CN108226480A - 测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法 - Google Patents

测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于解吸附铝盐吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原的解吸附剂，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。基于该解吸附剂，本发明建立了一种测定铝盐吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原含量的方法。该方法涉及的样品处理过程减少了铝盐佐剂对吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原含量检测的干扰，具有重复性高、准确度高、特异性好的特点，为铝盐吸附型DTap‑IPV疫苗的质量控制提供参考。

Description

测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，涉及一种测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法。
背景技术
脊髓灰质炎D-抗原是DTap-IPV疫苗(百白破-脊髓灰质炎联合疫苗)的主要有效成分，其有效成分含量与疫苗的保护效果有关，因此，D-抗原含量是DTap-IPV疫苗质量控制的重要一项。
目前，D-抗原含量的检测采用酶联免疫吸附法，其原理是将脊髓灰质炎多抗吸附在酶联反应板上，使供试品中的待检抗原与其发生特异结合，再加入酶标抗体，使其与吸附在酶标板上的抗原结合形成免疫复合物，通过酶反应底物在酶的作用下产生显色反应，并根据颜色变化对供试品种的抗原做定量分析。但是其检测结果易受佐剂等非抗原物质的干扰。而DTap-IPV疫苗为氢氧化铝吸附型疫苗。氢氧化铝佐剂与抗原表面携带的负电荷基团发生共价或配位结合，以颗粒的方式包裹抗原，与可溶性抗原一起形成沉淀，从而使复合物更具免疫性。氢氧化铝与抗原结合屏蔽了抗原表面的特异性结合位点，进而在抗原的体外检测过程中，抗原无法与酶联反应或酶标抗体上的特异抗体相结合，从而导致抗原检出量偏低。
因此，有必要针对脊髓灰质炎病毒抗原与氢氧化铝佐剂之间的吸附，开发一种解吸附液，从而使其可以破坏抗原与佐剂之间的作用力，在短时间内解离抗原，并通过酶联免疫法对解离后的脊髓灰质炎病毒抗原进行准确定量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是准确检测出铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中脊髓灰质炎的D-抗原含量，进行有效地质量控制。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。
所述柠檬酸盐溶液为5％-30％(优选20％)的柠檬酸钠溶液。
所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选TritonX-100。
所述表面活性剂在柠檬酸盐溶液中的终浓度为0.05％-0.2％，优选0.1％。
此外，一些金属离子螯合剂、有机酸、乙二醇等物质可以针对抗原与佐剂之间存在的一种或几种相互作用力进行破坏，达到解离抗原的目的。上述物质可以替代表面活性剂用于解吸附剂制备中。
在本发明的一个具体实施方式中，所述解吸附剂为含有TritonX-100的20％柠檬酸钠溶液，TritonX-100的终浓度为0.1％。
所述解吸附剂可按如下方法配制：①称取1g TritonX-100，用10mL纯化水溶解，混匀，即为10％TritonX-100溶液；②称取4g柠檬酸钠，用纯化水溶解，加入10％TritonX-1000.4mL，补加纯化水至20mL，即为解吸附剂。
本发明还提供一种用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，其是利用所述解吸附剂处理待测疫苗，并测定混合液中的D-抗原含量。
所述方法包括以下步骤：
(1)将待测疫苗配制成溶液，并与解吸附剂混匀后孵育；
(2)采用酶联免疫吸附法检测(1)所得混合液中的D-抗原含量。
优选地，步骤(1)中用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为15-25EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:10-10:1的体积比混匀，在20-30℃下孵育0.5-18h。
在本发明的一个具体实施方式中，用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为20EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:1的体积比混匀，在25℃下孵育2h。
步骤(2)中采用酶联免疫吸附法对混合液中的D-抗原进行检测。
本发明中，所述铝盐为氢氧化铝佐剂，即所述铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗为氢氧化铝吸附型疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供一种专属性强的用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，并基于该解吸附剂，建立了一种用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，该方法涉及的样品处理过程减少了铝盐佐剂对吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量检测的干扰，具有重复性高、准确度高、特异性好的特点，为铝盐吸附型DTap-IPV疫苗的质量控制提供参考。
附图说明
图1为本发明实施例2中96孔板布局图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂的制备
本实施例提供的用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，可按如下方法配制得到：
1、称取1g TritonX-100，用10mL纯化水溶解，混匀，即为10％TritonX-100溶液。
2、称取4g柠檬酸钠，用纯化水溶解，加入10％TritonX-100 0.4mL，补加纯化水至20mL，即为解吸附剂。
实施例2测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法1、实验材料
氢氧化铝吸附型DTap-IPV疫苗购自北京民海生物科技有限公司。
脊髓灰质炎病毒抗体购自北京民海生物科技有限公司。
吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗购自赛诺菲巴斯德公司，产品批号为NOA661M。
2、实验方法
2.1疫苗溶液的配制
用纯化水将待测氢氧化铝吸附型DTap-IPV疫苗配制成D-抗原含量为20EU/mL溶液，然后将溶液与实施例1的解吸附剂按1:1的体积比混匀，25℃孵育2h，得到供试品，用于下一步D-抗原含量检测。
2.2D-抗原含量测定
采用酶联免疫吸附法进行脊髓灰质炎病毒D-抗原含量检测，具体如下：
上样：向已包被20DU/mL脊髓灰质炎病毒抗体(一抗为牛多抗，购自北京民海生物科技有限公司)的96孔微孔板(图1)中，在1、2列加入参比品稀释液(除A1，A2外)100μl/孔，在A1、A2各加入预先稀释好的参比品200μl/孔，从A1、A2各取出100μl加入B排，并从B排梯度稀释至G排，G排弃去100μl，H排为空白对照(空白对照为样品稀释液)；再加入供试品100μl/孔，并做两孔平行，加完后轻轻振板混匀，盖好封板膜后置于37℃反应60min。
其中，参比品稀释液为含有1％BSA的0.01M PBS，参比品为经过国际标准品标定的脊髓灰质炎抗原。
用洗涤液洗净微孔板，每孔加入稀释好的酶标抗体(兔多抗，购自北京民海生物科技有限公司，酶标抗体1:50000倍稀释)100μl/孔，加完后轻轻振板混匀，盖好封板膜后置于37℃避光反应60min。
用洗涤液洗净微孔板，每孔加入TMB显色液50μl，室温显色10～15min。
每孔加入50μl 2M硫酸终止反应；
轻轻振荡混匀，10分钟内用酶标仪于450/630nm下读数。
结果计算：以参比品抗原浓度作为横坐标，参比品吸光度为纵坐标，做四参数方程：Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D
式中，A：当X趋向于0时的渐近线(OD最小值)，D：当X趋向于无穷时的渐近线(OD最大值)，X：浓度(DU/ml)，C：曲线拐点，Y：OD
将测得的供试品吸光度值带入该方程，得到每个供试品所对应的抗原含量，计算供试品中的抗原回收率。
回收率(％)＝(疫苗样品测得的抗原含量/疫苗样品理论抗原含量或对照抗原含量)×100％
实验结果见表1。
表1疫苗样品D-抗原回收率检测结果
以上结果显示，采用酶联免疫吸附法对目前市面可见的氢氧化铝吸附型联合疫苗进行检测，脊髓灰质炎的I、II、III各型D-抗原回收率均可达95％以上，表明抗原解吸附完全。
实施例3检测方法考察
1、表面活性剂的考察
为考察不同溶解剂(配制疫苗的溶剂)以及解吸附剂中是否添加表面活性剂对抗原回收率的影响，设置以下4组实验，测定不同配方条件下各型脊髓灰质炎抗原的回收率，结果表明，用0.01M PBS溶解疫苗与解吸附剂混合后，解吸附不完全，抗原回收率仅为77％，而用纯化水作为疫苗溶解剂，同时采用含有表面活性剂TritonX-100的解吸附剂，抗原回收率均能达到90％以上，因此优选解吸附剂中添加有TritonX-100。实验结果见表2。
表2不同溶解剂及表面活性剂添加抗原回收率对比
2、解吸附剂中TritonX-100的含量对铝盐吸附型DTap-IPV疫苗样品的D-抗原含量检测的影响
TritonX-100在20％柠檬酸钠溶液中的终浓度为0.05％-0.2％，以不加解吸附剂的供试品作为对照。结果TritonX-100浓度在0.1％时各型别D-抗原含量回收率均在90％以上，在0.05％时，各型回收率均较低，说明该浓度下并未完全解吸附，而浓度0.2％的解析附条件回收率虽能达到90％左右，相比之下，优选TritonX-100浓度0.1％。实验结果见表3。
表3不同浓度TritonX-100对抗原回收率的影响
3、解吸附时间对抗原回收率的影响
采用实施例1的解吸附剂按照不同孵育时间进行解吸附，分别为25℃解吸附1小时、2小时、3小时、4℃过夜；以不加解吸附剂的供试品作为对照；结果解吸附2小时以上，回收率均能达到95～105％之间，考虑到实验时间，优选解吸附2小时。实验结果见表4。
表4不同解吸附时间对检测结果影响
4、专属性考察
考察实施例1的解吸附剂对D-抗原含量测定是否产生干扰；将解吸附剂作为样品上样100μl/孔于96孔微孔板中，按照实施例2方法检测D-抗原含量。检测结果见表5。
表5解吸附剂抗原含量回收率测定结果
5、重复性考察
分别用实施例1的解吸附剂处理氢氧化铝吸附型DTap-IPV疫苗样品，按照体积比1:1，混匀，室温放置2h。重复按照实施例2的D-抗原含量检测方法测定各型脊髓灰质炎D-抗原含量，检测结果见表6。
表6重复性测定结果
本发明采用解吸附剂处理氢氧化铝佐剂制备的吸附型DTap-IPV疫苗样品，然后再采用酶联免疫吸附法进行脊髓灰质炎病毒D-抗原含量检测，结果表明所述解吸附剂对脊髓灰质炎病毒D-抗原检测无干扰；且各型抗原测定重复性CV值为1.32～1.49％，平均抗原回收率为95.3～97.6％，说明该方法重复性较好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，其特征在于，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。
2.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述柠檬酸盐溶液为5％-30％的柠檬酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选TritonX-100。
4.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述表面活性剂在柠檬酸盐溶液中的终浓度为0.05％-0.2％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的解吸附剂，其特征在于，其为含有TritonX-100的20％柠檬酸钠溶液，TritonX-100的终浓度为0.1％。
6.用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述解吸附剂处理待测疫苗，并测定混合液中的D-抗原含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测疫苗配制成溶液，并与解吸附剂混匀后孵育；
(2)采用酶联免疫吸附法检测(1)所得混合液中的D-抗原含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为15-25EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:10-10:1的体积比混匀，在20-30℃下孵育0.5-18h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为20EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:1的体积比混匀，在25℃下孵育2h。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述铝盐为氢氧化铝佐剂。
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