CN101971030A - 流感吸附疫苗的试验 - Google Patents

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Abstract

流感血凝素(HA)结合于铝盐佐剂，不易通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验直接测定。本发明通过在扩散之前包括解吸抗原的步骤而改进了吸附抗原的SRID方法。

Description

流感吸附疫苗的试验
技术领域
本发明涉及对流感疫苗，特别是其中抗原吸附于铝盐的疫苗进行试验的领域。
背景技术
目前有各种形式的流感病毒疫苗可用(参见，例如参考文献1的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于完整的病毒粒子、“裂解”病毒粒子或纯化的表面抗原。
除诺华疫苗公司(Novartis Vaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳液外，目前的流感疫苗不含佐剂。然而，佐剂已经用于实验性疫苗，其中铝盐用于多种场合，特别是用于针对流行毒株的疫苗。参考文献2-6利用氢氧化铝佐剂。参考文献7利用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。参考文献8也描述了利用铝盐佐剂。
标准化流感疫苗的抗原含量的有用试验是WHO在1978年推荐的单向辐射状免疫扩散(SRID)试验以替代基于红细胞凝集的测试[9，10]。该试验基于流感抗原扩散入含有特异性抗-血凝素(抗-HA)血清的琼脂糖凝胶。随着抗原向外扩散，其遇到凝胶中的同源抗体，从而首先形成可见的沉淀物，例如围绕孔的圆晕。随着扩散继续，浓度朝着更多物质迁移，沉淀物溶解。扩散进一步继续直至抗原的浓度降低，从而能再次沉淀。进一步扩散造成沉淀、再溶解和再沉淀，直至抗原太少从而不能再溶解沉淀物的边缘。如此圆晕的直径停止增加。最终圆晕的直径与制品中HA抗原的含量直接成比例。通过比较未知制品产生的圆晕与HA含量已知参比制品的圆晕，可测定未知制品的抗原含量。
参考文献5通过就在使用前临时混合抗原和佐剂来制备含佐剂的疫苗。因此，能在引入佐剂之前标准化抗原含量。然而，如果在散装(bulk)疫苗生产阶段混合抗原和佐剂，必须对吸附的抗原实施SRID试验。本发明人发现流感HA与铝盐佐剂极其牢固，从而不能良好扩散入SRID凝胶，因此不易采用标准方法直接测定。因此需要改进SRID试验以便用于预吸附的疫苗。
发明内容
本发明通过纳入先解吸抗原再扩散的步骤而改进了吸附抗原的流感SRID试验方案。因此，本发明提供进行SRID试验的方法，包括以下步骤：
(a)获得包含感兴趣抗原的起始组合物，其中所述抗原吸附于佐剂；
(b)处理该起始组合物以使抗原与佐剂解吸；和
(c)使解吸的组合物或其样品扩散入含有感兴趣抗原的特异性抗体的凝胶。
本发明还改进了佐剂吸附抗原的SRID试验，包括先使抗原解吸再进行抗原径向扩散。
更具体地说，先采用解吸步骤再进行受吸附干扰的任何流感疫苗分析步骤，例如包括SDS-PAGE、免疫印迹或蛋白质印迹、免疫测定(例如，ELISA)、BCA蛋白质试验等在内的试验技术。因此，本发明提供对流感抗原实施的方法，包括以下步骤：
(a)获得包含流感抗原的起始组合物，其中所述抗原吸附于佐剂；
(b)处理该起始组合物以使抗原与佐剂解吸；和
(c)将某种试验技术应用于该解吸组合物或其样品。
本发明还改进了佐剂吸附流感抗原的试验，包括先使抗原解吸再进行抗原测定。
本发明还提供采用本发明方法测定过的抗原组合物。本发明还提供包含采用本发明方法测定过的抗原的疫苗。
SRID试验
本发明的SRID试验包括上述(a)-(c)三步。
要用SRID试验分析的起始组合物包含吸附于佐剂的抗原。抗原通常是下文详述的流感病毒抗原，但也知道SRID试验可用于测定其它疫苗的效力，包括灭活的脊髓灰质炎和狂犬病疫苗[9，10]。可根据所测定的抗原选择凝胶中包含的抗体。
吸附抗原的佐剂通常是下文详述的不可溶金属盐。
SRID试验通常包括将待分析的组合物引入凝胶孔中。该孔通常是圆形，因此步骤(c)中的扩散基本上是径向的。在本发明试验中，吸附的抗原与佐剂解吸从而能扩散入凝胶。解吸的其它细节见下文。
解吸可在凝胶孔内发生，但通常发生在将抗原组合物加入孔中之前。因此，在步骤(b)和(c)之间，本发明方法可包括将解吸组合物或其样品引入含有感兴趣抗原的特异性抗体的凝胶的步骤。
典型SRID试验所用凝胶包含多个孔以便接收样品，进行平行分析。常在一次试验中测试同一材料的多份样品，通常采用不同的样品稀释度。本发明方法可将一份样品的抗原解吸，然后划分该样品再进行免疫扩散，在此情况中，先将步骤(b)的解吸抗原分成多份样品再进行步骤(c)。
SRID试验所用凝胶含有感兴趣抗原的特异性抗体，其浓度能在目标抗原浓度扩散中心的合适距离上形成免疫复合体。抗体会形成基本上均匀的已知或未知的浓度。对于许多不同抗原，制备这种凝胶是本领域熟知的。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，但通常利用含有多克隆抗体的抗血清。因此，优选的凝胶浸渍了多克隆抗-HA抗体。可使用山羊，或者更优选绵羊抗血清。
SRID试验中的凝胶优选琼脂或琼脂糖凝胶，但其它合适的材料也可用，本领域技术人员可根据支持抗原径向扩散的能力和支持抗原/抗体复合体沉淀的能力作出选择。
步骤(c)中扩散的温度和定时是本领域熟知的。
本发明方法可包括其它步骤：(d)测定凝胶中沉淀圆晕的尺寸。还可包括其它步骤：(e)比较步骤(d)检测的尺寸与标准尺寸，利用该比较结果计算应用于步骤(c)的材料中的抗原浓度。检测步骤可手工进行、自动进行[11]或半自动进行。通常从含有目标浓度的感兴趣抗原的样品检测标准尺寸。这些浓度如下文所详述的。
起始组合物
要通过SRID试验分析的起始组合物包含吸附于佐剂的抗原，该抗原通常是流感病毒抗原。
目前有各种形式的流感病毒疫苗可用，这些疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。可采用本发明分析基于完整病毒粒子、“裂解”病毒粒子或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常还包括神经氨酸酶)的灭活疫苗。供分析的流感抗原还可以是病毒体的形式。
灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙亚胺或它们的组合。本领域已知灭活病毒的非化学方法，例如紫外光或γ射线。
可通过各种方法从含病毒的液体收集病毒粒子。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒粒子破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
用洗涤剂和/或溶剂处理纯化的病毒粒子，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒粒子制品，从而获得裂解病毒粒子。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献12-17等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来裂解病毒。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，从而改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂。合适的裂解剂包括但不限于：乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、壬苯聚醇9(nonoxynol 9)(NP9)、新帕腾(Sympatens)-NP/090、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒粒子纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解过程可包括使含病毒粒子的物质澄清(以除去非病毒粒子物质)，浓缩收集的病毒粒子(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分离完整病毒粒子与非病毒粒子物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒粒子(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒粒子有用地重悬在含磷酸钠缓冲液的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗。
纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM、FOCETRIATM和INFLUVACTM产品是亚单位疫苗。
灭活流感抗原的另一种形式是病毒体[18](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。可用洗涤剂溶解流感病毒，然后除去核衣壳并重建含病毒糖蛋白的膜来制备病毒体。制备病毒体的备选方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，从而得到在它们的膜中含病毒蛋白的脂质体。本发明可用于储存大量病毒体，如INFLEXAL VTM和INVAVACTM产品那样。
流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以对温度敏感。流感病毒可以是冷适应的。采用活病毒作为抗原时，这三种特征尤其有用。
HA是目前灭活流感疫苗中的主要免疫原，一般通过SRID检测参比HA水平使疫苗剂量标准化。现有的疫苗通常含有约15μg HA/毒株，虽然在例如儿童，或大流行情况下或当利用佐剂时还可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3×或9×剂量[19，20])一样，已使用了分数剂量，例如1/2(即，7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8[7，8]。因此，本发明分析的疫苗可包含0.1-150μg，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μgHA/流感毒株，等等。具体的剂量包括，例如每种毒株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5，等等。
本发明所用的毒株可以含有野生型病毒中发现的天然HA，或者是经修饰的HA。例如，已知可修饰HA以除去导致病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，HA1/HA2切割位点附近的超碱性区域(hyper-basic region))。
用于疫苗的流感病毒毒株随季节而变。在目前的大流行间期，三价疫苗包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株。本发明可用于分析甲型流感和乙型流感病毒。可采用本发明分析散装单价抗原，即，含有只来自一种流感病毒毒株的抗原的组合物。一旦分析，可混合这些吸附的散装单价抗原以形成多价疫苗。还可采用本发明分析组合的半成品疫苗和组合的最终疫苗。
甲型流感病毒目前显示16种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。可采用本发明分析这些亚型中的任一种。病毒可具有NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的任一种。
本发明可用于大流行甲型流感病毒毒株。大流行毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即，有数十年未在人群中发现的血凝素(如H2)，或者以前从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群中的H5、H6或H9)，以至于疫苗受者和普通人群对该毒株的血凝素是免疫学原初的；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亚型毒株，例如H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7毒株。在H5亚型中，病毒分为许多进化支，例如进化支1或进化支2。已鉴定到进化支2的6种亚进化支，其中亚进化支1、2和3具有不同的地理学分布，并且因它们涉及人感染而特别相关。
乙型流感病毒目前未显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株确实属于两种不同的谱系。这些谱系在20世纪80年代后期出现，具有抗原性和/或遗传性彼此不同的HA[21]。
可用卵或细胞培养物培养根据本发明分析的流感病毒。目前培养流感病毒的标准方法利用无特定病原体(SPF)的含胚鸡蛋以及从鸡蛋尿囊液中纯化病毒。如果采用鸡蛋培养病毒，则所分析的物质可能包含鸡蛋蛋白(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)。
可用支持流感病毒复制的细胞系培养抗原。细胞系通常是哺乳动物来源。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)及犬细胞，但不优选使用灵长类细胞。可使用各种细胞类型，如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞如Vero细胞系。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，如CLDK和MDCK细胞系。
因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；CLDK；HKCC；293T；BHK；Vero；MRC 5；PER.C6；FRhL2；WI-38；等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[22]、克利尔(Coriell)细胞库[23]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。
最优选的细胞系是具有哺乳动物型糖基化的细胞系。作为哺乳动物细胞系的次优选替代方式，可以在禽类细胞系上培养病毒[例如，参考文献24-26]，包括来自鸭(例如鸭视网膜细胞)或鸡(例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF))等的细胞系。
用于培养流感病毒的最优选细胞系是源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞系[27-30]。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献27公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(′MDCK33016′，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献31公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。参考文献32公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCC PTA-6500)、′MDCK-SF 101′(ATCC PTA-6501)、′MDCK-SF 102′(ATCC PTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。参考文献33公开了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL-12042)。可以分析含有用任何这些MDCK细胞系培养的病毒的抗原的组合物。
病毒可以用贴壁培养或悬浮培养的细胞培养。也可使用微载体培养。因此，在一些实施方式中，细胞可能适用悬浮培养。
细胞系优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养。在本发明的内容中，培养基指没有人或动物来源的血清添加剂的无血清培养基。这种培养物中生长的细胞本身天然含有蛋白质，但无蛋白培养基应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。
除了抗原和佐剂，待分析组合物可包含其它药物成分。这些组分的详细讨论见参考文献34。
该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)汞物质，如不含硫柳汞[16，35]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。可包含琥珀酸α-生育酚作为汞物质的替代品[16]。
该组合物可包含生理盐，例如钠盐。优选1-20mg/ml之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodium phosphate dehydrate)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙等。
组合物的重量克分子渗透浓度可为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选240-360mOsm/kg，更优选处于290-310mOsm/kg范围内。
组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。
组合物的pH通常是5.0-8.1，更常见是6.0-8.0，例如6.5-7.5，或7.0-7.8。因此本发明方法可包括先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。
组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。组合物优选无谷蛋白。
本发明组合物可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，壬苯聚醇(NP9)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗可包含低于1mg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
佐剂
待分析样品中的抗原吸附于佐剂。各种佐剂能吸附抗原，包括微粒和不可溶金属盐，例如铝盐或钙盐。吸附可以是部分或完全吸附。例如，可吸附组合物中至少50％的抗原(例如，≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥99％等)。可通过，例如离心组合物并测定溶液中剩余多少物质(即，未吸附的)来简单地测定吸附程度。例如，通过参考文献36中描述的该方法检测磷酸钙佐剂的吸附能力。
本发明方法最常用的吸附剂是铝盐。
铝盐
适合吸附抗原的铝盐包括称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但只是为便于使用，并未精确描述实际化学化合物[例如，见参考文献37的第9章]。本发明可用常规用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。
称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm-1处存在吸收带和在3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰[参考文献37的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示抗原吸附能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mg Al+++ 1.8-2.6mg蛋白质之间。
称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根(即，羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中PO4/Al摩尔比通常是0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献37的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常是0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比在0.84-0.92之间，含0.6mg Al3+/ml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是颗粒状的(例如，电子透射显微照片中所见的平板样形态)。这些颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是0.5-20μm(例如，约5-10μm)。据报道，pH 7.4时，磷酸铝佐剂的吸附能力为每mg Al+++ 0.7-1.5mg蛋白质。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成反比，而该取代程度依据沉淀制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而不同。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多＝PZC酸性越高)或通过添加例如组氨酸缓冲液(使得PZC更具碱性)等缓冲液来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常是4.0-7.0，更优选5.0-6.5，例如约5.7。
本发明所用的铝盐悬液可含有缓冲液(例如，磷酸或组氨酸或Tris缓冲液)，但不一定。这些悬液优选无菌、无热原。悬液可含有游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。这些悬液也可含有氯化钠。
佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物[7]。在这种情况中，磷酸铝可能多于氢氧化铝，例如重量比至少为2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1，等等。
供分析的组合物中Al+++的浓度通常低于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml，等等。优选范围是0.3-1mg/ml。
除了包含一种或多种铝盐佐剂外，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。这种额外的组分包括但不限于：3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A(‘3d-MPL’)；和/或水包油乳液。以前将3d-MPL与磷酸铝[38]和氢氧化铝[39]佐剂混合。
钙盐
各种钙盐中通常只用磷酸钙作为佐剂。各种佐剂形式的磷酸钙已见诸报道，可用本发明方法分析这些形式中的任一种。
水合的磷酸钙凝胶佐剂可购自丹麦维德贝克的苏泊尔佛公司(Superfos，Vedbaek，Denmark)。
1995年，参考文献37的第8章总结了磷酸钙佐剂。可在有抗原存在下原位制备盐或吸附于预先形成的盐而将抗原吸附于磷酸钙。提及了预形成的磷酸钙凝胶的商业来源。提供了关于沉淀条件影响佐剂的理化性质，包括吸附性能的细节。
参考文献40报道了各种磷酸钙佐剂的结构和吸附特性。与严格的Ca3(PO4)2不同，这些佐剂据报道是式Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x所示的非化学计量羟基磷灰石，具有pH-依赖性表面电荷，零电荷点(PZC)为5.5。这些佐剂可形成尺寸约为10nm x 150nm的针状颗粒以及直径约为20-30nm的不规则板状。
参考文献41公开了含有反应活性空白位点的反应活性无定形磷酸钙，通过将碳酸化无定形磷酸钙的碳酸化前组分热分解成气态或蒸气副产物而除去该前组分，从而得到该反应活性位点。
参考文献42和43公开了颗粒状磷酸钙佐剂(“CAP”)，其中该颗粒的直径为300-4000nm(纳米颗粒)，并且具有球形和光滑表面。参考文献44公开了这些颗粒可用于粘膜免疫接种。
参考文献45利用大小适于经表皮转运的颗粒状羟基化磷酸钙。
参考文献46公开了一种复合颗粒，其在体内可溶并包含在其表面包被有Ca/P之比约为1.0-2.0的磷酸钙化合物的聚合物颗粒。
参考文献47公开了用于吸附疫苗的可注射磷酸钙水性凝胶，其中钙和磷酸根离子的混合比例为Ca/P重量比为1.62-1.85，当每升含有0.07原子的Ca时，20℃，凝胶的沉降时间是在10分钟内1-20mm。
可以改变磷酸钙佐剂的Ca与P的摩尔比，例如1.35-1.83[参见参考文献37的第8章]。现已发现佐剂的吸附特性根据沉淀期间所用条件而有所不同，例如缓慢搅拌所得佐剂的吸附能力低于快速搅拌形成的佐剂。
以Ca++计，本发明疫苗中磷酸钙的含量可以是0.1-10mg/ml，例如0.5-5mg/ml，优选0.75-3mg/ml，0.9-1.5mg/ml，或约1mg/ml。
解吸
本发明方法包括解吸吸附的抗原。可采用各种方法解吸。对于流感病毒抗原，本发明人发现表面糖蛋白和铝盐(特别是氢氧化铝佐剂)之间相互作用的性质意味着许多可用的解吸方法太温和(表示一部分蛋白质维持结合，从而导致低估抗原含量)或太剧烈(表示HA抗原变性或被切割，从而仍导致低估抗原含量)。因此，本发明人设计了流感蛋白基本上能完全解吸，但仍确保它们可为SRID测定的解吸处理。
解吸通常包括混合待分析组合物与一种或多种解吸试剂。合适的解吸试剂包括盐和/或表面活性剂。可在各种pH值下使用解吸试剂，但优选在6-9.5。可在冷藏温度(例如，2-8℃)或在较温暖的温度(例如，18-25℃)下解吸。
用作解吸试剂的合适盐包括磷酸盐，例如磷酸铵、磷酸三钾、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸氢二钠等。可利用各种浓度，例如10-1000mM，50-500mM的这些盐。现已发现浓度≥250mM(例如，≥350mM、≥400mM、≥450mM、≥500mM等)得到良好的结果，例如300-350mM或约332.5mM。因此，解吸盐在该浓度应维持可溶。其它合适的盐可包括柠檬酸盐、碳酸盐等。
正磷酸氢二钾是优选的解吸试剂。
用作解吸试剂的合适表面活性剂可以是离子或非离子型，包括两性离子型。非离子型表面活性剂尤其有用，优选两性离子型表面活性剂。已经检验了两性的“Zwittergent”表面活性剂，包括“Zwittergent 3-14TM”(正-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸(n-Tetradecyl-N，N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)；CAS 14933-09-6；′TDAPS′)。Zwittergent 3-14TM是合成的水溶性两性离子型表面活性剂，与其它两性表面活性剂不同，其能在广泛的pH范围中保留其两性离子特征。该特性归因于存在强碱性季铵离子和相同强度的酸性磺酸根离子。因此，优选的表面活性剂包括季铵离子和/或酸性磺酸根离子。可利用各种浓度，例如0.1-15％，1-10％等的表面活性剂。Zwittergent 3-14TM可在0.1％-2％，例如0.25％-1％，或约0.5％的浓度下使用。
解吸最好利用盐和表面活性剂的混合物。
其它方法
本发明提供产生疫苗的方法，包括以下步骤：
(i)制备感兴趣的散装抗原；
(ii)采用本发明方法分析该散装抗原的样品；
(iii)根据步骤(ii)的结果将散装抗原稀释至所需终浓度；
(iv)任选混合稀释的散装抗原和一种或多种药学上可接受的成分；和
(v)包装稀释的散装抗原以供销售。
步骤(i)的散装抗原可以是单价或多价抗原。步骤(iv)的成分可包括运载体、赋形剂、其它抗原等等。
本发明还提供制备样品以供SRID试验分析的方法，包括以下步骤：(a)获得包含感兴趣抗原的起始组合物，其中该抗原吸附于佐剂；和(b)处理该起始组合物以从该佐剂解吸该抗原。然后看通过RISD试验分析步骤(b)所得产物。可由同一人或不同的人进行该制备方法和实际SRID试验，可以在同一地理位置或在不同地理位置，例如在不同国家进行。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。
除非另有说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分与第三种组分混合，等等。
本发明实施方式
评估各种盐
从鸡蛋培养的A/纽约(H3N2)流感病毒制备散装单价表面糖蛋白。将该抗原(50μg/ml)完全吸附于氢氧化铝佐剂(1mg/ml AlhydrogelTM)，此后SRID的分析不再可靠。因此，检验了各种解吸试剂(终浓度见下表)。
缓冲盐：磷酸铵
磷酸钾(三-元)
正磷酸氢二钾
磷酸二氢钠
正磷酸氢二钠
表面活性剂：Zwittergent 3-14TM
通过涡流旋振彻底混合A/纽约H3N2流感表面糖蛋白和氢氧化铝佐剂，室温下温育18小时(+/-3小时)。然后以16,250g离心制剂4分钟以沉淀氢氧化铝与吸附的抗原。将沉淀的吸附抗原悬浮在这些组分制备的各种解吸溶液中，然后室温下温育至少18小时(+/-3小时)。然后再以16,250g离心制剂4分钟以沉淀氢氧化铝。通过蛋白质试验检测上清液中解吸的抗原，结果表示为所存在总蛋白的百分比。由于实验误差和所采用方法精度中的差异，回收率低于0％或高于100％均是可能的。
结果如下所示，其中两列显示解吸蛋白质回收％(左)和溶液中的最终磷酸盐浓度(mM)(右)：
Figure BPA00001186293100141
未进一步测试磷酸铵，因为其与BCA蛋白质试验不相容，而且蛋白质回收率低。
因此，利用表面活性剂和磷酸盐的混合物不难实现完全的抗原回收。高盐浓度(≥350mM)易得到最佳结果。用正磷酸氢二钾获得最佳结果。该盐易高浓度(例如，0.5M)溶解，同时能在维持蛋白质天然构象的pH下(低于9.5)均匀一致地实现HA解吸。
盐和洗涤剂浓度范围
从鸡蛋培养的A/越南/1203/2004(H5N1)重配株制备单价表面糖蛋白。将该表面抗原(HA浓度为90微克/毫升)以每毫克氢氧化铝60微克血凝素的比例完全吸附于氢氧化铝。彻底涡流旋振该制剂，4℃储存。
为评估各种磷酸钾和Zwittergent 3-14TM浓度下的解吸，将该试剂的等份试样经涡流旋振，然后以13,000rpm离心5分钟以沉淀氢氧化铝与吸附的抗原。评估了各种备选的解吸溶液：
(1)300mM磷酸氢二钾加O.5％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(2)350mM磷酸氢二钾加O.5％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(3)400mM磷酸氢二钾加O.5％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(4)300mM磷酸氢二钾加1.O％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(5)350mM磷酸氢二钾加1.O％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(6)400mM磷酸氢二钾加1.O％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(7)300mM磷酸氢二钾加2.0％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(8)350mM磷酸氢二钾加2.O％(w/v)Zwittergent 3-14TM
(9)400mM磷酸氢二钾加2.O％(w/v)Zwittergent 3-14TM
将解吸缓冲液加入沉淀物，经涡流旋振重悬并在4℃温育过夜。然后以13,000rpm离心各样品5分钟，测定上清液中的蛋白质含量。
上清液中解吸和测定的蛋白质含量如下所示(微克/毫升)：
Figure BPA00001186293100151
因此，利用90微克抗原剂量和该氢氧化铝佐剂，解吸在磷酸氢二钾浓度为350-450mM，而Zwittergent 3-14TM浓度为0.5-1.0％(w/v)时最佳。
评估其它血凝素浓度(部分1)
根据A/纽约(H3N2)的结果，如上所述制备流行毒株A/越南/1203/2004(H5N1)的抗原并吸附于氢氧化铝。HA浓度采用90、60、30、15和7.5微克/毫升。HA与氢氧化铝的比例维持于30微克HA对1毫克氢氧化铝。利用K2HPO4·3H2O(350、500和750mM)和Zwittergent 3-14TM(0.5％、2％或4％)的混合物进行解吸。加入Zwittergent后最终的缓冲液浓度是：
Figure BPA00001186293100152
  4   210
  500   0.5   475
  2   400
  4   300
  750   0.5   712.5
  2   600
  4   450
按照上述条件进行解吸，除了解吸步骤的温育温度是2-8℃。SRID血凝素回收如下所示：
Figure BPA00001186293100161
本项研究表明对于该抗原和佐剂的最佳组合是0.5％的Zwittergent 3-14TM与332.5mM(终浓度)磷酸氢二钾。
评估其它血凝素浓度(部分2)
如上所述制备流行毒株A/越南/1203/2004(H5N1)的抗原并吸附于氢氧化铝。HA浓度采用90、60、30、15和7.5微克/毫升。HA与氢氧化铝的比例维持于30微克HA对1毫克氢氧化铝。利用K2HPO4·3H2O(350mM)和Zwittergent 3-14TM(0.5％、2％或4％)的混合物进行解吸。加入Zwittergent后最终的缓冲液浓度是：0.5％ Zwittergent＝332.5mM，2％ Zwittergent＝280mM和4％ Zwittergent＝210mM。按照上述条件进行解吸，除了解吸步骤的温育温度是2-8℃。
结果如下所示(AMT＝算术平均滴度)：
Figure BPA00001186293100171
*一块平板用于不含佐剂的样品。
对于该抗原和佐剂，观察到的最佳解吸是0.5％浓度的Zwittergent 3-14TM(最终磷酸氢二钾浓度332.5mM)。较高浓度的Zwittergent明显降低血凝素的回收率。将以前研究的结果综合来看，可能是因为较高洗涤剂浓度下使用低浓度的磷酸氢二钾。因此，0.5％ Zwittergent 3-14与332.5mM磷酸氢二钾的组合是确保各种浓度的血凝素从氢氧化铝佐剂解吸的优选组合。
方法可靠性的验证
为评估该试验的可靠性，由第二操作者利用相同样品进行平行试验。
将A/越南/1203/2004纯化的表面糖蛋白配制成含3毫克/毫升氢氧化铝的30、15和7.5微克HA/毫升。2-8℃温育过夜后，配制的物质以16,250g离心5分钟以沉淀佐剂，小心地取出约900微升上清液而不要打散沉淀物。通过SRID分析这些上清液的血凝素，采用Pierce BCA蛋白质测定分析总蛋白以证实所有的蛋白质结合于佐剂，溶液中没有剩下。将50微升10％ Zwittergent 3-14(w/v)溶液连同950微升350mM K2HPO4解吸缓冲液加入沉淀物以制备终浓度为0.5％的Zwittergent 3-14TM和332.5mM K2HPO4，pH 9.4。
将溶液彻底涡流旋振最少10分钟以重新溶解沉淀物，4-8℃温育18±3小时。
温育后，将溶液涡流旋振最少10秒，然后以16,250g离心5分钟以沉淀佐剂。小心取出上清液，通过SRID分析血凝素。
下表所示数据是平行试验的SRID试验数据。
平行进行的SRID试验，操作者1
平行进行的SRID试验，操作者2
Figure BPA00001186293100182
这些结果证明两位操作者之间的精确度中等良好。
应该知道本发明只是借助实施例作了描述，可在本发明的范围和构思内作出改进。
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[47]美国专利4,016,252.

Claims (32)

1.一种进行免疫扩散试验的方法，包括以下步骤：
(a)获得包含感兴趣抗原的起始组合物，该组合物中所述抗原吸附于佐剂；
(b)处理该起始组合物以使抗原与佐剂解吸；和
(c)使解吸的组合物或其样品扩散入含有感兴趣抗原的特异性抗体的凝胶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感兴趣的抗原是流感病毒血凝素(HA)。
3.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，通过混合所述起始组合物或其样品与包含盐的解吸试剂以使抗原解吸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐是磷酸盐。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述盐是磷酸铵、磷酸钾或磷酸钠、磷酸氢二钠。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述盐是正磷酸氢二钾。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，通过混合所述起始组合物或其样品与包含表面活性剂的解吸试剂以使抗原解吸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述解吸试剂包含两性离子型表面活性剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂是正-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，利用包含正磷酸氢二钾和正-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸的解吸试剂以使抗原解吸。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述解吸试剂含有300-350mM正磷酸氢二钾和0.5％正-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)包括从凝胶的孔中扩散，其中在步骤(b)和(c)之间，该方法包括将解吸的组合物或其样品引入该孔的步骤。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)所用的凝胶是琼脂凝胶或琼脂糖凝胶。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括其它步骤：(d)测定凝胶中沉淀圆晕的尺寸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括其它步骤：(e)比较步骤(d)检测的尺寸与标准尺寸，利用该比较结果计算应用于步骤(c)的材料中的抗原浓度。
16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述起始组合物是灭活的流感疫苗。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含完整的病毒粒子。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含裂解的病毒粒子。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含病毒体。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含纯化的表面抗原。
21.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含不可溶的金属盐。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含钙盐。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含磷酸钙。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含铝盐。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含磷酸铝。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含氢氧化铝。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物。
28.一种对流感抗原进行试验的方法，包括以下步骤：
(a)获得包含流感抗原的起始组合物，该组合物中所述抗原吸附于佐剂；
(b)处理该起始组合物以使抗原与佐剂解吸；和
(c)将试验技术应用于该解吸组合物或其样品。
29.一种产生疫苗的方法，包括以下步骤：
(i)制备感兴趣的散装抗原；
(ii)采用以上权利要求中任一项所述的方法分析该散装抗原的样品；和
(iii)根据步骤(ii)的结果将散装抗原稀释至所需终浓度；
(iv)任选混合稀释的散装抗原和一种或多种药学上可接受的成分；和
(v)包装稀释的散装抗原以供销售。
30.一种用于佐剂吸附抗原的SRID试验的改进，所述改进之处在于先使抗原解吸再进行抗原的径向扩散。
31.一种抗原组合物，其已用权利要求1-27中任一项所述方法测定过。
32.一种疫苗，其包含已用权利要求1-27中任一项所述方法测定过的抗原。
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