CN102175874A - 一种疫苗免疫效果评价蛋白芯片的制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疫苗免疫效果评价蛋白芯片的制备及用途。本发明可检测人及动物接种疫苗后体内是否含有相应的保护性抗体，或人以及动物在接种疫苗一段时间后，这些疫苗是否还具有保护性。本发明将多个病种病原体的保护性抗原或相应疫苗经不同方法处理后的抗原物质点于修饰的片基上制备成蛋白芯片，可通过一次实验同时检测多种疫苗的保护性抗体，并能同时分析多份标本，且具有多种不同的信号检测方法，具有快速、准确、高通量、高灵敏度、高特异性的特点，可为疫苗的免疫效果评价提供一种新技术和新产品。

Description

一种疫苗免疫效果评价蛋白芯片的制备及用途

技术领域

本发明涉及一种疫苗免疫效果评价蛋白芯片的制备及用途。

背景技术

目前疫苗技术迅速发展，已有多种疫苗用于传染病的预防，对控制传染病的传播起到了重要作用。疫苗种类主要包括减灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、组分疫苗(亚单位疫苗)及血清等。为达到保护作用，所有疫苗都应诱导有效的免疫应答，但不同疫苗诱导的免疫应答类型不同，如减毒活疫苗可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，而灭活疫苗则以诱导体液免疫为主，基因工程疫苗(DNA疫苗和活载体疫苗)则可产生体液免疫和细胞免疫。免疫应答检测技术主要包括体液免疫和细胞免疫，虽然粘膜和细胞免疫应答对某些疫苗诱导的保护力很重要，但现有疫苗效果评价主要视其诱导血清抗体的效力而定，在大多数情况下抗体达到一定水平则认为具有保护作用。

我国在新中国成立后，给儿童进行了痘苗、卡介苗和百白破混合制剂的大规模接种，并于70年代中期逐渐形成了计划免疫的概念。免疫规划是指根据国家传染病防治规划，使用有效疫苗对易感人群进行预防接种所制定的规划、计划和策略。与计划免疫相比，免疫规划的内涵和外延更宽泛，一方面要不断将安全有效的疫苗纳入国家免疫规划，另一方面要扩大预防接种的受益人群。2008年2月18日，国家卫生部公布了《扩大国家免疫规划实施方案》，我国国家免疫规划所预防的病种覆盖了乙型肝炎、结核病、脊髓灰质炎、百日咳、白喉、破伤风、麻疹、甲型肝炎、流行性脑脊髓膜炎、风疹、流行性腮腺炎、流行性出血热、炭疽和钩端螺旋体病15种传染病，所覆盖病种之多，位居世界前列，所覆盖人群，也不再仅仅局限于儿童。据专家测算，扩大免疫规划后，相应疫苗的用量将大幅度增加，因此，对于评价免疫规划人群的个体差异是至关重要的。对疫苗的免疫效果、人群的抗体水平等指标进行大规模有效的评价可为国家顺利实施规划免疫提供可靠、高效的评价工具，对于疫苗的质量控制，促进疫苗的研发应用意义重大。

传统的检测方法主要有凝集试验、中和试验、酶联免疫试验、免疫沉淀试验、免疫印迹技术及放射免疫试验等。但上述方法除需专门的技术人员及昂贵的仪器设备外，检测步骤相当繁琐，灵敏度有限，还存在放射线辐射和污染等问题，而且尚不能实现高通量、多元化的检测。因此，一次只能检测一种抗体，且费时费力的方法越来越不适应新形势的要求。

随着生物技术的发展诞生了生物芯片技术，这个90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融生物学、微电子学、化学、物理学、计算机科学为一体的高交叉新技术。日趋成熟的蛋白芯片技术与基因芯片技术相似，采用原位合成、机械点样或共价结合等方法将多肽、蛋白、抗原、抗体、酶等固定于载体形成分子点阵，用于蛋白质功能研究及其相互作用分析。即利用生物分子与蛋白芯片的探针分子发生杂交或相互作用，检测和分析蛋白质的一项技术。由于一种捕获探针(抗原或抗体)可对应一种抗体或抗原，有多种捕获探针就可对应多种抗体或抗原，这样通过一次反应就能同时检测出多个指标，从而实现快速、高通量、多元化检测。目前对芯片反应信号的检测主要有荧光法、酶显色法和免疫金标银染显色法。荧光法是蛋白芯片通常采用的信号检测方法，主要利用激光共聚焦扫描仪对反应信号进行高通量检测和分析，具有高自动化、高灵敏度的特点，但需要昂贵的检测仪器和专业人员；酶显色法主要利用标记的生化酶与特定的显色液相互作用，根据矩阵的颜色变化对反应结果进行分析的过程，但特异性较差；免疫金标银染显色法主要利用纳米金标记蛋白质再用银染显色使结果可视化，既具有较高的特异性和灵敏度，又无需特殊仪器设备，具有广阔的应用潜力和前景。本实验室一直致力于生物芯片检测新技术研究，为了提高可视化检测的灵敏度，我们在对新型纳米金标底物研究中筛选到适合于HRP催化的纳米金复合底物NCS，该物质可导致大量纳米金颗粒直接沉积，从而起到信号放大的作用，可以应用与生物芯片等的高灵敏度检测，以及新型的纳米金免疫诊断试剂的研制(专利申请号：200710301755.5)。

目前，国家免疫规划针对的病种增至15种传染病，覆盖面积广，接受免疫的人群也不仅仅是儿童，因此对于免疫后人群的抗体水平检测就显得尤为重要了，通过该项指标不仅可以直观的对所采用疫苗的效果进行准确评价，而且可以迅速对免疫水平低下人群个体采取具有针对性的措施，改善免疫效果。但是，目前疫苗的免疫效果、人群的抗体水平等指标均无法进行大规模有效评价，常规的检测方法耗时长，且只能在一次实验中评价一种疫苗，大大减低了评价的效率，无法满足现有的需要。而且目前国内尚无针对多种疫苗病种病原体的抗体水平高通量检测技术与产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白芯片，该芯片能同时检测多种疫苗的保护性抗体从而评价相应疫苗的接种效果，并提供其制备方法。

本发明的蛋白芯片由表明经过醛基化处理的片基、捕获抗原及显色试剂组成。捕获抗原为多种疫苗对应病种病原体的保护性抗原也可为相应疫苗经不同处理方法处理后的抗原物质，每一种病原体的保护性抗原对应检测一个病种的保护性抗体，所有的捕获抗原以矩阵形式点在表面经过处理的片基上，这样通过一次反应就能同时检测多种抗体。

本发明的蛋白芯片将捕获抗原固定于载体表面，待测样品中的保护性抗体能与特定的捕获抗原特异性结合而锚定在芯片对应位置上，经显色试剂显色后通过信号扫描等分析即可判定每份样品中是否含有各种疫苗的保护性抗体。

本发明的蛋白芯片采用间接法进行样品检测，血清样本与已锚定在片基上的保护性抗原反应后，加入已标记报告分子的能与待测抗体结合的蛋白(二抗、Protein A/G等)，根据所标报告分子的不同，有如下3种信号检测方法：

1、荧光法：荧光染料Cy3、Cy5或FITC标记的，可直接置于荧光扫描仪中显示并分析结果；

2、一步法金标银染可视化法：Nanogold标记的，在各反应区加入适量银增强试剂显色，避光反应数分钟后用水终止反应，可直接用肉眼观察结果，也可用普通扫描仪分析结果；

3、两步法金标银染可视化法：HRP标记的，在各反应区加入适量纳米金复合底物(Nanogold-DAB)后，再加入适量银增强试剂显色，避光反应数分钟后用水终止反应，可直接用肉眼观察结果，也可用普通扫描仪分析结果。

本发明所述的蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

1、捕获抗原预处理：将各疫苗病种病原体的保护性抗原和疫苗处理液与蛋白芯片点样缓冲液混合均匀，使各探针的点样浓度调至最适；

2、蛋白芯片探针阵列的设计：图11为国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片的外观示意图及探针点阵布局模式图，其中1a至8a为IgG阳性对照；1b至1d为麻疹病毒H蛋白；2b至2d为风疹病毒E1蛋白；3b至3d为腮腺炎病毒NP蛋白；4b至4d为甲肝病毒vp1蛋白；5b至5d为甲肝病毒vp3蛋白；6b至6d为HBsAg；7b至7d为乙脑病毒E蛋白；8b至8d为脊髓灰质炎病毒D抗原(I，II，III型)；1e至1g为百日咳FHA；2e至2g为白喉毒素；3e至3g为破伤风毒素；4e至4g为结核杆菌Ag85B抗原；5e至5g为出血热病毒NP蛋白；6e至6g为炭疽杆菌PA蛋白；7e至7g为钩端螺旋体混合抗原；8e至8g为A群脑膜炎球菌荚膜多糖；1h至8h为BSA阴性对照；

3、点制蛋白芯片：运用点接触式法进行点样，将各抗原点于片基的各个反应区中，于适度温度和湿度下放置一段时间，使探针与片基充分交联；

4、封闭：在固定有抗原的反应区中滴加胎牛血清(FCS)封闭液，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表明为结合的空白位点；

5、保存备用：甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片，晾干后置于4℃保存备用。

本发明提供的疫苗免疫效果评价蛋白芯片的优势之处在于：可以通过一次实验检测人或动物体内是否含有多种疫苗的保护性抗体，或人以及动物在接种相应疫苗一段时间后，这些疫苗是否还具有保护性，实现了简便、高通量的检测，方便疫苗的补种接种和效果的评价。提供了3种不同的信号检测方法，更具选择性：荧光法虽然最为简便但需要昂贵的检测仪器和专业人员，一步法金标银染虽不需特殊仪器但灵敏度较低，两步法金标银染虽步骤略多但灵敏度较现有方法高10-100倍。本发明也为免疫效果评价提供了一种新技术和新产品，为国家顺利实施计划免疫提供可靠、高效的评价工具，对于疫苗的质量控制，促进疫苗的研发应用具有重要意义。

附图说明

图1：蛋白芯片的制备及反应流程图，其中Ag为抗原，S为固相支持物，Ab为抗体，anti-Ab为二抗或Protein A/G等，serum为血清，*为荧光标记物Cy3、Cy5或FITC，HRP为辣根酶，DAB-Nanogold为纳米金标记的3，3’4，4’-四氨基联苯(DAB)，Silver ions为银离子。

图2：A群脑膜炎球菌多糖疫苗芯片探针点阵布局，其中1a至4a为IgG阳性对照；1b至1d为未处理的A群脑膜炎球菌多糖疫苗液；2b至2d为饱和碳酸钠溶液处理的A群脑膜炎球菌多糖疫苗液；3b至3d为重铬酸钾稀盐酸混合液处理的A群脑膜炎球菌多糖疫苗液；4b至4d为乙醇处理的A群脑膜炎球菌多糖疫苗液；1e至4e为BSA阴性对照。

图3：A群脑膜炎球菌多糖疫苗芯片检测结果，其中A-I为接种过A群脑膜炎球菌多糖疫苗的新兵血清样本，J为阴性对照血清。

图4：炭疽裂解液Western Blot检测结果和PAGE纯化炭疽裂解液后蛋白的SDS-PAGE分析结果，其中L：炭疽裂解液；M：低分子量蛋白标准；1.PA蛋白。

图5：炭疽抗原芯片探针点阵布局，其中1a至4a为IgG阳性对照；1b至1c为纯化的PA蛋白原液；2b至2c为纯化的PA蛋白1∶2稀释液；3b至3c为纯化的PA蛋白1∶4稀释液；1d至1e为未纯化炭疽裂解液；2d至3e为其他炭疽抗原；4b至4e为BSA阴性对照。

图6：炭疽抗原芯片检测结果，其中A为抗LF单抗，B为抗PA单抗，C为炭疽抗血清，D为阴性对照。

图7：脊灰病毒抗原芯片探针点阵布局，其中1a至6a为IgG阳性对照；1b至1c为脊灰I型灭活病毒原液；2b至2c为脊灰I型灭活病毒1∶20稀释液；3b至3c为脊灰I型灭活病毒1∶400稀释液；4b至4c为脊灰I型灭活病毒1∶8000稀释液；5b至5c为脊灰II型灭活病毒原液；6b至6c为脊灰II型灭活病毒1∶20稀释液；1d至1e为脊灰II型灭活病毒1∶400稀释液；2d至2e为脊灰II型灭活病毒1∶8000稀释液；3d至3e为脊灰III型灭活病毒原液；4d至4e为脊灰III型灭活病毒1∶20稀释液；5d至5e为脊灰III型灭活病毒1∶400稀释液；6d至6e为脊灰III型灭活病毒1∶8000稀释液；1f至4f为脊灰疫苗糖丸处理液；5f至6f为BSA阴性对照。

图8：脊灰病毒抗原芯片检测结果，其中A-I为接种过脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸的儿童血清样本，J为阴性对照血清。

图9：吸附白破联合疫苗与麻腮风联合减毒活疫苗芯片探针点阵布局，其中1a至5a、1b至1e为IgG阳性对照；2b至2c为未处理的吸附白破联合疫苗液；3b至3c为重铬酸钾稀盐酸混合液处理的吸附白破联合疫苗液；4b至4c为饱和碳酸钠溶液处理的吸附白破联合疫苗液；2d至2e为未处理的麻腮风联合减毒活疫苗液；3d至3e为饱和碳酸钠溶液处理的麻腮风联合减毒活疫苗液；4d至4e为重铬酸钾稀盐酸混合液处理的麻腮风联合减毒活疫苗液；5b至5e为BSA阴性对照。

图10：吸附白破联合疫苗与麻腮风联合减毒活疫苗芯片检测结果，其中A为阴性对照血清，B和C为接种过吸附白破联合疫苗的新兵血清样本，D为接种过麻腮风联合减毒活疫苗的新兵血清样本。

图11：国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片的外观示意图及探针点阵布局，其中1a至8a为IgG阳性对照；1b至1d为麻疹病毒H蛋白；2b至2d为风疹病毒E1蛋白；3b至3d为腮腺炎病毒NP蛋白；4b至4d为甲肝病毒vp1蛋白；5b至5d为甲肝病毒vp3蛋白；6b至6d为HBsAg；7b至7d为乙脑病毒E蛋白；8b至8d为脊髓灰质炎病毒D抗原(I，II，III型)；1e至1g为百日咳FHA；2e至2g为白喉毒素；3e至3g为破伤风毒素；4e至4g为Ag85B抗原；5e至5g为出血热病毒NP蛋白；6e至6g为炭疽杆菌PA蛋白；7e至7g为钩端螺旋体混合抗原；8e至8g为A群脑膜炎球菌荚膜多糖；1h至8h为BSA阴性对照。

图12：3种信号检测方法对比图，其中1为荧光法，2为一步法金标银染可视化法，3为两步法金标银染可视化法，A-I为儿童血清样本，J为阴性对照血清。

图13：常用疫苗保护性抗体检测蛋白芯片探针点阵布局，其中1a至6a为IgG阳性对照；1b至1d为麻疹病毒H蛋白；2b至2d为风疹病毒E1蛋白；3b至3d为腮腺炎病毒NP蛋白；4b至4d为HBsAg；5b至5d为乙脑病毒E蛋白；6b至6d为A群脑膜炎球菌荚膜多糖；1e至1g为百日咳FHA；2e至2g为白喉毒素；3e至3g为破伤风毒素；4e至4g为甲肝病毒vp1蛋白；5e至5g为甲肝病毒vp3蛋白；6e至6g为BSA阴性对照。

图14：3种信号检测方法灵敏度对比图，其中1为荧光法，2为一步法金标银染可视化法，3为两步法金标银染可视化法，用于反应的血清稀释度依次为1∶5、1∶10、1∶25、1∶50、1∶100。

具体实施方式

实施例1部分病种病原体保护性抗原的处理

一、材料

A群脑膜炎球菌多糖疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司；炭疽杆菌裂解液由王希良教授惠赠；脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸购自中国医学科学院医学生物学研究所；脊髓灰质炎灭活病毒(I，II，III型)取自解放军302医院；吸附白喉破伤风联合疫苗购自上海生物制品研究所；麻腮风联合减毒活疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司；醛基化的玻璃片基购自CEL Associates公司；Cy3标记羊抗人IgG购自sigma公司。

二、方法与结果

1.不同方法处理A群脑膜炎球菌多糖疫苗效果对比

(1)A群脑膜炎球菌多糖疫苗的处理

将A群脑膜炎球菌多糖疫苗(干粉)用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)复溶，使多糖浓度为1.5mg/mL，用3种不同的方法处理疫苗液：①取20微升疫苗液加入5微升饱和碳酸钠溶液，混匀，4℃静置2h；②取20微升疫苗液加入2微升重铬酸钾与稀盐酸混合液(饱和重铬酸钾溶液与1M盐酸溶液100∶1混合)，混匀，4℃静置2h；③取20微升疫苗液加入80微升无水乙醇，震荡混匀，充分反应10min后，10000rpm离心5min，弃上清，沉淀复溶于10微升0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中。并设未处理的疫苗液作为对照。

(2)处理效果的对比

将各疫苗液与点样液9∶1混匀，用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，探针点阵的布局见附图2。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。将阳性血清与阴性对照用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)以1∶5稀释，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。将Cy3标记羊抗人IgG以1∶400稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。扫描结果见附图3，可知饱和碳酸钠溶液处理的疫苗液处理的疫苗液效果最好，检出率最高。

2.炭疽裂解液中PA蛋白的PAGE纯化与免疫性验证

(1)炭疽裂解液中PA蛋白的PAGE纯化

用Western Blot检测炭疽裂解液中的蛋白PA，对炭疽裂解液中的PA蛋白进行PAGE纯化，纯化的抗原进行SDS-PAGE分析，结果表明获得了纯度较高的蛋白(图4)。

(2)验证所纯化PA蛋白的免疫性

用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，探针点阵的布局见附图5。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。将单抗、阳性血清与阴性对照用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)稀释，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。每个反应区加入Cy3标记的二抗10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。扫描结果见附图6，可知纯化后的PA蛋白较其他炭疽抗原特异性和灵敏性均较好。

3.脊髓灰质炎灭活病毒与脊灰疫苗糖丸作为探针的效果对比

(1)灭活病毒与糖丸的处理

将三个血清型的脊灰灭活病毒用生理盐水分别以1∶1、1∶20、1∶400、1∶8000稀释。脊灰疫苗糖丸研成粉末，取0.3g溶于250微升生理盐水中，震荡混匀后加入750微升无水乙醇，充分震荡混匀，10000rpm离心5min，弃上清，沉淀于4℃敞口过夜，使乙醇充分挥发后复溶于100微升生理盐水中。

(2)不同探针效果的对比

用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，探针点阵的布局见附图7。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。将阳性血清与阴性对照用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)以1∶5稀释，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。将Cy3标记羊抗人IgG以1∶400稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。扫描结果见附图8，可知处理后的脊灰疫苗糖丸作为探针的效果明显好于灭活病毒。

4.不同方法处理吸附白喉破伤风联合疫苗与麻腮风联合减毒活疫苗效果对比

(1)吸附白喉破伤风联合疫苗与麻腮风联合减毒活疫苗的处理

将吸附白破联合疫苗与麻腮风联合减毒活疫苗分别用2种不同的方法处理疫苗液：①取20微升疫苗液加入5微升饱和碳酸钠溶液，混匀，4℃静置2h；②取20微升疫苗液加入2微升重铬酸钾与稀盐酸混合液(饱和重铬酸钾溶液与1M盐酸溶液100∶1混合)，混匀，4℃静置2h。并设未处理的疫苗液作为对照。

(2)处理效果的对比

用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，探针点阵的布局见附图9。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。将阳性血清与阴性对照用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)以1∶5稀释，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。将Cy3标记羊抗人IgG以1∶400稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。扫描结果见附图10，可知吸附白喉破伤风联合疫苗以饱和碳酸钠溶液处理的效果最好，而麻腮风联合减毒活疫苗则是以重铬酸钾与稀盐酸混合液处理的效果最好。

实施例2国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片探针点阵设计和芯片制备

一、材料

HBsAg由本室表达并保存；麻疹病毒H蛋白、风疹病毒E1蛋白、腮腺炎病毒NP蛋白、甲肝病毒vp1和vp3蛋白、乙脑病毒E蛋白、结核杆菌Ag85B抗原购自abcam公司；IgG、BSA、百日咳杆菌FHA、白喉毒素、破伤风毒素购自sigma公司；脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸购自中国医学科学院医学生物学研究所；A群脑膜炎球菌多糖疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司；出血热病毒NP蛋白由梁米芳教授惠赠；炭疽杆菌PA蛋白由本室纯化；钩端螺旋体抗原由端青教授惠赠；醛基化的玻璃片基购自CEL Associates公司。

二、方法与结果

1.国家免疫规划病种各病原微生物保护性抗原的选择

根据《中华人民共和国药典》(2010版三部)中收录的国家免疫规划疫苗及其相关的有效抗原成分，及近年来相关文献对于所述免疫规划病种病原微生物保护性抗原的报道，选择的各病原体保护性抗原如表1所示。

表1.国家免疫规划病种病原微生物保护性抗原及点样浓度

本发明是以各捕获探针在其最适点样浓度下点制而成的蛋白芯片。

2.国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片探针点阵的设计

设计了由国家免疫规划病种各病原微生物保护性抗原组成的反应矩阵，每个矩阵上点有各病原体的保护性抗原、阴性对照(BSA)和阳性对照(IgG)，每种抗原设3个平行点。图11为国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片的外观示意图及探针点阵布局模式图，其中1a至8a为IgG阳性对照；1b至1d为麻疹病毒H蛋白；2b至2d为风疹病毒E1蛋白；3b至3d为腮腺炎病毒NP蛋白；4b至4d为甲肝病毒vp1；5b至5d为甲肝病毒vp3蛋白；6b至6d为HBsAg；7b至7d为乙脑病毒E蛋白；8b至8d为脊髓灰质炎病毒D抗原(I，II，III型)；1e至1g为百日咳FHA；2e至2g为白喉毒素；3e至3g为破伤风毒素；4e至4g为Ag85B抗原；5e至5g为出血热病毒NP蛋白；6e至6g为炭疽杆菌PA蛋白；7e至7g为钩端螺旋体混合抗原；8e至8g为A群脑膜炎球菌荚膜多糖；1h至8h为BSA阴性对照。

3.国家免疫规划病种保护性抗体检测蛋白芯片的制备

用厚约50微米的防水纸制成方形格栅，将其紧密贴于醛基化的玻片上，使玻片分割成10个相互分开的方形小区，每个区的边长为7毫米。然后将各抗原用0.01mol/LPBS(pH＝7.4)溶解稀释至最适点样浓度，用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)点到醛基化玻片上的各个方形小区中，这样就得到了包含10个完全一样探针矩阵的反应区的芯片，探针点阵的布局及芯片示意图见附图11。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。

实施例3蛋白芯片检测血清标本中的保护性抗体

一、材料

Cy3标记羊抗人IgG、纳米金标记羊抗人IgG、HRP标记羊抗人IgG购自sigma公司；纳米金复合底物(Nanogold-DAB)、银增强试剂A和B液由本室制备和保存。

二、方法与结果

取上面实施例制备好的蛋白芯片平衡至室温，将血清样本用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)以1∶5稀释，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。

1.荧光显色

将Cy3标记羊抗人IgG以1∶400稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。

2.一步法金标银染可视化显色

将纳米金标记羊抗人IgG以1∶40稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，再用双蒸水洗涤3次后晾干。将银增强试剂A和B液等体积混匀，每个反应区加入20微升并迅速展开铺匀，避光作用5分钟，再用双蒸水洗涤3次后晾干。目视或使用本室自制扫描仪分析各点的显色强度。

3.两步法金标银染可视化显色

将HRP标记羊抗人IgG以1∶5000稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。每个反应区加入10微升纳米金复合底物(Nanogold-DAB)，芯片置于37℃湿孵20分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，再用双蒸水洗涤3次后晾干。将银增强试剂A和B液等体积混匀，每个反应区加入20微升并迅速展开铺匀，避光作用5分钟，再用双蒸水洗涤3次后晾干。目视或使用本室自制扫描仪分析各点的显色强度。

三种显色方法结果如图12所示，结果具有较好的一致性，且两步法金标银染可视化显色灵敏度明显较其它两种高。

实施例4三种显色方法的检测灵敏度对比

一、材料

HBsAg由本室表达并保存；麻疹病毒H蛋白、风疹病毒E1蛋白、腮腺炎病毒NP蛋白、甲肝病毒vp1和vp3蛋白、乙脑病毒E蛋白购自abcam公司；IgG、BSA、百日咳杆菌FHA、白喉毒素、破伤风毒素购自sigma公司；A群脑膜炎球菌多糖疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司；醛基化的玻璃片基购自CEL Associates公司；Cy3标记羊抗人IgG、纳米金标记羊抗人IgG、HRP标记羊抗人IgG购自sigma公司；纳米金复合底物(Nanogold-DAB)、银增强试剂A和B液由本室制备和保存。

二、方法与结果

用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，探针点阵的布局及芯片示意图见附图13。点样后将芯片于4℃放置10小时，于每个反应区中加入10微升封闭液0.01mol/L PBS(25％FCS，0.04％蔗糖，pH＝7.4)并展开铺匀，于37℃湿孵2小时，以封闭片基表面未结合的空白位点。孵育结束后甩去封闭液，用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后置于4℃保存备用。

取上述制备好的蛋白芯片平衡至室温，将血清样本用样本稀释液0.01mol/L PBS(25％FCS，pH＝7.4)稀释成1∶5、1∶10、1∶25、1∶50、1∶100，于每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干后准备显色。

1.荧光显色

将Cy3标记羊抗人IgG以1∶400稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。然后用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。

2.一步法金标银染可视化显色

将纳米金标记羊抗人IgG以1∶40稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，再用双蒸水洗涤3次后晾干。将银增强试剂A和B液等体积混匀，每个反应区加入20微升并迅速展开铺匀，避光作用5分钟，再用双蒸水洗涤3次后晾干。目视或使用本室自制扫描仪分析各点的显色强度。

3.两步法金标银染可视化显色

将HRP标记羊抗人IgG以1∶5000稀释，每个反应区加入10微升，芯片置于37℃湿孵30分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，晾干。每个反应区加入10微升纳米金复合底物(Nanogold-DAB)，芯片置于37℃湿孵20分钟。用洗涤液PBST(0.01mol/L，0.05％Tween-20，pH＝7.4)轻摇洗净芯片3次，每次20秒，再用双蒸水洗涤3次后晾干。将银增强试剂A和B液等体积混匀，每个反应区加入20微升并迅速展开铺匀，避光作用5分钟，再用双蒸水洗涤3次后晾干。目视或使用本室自制扫描仪分析各点的显色强度。

三种显色方法检测灵敏度对比结果如图14所示，两步法金标银染可视化显色比荧光法的检测灵敏度提高10倍以上，比一步法金标银染可视化显色的检测灵敏度提高2倍以上。

Claims (8)

1.一种利用蛋白芯片技术检测疫苗保护性抗体的方法及其在评价疫苗接种效果中的应用，其特征在于由表面经过处理的片基、捕获抗原及显色试剂组成，捕获抗原固定于片基表面，待测样品中的保护性抗体能与特定的捕获抗原特异性结合而锚定在芯片相应位置上，经显色试剂显色后通过信号扫描等分析即可判定每份样品中是否含有各种疫苗的保护性抗体。

2.根据权力要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述捕获抗原为多种疫苗对应病种病原体的保护性抗原也可为相应疫苗经不同处理方法处理后的抗原物质，每一种捕获抗原对应检测一个病种的保护性抗体，所有的捕获抗原以矩阵形式点在表面经过处理的片基上，这样通过一次反应就能同时检测多种抗体。

3.根据权力要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述疫苗对应病种病原体包括麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、结核杆菌、出血热病毒、炭疽杆菌、钩端螺旋体和脑膜炎奈瑟菌等，对应的疫苗包括麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、乙脑疫苗、脊灰疫苗、百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、卡介苗、出血热疫苗、炭疽疫苗、钩体疫苗和A群流脑疫苗等。

4.根据权力要求1和2所述的蛋白芯片，其特征在于，所述疫苗的不同处理方法为：将疫苗液浓缩后，用饱和碳酸钠溶液以去除氢氧化铝等佐剂、重铬酸钾与稀盐酸混合液去除明胶等保护剂或用乙醇沉淀疫苗中的抗原物质。

5.根据权力要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述显色试剂为已标记报告分子的能与待测抗体结合的蛋白，如二抗、Protein A/G。

6.根据权力要求1和5所述的蛋白芯片，其特征在于，报告分子可为Cy3、Cy5、FITC、Nanogold或HRP，标记物不同拥有不同的信号检测方法。

7.根据权力要求1和6所述的蛋白芯片，其特征在于，包括以下信号检测方法：

(1)Cy3、Cy5或FITC标记：直接置于荧光扫描仪中显示并分析结果；

(2)Nanogold标记：各反应区加入适量银增强试剂显色，避光反应数分钟后用水终止反应，可直接用肉眼观察结果，也可用普通扫描仪分析结果；

(3)HRP标记：各反应区加入适量纳米金复合底物(Nanogold-DAB)后，再加入适量银增强试剂显色，避光反应数分钟后用水终止反应，可直接用肉眼观察结果，也可用普通扫描仪分析结果，灵敏度较现有方法提高10-100倍。

8.权力要求1和2所述的蛋白芯片可被分隔成多个反应区，最佳为2-12个，每个反应区点制有相同的捕获抗原阵列，这样通过一次反应就能同时检测多份标本。

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