CN101587121A - 一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法。本发明提供的方法是将灭活的待测血清与禽流感病毒混合，将得到病毒－血清混合物与禽流感病毒的宿主细胞共培养，以抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗体为一抗，进行酶联免疫反应，确定待测血清中所述禽流感病毒血清中和抗体的效价。本发明的方法可用于检测禽流感疫苗的有效性。本发明提供的方法具有客观性强，便于标准化；所需时间短；可以在BSL－2实验室进行；可进行高通量检测，结果客观；方法稳定可靠的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法。
背景技术
禽流感(avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒(AIV)引起的一种家禽和野禽的感染或疾病综合征，鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等均可感染。这种高度接触性的传染病可呈无症状感染、不同程度的呼吸道症状、产蛋率下降，以至引起头冠和肉髯紫黑色、呼吸困难、下痢、腺胃乳头和肌胃角膜下等器官组织广泛性出血、胰脏坏死、纤维素性腹膜炎、甚至100％致死率的急性败血症。野鸟或者侯鸟是AIV的自然宿主，现已证实禽流感病毒可以由家禽直接感染人，具有重要的公共卫生学意义。
根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，可将禽流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型。其中H5亚型和H7亚型为高致病性禽流感(highly Pathogenic AvianInfluenza，HPAI)，传播迅速、病程短，可引起家禽大批死亡，给养禽业造成严重损失。此外，越来越多的证据表明，HPAIV还可以突破种间障碍，感染人并造成发病和死亡。因此，世界动物卫生组织将HPAI列入必须通报的疾病名录，我国也将其定为一类动物传染病。
按照国际上通行的对动物疫苗的评价方法，必须进行攻毒试验，对于禽流感疫苗来说，也就是说给鸡(动物)先免疫以后，再用毒株进行攻击，看它是否会发病。如果未发病，通过检测血凝抑制抗体和/或保护性抗体也就是中和抗体的效价来确定疫苗的效力大小。传统的禽流感病毒中和抗体的检测主要采用全程细胞培养法，该方法通过观察细胞病变(CPE)判断结果，主观性强；细胞病变一般要通过连续观察5-7天才能最后确定结果，需要时间长；而且高致病性禽流感抗体检测必须在BSL-3实验室进行；一次检测标本量少，难以一次大量检测；该方法难以商品化。
发明内容
本发明提供了一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法。
本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法，依次包括以下步骤：
1)将灭活的待测血清原液进行倍比稀释后，分别与禽流感病毒混合，得到病毒-血清混合物；
2)将步骤1)中的病毒-血清混合物与禽流感病毒的宿主细胞共培养；
3)以抗流感病毒NP蛋白的抗体为一抗，进行酶联免疫反应，确定待测血清中所述禽流感病毒血清中和抗体的效价。
上述步骤2)中，所述禽流感病毒的宿主细胞具体可为MDCK细胞、Vero细胞等。
上述步骤2)中，所述共培养的条件可为在37℃、5％CO2温箱中培养18-22小时。
上述步骤3)中，所述抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
为了提高检测结果的可靠性，所述方法中设置有阴性血清对照、阳性血清对照、阴性细胞对照和阳性细胞对照。
所述阴性血清对照为未感染禽流感病毒的动物血清；所述阳性血清对照为感染禽流感病毒的动物血清；所述阴性细胞对照为未感染禽流感病毒的宿主细胞；所述阳性细胞对照为感染禽流感病毒的宿主细胞。
本发明的方法可用于初步检测禽流感疫苗的有效性，在实际应用中，可结合其他方法对禽流感疫苗进行综合评价。
本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法，具有如下优点：
1、检测方法采用细胞培养与ELISA检测方法结合，客观性强，便于标准化。
2、实验可以在36小时内完成，大大缩短了确定结果的时间。
3、该方法不仅可以在BSL-3实验室进行，也可以在BSL-2实验室进行，扩大了实验操作的范围。
4、标本可以进行高通量检测，结果计算有客观的指标。
5、方法中所用的试剂可以装配成试剂盒进行商品化。
6、自制配套试剂，方法稳定可靠。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为96孔板布局图。
具体实施方式
本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法包括病毒中和试验和ELISA检测两个步骤。
病毒中和试验包括：
1)将灭活的血清原液倍比稀释；
2)将步骤1)的血清与200TCID50病毒液等体积比混合；
3)病毒-血清混合物于37℃，5％CO2反应1小时。
4)将步骤3)的病毒-血清混合物与宿主细胞混合，37℃、5％CO2温箱中培养18-22小时。其中，病毒-血清混合物与宿主细胞混合方式有两种，一种是将细胞加入病毒-血清混合物中，另一种是将病毒-血清混合物加入细胞长成单层的培养板孔中。
ELISA检测包括：
1)吸出过夜细胞培养液，80％冷丙酮固定15-20分钟，晾干；
2)分别加入抗流感病毒NP蛋白单克隆抗体，37℃培养箱作用60分钟，清洗，拍干；
3)分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃作用45分钟，清洗，拍干；
4)辣根过氧化物酶显色，测定OD值；
5)通过细胞半数感染阈值计算血清中和抗体的效价。
上述检测方法中设置了阴性血清对照、阳性血清对照、阴性细胞对照和阳性细胞对照。
上述细胞半数感染阈值的计算公式如下：
X＝(VC-CC)/2+CC
注：X：为细胞半数感染阈值；VC：为阳性细胞对照平均OD值；
CC：为阴性细胞对照平均OD值。
上述血清中和抗体的效价的计算方式如下：
若被检血清孔的OD值小于X值，则该孔血清能保护50％的细胞不被病毒感染。以能保护50％细胞不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点，用中和抗体的效价表示。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例、检测禽流感疫苗免疫动物血清中针对禽流感病毒的中和抗体
一、中和抗体检测
(一)病毒滴度测定(组织培养半数感染量-TCID50滴定)
1.配制病毒稀释液
病毒稀释液的配制方法如下：
RPMI1640+1％牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。
429毫升 RPMI1640
66毫升 7.5％牛血清白蛋白(BSA)
5毫升 青霉素与链霉素混合物(10000单位/毫升)
2、病毒的稀释
1)取1管禽流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-rg(美国CDC，Safety and immunogenicityof an inactivated subvirion influenza A(H5N1)vaccine.N Engl J Med2006；354：1343-51.)，1∶100稀释(100微升病毒液+9.9毫升稀释液)。
2)将1∶100稀释过的病毒液做系列半对数稀释，使之成为原病毒液的10-2、10-2.5、10-3、10-3.、5……10-7。每个稀释度的病毒液取100微升加至细胞培养板中。
3、MDCK细胞的准备
1)使用前2天将MDCK细胞1∶100传代，使之70-90％成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高(大于30代)将使细胞对病毒的敏感性降低。
2)弃去细胞培养液，用PBS洗细胞两次，然后弃去，以去除牛血清。
3)加1.5毫升0.25％胰酶覆盖细胞(25cm2的细胞培养瓶中)，37℃、5％CO2温箱中消化3-8分钟。
4)待细胞开始脱落时，加5-10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞。
5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，用1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。
6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。
7)加100微升细胞(1.5×104细胞/孔)于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。
8)在37℃、5％CO2温箱中培养18-22小时。
4、测定组织细胞半数感染剂量(TCID50)
1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞两次。
2)弃去PBS(不要让细胞干燥)，加入100微升/孔固定液。
3)覆盖微量培养板，于室温固定细胞15-20分钟。
4)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。
5)用ELISA检测细胞感染。
6)利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度(OD)值，计数细胞阴性对照孔的平均OD值。
7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。
8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算。
(二)病毒中和试验
1、血清的准备和稀释
禽流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-rg(美国CDC，Safety and immunogenicity of aninactivated subvirion influenza A(H5N1)vaccine.N Engl J Med2006；354：1343-51.)56℃加热灭活30分钟后免疫Balb/C小鼠，不同时间采集血清进行检测。
待检动物血清56℃加热灭活30分钟。灭活后的血清用病毒稀释液稀释为原浓度的1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120。
将未感染禽流感病毒的动物血清作为阴性血清，56℃加热灭活30分钟。灭活后的血清用病毒稀释液稀释为原浓度的1/80和1/160。
将已感染禽流感病毒并产生中和抗体的动物血清作为阳性血清(哈尔滨兽医研究所)。56℃加热灭活30分钟。灭活后的血清用病毒稀释液稀释为原浓度的1/100和1/200。
2、病毒的准备
1)用病毒稀释液稀释步骤(一)得到的病毒液，使100μl中含有200TCID50禽流感病毒。
2)分别取上述不同稀释度的待检血清稀释液、阴性血清稀释液、阳性血清稀释液各120μl，分别加入120μl 200TCID50病毒液，使病毒-血清混合物混匀。
3)病毒-血清混合物于37℃，5％CO2反应1小时，30分钟时混匀一次。
3、在96孔板中，每孔加入100μl MDCK细胞液(1.5×104细胞/孔)，200μl PBS清洗含有细胞的培养板孔2次(注意最后一次将PBS尽量吸干净)
4、在加入细胞液的96孔板中分别加入病毒-血清混合物、病毒液、病毒稀释液，见表1，将96孔板在37℃、5％CO2温箱中培养22小时。
96孔板如图1，具体布局见表1。
如表1所示，向进行完步骤3操作的96孔板的80个孔中，每孔加入步骤2制备的病毒-待测血清混合物100μl。每个96孔板进行8个样品的检测，其中每个样品血清占据10个孔(血清浓度分别为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120)。每板含有2个阳性血清对照孔，分别加入100μl 1/100的病毒-阳性血清混合物和100μl 1/200的病毒-阳性血清混合物。每板含有2个阴性血清对照孔，分别加入100μl 1/80的病毒-阴性血清混合物和100μl 1/160的病毒-阴性血清混合物。每板含有5个阳性细胞对照孔，每个孔分别加入50μl的200TCID50病毒液、50μl病毒稀释液。每板含有5个阴性细胞对照孔，每个孔分别加入100μl病毒稀释液。每板含有2个空白对照孔，不加任何试剂。实验设三次重复。
(三)ELISA检测
1、吸出过夜细胞培养液，用200μl/孔PBS清洗2遍，加入200μl PBS配置的80％冷丙酮固定15-20分钟，晾干备用(也可4℃保存)。
2、每孔加入1∶25000的抗流感病毒NP蛋白单克隆抗体(HB-65 H16-L10-4R5，北京百星高科开发公司)100μl(注意空白不加)，放置37℃培养箱作用60分钟，用PBS洗液洗5次后将液体拍干。
3、每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(GAM-IgG-HRP，北京万泰生物科技公司)。37℃作用45分钟，用PBS洗液洗5次后将液体拍干。
4、每孔加A液(用5毫升无水乙醇溶解5mg四甲基联苯胺，以1∶4的比例与醋酸盐缓冲液混合)50μl，B液(0.03％的H2O2水溶液)50μl，避光反应15分钟后加终止液(2M硫酸)50μl，酶联检测仪450nm波长测定OD值。
结果见表2。
表2OD值检测结果
| 0.137 | 0.103 | 0.146 | 0.184 | 0.293 | 0.382 | 0.417 | 0.522 | 0.473 | 0.522 | 0.047 | 0.077 |
| 0.095 | 0.112 | 0.096 | 0.070 | 0.084 | 0.096 | 0.115 | 0.275 | 0.330 | 0.423 | 0.085 | 0.080 |
| 0.436 | 0.403 | 0.335 | 0.325 | 0.324 | 0.334 | 0.378 | 0.347 | 0.297 | 0.408 | 0.458 | 0.436 |
| 0.095 | 0.125 | 0.114 | 0.128 | 0.192 | 0.351 | 0.382 | 0.384 | 0.344 | 0.427 | 0.433 | 0.475 |
| 0.079 | 0.100 | 0.091 | 0.155 | 0.246 | 0.439 | 0.387 | 0.417 | 0.337 | 0.473 | 0.065 | 0.465 |
| 0.107 | 0.090 | 0.089 | 0.089 | 0.118 | 0.160 | 0.434 | 0.371 | 0.433 | 0.418 | 0.438 | 0.499 |
| 0.098 | 0.097 | 0.095 | 0.132 | 0.293 | 0.477 | 0.455 | 0.488 | 0.387 | 0.489 | 0.049 | 0.055 |
| 0.103 | 0.090 | 0.112 | 0.208 | 0.230 | 0.468 | 0.528 | 0.429 | 0.457 | 0.552 | -0.002 | 0.000 |
5、通过细胞半数感染阈值计算血清中和抗体的效价。
计算公式：
X＝(VC-CC)/2+CC
注：X：为细胞半数感染阈值；VC：为阳性细胞对照平均OD值；
CC：为阴性细胞对照平均OD值。
结果判定：若被检血清孔的OD值小于X值，则该孔血清能保护50％的细胞不被病毒感染。以能保护50％细胞不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点，用中和抗体的效价表示。
CC＝(0.047+0.077+0.085+0.080)/4＝0.07225，
VC＝(0.458+0.436+0.433+0.475)/4＝0.4505，
X＝(0.07225+0.4505)/2＝0.261。
8个样本的中和抗体效价结果见表3。
二、检测结果的验证
采用传统的观察CPE检测方法检测待检血清中H5N1中和抗体。
(一)病毒滴度测定
同步骤一的(一)。
(二)病毒中和试验
同步骤一的(二)。
(三)CPE检测
观察5-7天，每天记录细胞病变(CPE)出现情况，最终按CPE的孔数计算中和抗体的效价。
8个样本的中和抗体效价结果见表3。
表3中和抗体与CPE结果
| 编号 | 中和抗体法(ELISA-MN) | 传统方法(CPE-MN) |
| R034(样本S1) | 1∶80 | 1∶223.8 |
| R035(样本S2) | 1∶640 | 1∶223.8 |
| R010(样本S3) | ＜1∶10 | ＜1∶10 |
| R040(样本S4) | 1∶160 | 1∶112.2 |
| R041(样本S5) | 1∶160 | 1∶112.2 |
| R042(样本S6) | 1∶320 | 1∶112.2 |
| R043(样本S7) | 1∶80 | 1∶112.2 |
| R044(样本S8) | 1∶160 | 1∶112.2 |
结果表明，本发明提供的新方法具有以下优点：
1)相对于CPE-MN方法ELISA-MN检测敏感度高。
2)ELISA-MN检测需要的时间短，30小时内出结果，CPE-MN方法需要5-7天。
3)CPE-MN方法必须在生物安全三级实验室得出准确结果。
4)ELISA-MN检测可标准化，比CPE-MN方法更客观。
Claims (6)
1、一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法，依次包括以下步骤：
1)将灭活的待测血清原液进行倍比稀释后，分别与禽流感病毒混合，得到病毒-血清混合物；
2)将步骤1)中的病毒-血清混合物与禽流感病毒的宿主细胞共培养；
3)以抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗体为一抗，进行酶联免疫反应，确定待测血清中所述禽流感病毒血清中和抗体的效价。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述禽流感病毒的宿主细胞为MDCK细胞或Vero细胞。
3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述共培养的条件为在37℃、5％CO2温箱中培养18-12小时。
4、如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
5、如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中设置有阴性血清对照、阳性血清对照、阴性细胞对照和阳性细胞对照。
6、权利要求1-5中任一所述的方法在检测禽流感疫苗有效性中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008101119065A CN101587121A (zh) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | 一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102175874A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-09-07 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种疫苗免疫效果评价蛋白芯片的制备及用途 |
| CN104062443A (zh) * | 2014-07-14 | 2014-09-24 | 江苏省疾病预防控制中心 | 一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用 |
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2008
- 2008-05-19 CN CNA2008101119065A patent/CN101587121A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THOMAS ROWE等: "《Detection of antibody to avian influenza A (H5N1)virus in human serum by using a combination of serologic assays, Journal of clinical microbiology》", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20091125 |