CN111840540B - 一种乙肝疫苗的解析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乙肝疫苗的解析方法，包括以下步骤：（a）将乙肝疫苗样品于‑15℃以下反复冻融至少一次；（b）将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育1~3h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1~2；（c）最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1~3h，即完成解析。本发明能够将乙肝疫苗中的有效成分与佐剂有效分离，从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测。由于之前解析液解析率低，现有的测定乙肝疫苗活性的方法为动物法，新解析方式发明后可以有效替代动物实验，节约动物成本。

Description

一种乙肝疫苗的解析方法
技术领域
本发明涉及乙肝疫苗含量检测技术领域，具体地说是一种乙肝疫苗的解析方法。
背景技术
疫苗用氢氧化铝佐剂通常是通过向铝盐溶液中加入碱液，生成不带电荷的中性物质相互聚集而形成沉淀。聚集物还会通过羟桥键发生双分子和多分子缩聚，形成大分子。铝盐加碱得到蓬松的絮状氢氧化铝沉淀，由于含有较多的配位水，氢氧化铝沉淀松散的聚集在一起，有时也被称之为晶态偏氢氧化铝AlO(OH)。
氢氧化铝是两性化合物，等电点(isoelectric point,pI)为11.4，在与机体间质液pH相近的缓冲液中其带正电荷，可很好的吸附酸性蛋白抗原。一般氢氧化铝粒径大小1-10μm，不同批次的氢氧化铝佐剂在粒径上存在一定的差别。
乙肝疫苗中的HBsAg被佐剂所吸附后，需要将其解析后采用酶联免疫实验检测其乙肝的真实含量。根据《中华人民共和国药典》第三部通则的要求，用二乙醇胺、Triton100来对佐剂进行解析，但由于与佐剂结合过于牢固，且现有的解析液解析效果比较差，采用酶联免疫实验检测不到乙肝疫苗的真实含量，测试结果仅为有效成分含量的40％左右，测定产品中含量值较低，不能真实反映产品的有效成分。应用现有方法对本公司样品进行解析率调查，结果如表1所示。
表1：
样品 含量(ug/mL) 解析率(％)
样品1 7.8 39.0
样品2 8.7 43.5
样品3 8.2 41.0
样品4 7.5 37.5
样品5 8.5 42.5
样品6 8.6 43.0
样品7 7.7 38.5
样品8 8.0 40.0
均值 8.1 40.6
为准确反映乙肝疫苗中有效成分的含量，根据佐剂的特性，认为加入酸可降低其吸附效果，将乙肝疫苗完全解析出来，用酶联免疫实验检测乙肝疫苗中HBsAg的真实含量。
发明内容
本发明的目的就是提供一种乙肝疫苗的解析方法，以解决现有方法解析率低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种乙肝疫苗的解析方法，包括以下步骤：
(a)将乙肝疫苗样品于-15℃以下反复冻融至少一次；
(b)将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育1～3h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1～2；
(c)最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1～3h，即完成解析。
更优选地，所述解析方法包括以下步骤：
(a)将乙肝疫苗样品于-20℃反复冻融两次；
(b)将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育2h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1；
(c)最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1h，即完成解析。
步骤(b)中，所述盐酸的浓度为1mol/L。
所述乙肝疫苗指用氢氧化铝佐剂吸附的乙肝疫苗。
本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种解析乙肝疫苗的新型方法，能够将乙肝疫苗中的有效成分与佐剂有效分离，从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测，既提高了检验效率又节约成本。产品中有效成分与佐剂得以有效分离，可进行体外法测定乙肝产品效力的实验摸索。目前乙肝疫苗效力测定采用小鼠法，小鼠用量为1.5万只/年。乙肝疫苗中有效成分一旦可用体外法进行准确的定量测试，则可替代小鼠法，节约动物成本，提高检验效率和准确性，更好的保证疫苗的有效性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行。乙肝疫苗样品为我公司产品。
实施例1
将同批次的乙肝疫苗样品分别与硫酸、盐酸、磷酸混合，混合后于37℃水浴半小时，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，三种酸的浓度均为1mol/L，样品与酸的体积比均为1:2，做若干平行试验并测定解析率，结果如表2所示。
表2：
酸的种类 解析率均值/％
盐酸 70.1250A
硫酸 47.3125B
磷酸 44.8750B
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，使用盐酸解析效果更优。
实施例2
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1、1:2、1:5与盐酸混合，混合后于37℃水浴半小时，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表3所示。
表3：
体积比 解析率均值/％
1:1 76.7500A
1:2 70.1250B
1:5 67.3125C
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，产品与盐酸的比例在1:1时解析效果更优。
实施例3
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1与盐酸混合，混合后于37℃分别水浴0.5h、1h、2h、3h，之后加入保护剂Triton100，再37℃水浴半小时。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表3所示。
表3：
水浴时间/h 解析率均值/％
3 88.1875A
2 88.6250A
1 78.6875B
0.5 72.8125C
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，水浴2h时解析效果更优。
实施例4
将同批次的乙肝疫苗样品分别以体积比1:1与盐酸混合，混合后于37℃水浴2h，之后加入保护剂Triton100，再于37℃下分别水浴0.5h、1h、2h、3h。其中，使用盐酸的浓度均为1mol/L，做若干平行试验并测定解析率，结果如表4所示。
表4：
水浴时间/h 解析率均值/％
3 89.1875A
2 89.6875A
1 90.8750A
0.5 83.4375B
未使用同一字母表示数据存在显著差异。
由上可知，与保护剂Triton100的作用时间1h时解析效果更优。
实施例5
样品的解析条件最终确定为盐酸与产品比例在1:1，水浴2h后，再加入保护剂Triton100，水浴1h。但是样品的解析率在90％，仍未达到100％。加入对样品的前期处理，即将样品放置-20℃冰箱中连续冻融两次，进行实验。结果如表5所示。
表5：
样品 含量(ug/mL) 解析率/％
1 19.8 99
2 19.5 98
3 20.0 100
4 20.2 100
5 19.9 100
6 19.0 95
7 19.6 98
8 19.5 98
均值 19.7 99
由上可知，样品前处理对最终解析率具有突出的作用。
实施例6
本方法建立以后，由三名人员对三批样品分别进行测试，得到的样品解析率均为95％以上，人员的RSD均<5％，结果见表6，说明此方法效果显著。
表6：
提供了一种解析乙肝疫苗的新型方法，即样品解析之前于-20℃反复冻融两次，用HCL与疫苗1:1混合，37℃孵育2h，后再加入保护剂Triton100，37℃水浴1h。将乙肝疫苗从佐剂中解析的解析率由40％左右提升至95％以上，使乙肝疫苗的有效成分得以与佐剂有效分离，从而可通过免疫试剂盒对其有效成分进行准确监测。
由于之前解析液解析率低，现有的测定乙肝疫苗活性的方法为动物法，新解析方式发明后可以有效替代动物实验。

Claims (1)

1.一种乙肝疫苗的解析方法，其特征是，包括以下步骤：
（a）将乙肝疫苗样品于-20℃反复冻融两次；
（b）将经冻融处理的乙肝疫苗样品与盐酸混合，并在37℃条件下孵育2h，其中，乙肝疫苗样品与盐酸的体积比为1∶1；所述盐酸的浓度为1mol/L；
（c）最后加入保护剂Triton100，并在37℃条件下水浴1h，即完成解析；
所述乙肝疫苗指用氢氧化铝佐剂吸附的乙肝疫苗。
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