CN112138155B

CN112138155B - 一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法

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Publication number: CN112138155B
Application number: CN201910574668.XA
Authority: CN
Inventors: 刁美君; 魏健; 史力; 莫呈钧; 张智
Original assignee: Immune Path Biotechnology Suzhou Co Ltd
Current assignee: Immune Path Biotechnology Suzhou Co Ltd
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: US20220331424A1; CN112138155A; WO2020259557A1

Abstract

本发明涉及一种包含磷酸铝佐剂及CpG佐剂的新复合佐剂系统及其制备方法和抗原回收方法。本发明的新型佐剂系统可激发良好的体液免疫和细胞免疫反应，为新型疫苗佐剂的开发及应用提供了新的思路。

Description

一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含磷酸铝佐剂及CpG的新佐剂系统。

背景技术

近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，尤其是蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高，但蛋白疫苗免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，应用佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。

铝盐佐剂成本低、使用方便，是生物制品生产中应用最广的一种佐剂，有超过80年的使用安全性数据，也是最早被美国食品药物监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的佐剂。目前常用的铝佐剂主要为氢氧化铝佐剂(aluminum hydroxide adjuvant)和磷酸铝佐剂(aluminum phosphate)两种。铝盐作为疫苗佐剂有很多优点，除了可以有效地诱导体液免疫应答，和具有非常充分的安全性数据，它还有成本低，以生产等优势。，但是铝佐剂对细胞免疫作用不明显，难以诱导高强度的细胞免疫应答。由于氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂的等电点、胶体粒径等理化性质不同，和不同疫苗抗原配伍的复配优势和吸附率也不一样。有些抗原更适合氢氧化铝佐剂，有些抗原更适合磷酸铝佐剂。就磷酸铝佐剂家族而言，也因其磷酸根的含量不同，而呈现不同的等电点。

新型CpG ODN佐剂是未来最具应用前景的疫苗佐剂技术之一，美国的Coley公司和Dynavax公司生产的含CpG ODN佐剂疫苗已分别进入三期临床和获批上市。CpG OND为非甲基化的短核苷酸(胞嘧啶和鸟嘌呤，CpG)为基序的寡脱氧核苷酸(ODN)短序列，具有强烈的免疫刺激作用。CpG OND不仅可增强疫苗的体液免疫应答，尤其是可明显增强其细胞免疫应答，可以弥补铝佐剂的不足。目前CpG是已被临床证明安全有效的新型佐剂，能够增强疫苗的免疫原性，提高免疫应答率，刺激机体形成更有效的免疫保护，是开发新型疫苗的良好佐剂选择。

研究表明CpG与铝佐剂联用，大多为氢氧化铝佐剂而少有涉及磷酸铝佐剂。氢氧化铝佐剂以铝羟基形式存在的，是一种纤维状粒子，等电点一般在10.0~11.0左右，在中性pH的溶液中以带正电荷微米颗粒形式存在，可较好的吸附带负电荷的CpG以及带负电的抗原；但是这种复合使用对于和氢氧化铝佐剂不兼容（吸附较差）的抗原就没有意义了。磷酸铝佐剂是羟基磷酸铝复合物，为一种球形粒子的聚集体，商品化的磷酸铝佐剂的等电点多是4.0-5.0左右，在中性pH （pH6-7.4）的溶液中以带负电荷微米颗粒形式存在，不利于带负电荷的CpG的吸附。另外一些铝佐剂，介于磷酸铝和氢氧化铝之间，例如美国默克公司自己生产的铝佐剂等电点是7.0左右。这种佐剂还是含有较大比例磷酸铝化学成分，适合于与纯粹的磷酸铝和氢氧化铝不太兼容的抗原；这种佐剂对CpG的吸附也不是十分有利。与调节铝佐剂对抗原等吸附率有些相关的一些工作，例如在中国专利CN106729702中描述的，对现有磷酸铝佐剂配制工艺和后处理工艺进行了探索改造，以获得吸附能力和外观形态均不太一样的磷酸铝佐剂，据报道制备得到的磷酸铝粒径可以有效地控制在75-150 nm 之间，等电点在4.0-6.0之间，目的是让铝佐剂表面电荷和粒径趋于稳定，且可以在pH值接近人体体液pH值溶液中使用。。

含有佐剂的疫苗制剂均为佐剂吸附抗原型疫苗（疫苗中的抗原吸附于佐剂上）。而由于佐剂的存在，一些疫苗活性相关的质量检定项目的检测会受到干扰，甚至无法开展。因此，实际操作中既需要提供一种具有较好解吸附效果的佐剂系统，需要将吸附于佐剂上的抗原通过一定方式解离下来用于活性检测和分析。例如，中国专利103471902A中给出了对包含磷酸铝佐剂的疫苗的解吸附方式，指出应以碱溶液将含有佐剂的疫苗溶解，再采用含金属络合剂的酸性化学试剂中和的方法。这种方法极易造成抗原的降解，缺乏可行性。而专利CN1572324A则对佐剂系统的吸附方式给出了改进，指出对于包含铝佐剂及CpG佐剂的佐剂系统，抗原应仅吸附在铝佐剂上，而不宜吸附在CpG佐剂上（免疫刺激剂），这样更有利于达到质量控制的要求，而事实上疫苗抗原比CpG分子大几百倍，甚至千倍，理论上不存在抗原在CpG上吸附的可能性。

本发明提供了一种新的复合佐剂系统，包括特殊工艺生产的磷酸铝佐剂和CpG佐剂，该新佐剂系统通过在生产过程中仔细调节磷酸根和铝离子的比例而实现调节最终铝佐剂颗粒等电点，控制佐剂表面电荷，提高抗原和CpG吸附率，本发明还提供了一种优化的解吸附方法，可以实现较高的抗原解吸附效率，为后续抗原的体外活性评价提供基础，具有良好的商业价值。

发明内容

本发明给出了一种包含磷酸铝佐剂的改良型佐剂系统。本发明中的磷酸铝佐剂，与传统商用选择等电点在4.0-6.0左右的磷酸铝佐剂不同，可根据需要产生等电点满足需要的铝佐剂；例如选择等电点为7.0-9.0 ，可满足抗原和CpG佐剂都能较好地吸附在磷酸铝佐剂上的需要。

本发明发现，通过将CpG佐剂和特殊选出的磷酸铝佐剂组合使用，获得相应的复合佐剂系统，该佐剂系统具有较好的单独吸附抗原或CpG佐剂的能力，也允许抗原和CpG同时都被有效地解吸附利于疫苗的制备。其中，本发明展示，当磷酸铝中铝元素对磷酸的比值升高时，CpG的吸附强度会线性增加，因为在相同的中性pH环境下，随着磷酸铝中铝元素对磷酸的比值升高，磷酸铝的等电点也在线性升高，导致磷酸铝的表面电荷阳性增强，有利于带负电荷的CPG的吸附。在理论上，这非常有利于CpG和可以吸附在该铝佐剂表面的抗原的协同免疫效果，更有利于疫苗生产中的质量和工艺控制。本发明进一步聚焦在磷酸铝佐剂中铝元素含量及CpG含量之间的质量比在1:4-4:1之间时，发现CpG佐剂可以较好地吸附在磷酸铝佐剂上，同时被选用的抗原也具有较好的解吸附效果。更优选地，磷酸铝佐剂中铝元素及CpG之间的质量比在1:2-2:1之间时，CpG和相应的抗原在磷酸铝佐剂上都达到了最佳吸附。

本发明中所指出的CpG佐剂，是指含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的DNA片段。它能激活B细胞、NK细胞、DC树突状等细胞，诱导释放IL-12、IFN-γ，从而诱导强Th1型应答和细胞免疫。作为理想的CpG佐剂是CpG7909 (Coley公司)或CpG 1018ISS(Dynavax公司)等。

本发明通过调节可溶性铝盐、可溶性磷酸盐与碱性溶液三者的比例，获得了一系列等电点大于商品化磷酸铝佐剂等电点（等电点为5.0）的磷酸铝佐剂。更优选地，本发明的发明人制备得到的磷酸铝佐剂，等电点在7.0-9.0之间；优选地为8.0-9.0之间。最优选地，本发明的发明人制备得的磷酸铝佐剂，等电点在8.5-9.0之间。在此基础上，本发明的发明人给出了一种包含磷酸铝佐剂的复合型佐剂系统，本发明所提供的获得等电点在7.0-9.0之间磷酸铝佐剂的方法为：

1) 将可溶性铝盐（优选为AlCl₃）、可溶性磷酸盐（NaH₂PO₄，Na₂HPO₄或Na₃PO₄）混合，制备得到溶液1，其中PO₄ ^3-与Al³⁺之间摩尔比在1:3-1:10之间；

2) 将溶液1与碱溶液（优选为NaOH）混合，在预定pH条件下沉淀来制备磷酸铝佐剂，其中PO₄ ^3-与Al³⁺之间的摩尔比在1:3-1:10之间; 为保证衡定pH,在使用NaH₂PO₄的情况下，Al³⁺与OH^-摩尔比在3:5.56-10:22.7之间。

3) 吸附抗原和CpG佐剂，形成本发明中的复合型佐剂系统的疫苗产品；或者将直接与带负电荷的CpG佐剂合用，形成复合佐剂系统。关于上述方法，另一种表述方式为：

1) 将可溶性铝盐、可溶性磷酸盐与不同浓度碱性溶液相混合；

2) 通过调节反应溶液中可溶性铝盐和可溶性磷酸盐的配比，从而得到一系列不同等电点的磷酸铝佐剂;

3) 与带负电荷的CpG佐剂合用，形成复合佐剂系统。

其中，上述可溶性铝盐为AlCl₃，可溶性磷酸盐为NaH₂PO₄，Na₂HPO₄或Na₃PO_4，所述碱性溶液为NaOH，所述pH值为7.0-12.0。

在本发明所提供的佐剂系统中，磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和50-100%CpG佐剂，更优选地，佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和80-100%CpG佐剂。为了达到疫苗中抗原质量检定的目的，同时避免检测受到干扰，本发明创建了一种优化的解吸附方法，包括如下步骤：

1) 将吸附了抗原的前述佐剂系统与解吸附液混合后温和摇动或振荡1小时以上；

2) 直接得到上清溶液即得解析附下来的抗原溶液；或适当离心后获得上清溶液以分离可能残存的铝佐剂颗粒。其中，优选的解吸附液包含磷酸钠、枸橼酸钠、氯化钠以及吐温80。解吸附液与解吸附样品（即吸附了抗原的佐剂系统）之间的质量比例大于1:1。本领域技术人员可以理解的是，解吸附液体积越大，则解吸附效果将更好，但是考虑到成本等因素，包括获得的上清液中抗原浓度，优选地为1:1-1:3之间。上述解吸附液可包含160 mM-220mM的磷酸钠，0.2-0.6M的枸橼酸钠，0.15-2.0M的氯化钠以及0.01-0.40% PS-80，且pH值为6.0-7.0。

本发明所提供的新型佐剂体系（磷酸铝和CPG7909或CPG1018），与现有商用佐剂（尤其是CpG联合氢氧化铝佐剂）相比，具有更好的吸附及解吸附能力（实施例中将详述），和适用于更广谱（更多种）的抗原。从而使得本发明的佐剂具有更广泛的运用领域包括质量和工艺控制以及更好的疫苗免疫效果。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1所示为不同P/Al的磷酸铝佐剂的等电点，其中，●表示表1中A组的PI值；■表示表1中B组的PI值；

表示表1中C组的PI值。需要说明的是，P表示磷酸；Al表示铝；PI表示等电点；P/Al（w/w）表示磷酸铝中磷含量与铝含量的重量比例。

图2所示为不同等电点的Al佐剂对CpG的吸附曲线。其中，AP表示磷酸铝佐剂；曲线展示了AP（等电点为9.0■，等电点为7.7▲，表，★等电点为8.5，和等电点为5.1

的磷酸铝）对CpG的吸附效果。

图3所示为Western-blot（WB）检测Al吸附模型抗原蛋白gE蛋白的完整性。在铝佐剂吸附了gE蛋白和CpG后，上清液中的gE蛋白含量检测不到（低于可检测值）。其中左图从左至右样品依次为：1-5道：AP（磷酸铝PI=9.0, gE）、6-10道：AH（氢氧化铝， gE）, 11道：标记（Marker），12道：阳性对照（gE蛋白）右图从左至右样品依次为：1道：标记（Marker）， 1-5道: AP（磷酸铝 PI=7.7, gE），6-11道: AH（氢氧化铝， gE）, 12道: 阳性对照（gE蛋白）

图4所示为不同浓度的CpG被100μg gE/600μg Al/mL样品吸附后，CpG的吸附率。其中，◆表示AP（PI=9.0）；▲表示AP（PI=8.5）；■表示AP（PI=7.7）。

图5所示为AH佐剂吸附的gE和CpG在不同解吸附液（解吸附液A-E，见下面表3）的作用下，在解吸附2小时、24小时以及48小时后的解吸附回收率。由于AH基本不能被溶解，故本实验误差为+/-20%左右。

图6所示为吐温80 （PS-80）对AH佐剂吸附的gE和CpG在解吸附3小时后的解吸附回收率的影响。由于AH基本不能被溶解，故本实验误差为+/-20%左右。

图7所示为不同剂量的解吸附液对不同铝佐剂（磷酸铝AP和氢氧化铝AH（PI=11））吸附gE蛋白样品的解吸附效果对比。1# 和2#为两次实验，分别用了含200 MM（1#），和160mM （2#）磷酸钠的解吸附液（见下面表4）：1:1 和 1:3 分别为样品和解吸附液配比分别为1:1 和 1:3。

具体实施方式

本发明的目的：通过调节反应液的比例，制备不同等电点的磷酸铝(AP)佐剂，应用于制备成高抗原吸附率的磷酸铝和CpG的新型复合佐剂，旨在满足不影响抗原在铝佐剂上吸附的条件下，改变商品化磷酸铝对CpG的弱吸附效果，从而改变目前只能使用氢氧化铝吸附CpG的现状。同时，本申请的发明人发现，相较氢氧化铝佐剂吸附CpG的佐剂系统，本发明的佐剂系统具有更有效的解吸附抗原特性。同时在后期研究中提供了一种针对高吸附率的磷酸铝和CpG的新佐剂系统的解吸附方法，更有利于疫苗领域中的制备及评价，为用体外活性检测代替动物实验检测疫苗抗原活性放行产品提供了机会，具有广泛的应用前景。

实施例1 高吸附率的磷酸铝和CpG的新佐剂组合的制备

1. 不同等电点的磷酸铝佐剂的获得

分别将反应液1（氯化铝与磷酸二氢钠的混合溶液）和反应液2（氢氧化钠溶液）以一定的比例泵入容积为600mL的玻璃反应器中。调节PO₄ ^3-/Al³⁺的组分比例以及NaOH的加入体积，具体信息见下表1。反应器置于连续搅拌的条件下，以恒定的速度搅拌。收集混悬液，静置后，弃去上清夜，或将样品离心，获得沉淀得铝佐剂。根据需要可将沉淀分散于一定体积纯水中，即得某浓度范围的磷酸铝佐剂溶液。

表1 不同等电点的磷酸铝佐剂反应例子信息汇总表

。

将制备的磷酸铝混悬液进行121℃、湿热灭菌。然后4℃条件下保存。测定反应产物的P/Al比以及等电点。在制备过程中，可通过调节反应液1中PO₄ ^3-/Al³⁺的组分比例以及反应液2中NaOH的加入体积，制备得到一系列等电点（PI）值范围在4.5~9.2的磷酸铝佐剂。结果见图1。

从图1中可知，当反应液1中PO₄ ^3-与Al³⁺之间摩尔比在1:3-1:10之间；而反应液1与反应液2中，PO₄ ^3-与Al³⁺与NaOH溶液之间的摩尔比在1:3:5.56-1:10:22.7之间时，制备得到的磷酸铝佐剂等电点在7.0以上。以下实施例的进一步研究可知，通过上述等电点在7.0以上磷酸铝佐剂制备得到的磷酸铝及CpG佐剂系统，具有良好的吸附效果及解吸附效果。

以下，将选择等电点（PI）分别为9.0、8.5、7.7、5.1的四种磷酸铝佐剂（AP）为代表，进行后续吸附、解吸附研究。需要说明的是，当等电点（PI）分别为9.0、8.5、7.7、5.1时，上述四种磷酸铝佐剂（AP）在制备时，P元素和Al元素之间的质量百分比分为：0.192、0.235、0.495以及0.526。本次研究所用商品化AH的PI（等电点）值为11.0。

2. 等电点不同的磷酸铝(AP)佐剂与CpG的吸附作用

选择PI分别为5.1、7.7、8.5、9.0的磷酸铝(AP)佐剂，研究这些佐剂与CpG的吸附作用，具体方式如下：将CpG缓冲液稀释至200μg/ml；各铝佐剂自800μg/ml对倍梯度稀释，直至50μg/ml。各铝佐剂梯度稀释样品与CpG稀释液等体积对加，CpG佐剂与铝佐剂中铝元素的质量比如表2所示。随后，将上述溶液吸附4h，离心取上清，通过UV-MCA法计算CpG吸附率，结果见图2。MCA方法为Multicomponent Analysis 方法。

表2 CpG与铝佐剂(PI分别为5.1、7.7、8.5、9.0的AP)阶梯溶液配制比

。

由图2可知，对CpG的吸附强弱与铝佐剂（AP）的等电点以及CpG与Al的比例有关。从图2可知，现有技术中常见的磷酸铝佐剂（等电点在5.0左右）对CpG基本不吸附。而当等电点在7.0以上时，磷酸铝佐剂对CpG佐剂的吸附效果有了大幅提升（几十倍），具有出色的技术效果，与常用的氢氧化铝佐剂相近。且更进一步地，当等电点在8.5-9.0之间时，本发明所提供的改良型佐剂系统中磷酸铝对CpG的吸附率具有更好的效果。

由此可知，在佐剂制备过程中，通过调节反应器中PO₄ ^3-/Al³⁺的组分比例以及NaOH的加入体积，可以制备得到不同PI的磷酸铝佐剂。当PI>7.7的AP铝佐剂，对CpG的吸附效果较好，基本可替代氢氧化铝佐剂，形成新型磷酸铝-CpG复合佐剂组合。

实施例2 磷酸铝(AP)与CpG佐剂应用于gE免疫疫苗

PI为7.7、8.5、9.0的磷酸铝(AP)佐剂与CpG、gE抗原的吸附作用：先将gE抗原吸附到铝佐剂（AP）上，制备成gE抗原/Al（w/w）比例为200μg/1200μg/ml的吸附样品；然后向该gE抗原/Al吸附样品中加入不同浓度的CpG 样品：1）0μg/ml、2）100μg/ml、3）200μg/ml、4）300μg/ml、5）500μg/ml，6）600μg/ml，7）900μg/ml，8）1200μg/ml，吸附24h后，离心取上清，通过western-blot、及UV二阶导分别计算CpG、gE的吸附效果。

由实验结果图3可知，PI等于或大于7.7的磷酸铝佐剂吸附抗原和CPG后，制剂中吸附后游离gE抗原浓度低于WB检测底线（<10μg/μl）。而gE抗原的总蛋白浓度为100μg/μl，因此，本发明所提供的磷酸铝佐剂系统在CpG存在条件下对gE抗原的吸附率不低于90%，而且CpG含量的增加不会使铝佐剂对gE抗原吸附率降低。

检查抗原吸附对CPG吸附的影响：根据WB结果（图3），在CPG存在下，吸附后样品上清中gE抗原蛋白量小于10μg/ml，因此对上清液检测到的UV吸收值基本反应的是CpG的UV吸收量。通过UV二阶导方法测得吸附有gE抗原的铝佐剂对CpG佐剂的吸附曲线如图4所示。从图4中可以看出，本发明所提供的磷酸铝（等电点在7.0-9.2之间）在已经有抗原吸附的条件下，对CpG吸附能力良好，且CpG吸附率仍然保持了和PI相对应的关系。

实施例3 的抗原解吸附方法

1）解吸附液种类的筛选。

gE/Al（铝佐剂中的Al元素）（w/w）(AH氢氧化铝佐剂)比例为200μg/1200μg/ml的吸附样品，在解吸附条件如下表3，按照1:3的比例加入解吸附液。25℃解吸附2h、24h、48h离心获得上清，通过检测UV二阶导确定gE含量，计算回收率，结果如图5所示。

CpG/Al（w/w）(AH佐剂)比例为600μg/1200μg/ml的吸附样品，按照1:3的比例加入解吸附液。25℃解吸附2h，24h，48h离心获得上清，通过检测UV二阶导，确定CpG的含量，计算回收率，结果如图5所示。

通过图5的数据可知，尽管各个解吸附液效果各异，且有些对CPG的回收笑够可以接受，但总体来说都对完整的从氢氧化铝上解吸附下来抗原并回收无能为力（平均低于50%回收率）。

表3 不同解吸附液组分的例子。其中C,D,E配方为自创。

。

2）表面活性剂对解吸附后的gE抗原有保护作用。

选择用在解吸附液 A和解吸附液E的组分中加入0.4%的吐温80，PS-80，以及含有Triton X-100表面活性剂的解离液B，重复上述佐剂解吸附实验。37℃解吸附3h离心后，获得上清，检测UV二阶导，确定CpG的含量，计算回收率，结果如图6所示。由此可知，相较常规的Triton X-100表面活性剂，PS-80表明活性剂具有更良好的保护解吸附抗原的作用。图中数据建议，加了PS-80的解吸附液E为最佳选择。

3）考察氢氧化铝(AH)、磷酸铝(AP)佐剂在使用相同解吸附条件时的gE抗原解吸附效果。

根据上述实验，最终将解吸附确定为解吸附液E，并添加PS-80表明活性剂。在此基础上，进一步研究氢氧化铝(AH)、磷酸铝(AP)佐剂在使用相同解吸附条件时的gE抗原解吸附效果。

gE疫苗，在下表4所示解吸附条件下，经过24小时解吸附，样品中可观察到离心后的含有的AP佐剂样品底部只有微量残余，而含有的氢氧化铝佐剂样品离心后底部仍有大量白色固体存在。通过对比图7相同解吸附条件下不同铝佐剂的gE的解吸附率，可知氢氧化铝佐剂吸附样品的gE解吸附回收率远远低于磷酸铝佐剂吸附样品的gE解吸附回收率。在吸附样品/解吸附液的比例为1：3时，解吸附效果较好。由此可知，本发明所提供的新型佐剂，与现有商用CpG联合氢氧化铝佐剂相比，具有更好的解吸附能力。

表4 氢氧化铝(AH)、磷酸铝(AP，PI=7.0、8.5或9.0)佐剂吸附gE样品解吸附条件

。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，即每一篇文献被单独引用作为参考。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种参数在阐述的数值区间内改动或修改，但这些等价形式都应落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种复合佐剂系统，其特征在于，其包含磷酸铝佐剂和CpG佐剂，所述磷酸铝佐剂的等电点在7.0-9.0之间；

所述磷酸铝佐剂的制备方法为：

1)将可溶性铝盐、可溶性磷酸盐混合，制备得到溶液1；

2)将溶液1与碱的溶液混合，在预定pH条件下沉淀来制备磷酸铝佐剂；

所述pH值为7-12；其中，使用的磷酸盐为磷酸二氢盐，且PO₄ ^3-、Al³⁺与来源于碱的溶液的OH^-摩尔比在1:3:5.56-1:10:22.7之间。

2.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附疫苗抗原和CpG佐剂。

3.如权利要求2所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和50-100%CpG佐剂。

4.如权利要求3所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和80-100%CpG佐剂。

5.如权利要求2所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂与CpG之间的重量比为磷酸铝:CpG佐剂=1:4-4:1。

6.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂与CpG佐剂之间的重量比为1:2-2:1。

7.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂的等电点在8.0-9.0之间。

8.一种制备佐剂系统的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

1)将可溶性铝盐、可溶性磷酸盐与不同浓度碱的溶液相混合，在预定pH条件下沉淀来制备磷酸铝佐剂，所述pH值为7-12，其中，使用的磷酸盐为磷酸二氢盐，且PO₄ ^3-、Al³⁺与来源于碱的溶液的OH^-摩尔比在1:3:5.56-1:10:22.7之间；

2)通过调节反应溶液中可溶性铝盐和可溶性磷酸盐的配比，从而得到一系列不同等电点的磷酸铝佐剂;

3)与带负电荷的CpG佐剂合用，形成复合佐剂系统。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于，其中,所述可溶性铝盐为ALCL₃ ,可溶性磷酸盐为磷酸二氢盐，所述碱的溶液为NaOH。

10.一种针对权利要求2-5任一项所述的佐剂系统的抗原解吸附方法，包括如下步骤：

1)将吸附了抗原的权利要求2-5任一项所述的佐剂系统与解吸附液混合后轻微振荡1小时以上；

2)直接获得或经过离心后得到上清溶液获得解析附下来的抗原溶液；

所述解吸附液包含160mM-220mM的磷酸钠，0.2-0.6M的枸橼酸钠，0.15-2M的氯化钠以及0.01-0.4% 吐温-80，且解吸附液的pH为6-7。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，CpG佐剂是CpG7909和CpG1018。

12.如权利要求1-7任一项所述的佐剂系统，其特征在于， CpG佐剂是CPG7909和CpG1018。