CN104062443A - 一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体检测中的应用。通过原核表达发热伴血小板减少综合征病毒NP蛋白，制备针对NP蛋白的鼠源单抗或多抗。通过酶联免疫吸附法检测NP蛋白来测定确定病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)。将待检标本与等量病毒液混合接种细胞。用NP蛋白的单抗或多抗为1抗，通过双抗体酶联免疫吸附法检测标本中和抗体效价。本发明可应用在发热伴血小板减少综合征疫苗的临床免疫效果评价、人群或动物群发热伴血小板减少综合征血清流行病学研究，以及人工制备发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的体外效价测定和评估等方面。本发明提供的方法具有敏感、快速、特异和通量高等特点。

Description

一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发热伴血小板减少综合症病毒中和抗体定量检测中的应用。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是我国近年来新发现的由布尼亚病毒引起的一种出血性疾病，病原称之为SFTS病毒。本病主要分布山区和丘陵地带的农村，呈散发，人群普遍易感。临床表现为发热，体温多在38℃以上，伴乏力、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。绝大部分患者预后良好，但部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭死亡，重症死亡率高达15-30％。目前在我国的河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏、浙江等地都发现了SFTS病例。近期在日本、韩国和美国都发现了由SFTS相关病毒引起的病例，表明病毒的分布范围较广，已成为威胁人类健康和公共卫生的重要新发传染病。。此外，在该病毒能够感染猪、羊、牛、犬、禽等动物，对动物健康也有潜在的威胁。
病毒的特异性中和抗体水平能够反应个体或群体的抗病毒状态，同时也常用来评价疫苗的临床免疫效果，因此检测中和抗体具有重要的临床和流行病学意义。目前检测SFTS病毒中和抗体方法主要是通过观察细胞病变或免疫荧光法来进行，耗时、费力、敏感性差，而且不能同时检测大量标本。此外，SFTS病毒感染细胞(如Vero)后细胞病变不明显，更增加了检测中和抗体的难度。NP蛋白较为保守，在病毒粒子中含量丰富。运用酶联免疫吸附法，通过双抗体法检测病毒NP蛋白，在此基础上可以建立一种快速、敏感、可实现大量自动检测的SFTS病毒中和抗体检测方法。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种病毒中和抗体定量检测试剂盒及其在发热伴血小板减少综合症病毒中和抗体定量检测中的应用。检测的标本包括人和动物血清、人工制备的单抗或多抗或其它基因工程抗体。
本发明提供的定量检测发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的试剂盒由96孔细胞板、Vero细胞、100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig，底物四甲基 联苯胺(TMB)显色剂组成。
本发明所述发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的定量检测试剂盒的制备原理:
(1)原核表达发热伴血小板减少综合征病毒NP蛋白，免疫小鼠制备针对NP蛋白的单抗或多抗；
(2)采用组织细胞半数感染量(TCID50)测定病毒的滴度，通过酶联免疫吸附法检测NP蛋白来确定细胞感染状况；
(3)将待检血清倍比稀释，与等量的100TCID50病毒混合，接种细胞，在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h；
(4)用NP蛋白的单抗或多抗为1抗，通过双抗体酶联免疫吸附法检测标本中和抗体效价。
上述过程所用的细胞包括Vero、BHK-21、C6/36、DH82细胞。其使用方法为:
(1)抗体-病毒混合物和Vero细胞共培养：将系列倍比稀释的待检抗体和100TCID50/50μL的稀释病毒液混合，放入37℃培养箱作用1h，每孔加100μl1.5x104细胞/孔的细胞，细胞培养板在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h；
(2)固定：用PBS液洗细胞2次，每孔加入80％的冰丙酮100μl，室温固定细胞10min；
(3)酶标仪检测：每孔加入稀释后的NP蛋白的单抗(抗体1)1000μl，室温作用1h，用250μl/次PBS+0.05％TWEEN-20洗涤液洗洗板4次，每孔加入100μl稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG(抗体2)，室温作用1h，用250μl PBS+0.05％TWEEN-20洗涤液洗涤板6次，每孔加入TMB底物100μl，室温放10min显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1M硫酸100μl终止反应，用450纳米酶标仪读出每孔OD值；
(4)结果判读：结果判定采用公式：X＝(VC平均OD值—CC平均OD值)/2，X表示50％的Vero细胞感染时的OD值，每孔OD值低于X值时，判定为中和抗体检测阳性，中和抗体阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体效价。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1).本发明根据酶联免疫吸附法原理，通过酶标记的双抗体检测NP蛋白来指示病毒的感染情况，极大的提供了特异性和敏感性。
(2).本发明提供的方法，不仅可以检测人和动物血清中和抗体，也能检测人工方法中和抗体，能够对中和抗体进行定性和定量检测。
(3).本发明提供的方法大大缩短了中和抗体检测时间，一般可在30小时内完成实验。
(4).本发明提供的中和抗体检测试剂盒，能够高通量对标本进行检测。快速、敏感、特异 可实现大量自动检测SFTS病毒中和抗体。
(5)本发明可应用在发热伴血小板减少综合征疫苗的临床免疫效果评价、人群或动物群发热伴血小板减少综合征血清流行病学研究，以及人工制备发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的体外效价测定和评估等方面。
附图说明
图1发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体检测96孔细胞培养板布置。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1：NP蛋白单抗和多抗的制备
通过RT-PCR法扩增SFTS病毒NP基因，阅读框插入表达质粒pQE30(Qiagen，Germany)的多克隆位点内，得到NP基因原核表达质粒pQE30-SFTS-NP,转化E.Coli M15菌株(Qiagen，Germany)，诱导表达6His-NP重组蛋白。NP重组蛋白纯化定量后，按常规方法免疫BALB/c小鼠，制备抗SFTS病毒NP蛋白的单抗和多抗。
实施例2：.病毒滴度测定
采用组织细胞半数感染量(TCID50)测定法。将-70℃冻存的病毒液100倍稀释。取1：100倍稀释的病毒液，在96孔细胞培养板上进行1/2log稀释，即10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10 －7。每孔含100μl病毒液，每个稀释度做4孔重复。
取对数生长期的细胞，用LEDTA-胰酶消化，用细胞培养液分散细胞，加病毒稀释液至10mL，用细胞计数板对细胞计数，将细胞稀释成1.5×105细胞/mL备用。已稀释好病毒的微量细胞培养板中，加100μl细胞(1.5x104细胞/孔)。细胞培养板最好一列做正常细胞(CC)对照。在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h。
用PBS液(PH7.2)的洗细胞2次，每孔加入80％的冰丙酮100μl，室温固定细胞10min。弃去固定液，让微量培养板室温干燥。(1)去除丙酮,用PBS洗涤微量培养板3次。每孔加入稀释后的抗SFTS病毒NP蛋白的单抗或多抗(抗体1)1000μl，室温作用1h。用250μl/次洗涤液洗(PBS+0.05％TWEEN-20)洗板4次。每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG(抗体2)，室温作用1h。用250μl洗涤液洗涤板6次。每孔加入四甲基联苯胺底物(TMB Substrate kit,Thermo Scientific公司)100μl。室温放10min左右显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1M硫酸100μl终止反应。用酶标仪(450纳米)读出每孔OD值。计算CC对照孔的平均OD值，接种不同稀释度病毒的孔平均OD值是CC对照孔平 均OD值2倍以上，则判断为病毒生长阳性。
根据Reed和Muench方法计算病毒的TCID50/100ml。
实施例3：中和抗体检测
在96孔细胞培养板上进行血清中和抗体效价检测。在96孔细胞板的每孔中加入50μl MEM细胞培养液(不含牛血清)。第一排中前11孔(A1～A11)在加入40μl病毒稀释液，使之成为90μl/每孔，加入10μl待检血清于第一排A1～A11，系列倍比稀释(A～H)为1：10、1：20、1：40...1：1280。稀释病毒至100TCID50/50mL。除CC孔(E12、F12、G12、H12)外,每孔加入50μl病毒工作液。孔A12、B12、C12和D12作为病毒接种对照(VC)孔。CC孔加入50μl MEM细胞培养液(不含牛血清)。另外，选择1列孔作病毒工作液滴度核实，每孔加入200TCID50/100mL，作系列倍比稀释，使之成为100TCID50，50，25，12，6,…..0.7，然后每孔加入50μl MEM细胞培养液使体积成为100μl/孔。混匀病毒－血清混合物，放37℃培养箱作用1h。每孔加100μl细胞(1.5x104细胞/孔)。细胞培养板孔E12、F12、G12和H12做正常细胞(CC)对照。在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h。
弃去微量培养板中的细胞液。用250μL PBS液(PH7.2)的洗细胞2次，每孔加入80％的冰丙酮100μl，室温固定细胞10min。弃去固定液，让微量培养板室温干燥。(1)去除丙酮,用PBS洗涤微量培养板3次。每孔加入稀释后的抗SFTS病毒NP蛋白的单抗或多抗(抗体1)1000μl，室温作用1h。用250μl/次洗涤液洗(PBS+0.05％TWEEN-20)洗板4次。每孔加入100μl稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG(抗体2)，室温作用1h。用250μl洗涤液洗涤板6次。每孔加入TMB底物100μl。室温放10min左右显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1M硫酸100μl终止反应。用酶标仪(450纳米)读出每孔OD值。
结果判定采用公式：X＝(VC平均OD值—CC平均OD值)/2。X表示50％的Vero细胞感染时的OD值。每孔OD值低于X值时，判定为中和抗体检测阳性，中和抗体阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体效价。
实施例4：检测试剂盒的制备
应用酶联免疫吸附原理，制备一种发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体定量检测试剂盒，试剂盒的组成部分为96孔细胞板、Vero细胞、100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig，底物四甲基联苯胺(TMB)显色剂等。具体检测步骤：
抗体-病毒混合物和Vero细胞共培养
按照图1所示布置检测抗体和相关对照。在96孔细胞板将待检抗体系列倍比稀释为1：10、 1：20、1：40...1：1280。稀释病毒至100TCID50/50mL。除CC孔(E12、F12、G12、H12)外,每孔加入50μl病毒工作液。孔A12、B12、C12和D12作为病毒接种对照(VC)孔，孔E12、F12、G12和H12做正常细胞(CC)对照。CC孔加入50μl MEM细胞培养液(不含牛血清)。混匀病毒－血清混合物，放37℃培养箱作用1h。每孔加100μl细胞(1.5x104细胞/孔)。细胞培养板在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h。
(2)固定
用250μL PBS液(PH7.2)的洗细胞2次，每孔加入80％的冰丙酮100μl，室温固定细胞10min。
(3)酶标仪检测
去除丙酮,用PBS洗涤微量培养板3次。每孔加入稀释后的NP蛋白的单抗(抗体1)1000μl，室温作用1h。用250μl/次洗涤液洗(PBS+0.05％TWEEN-20)洗板4次。每孔加入100μl稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG(抗体2)，室温作用1h。用250μl洗涤液洗涤板6次。每孔加入TMB底物100μl。室温放10min左右显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1M硫酸100μl终止反应。用酶标仪(450纳米)读出每孔OD值。
(4)结果判读
结果判定采用公式：X＝(VC平均OD值—CC平均OD值)/2。X表示50％的Vero细胞感染时的OD值。每孔OD值低于X值时，判定为中和抗体检测阳性，中和抗体阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体效价。

Claims (4)

1.一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒，其特征是由96孔细胞板、Vero细胞、100TCID50病毒液、NP蛋白单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig，底物四甲基联苯胺TMB显色剂组成。
2.根据权利要求1所述一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒的使用方法，其特征是由以下步骤构成:
(1)抗体-病毒混合物和Vero细胞共培养：将系列倍比稀释的待检抗体和100TCID50/50μL的稀释病毒液混合，放入37℃培养箱作用1h，每孔加100μl1.5x104细胞/孔的细胞，细胞培养板在37℃，5％CO2孵箱中培养20～24h；
(2)固定：用PBS液洗细胞2次，每孔加入80％的冰丙酮100μl，室温固定细胞10min；
(3)酶标仪检测：每孔加入稀释后的NP蛋白的单抗1000μl，室温作用1h，用250μl/次PBS+0.05％TWEEN-20洗涤液洗洗板4次，每孔加入100μl稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温作用1h，用250μl PBS+0.05％TWEEN-20洗涤液洗涤板6次，每孔加入TMB底物100μl，室温放10min显色，CC对照孔尚未变色时，每孔加入1M硫酸100μl终止反应，用450纳米酶标仪读出每孔OD值；
(4)结果判读：结果判定采用公式：X＝(VC平均OD值—CC平均OD值)/2，X表示50％的Vero细胞感染时的OD值，每孔OD值低于X值时，判定为中和抗体检测阳性，中和抗体阳性的血清最高稀释度即为血清的中和抗体效价。
3.权利要求1所述一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测中的应用。
4.权利要求1所述一种病毒中和抗体的定量检测试剂盒在发热伴血小板减少综合征疫苗的临床免疫效果评价或人群或动物群发热伴血小板减少综合征血清流行病学研究中的应用。
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