (交叉反應材料197，遺傳解毒形式的白喉類毒素)、白喉類毒素、腦膜炎雙球菌外膜複合物、破傷風類毒素片段C、百日咳類毒素、流感嗜血桿菌蛋白D、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、和來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A、外膜複合物c (OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺炎球菌表面黏附素A (PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽桿菌(Baccillus anthracis)的保護性抗原(PA)和炭疽桿菌的解毒水腫因子(EF)和致死因子(LF)、卵白蛋白、匙孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、人類血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和結核菌素(PPD)的純化蛋白衍生物、合成肽、熱休克蛋白、百日咳蛋白、細胞素、淋巴激素、激素、生長因子、包含來自多種病原體衍生的抗原(例如N19)的多種人類CD4+ T細胞表位的人工蛋白、鐵攝取蛋白、來自艱難梭狀芽孢桿菌(C. difficile) 的毒素A或B和無乳鏈球菌(S.agalactiae)蛋白或其任何等同物。較佳地，結合物中的載體蛋白選自TT或CRM₁₉₇ 。

在第三實施方案的第一方面中，Hib抗原衍生自B型流感嗜血桿菌菌株的莢膜多糖。為了產生PRP多糖，b型流感嗜血桿菌細菌在一定溫度、攪拌和光密度等條件下在半合成培養基中生長。PRP是外膜結合多糖，在攪拌條件下於發酵過程中釋放到培養基中。發酵的生物質分離的發酵液含有粗PRP，其藉由使用洗滌劑N,N,N-三甲基-1-十六烷基溴化銨進行沉澱來再次純化，然後進行乙醇梯度沉澱和過濾。測試最終純化的PRP多糖是否符合根據WHO、BP、EP、IP等對諸如內毒素、核酸和蛋白質之規格。

在第三實施方案的第二方面中，藉由多糖(PRP)與載體蛋白的偶聯製備多糖-蛋白質結合物。使用結合方法將Hib PRP與載體蛋白結合，所述結合方法包括以下步驟：使用鹼性緩衝劑解聚合PRP以獲得尺寸減小之PRP；用氰化劑如CDAP (1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽)處理以形成氰酸酯；將活化的氰基化多糖與載體蛋白的胺基偶聯；使用超過濾純化最終的結合物。

更佳地，選擇以1：1.5：1比例的反應物(即PRP、CDAP和CRM197)最佳輸入比例用於結合反應。在結合期間，使用鹼性緩衝劑(0.4M Carb-Bicarbonate緩衝劑，pH 10.5±0.1)使純化的PRP多糖解聚合，以獲得尺寸減小的PRP。使用CDAP (1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽)化學處理尺寸減小的PRP進行氰基化以形成氰酸酯。活化的氰基化多糖直接與載體蛋白CRM₁₉₇ 上的胺基偶聯。藉由使用HPLC的離線測試確認Hib結合物的轉化程度。藉由達到所欲的結合物轉化量來淬滅結合反應，其中Hib結合物的轉化規格不低於65％，並且隨後藉由加入甘胺酸(2M)中和結合物反應。將Hib PRP-CRM₁₉₇ 結合物在超過濾膜過濾器(300kDa和100kDa)上進一步純化以去除非反應性試劑和副產物。將最終的結合物原液以0.22 μm過濾並儲存於2-8℃。

在第三實施方案的第三方面中，Hib PRP與載體蛋白結合，其中糖：蛋白質比率(w/w)在0.4和1之間；並且最終Hib PRP-蛋白質結合物原液中的游離PRP含量不超過5％，更佳小於2％。 •白喉類毒素(D)

白喉是一種由細菌白喉桿菌引起的傳染病，主要感染喉嚨和上呼吸道，並產生影響其他器官的毒素。白喉毒素是由白喉桿菌分泌的外毒素，具有抗原特性並且在性質上是有毒的。為了降低毒性，藉由使毒素滅活將毒素轉化為滅活類毒素。滅活方法可選自一種或多種用熱、UV、福馬林/甲醛、乙醯氮丙啶等的處理。為了增加免疫原性，類毒素被吸附到佐劑上。由此形成的類毒素能夠誘導針對白喉桿菌的抗毒素抗體。二聚體的存在可導致不良反應。

在本發明的第四實施方案中，製備了白喉類毒素。

在第四實施方案的第一方面中，白喉毒素(外毒素)從白喉桿菌獲得並使用合適的滅活劑解毒。合適的滅活劑的實例包括甲醛。

在第四實施方案的第二方面中，使用凝膠過濾層析純化獲得的白喉類毒素，所述凝膠過濾層析以Sephacryl S-300HR作為樹脂，線性流速為2-5 ml/min。由此獲得的純化的D包含不具非所欲的聚集體的均質級分(參見圖1)，其中至少80-90％的單體白喉類毒素進一步用於多價疫苗的製劑。另外的PLgel、Sephacryl S-200HR、Sephadex、Bio-Gel(交聯聚丙烯醯胺)、瓊脂糖凝膠和/或Styragel也可用於使用凝膠滲透層析純化的目的。

在第四實施方案的第三方面中，白喉類毒素被吸附在一種或多種鋁鹽上，所述鋁鹽包括氫氧化鋁和磷酸鋁，較佳在磷酸鋁上。 •破傷風類毒素(T)

破傷風是由細菌破傷風梭菌(C. tetani)的產毒菌株引起的急性傳染病，所述破傷風梭菌是一種革蘭氏陽性、孢子形成的、嚴格厭氧的細菌。破傷風毒素是破傷風梭菌分泌的外毒素，具有抗原特性並且在性質上是有毒的。為了降低毒性，藉由使毒素滅活將毒素轉化為滅活類毒素。滅活方法可以選自一種或多種用熱、UV、福馬林/甲醛、乙炔亞胺等的處理。為了增加免疫原性，類毒素被吸附到佐劑上。由此形成的類毒素能夠誘導針對破傷風梭菌的抗毒素抗體。二聚體的存在可導致不良反應。 在本發明的第五實施方案中，製備了破傷風類毒素。

在第五實施方案的第一方面中，破傷風毒素是從破傷風梭菌中獲得，並使用合適的滅活劑進行解毒。合適的滅活劑的實例包括甲醛。

在第五實施方案的第二方面中，使用凝膠過濾層析純化獲得的破傷風類毒素，所述凝膠過濾層析以Sephacryl S-300HR作為樹脂，線性流速為2-5 ml/min。由此獲得的純化T是不含非所欲的聚集體的均質級分，其中至少80-90％的單體破傷風類毒素進一步用於多價疫苗的製劑。另外的PLgel、Sephacryl S-200HR、Sephadex、Bio-Gel(交聯聚丙烯醯胺)、瓊脂糖凝膠和Styragel也可用於使用凝膠滲透層析純化的目的。 在第四實施方案的第三方面中，破傷風類毒素被吸附在一種或多種鋁鹽上，所述鋁鹽包括氫氧化鋁和磷酸鋁，較佳在磷酸鋁上。 •百日咳抗原

百日咳(頓咳)是由百日咳博德氏桿菌引起的，這是一種小的革蘭氏陰性球菌，其感染人體呼吸道的黏膜層。使用中的疫苗有兩種形式，全細胞型百日咳疫苗(wP)和非細胞型百日咳疫苗(aP)。全細胞型百日咳疫苗是通常用福馬林滅活的整個百日咳博德氏桿菌生物體的懸浮液。用wP疫苗進行免疫相對便宜且高效。此外，組合疫苗中wP的存在充當許多其他抗原組分的佐劑。

非細胞型百日咳(aP)疫苗含有百日咳博德氏桿菌的純化組分(例如滅活的百日咳毒素)，其單獨或與其他百日咳博德氏桿菌組分(如絲狀血球凝集素、菌毛抗原、百日咳桿菌黏附素和經修飾的腺苷酸環化酶)組合。與wP疫苗相比，非細胞型百日咳疫苗提供較少的不良反應。 在本發明的第六實施方案中，百日咳疫苗是選自全細胞型百日咳或非細胞型百日咳中的一種或多種的百日咳抗原。

在第六實施方案的第一方面中，百日咳疫苗是非細胞型百日咳抗原，其選自絲狀血球凝集素、菌毛抗原、百日咳桿菌黏附素和經修飾的腺苷酸環化酶中的一種或多種。可以使用重組DNA技術在合適的宿主中表現非細胞型百日咳抗原。

在第六實施方案的第二方面中，百日咳疫苗是全細胞型百日咳，其包含特定比例的百日咳博德氏桿菌菌株134、509、25525和6229，並隨後藉由利用不含硫柳汞的改良之滅活方法滅活；因此導致反應原性降低和效力增加。較佳地，wP抗原由百日咳博德氏桿菌菌株134、509、25525和6229以1：1：0.25：0.25的比例混合製成。

在第六實施方案的第三方面中，wP滅活方法包括在甲醛存在下在56±2℃熱滅活10至15分鐘；其中wP原液保持非塊狀並且容易均質化，從而導致反應原性降低並且在更長的期間內提供更好的wP效力。 •B型肝炎表面抗原(HBsAg)

B型肝炎是由B型肝炎病毒(HBV)引起的具潛在生命威脅的肝臟感染。B型肝炎表面抗原(HBsAg)是一種表面蛋白，亦作為高效疫苗中的免疫原用於預防HBV感染。HBsAg蛋白能在合適的宿主微生物中重組表現；或者能從慢性B型肝炎患者/帶原者的血漿中單離出來。

在本發明的第七實施方案中，製備了B型肝炎表面抗原(HBsAg)。

在第七實施方案的一方面中，使用重組DNA技術在多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)酵母菌細胞中表達HBsAg。其他酵母菌如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)也可用作宿主細胞，用於重組表達HBsAg。

在第七實施方案的一方面中，B型肝炎抗原(HBsAg)吸附在一種或多種鋁鹽上，所述鋁鹽包括氫氧化鋁和磷酸鋁，較佳在磷酸鋁上。二價組合疫苗組合物及其製備方法

在本發明的第八實施方案中，多價疫苗是全液體二價組合疫苗。二價組合疫苗包含滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒；和滅活的輪狀病毒(IRV)。

在第八實施方案的第一方面中，滅活的小兒麻痺病毒選自沙克和沙賓病毒株之群組；且基於沙克或沙賓病毒株的IPV，其沙賓或沙克病毒株之第1型、第2型和第3型的各濃度不超過20D抗原單位。

在第八實施方案的第二方面中，滅活的小兒麻痺病毒是沙克病毒株，並且基於沙克病毒株的IPV，其沙克病毒株第1型、第2型或第3型的各濃度選自以下的劑量組合物：7.5-16-10、8-2-5、10-2-5、10-2-10、10-2-12、10-2-16、7.5-16-10、5-2-5 D抗原單位；更具體地，基於沙克病毒株的IPV，其沙克病毒株第1型、第2型或第3型的各濃度選自8-2-5和10-2-10 D抗原單位。

在第八實施方案的第三方面中，滅活的小兒麻痺病毒是沙賓病毒株，並且基於沙賓病毒株的IPV，其沙賓病毒株第1型、第2型和第3型的各濃度選自以下的劑量組合物：5-16-10、2.5-8-5、5-8-10D抗原單位；更具體地，基於沙賓病毒株的IPV，其沙賓病毒株第1型、第2型和第3型的各濃度為5-16-10D抗原單位。

在第八實施方案的第四方面中，可注射之熱滅活輪狀病毒(IRV)是輪狀病毒CDC-9或CDC-66病毒株，並且IRV的濃度在5-50 μg/劑的範圍內，更具體地IRV的濃度是10 μg/劑。

在第八實施方案的第五方面中，藉由將IPV (沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在一種或多種包括氫氧化鋁和磷酸鋁之鋁鹽上，較佳在氫氧化鋁上，以製備二價組合物。將各個單價吸附的IPV和IRV原液進一步混合在一起，並在2-8℃於震震盪器上保持1-4小時。六價組合疫苗組合物及其製備方法

在本發明的第九實施方案中，全液體六價(DTwP-IPV-IRV-Hib)疫苗製劑如下製備： a)將IPV(沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6。 b)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5，加入T並在室溫攪拌混合18-24小時。 c)將步驟a和b中獲得的溶液混合，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘。 d)將wP抗原和組胺酸加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘並在2-8℃靜置條件下放置過夜。 e)在2-8℃將Hib PRP結合物和2-苯氧基乙醇(2-PE)加入到步驟d獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6。 f)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟e獲得的混合物中，然後攪拌2小時。

在本發明的第十實施方案中，多價疫苗組合物是全液體六價疫苗製劑。全液體六價疫苗製劑包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒沙克病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和B型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為2-20 μg PRP含量的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。 在第十實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；TT的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為10D單位、第2型的存在量為2D單位、第3型的存在量為10或16D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg和WFI。

在本發明的第十一實施方案中，多價疫苗組合物是全液體六價疫苗製劑。全液體六價疫苗製劑包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒沙克病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十一實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20D單位的範圍、第2型的存在量為1-20D單位的範圍、第3型的存在量為1-20D單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為2-20 μg PRP含量的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十一實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為10D單位、第2型的存在量為2D單位、第3型的存在量為10或16D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM197結合物的量為10 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十二實施方案中，多價疫苗組合物是全液體六價疫苗製劑。全液體六價疫苗製劑包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I型、第Π型和第III型小兒麻痺病毒沙賓病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物和其它賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十二實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十二實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為5D單位、第2型的存在量為16D單位、第3型的存在量為10D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十三實施方案中，多價疫苗組合物是全液體六價疫苗製劑。全液體六價疫苗製劑包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I型、第Π型和第III型小兒麻痺病毒沙賓病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十三實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在於0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十三實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是六價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為5D單位、第2型的存在量為16D單位、第3型的存在量為10D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為10 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。七價組合疫苗組合物及其製備方法

在本發明的第十四實施方案中，七價(DTwP-HBsAg-IPV-IRV-Hib)疫苗製劑如下製備： a)將IPV(沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6。 b)將HBsAg吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至6.0-6.5。 c)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5並加入T。 d)步驟b和c中獲得的溶液，然後在室溫混合攪拌18-24小時。 e)加入上述混合物[如步驟a和d中獲得的]，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘。 f)將wP抗原和組胺酸加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘並在2-8℃靜置條件下放置過夜。 g)在2-8℃將Hib PRP蛋白質結合物和2-PE加入步驟f中獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6。 h)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟g獲得的混合物中，然後攪拌2小時。

在本發明的第十五實施方案中，多價疫苗組合物是全液體七價疫苗製劑。全液體七價疫苗製劑均包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒沙克病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物；B型肝炎表面抗原(HBsAg)和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十五實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的存在量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為5-30 μg的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十五實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為10D單位、第2型的存在量為2D單位、第3型的存在量為10或16D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為5 μg；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為12.5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十六實施方案中，多價疫苗組合物是全液體七價疫苗製劑。全液體七價疫苗製劑均包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒沙克病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物；B型肝炎表面抗原(HBsAg)和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十六實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為5-30 μg的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十六實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為10D單位、第2型的存在量為2D單位、第3型的存在量為10或16D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為10 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為12.5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十七實施方案中，多價疫苗組合物是全液體七價疫苗製劑。全液體七價疫苗製劑均包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I、第II和第III型小兒麻痺病毒沙賓病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；和b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物；B型肝炎表面抗原(HBsAg)和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十七實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為1-20D單位的範圍、第2型的存在量為1-20D單位的範圍、第3型的存在量為1-20D單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為5-30 μg的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十七實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為5D單位、第2型的存在量為16D單位、第3型的存在量為10D單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的量為5 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為12.5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十八實施方案中，多價疫苗組合物是全液體七價疫苗製劑。全液體七價疫苗製劑均包含白喉類毒素(D)；破傷風類毒素(T)；滅活的全細胞型百日咳博德氏桿菌抗原(wP)；滅活的第I型、第II型和第III型小兒麻痺病毒沙賓病毒株；滅活的輪狀病毒(IRV)；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物；B型肝炎表面抗原(HBsAg)和其他賦形劑如基於鋁的佐劑(磷酸鋁、氫氧化鋁)、2-苯氧基乙醇、L-組胺酸和WFI。

在第十八實施方案的一個較佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒的沙賓病毒株第1型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為5-30 μg的範圍；鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍和WFI。

在第十八實施方案的一個最佳方面，多價疫苗組合物是七價疫苗組合物，其中D的存在量為22.5 Lf；T的存在量為7.5 Lf；wP的存在量為15 IOU；劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為5D抗原單位、第2型的存在量為16D抗原單位、第3型的存在量為10D抗原單位；IRV的存在量為10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的量為10 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為12.5 μg；鋁含量的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為1.55 mg的範圍和WFI。

在本發明的第十九實施方案中，組合疫苗組合物/製劑包含一種或多種選自由以下組成之群組的防腐劑：苄索氯銨(Phemerol)、硫柳汞、苯酚和2-苯氧基乙醇(2-PE)。更佳地，組合疫苗組合物/製劑包含2-苯氧基乙醇(2-PE)作為防腐劑。

在本發明的第二十實施方案中，組合疫苗組合物/製劑含有一種或多種藥學上可接受的賦形劑，所述賦形劑選自由以下所組成之群組：糖和多元醇、表面活性劑、聚合物、鹽、胺基酸、pH調節劑等。

在第二十實施方案的第一方面中，糖和多元醇包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘油等。在第二十實施方案的第二方面中，表面活性劑包括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等。在第二十實施方案的第三方面中，聚合物包括葡聚糖、羧甲基纖維素、透明質酸、環糊精等。鹽的實例可包括NaCl、MgCl₂ 、KCl、CaCl₂ 等。在第二十實施方案的第四方面中，胺基酸包括精胺酸、甘胺酸、組胺酸等。在第二十實施方案的第五方面中，pH調節劑包括氫氧化鈉、鹽酸等。

在本發明的第二十一實施方案中，最終組合疫苗組合物/製劑的pH在pH 6.0至pH 7.5的範圍內；更佳在pH 6.2至pH 7.2的範圍內；並且最佳在pH 6.4至pH 6.6的範圍內。實施例 實施例 1 ：劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒 ( 沙克 / 沙賓 ) 抗原的製備

印度血清研究所 (Serum Institute of India) 根據以下方案已開發滅活的小兒麻痺病毒的滅活和吸附： •CCL81-VERO(猴腎)細胞用作宿主細胞，用於生長小兒麻痺病毒(即沙賓和沙克病毒株)。 •IPV的純化 •使用具有100 KDa匣(0.5 m2)的切向流過濾系統將澄清化的收穫庫濃縮至10X，並且隨後用收穫體積3倍的磷酸鹽緩衝劑(40 mM，pH:7.0)滲濾。 •濃縮物藉由離子交換層析(IEC)純化。使用Akta explorer (GE Healthcare)將10X TFF濃縮物通過填充在管柱xk-26中的DEAE Sepharose快速流(弱陰離子交換器)。帶負電荷的雜質與管柱結合，而小兒麻痺病毒磷酸鹽緩衝劑40 mM而被收集於流出物(flow through)。 •為了在頗為繁複之滅活過程(13天)中使抗原損失最小化，將純化的病毒庫用TFF系統[100 KDa，0.1 m2)從磷酸鹽緩衝劑緩衝交換至TRIS緩衝劑(40 mM，pH：7)。將純化的病毒庫與三倍體積的tris緩衝劑交換。 •IPV的滅活 •加入含有0.5％甘胺酸的10X濃縮M-199，以達到最終濃度1X。將滅活劑福馬林(0.025％)加入到純化的病毒原液中，同時恒定混合。滅活在37℃進行同時連續攪拌13天，包括在第7天和第13天進行0.22u過濾。結果和結論

當甲醛滅活方法特別在磷酸鹽緩衝劑存在下進行時，觀察到沙賓和沙克病毒株顯著的D-抗原損失，而發現在TRIS緩衝劑存在下進行甲醛滅活導致D-抗原的最小損失。

	D-抗原含量(滅活期間40 mM磷酸鹽緩衝劑)	D-抗原含量(滅活期間40 mM Tris緩衝劑)
第I型	52.70 DU/ml	408.19 DU/ml
第II型	22.63 DU/ml	180.20 DU/ml
第III型	4.21 DU/ml	21.50 DU/ml

實施例 2 ：可注射之熱滅活輪狀病毒 (IRV) 抗原的製備

使用2010年5月12日申請，名稱為“New Human Rotavirus Strains and Vaccinea”的PCT專利申請案PCT/US2010/034537；及2008年9月4日申請，名稱為“Thermal Inactivation of Rotavirus”的PCT專利申請案PCT/US2008/075239所揭露之輪狀病毒株(CDC-9)。

疾病管制中心(Centers for Disease Control，CDC)已開發了一種輪狀病毒滅活方法。CDC亦已開發了用於測試輪狀病毒特異性IgG和中和抗體的測定。

•使用Vero細胞(CCL-81)作為宿主細胞培養輪狀病毒(CDC-9病毒株)，並使用30+2 μ過濾器澄清化收穫物以除去細胞碎片。

•用Benzonase (5000單位每升)處理澄清的收穫物，在37℃連續攪拌孵育4小時。

•以100KDa匣使用'HBSS (Hanks平衡鹽溶液) + 10％山梨糖醇'和將Benzonase處理的原液進一步10X濃縮並進行4X滲濾。

•使用稀釋緩衝劑透析滲濾的原液，並使用親和層析(cellufine硫酸樹脂)進一步純化。

•使用60℃加熱5小時進行純化的CDC-9的滅活，兩小時後更換一次容器。將滅活的CDC-9原液儲存在-80℃直至進一步使用。實施例 3 ：白喉類毒素的純化

使用凝膠過濾層析純化白喉類毒素，方法參數設定如下：表 1 ：方法參數

Sr. No.	參數	細節
1	使用的原始原液(Native Bulk)D	--
2	藉由Lowry測定的含量(原始原液D)	11mg/ml
3	LF/ml	3000
4	純化方法	凝膠過濾層析(GFC)
5	樹脂	Sephacryl S-300 HR
6	使用的管柱	XK 26/70cm
7	管柱填充床高度	~50cm
8	線性流速	1-3 ml/min
9	樣品(D)填載	總柱床體積的4%
10	級分(fraction)收集	每份5ml (2min)
11	分析	Lowry測定、LF估計、%單體

合併No 6至11級分並分析單體含量(參見圖1)。結果與解釋：

使用上述相同參數進行多次運行。CRM₁₉₇ 原液濃縮物用作標記物以比較％單體含量。單體CRM₁₉₇ 能被認為是最純淨形式的DT。發現單體含量百分比在80-90％的範圍內。表 2 ：獲得的純化 DT 的 % 回收和單體含量

Sr. No.	樣品	蛋白質濃度(mg/ml)	%單體	%回收
1	原始(Native) DT	--	67.19	--
2	原始(Native) CRM	--	86.96	--
3	GFC DT FR 8	2.03	83.21	注射的DT量 120mg    獲得的量 75.1mg (62.5%)
4	GFC DT FR 9	3.38	87.15
5	GFC DT FR 10	4.08	87.24
6	GFC DT FR 11	3.52	86.60
7	GFC DT FR 12	2.01	89.97
8	GFC DT FR 10-11	3.83	86.03	31.6%
9	GFC DT FR 9-12	2.96	87.42	48.9%
10	GFC DT FR 7-13	2.19	86.24	63.3%

實施例 4 ：破傷風類毒素的純化

使用凝膠過濾層析/HIC (苯基瓊脂糖)純化破傷風類毒素，其方法參數設定如下：表 3 ：方法參數

Sr. No.	參數	細節
1	使用的原始原液T	--
2	通過Lowry測定的含量(原始原液T)	11 mg/ml
3	LF/ml	3000
4	純化方法	凝膠過濾層析(GFC)
5	樹脂	Sephacryl S-300 HR
6	使用的管柱	XK 26/70cm
7	管柱填充床高度	~50cm
8	線性流速	1-3 ml/min
9	樣品(T)填載	總柱床體積的4%
10	級分收集	每份5ml (2min)
11	分析	Lowry測定、LF估計、%單體

結果：

使用上述相同參數進行多次運行。發現單體含量百分比在80-90％的範圍內。實施例 5 ： Hib PRP- 蛋白質結合物的製備

PRP多糖如下產生： b型流感嗜血桿菌細菌在一定溫度、攪拌和光密度等條件下在半合成培養基中生長。PRP是外膜結合多糖，在攪拌條件下於發酵過程中釋放到培養基中。發酵的生物質分離的發酵液含有粗PRP，其使用洗滌劑N,N,N-三甲基-1-十六烷基銨溴化物進行沉澱來再次純化，然後進行乙醇梯度沉澱和過濾。測試最終純化的PRP多糖是否符合根據WHO、BP、EP、IP等對諸如內毒素、核酸和蛋白質之規格。

Hib PRP-蛋白質結合物如下製備： 藉由將PRP多糖與CRM₁₉₇ 載體蛋白偶聯來製備多糖結合物。選擇以1：1.5：1比例的反應物(即PRP多糖、CDAP和CRM₁₉₇ )的輸入比例用於結合反應。在結合期間，使用鹼性緩衝劑(0.4M Carb-Bicarbonate緩衝劑，pH 10.5±0.1)使純化的PRP多糖解聚合，以獲得尺寸減小的PRP。使用CDAP (1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽)化學處理尺寸減小的PRP進行氰基化以形成氰酸酯。活化的氰基化多糖可因此與載體蛋白CRM₁₉₇ 上的胺基直接偶聯。藉由HPLC確認Hib結合物的轉化程度。藉由達到所欲之結合物轉化量來淬滅結合反應，其中Hib結合物的轉化規格不低於65％，隨後藉由添加甘胺酸(2M)中和結合物反應。Hib PRP-CRM₁₉₇ 結合物在超過濾膜過濾器(300kDa和100kDa)上純化，以去除非反應性試劑和副產物。將最終的結合物原液以0.22 μm過濾並儲存於2-8℃。

獲得的Hib PRP-CRM₁₉₇ 結合物抗原的品質特徵如下：

PRP含量(mg/ml):	1.49
蛋白質含量(mg/ml) :	2.98
比例(Ps:蛋白質) :	0.52
游離PRP (%):	1.77
PMW (kD) :	983
平均MW (kD) :	752

實施例 6 ：二價 (IPV-IRV 疫苗 ) 組合物

印度血清研究所 根據以下方案已開發了包含劑量減少的滅活的小兒麻痺病毒和滅活的輪狀病毒的二價組合物： 二價疫苗的組合物如下表 4 二價組合物

組分	二價疫苗 組合物I ( 沙克IPV+IRV)	二價疫苗 組合物II ( 沙克IPV+IRV)	二價疫苗 組合物III ( 沙克IPV+IRV)	二價疫苗 組合物IV ( 沙賓IPV+IRV)
抗原含量-IPV	第1型：≥ 8DU/劑 第2型：≥ 2DU/劑 第3型：≥ 5DU/劑	第1型：≥10DU/劑 第2型：≥ 2DU/劑 第3型：≥10DU/劑	第1型：≥10DU/劑 第2型：≥ 2DU/劑 第3型：≥16DU/劑	第1型：≥ 5DU/劑 第2型：≥16DU/劑 第3型：≥10DU/劑
抗原含量-IRV	總蛋白質≥10mcg/劑	總蛋白質≥10mcg/劑	總蛋白質≥10mcg/劑	總蛋白質≥10mcg/劑
明礬(Alum)	0.8mg/劑	0.8mg/劑	0.8mg/劑	0.8mg/劑

實施例 7 ：二價 (IPV-IRV) 疫苗的製備

二價(IPV-IRV)疫苗是按照以下方法製備： •IPV 的吸附 ·在容器中取所欲體積的Al(OH)₃ 。 ·加入所欲體積的單價沙克/沙賓IPV原液並用稀釋劑製成最終體積 ·用1N NaOH/1N HCl將最終製劑pH調節至6.5。 ·將單價製劑原液保持在磁力攪拌器/震盪器上於2-8℃過夜。 •IRV 的吸附 ·在容器中取所欲體積的Al(OH)₃ 。 ·加入所欲體積的IRV原液，並用稀釋劑製成最終體積。 ·用1N NaOH/1N HCl將最終製劑pH調節至6.5。 ·將單價製劑原液保持在磁力攪拌器/震盪器上於2-8℃過夜。•二價 (EPV-IRV) 疫苗的配製 ·混合IPV和IRV製劑的單價原液。 ·在震盪器上於2-8°C保持2小時。 ·將最終製劑儲存在2-8°C直至進一步使用。實施例 8 ：二價疫苗的效力測試

使用微中和測定測試血清樣品針對小兒麻痺病毒沙賓第1、第2和第3型以及輪狀病毒株Wa的中和抗體來檢測二價疫苗的效力。以log2格式報告針對小兒麻痺病毒的中和滴定量。中和滴定量為2.5被認為是陰性。對於輪狀病毒，中和滴定量＜20被認為是陰性的。表 5

	樣品ID	沙賓1	沙賓2	沙賓3	IRV (Wa)
		D0	D42	D0	D42	D0	D42	D0	D42
沙克8-2-5+IRV 10ug	7A	2.5	6.17	2.5	10.5	2.5	7.83	＜20	320
7B	2.5	4.5	2.5	7.17	2.5	2.5	＜20	1280
8A	2.5	7.83	2.5	9.5	2.5	8.83	＜20	320
8B	2.5	8.5	2.5	10.5	2.5	6.5	＜20	160
沙克5-2-5+IRV 10ug	9A	2.5	5.5	2.5	10.5	2.5	3.5	＜20	640
9B	2.5	2.5	2.5	8.83	2.5	5.83	＜20	640
沙賓5-16-10+IRV 10ug	10A	2.5	7.5	2.5	9.5	2.5	6.5	＜20	640
10B	2.5	10.5	2.5	10.5	2.5	10.5	＜20	320
11A	2.5	10.5	2.5	10.5	2.5	10.5	＜20	640
11B	2.5	10.5	2.5	10.5	2.5	9.17	＜20	640
沙賓2.5-8-5+IRV 10ug	12A	2.5	10.5	2.5	10.5	2.5	8.83	＜20	320
12B	2.5	10.5	2.5	10.5	2.5	8.17	＜20	80
活輪狀病毒 (Rota Live) (Log 5.5 FFU)	15A	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	＜20	320
15B	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	＜20	640
陰性	17A	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	＜20	＜20
17B	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	＜20	＜20
	對照	6.5		4.83		4.17		＜20(陰性對照)
		6.5		5.17		4.5		160(陽性對照1)
		6.17		5.5		4.5		1280(陽性對照2)
		5.83		4.5		5.5
A欄中的數字(例如8-2-5)分別表示小兒麻痺第1-2-3型的D抗原單位。每隻豚鼠(7A至12B)在第1天、第14天和第28天接受三劑量的含有IPV和10 ug滅活的輪狀病毒抗原(IRV)的組合疫苗，並在第42天收集血清樣品。豚鼠第15A和15B接受三劑量的活輪狀病毒(log 5.5 FFU或10ug)作為陽性對照。在陰性對照組(17A和17B)中，使用僅含有明礬(Alum)而不含任何抗原的的製劑用於免疫。

表 6

用於三價沙克+Rota 1 劑量和2 劑量的SNT
第7 組：沙克+Rota 8-2-5		第8 組：沙克+Rota 8-2-5		第9 組：沙克+Rota 5-2-5
(1 劑量)	(2 劑量)	(2 劑量)
大鼠No	第1型	第2型	第3型		大鼠No	第1型	第2型	第3型		大鼠 No	第1型	第2型	第3型
1	2	7	7		1	10	8	11		1	3	9	12
2	3	7	9		2	7	8	10		2	7	6	12
3	4	7	8		3	7	7	7		3	7	8	10
4	4	6	10		4	10	7	10		4	11	9	8
5	0	7	8		5	9	7	12		5	5	6	10
6	0	9	10		6	5	8	9		6	10	9	12
7	5	7	10		7	5	6	10		7	6	6	12
8	8	9	6		8	10	8	11		8	2	10	12
9	4	8	5		9	6	9	11		9	9	9	10
10	6	8	10		10	7	9	10		10	5	NS	NS

表7

用於三價沙賓+Rota 1 劑量和2 劑量的SNT
第10 組：沙賓+Rota 8-2-5		第11 組：沙賓+Rota 8-2-5		第12 組：沙賓+Rota 5-2-5
(1 劑量)	(2 劑量)	(2 劑量)
大鼠No	第1型	第2型	第3型		大鼠No	第1型	第2型	第3型		大鼠No	第1型	第2型	第3型
1	7	4	11	1	8	7	12	1	5	4	11
2	10	5	11	2	5	7	NS	2	7	2	12
3	7	3	10	3	8	4	12	3	6	6	9
4	8	5	11	4	6	7	12	4	6	8	9
5	7	4	11	5	8	7	12	5	7	5	8
6	8	4	11	6	8	7	12	6	5	6	12
7	6	3	12	7	8	4	10	7	8	6	10
8	11	5	12	8	7	4	11	8	8	6	11
9	7	7	10	9	8	4	12	9	10	7	12
10	9	4	12	10	6	3	10	10	NS	NS	NS

第13組：市售沙克(1劑量)		第14組：市售沙克(2劑量)		第16組
陰性對照
大鼠No	第1型	第2型	第3型	大鼠No	第1型	第2型	第3型	大鼠No	第1型	第2型	第3型
1	4	7	2	1	6	7	NS	1	0	0	0
2	0	4	6	2	3	8	11	2	0	0	0
3	0	6	5	3	1	7	8	3	0	0	0
4	4	8	9	4	7	8	9	4	0	0	0
5	0	7	3	5	2	5	7	5	0	0	0
6	3	6	3	6	7	8	10	6	0	0	0
7	3	6	6	7	7	6	9	7	0	0	0
8	0	4	6	8	12	7	9	8	0	0	0
9	5	8	5	9	10	9	11	9	0	0	0
10	0	4	5	10	5	8	7	10	0	0	0

結果和解釋： 1.與第0天相比，二價疫苗(IPV + IRV)在第42天產生顯著更高的血清轉化。 2.與市售IPV相比，在SIIL開發的具有5:16:10 DU和明礬(alum)的單劑量的三價沙賓IPV產生更好的血清轉化。 3.與市售IPV相比，在SIIL開發的具有2.5：8：5 DU與明礬(alum)的雙倍劑量的三價沙賓IPV產生優異的血清轉化。 4.與市售IPV相比，在SIIL配製的具有8:2:5 DU與明礬(alum)的單劑量的三價沙克IPV產生更好的血清轉化。 5.與商業IPV相比，在SIIL配製的具有5:2:5 DU與明礬(alum)的雙倍劑量的三價沙克IPV產生優異的血清轉化。實施例 9 ：包含劑量減少的 IPV 、滅活的輪狀病毒、 D 、 T 、 wP 和 Hib PRP- 蛋白質結合物的六價組合疫苗組合物如下所示： 表 8 ：具有劑量減少的 Salk IPV 的六價製劑 -1

S ．No.	製劑組分	製劑1A	製劑1B	製劑1C	製劑1D	製劑1E	製劑1F	製劑1G	製劑1H
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	10	7.5	8	10	10	7.5	5	10
2	16	2	2	2	16	2	2
10	10	5	5	12	10	5	16
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	10 μg PRP含量
7	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
8	2-苯氧乙醇	3.25 mg
9	L-組胺酸	1.55 mg
10	WFI	q.s.

表 9 ：具有劑量減少的 Salk IPV 的六價製劑 -2

S ．No.	製劑組分	製劑2A	製劑2B	製劑2C	製劑2D	製劑2E	製劑2F	製劑2G	製劑2H
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	10	7.5	8	10	10	7.5	5	10
2	16	2	2	2	16	2	2
10	10	5	5	12	10	5	16
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-TT結合物	5μg PRP含量
7	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
8	2-苯氧乙醇	3.25 mg
9	L-組胺酸	1.55 mg
10	WFI	q.s.

表 10 ：具有劑量減少的沙賓 IPV 的六價製劑 -3

S ．No.	製劑組分	製劑3A	製劑3B	製劑3C
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	5	2.5	5
16	8	8
10	5	10
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	PRP含量10 μg
7	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
8	2-苯氧乙醇	3.25 mg
9	L-組胺酸	1.55 mg
10	WFI	q.s.

表 11 ：具有劑量減少的沙賓 IPV 的六價製劑 -4

S ．No.	製劑組分	製劑4A	製劑4B	製劑4C
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	5	2.5	5
16	8	8
10	5	10
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	5 μg PRP含量
7	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
8	2-苯氧乙醇	3.25 mg
9	L-組胺酸	1.55 mg
10	WFI	q.s.

實施例 10 ：製備包含劑量減少的 IPV 、滅活的輪狀病毒、 D 、 T 、 wP 和 Hib PRP- 蛋白結合物的六價組合疫苗組合物的方法如下： a)將IPV(沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6。 b)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5，加入T並在室溫攪拌混合18-24小時。 c)將步驟a和b中獲得的溶液混合，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘。 d)將wP抗原和組胺酸加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘並在2-8℃靜置條件下放置過夜。 e)在2-8℃將Hib PRP結合物和2-PE加入到步驟d中獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6。 f)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟e中獲得的混合物中，然後攪拌2小時。

藉由使用新穎之結合方法製備並隨後在穩定劑存在下在低溫混合的Hib PRP-載體蛋白結合物顯示出具有最小的游離PRP釋放的更高的穩定性以及改良的免疫原性。此外，在混合的後期添加全細胞型百日咳抗原使基於水解的降解最小化並提供穩定且具免疫原性的wP抗原。實施例 11 ：包含劑量減少的 IPV 、滅活的輪狀病毒、 D 、 T 、 wP 、 HBsAg 和 Hib PRP- 蛋白質結合物的七價組合疫苗組合物如下所示： 表 12 ：具有劑量減少的沙克 IPV 的七價製劑 -5

S ．No.	製劑組分	製劑5A	製劑5B	製劑5C	製劑5D	製劑5E	製劑5F	製劑5G	製劑5H
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	10 2 10	7.5 16 10	8 2 5	10 2 5	10 2 12	7.5 16 10	5 2 5	10 2 16
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	10 μg PRP含量
7	B型肝炎表面抗原(HBsAg)	12.5 μg
8	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
9	2-苯氧乙醇	3.25 mg
10	L-組胺酸	1.55 mg
11	WFI	q.s.

表 13 ：具有劑量減少的沙克 IPV 的七價製劑 -6

S ．No.	製劑組分	製劑6A	製劑6B	製劑6C	製劑6D	製劑6E	製劑6F	製劑6G	製劑6H
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙克病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	10 2 10	7.5 16 10	8 2 5	10 2 5	10 2 12	7.5 16 10	5 2 5	10 2 16
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-TT結合物	5 μg PRP含量
7	B型肝炎表面抗原(HBsAg)	12.5 μg
8	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
9	2-苯氧乙醇	3.25 mg
10	L-組胺酸	1.55 mg
11	WFI	q.s.

表 14 ：具有劑量減少的沙賓 IPV 的七價製劑 -7

S ．No.	製劑組分	製劑7A	製劑7B	製劑7C
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	5 16 10	2.5 8 5	5 8 10
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	10 μg PRP含量
7	B型肝炎表面抗原(HBsAg)	12.5 μg
8	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
9	2-苯氧乙醇	3.25 mg
10	L-組胺酸	1.55 mg
11	WFI	q.s.

表 15 ：具有劑量減少的沙賓 IPV 的七價製劑 -8

S ．No.	製劑組分	製劑8A	製劑8B	製劑8C
1	白喉類毒素(D)	22.5 Lf
2	破傷風類毒素(T)	7.5 Lf
3	滅活的百日咳博德氏桿菌抗原(wP)	15 IOU
4	滅活的小兒麻痺病毒沙賓病毒株 第I型(D抗原單位) 第II型(D抗原單位) 第III型(D抗原單位)	5 16 10	2.5 8 5	5 8 10
5	滅活的輪狀病毒(IRV)	10 μg
6	B型流感嗜血桿菌 PRP-CRM197 結合物	5 μg PRP含量
7	B型肝炎表面抗原(HBsAg)	12.5 μg
8	鋁含量	不超過0.9 mg的Al3+
9	2-苯氧乙醇	3.25 mg
10	L-組胺酸	1.55 mg
11	WFI	q.s.

實施例 12 ：製備包含劑量減少的 IPV 、滅活的輪狀病毒、 D 、 T 、 wP 、 HBsAg 和 Hib PRP- 蛋白質結合物的七價組合疫苗組合物的方法如下： a)將IPV(沙賓/沙克株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6。 b)將HBsAg吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至6.0-6.5。 c)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5並加入T。 d)將步驟b和c中獲得的溶液混合，然後在室溫攪拌混合18-24小時。 e)加入上述混合物[如步驟a和d中獲得的]，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘。 f)將wP抗原和組胺酸加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘並在2-8℃靜置條件下放置過夜。 g)在2-8℃將Hib PRP蛋白質結合物和2-PE加入步驟f中獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6。 h)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟g中獲得的混合物中，然後攪拌2小時。

藉由使用新穎之結合方法製備且隨後在穩定劑存在下在低溫混合的Hib PRP-載體蛋白結合物顯示出具有最小的游離PRP釋放的更高的穩定性以及改良的免疫原性。此外，在混合的後期添加全細胞型百日咳抗原使基於水解的降解最小化並提供穩定且具免疫原性之wP抗原。

圖1：白喉類毒素的凝膠過濾層析Sephacryl S-300 HR，層析柱XK 26/70的純化-層析圖。

Claims (39)

1. 一種組合疫苗，其包含： i) 選自沙克(Salk)或沙賓(Sabin)病毒株之滅活小兒麻痺病毒抗原； ii) 滅活輪狀病毒抗原； iii) 任選地，一種或多種選自由以下所組成之群的抗原：白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞型百日咳、HBsAg、Hib PRP-載體蛋白結合物、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis) A抗原、腦膜炎雙球菌C抗原、腦膜炎雙球菌W-135抗原、腦膜炎雙球菌Y抗原、腦膜炎雙球菌X抗原、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、腦膜炎雙球菌B小泡(bleb)或純化抗原、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、炭疽、BCG、A型肝炎抗原、B型肝炎抗原、人類乳突病毒、傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)抗原、非細胞型百日咳、經修飾的腺苷酸環化酶、瘧疾抗原(RTS,S)、麻疹、腮腺炎、風疹、登革熱、茲卡(Zika)、伊波拉(Ebola)、屈公熱(Chikungunya)、日本腦炎、腹瀉抗原；及 iv) 一種或多種選自鋁鹽的佐劑，例如氫氧化鋁或磷酸鋁， 其中該小兒麻痺病毒抗原是劑量減少的組合物，其具有至少一種選自沙賓第1型、第2型或第3型；或沙克第1型(Mahoney type 1)、第2型(MEF type 2)或第3型(Saukett type 3)之滅活小兒麻痺病毒病毒株。
2. 如請求項1之疫苗，其中該劑量減少的滅活小兒麻痺病毒抗原吸附在具有Al^{3 +} 濃度界於0.1-2.5 mg/劑且至少70％吸附百分比的氫氧化鋁佐劑上。
3. 如請求項2之疫苗，其中該劑量減少的滅活小兒麻痺病毒抗原吸附在具有Al³⁺ 濃度界於0.1-0.7 mg/劑且至少90％吸附百分比的氫氧化鋁佐劑上。
4. 如請求項1之疫苗，其中該劑量減少的滅活小兒麻痺病毒抗原係選自由以下所組成之群： i) 具有選自5-16-10 D-抗原單位之沙賓第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； ii) 具有選自2.5-8-5 D-抗原單位之沙賓第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； iii) 具有選自5-8-10 D-抗原單位之沙賓第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； iv) 具有選自7.5-16-10 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； v) 具有選自8-2-5 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； vi) 具有選自10-2-5 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； vii) 具有選自10-2-10 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； viii) 具有選自10-2-12 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； ix) 具有選自10-2-16 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； x) 具有選自7.5-16-10 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物； xi) 具有選自5-2-5 D-抗原單位之沙克第1型、第2型、第3型組合的劑量組合物。
5. 如請求項1之疫苗，其中該輪狀病毒抗原係選自CDC-9、CDC-66或任何其它滅活輪狀病毒病毒株之可注射的熱滅活輪狀病毒，並且吸附在具有Al^{3 +} 濃度界於0.1-2.5 mg/劑且提供至少70％的吸附百分比的氫氧化鋁佐劑上。
6. 如請求項5之疫苗，其中該輪狀病毒抗原係熱滅活CDC-9輪狀病毒病毒株，並且吸附在具有Al^{3 +} 濃度界於0.1-0.5 mg/劑且提供至少90％的吸附百分比的氫氧化鋁佐劑上。
7. 如請求項1之疫苗，其中該D和T抗原吸附在磷酸鋁佐劑上。
8. 如請求項1之疫苗，其中該D和T係使用凝膠滲透層析以選自由以下所組成之群的樹脂純化：Sephacryl S-300 HR、PLgel、Sephacryl S-200HR、Sephadex、Bio-Gel (交聯之聚丙烯醯胺瓊脂糖凝膠)及Styragel。
9. 如請求項1之疫苗，其中該百日咳抗原是非細胞型抗原，其包含至少一種或多種選自以下的抗原：經修飾的腺苷酸環化酶、百日咳類毒素(PT)、絲狀血球凝集素(FHA)、百日咳桿菌黏附素(P69或PPN)、菌毛蛋白(FTM 1、2和3)。
10. 如請求項1之疫苗，其中該百日咳抗原是滅活全細胞型百日咳，其包含百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis)菌株134、509、25525和6229中的一種或多種。
11. 如請求項1之疫苗，其中Hib抗原是使用氰基化結合化學與載體蛋白結合的Hib PRP多糖，其中該氰基化試劑係選自：1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)、1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸鹽(CPPT)、1-氰基咪唑(即1-CI)、1-氰基苯並三唑(1-CBT)或2-氰基噠嗪-3(2H)酮(2-CPO)；且載體蛋白係選自由以下所組成之群：CRM₁₉₇ 、白喉類毒素、腦膜炎雙球菌外膜複合物、破傷風類毒素片段C、百日咳類毒素、流感嗜血桿菌蛋白D、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST和來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A、外膜複合物c (OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺炎球菌表面黏附素A (PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽桿菌(Baccillus anthracis)的保護性抗原(PA)和炭疽桿菌的解毒水腫因子(EF)和致死因子(LF)、卵白蛋白、匙孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和結核菌素(PPD)的純化蛋白衍生物、合成肽、熱休克蛋白、百日咳蛋白、細胞激素、淋巴激素、激素、生長因子、包含來自多種病原體衍生抗原的多種人類CD4+ T細胞表位的人工蛋白質，諸如N19、鐵攝取蛋白、來自艱難梭狀芽孢桿菌(C. difficile)的毒素A或B及無乳鏈球菌(S. agalactiae)蛋白。
12. 如請求項1之疫苗，其中HBsAg抗原是B型肝炎的表面抗原，並且單獨吸附在磷酸鋁上。
13. 如請求項1之疫苗，其中疫苗包含至少一種選自由以下所組成之群的防腐劑：2-苯氧基乙醇、苯酚、硫柳汞、甲醛。
14. 如請求項1-6之疫苗，其中該組合疫苗是二價疫苗組合物，其包含劑量減少的IPV和滅活的IRV。
15. 如請求項14之疫苗，其中基於沙克病毒株的IPV，其第1型、第2型及第3型的各濃度不超過20 D抗原單位。
16. 如請求項15之疫苗，其中基於沙克病毒株的IPV，其第1型、第2型和第3型的各劑量濃度係選自i) 8 D抗原單位、2 D抗原單位、5 D抗原單位；ii) 10 D抗原單位、2 D抗原單位、10 D抗原單位；及iii) 10 D抗原單位、2 D抗原單位、16 D抗原單位。
17. 如請求項14之疫苗，其中基於沙賓病毒株的IPV，其第1型、第2型或第3型的各濃度不超過20 D抗原單位。
18. 如請求項17之疫苗，其中基於沙賓病毒株的IPV，其第1型、第2型及第3型的濃度是5-16-10 D抗原單位。
19. 如請求項14-18之疫苗，其中基於沙克或沙賓病毒株的IPV，其第1型、第2型及第3型的濃度是如請求項4所請劑量。
20. 如請求項14之疫苗，其中滅活輪狀病毒的濃度為10 μg/劑。
21. 如請求項14之疫苗，其中明礬(Alum)(Al³⁺ )用作佐劑，其濃度不大於1 mg/劑。
22. 如請求項1之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-蛋白質結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍。
23. 如請求項22之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為約10 D抗原單位、第2型的存在量為約2 D抗原單位、第3型的存在量為約10或16 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的存在量為約5 μg的PRP含量；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
24. 如請求項22之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為約10 D抗原單位、第2型的存在量為約2 D抗原單位、第3型的存在量為約10或16 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的存在量為約10 μg的PRP含量；總鋁含量(Al^{3 +} )的存在量不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
25. 如請求項1之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-蛋白質結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍。
26. 如請求項25之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為約5 D抗原單位、第2型的存在量為約16 D抗原單位、第3型的存在量為約10 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的存在量為約5 μg的PRP含量；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
27. 如請求項25之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為約5 D抗原單位、第2型的存在量為約16 D抗原單位、第3型的存在量為約10 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的存在量為約10 μg的PRP含量；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
28. 如請求項1之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第3型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-蛋白質結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量為5-30 μg的範圍；總鋁含量(Al^{3 +} )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍。
29. 如請求項28之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為約10 D抗原單位、第2型的存在量為約2 D抗原單位、第3型的存在量為約10或16 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的存在量為約5 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的存在量為約12.5 μg；總鋁含量(Al^{3 +} )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
30. 如請求項28之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV，其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙克病毒株第1型的存在量為約10 D抗原單位、第2型的存在量為約2 D抗原單位、第3型的存在量為約10或16 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的存在量為約10 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量為約12.5 μg；總鋁含量(Al^{3 +} )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
31. 如請求項1之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV，其中D的存在量為1-50 Lf的範圍；T的存在量為1-30 Lf的範圍；wP的存在量為10-50 IOU的範圍；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍、第2型的存在量為1-20 D抗原單位、第3型的存在量為1-20 D抗原單位的範圍；IRV的存在量為1-30 μg的範圍；b型流感嗜血桿菌PRP-蛋白質結合物的量為2-20 μg的PRP含量的範圍；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量為5-30 μg的範圍；總鋁含量(AT³⁺ )的存在量為0.4-1.5 mg的範圍；2-苯氧基乙醇的存在量為2-6 mg的範圍；L-組胺酸的存在量為0.5-5 mg的範圍。
32. 如請求項31之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV；其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為約5 D抗原單位、第2型的存在量為約16 D抗原單位、第3型的存在量為約10 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-TT結合物的存在量為約5 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量為約12.5 μg；總鋁含量(Al^{3 +} )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.55 mg。
33. 如請求項31之疫苗，其包含D、T、wP、Hib B、HBsAg、IPV和IRV；其中D的存在量為約22.5 Lf；T的存在量為約7.5 Lf；wP的存在量為約15 IOU；劑量減少的滅活小兒麻痺病毒沙賓病毒株第1型的存在量為約5 D抗原單位、第2型的存在量為約16 D抗原單位、第3型的存在量為約10 D抗原單位；IRV的存在量為約10 μg；b型流感嗜血桿菌PRP-CRM₁₉₇ 結合物的存在量為約10 μg的PRP含量；B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量為約12.5 μg；總鋁含量(Al³⁺ )的存在量為不超過0.9 mg；2-苯氧基乙醇的存在量為約3.25 mg；L-組胺酸的存在量為約1.5 mg。
34. 如請求項1-33之疫苗，其中該IPV和IRV抗原分別吸附在氫氧化鋁上；且其他抗原未吸附或吸附在選自磷酸鋁、氫氧化鋁及其組合的一種或多種鋁鹽上。
35. 如請求項1-33之疫苗，其中該疫苗視情況包含選自由以下組成之群的賦形劑：組胺酸、蔗糖、甘胺酸和氯化鈉；較佳濃度範圍為5-40 mM的組胺酸，最佳濃度為20 mM的組胺酸。
36. 一種製備如請求項1及14之組合疫苗的方法，其包括以下步驟： a)將IPV (沙賓/沙克病毒株)原液(bulk)和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上； b)混合IPV和IRV的單價原液，並將混合物在震盪器上於2-8 ℃保持2小時。
37. 一種製備如請求項1及22-27之(六價)組合疫苗的方法，其包括以下步驟： a)將IPV(沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6，較佳6.5； b)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5並加入T，並在室溫攪拌混合18-24小時； c)加入上述混合物[步驟a和步驟b中所獲得者]，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘； d)將wP抗原和穩定劑加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘，並在2-8 ℃靜置條件下放置過夜； e)在2-8 ℃將Hib PRP結合物和2-PE加入到步驟d中獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6； f)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟e中獲得的混合物中，然後攪拌2小時。
38. 一種製備如請求項1及28-33之(七價)組合疫苗的方法，其包括以下步驟： a)將IPV(沙賓/沙克病毒株)原液和IRV原液分別吸附在氫氧化鋁上，然後將pH調節至6.2-6.6； b)將HBsAg吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至6.0-6.5； c)將D吸附在磷酸鋁上，然後將pH調節至5.5-6.5並加入T； d)藉由在室溫攪拌18-24小時，將步驟b和c中獲得的混合物混合； e)加入上述混合物[步驟a和d中所獲得者]，然後將pH調節至6.4-6.6並在室溫攪拌60分鐘； f)將wP抗原和穩定劑加入上述混合物中，然後攪拌60分鐘，並在2-8 ℃靜置條件下放置過夜； g)在2-8 ℃將Hib PRP結合物和2-PE加入到步驟d中獲得的混合物中，然後將pH調節至6.4-6.6； h)將NaCl和WFI (q.s.)加入到步驟e中獲得的混合物中，然後攪拌2小時。
39. 如請求項1-38之疫苗，其中i)藉由使用凝膠滲透層析獲得的該純化的白喉類毒素和破傷風類毒素具有至少80％的單體含量；ii)藉由使用氰基化結合方法製備的並隨後在賦形劑存在下在低溫混合的該Hib PRP-載體蛋白結合物顯示出具有最小的游離PRP釋放之更高的穩定性以及改良之免疫原性；iii)在混合的後期加入的該全細胞型百日咳抗原使基於水解的降解最小化並提供穩定且具免疫原性之wP抗原。

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