CN102391996A - 重组痘苗病毒天坛株及使用其检测痘苗病毒中和抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，还涉及痘苗病毒中和抗体检测方法以及包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株用于痘苗病毒中和抗体检测的用途。

Description

重组痘苗病毒天坛株及使用其检测痘苗病毒中和抗体的方法

技术领域：

本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及痘苗病毒中和抗体检测。 

背景技术

痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属中最为人们所熟悉的成员，也是目前已知结构上最为复杂的一种病毒。痘苗病毒天坛株(Vaccinia Tian Tan，VTT)曾作为天花病毒病的疫苗株在我国大量人群中长期使用，具有相对毒力较弱、使用安全和生物学性状清楚等特点，是研制基因工程重组痘苗病毒活疫苗及真核表达载体的理想毒株(McCurdy LH，Rutigliano JA，Johnson TR，Chen M，Graham BS.Modified vaccinia virus Ankara immunization protects against lethal challenge with recombinant vaccinia virus expressing murine interleukin-4.Journal of virology 2004Nov；78(22)：12471-9；Dai K，Liu Y，Liu M，Xu J，Huang W，Huang X，et al.Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes.Vaccine 2008Sep 15；26(39)：5062-71；以及Gomella LG，Mastrangelo MJ，McCue PA，Maguire HJ，Mulholland SG，Lattime EC.Phase i study of intravesical vaccinia virus as a vector for gene therapy of bladder cancer.The Journal of urology 2001Oct；166(4)：1291-5)。 

20世纪中叶，世界卫生组织(WHO)在全球开展了灭绝天花的运动。在这场运动中，世界范围内应用最广泛的痘苗病毒疫苗有4株：EM63株，李斯特(Lister)株，NYCBH株和天坛株，其中天坛株在中国人群中大量接种，其在中国天花消灭过程中发挥了重要作用。虽然自1980年WHO宣布全球消灭天花后，痘苗病毒天坛株疫苗停止接种使用(Bhattacharya S.Uncertain advances：a review of the final phases of the smallpox eradication program in India，1960-1980.American journal of public health 2004Nov；94(11)：1875-83)，但我国人群中仍存在针对痘苗病毒的中和抗体。这些中和抗体水平将直接影响各类痘苗病毒载体疫苗的应用效果。 

因此，在目前痘苗病毒被广泛作为载体研究疫苗的现状下，确切了解我国各年龄段人群针对天花病毒的免疫状态显得非常重要。因此，迫切需要建立一种高通量、灵敏度高可定量的针对痘苗病毒的中和抗体检测方法。 

目前，检测痘苗病毒中和抗体的方法基本有以下三类： 

1.噬斑抑制法：这是一种最为传统的中和抗体检测方法，被认为是“金标准”(董小曼，陈秀珍，董翊.天花疫苗天坛株病毒中和试验方法的建立和验证.中国医药生物技术2007；2(6)：464-6)。其理论依据为，痘苗病毒形成的单个噬斑被认为代表一个感染性病毒单位，因此，噬斑数量的减少直接和中和抗体水平相关联(Katz JB.The effect of the virus-serum incubation period upon vaccinia virus serum neutralization titers.Journal of biological standardization 1987Oct；15(4)：389-92)。该方法的主要缺点是检测周期长(4-7天)；检测通量低；结果分析主观性强；需要在6孔细胞培养板中分析，因此样品量较大。2008年，Maria教授采用96孔板分析中和抗体滴度降低了样品需求量，但仍需放大12.5倍后人工判读数据(Borges MB，Kato SE，Damaso CR，Moussatche N，da Silva Freire M，Lambert Passos SR，et al.Accuracy and repeatability of a micro plaque reduction neutralization test for vaccinia antibodies.Biologicals 2008Mar；36(2)：105-10)。而且，本方法很难标准化，不便于实验室间的推广。 

2.mRNA转录抑制法：为了克服各种痘苗病毒毒株间基因差异和检测周期较长的问题，2011年，德国Marit Kramshi教授利用实时荧光定量RT-PCR方法，通过检测痘苗病毒李斯特株mRNA转录的抑制水平评价中和抗体滴度。这种方法虽然可以将检测周期缩短至12小时并有效克服各种毒株之间基因差异的问题(Kramski M，Drozd A，Lichtfuss GF，Dabrowski PW，Ellerbrok H.Rapid detection of anti-Vaccinia virus neutralizing antibodies.Virology journal；8：139)，但最大的缺点是大大增加了检测的成本并对检测人员和实验环境的要求明显提高，并且不适合进行高通量分析。 

3.报告基因表达抑制法： 

2003年，美国国立卫生研究院Jody M教授利用包含β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因的重组痘苗病毒WR株建立了一种中和抗体检测方法，通过β-半乳糖苷酶催化底物发光值的下降程度，反映样品中痘苗病毒中和抗体水平的高低。本方法虽然具有灵敏度高、检测时间短以及可高通量的优点， 但是操作步骤繁琐的缺点非常明显。β-半乳糖苷酶催化底物发光反应的线性范围较窄，因此需要对培养上清进行系列稀释使发光值处于线性标准曲线范围内(Manischewitz J，King LR，Bleckwenn NA，Shiloach J，Taffs R，Merchlinsky M，et al.Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression.The Journal of infectious diseases 2003Aug 1；188(3)：440-8)。 

2004年，德国环境与健康研究中心的Antonio C教授利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组痘苗病毒安卡拉株(MVA-gfp)，建立了一种快速、灵敏且高通量的中和抗体检测方法。但是，本方法主要的缺点在于利用流式细胞仪检测MVA-gfp细胞感染抑制率，检测成本较高(Cosma A，Buhler S，Nagaraj R，Staib C，Hammarin AL，Wahren B，et al.Neutralization assay using a modified vaccinia virus Ankara vector expressing the green fluorescent protein is a high-throughput method to monitor the humoral immune response against vaccinia virus.Clinical and diagnostic laboratory immunology 2004Mar；11(2)：406-10)。 

为了适应群体痘苗病毒中和抗体滴度普查的要求，仍需要建立一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、检测周期短和/或适合高通量检测的新型方法。 

发明内容

本发明提供了一种包含萤火虫荧光素酶(luciferase)基因的重组痘苗病毒天坛株。 

本发明提供了一种检测样品中痘苗病毒中和抗体水平的方法，所述方法包括： 

将本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株与待测样品共同孵育； 

接种痘苗病毒嗜性细胞；以及 

进行发光测定。 

本发明还提供了将本发明的重组痘苗病毒天坛株用于体外检测样品中痘苗病毒中和抗体水平的用途。 

本发明还提供一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括本发明的包 含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，任选地还包括指示用所述包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株检测待测样品中的痘苗病毒中和抗体的说明书。 

本发明的抗体检测方法是基于编码荧光素酶的报告基因表达抑制的特点。本发明的抗体检测方法具有如下一种或多种优点：检测周期短；灵敏度高；可重复性高；结果判读客观；高通量；样品需求量少；检测成本低；方法可标准化，便于实验室间推广。 

附图说明

图1示出了本发明的痘苗病毒中和抗体检测方法的原理示意图(图1A至图1C)。 

图2显示了pSCluc构建质粒图。 

图3左图显示了10pfu/10000细胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero细胞在内的三种不同细胞后发光值随时间的变化，图3右图显示了1000pfu/10000细胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero细胞在内的三种不同细胞后发光值随时间的变化。 

图4显示了在测定发光值前不冲洗或冲洗Vero细胞对发光值的影响。 

图5显示了Vero细胞接种量分别为10000细胞/孔和30000细胞/孔时的发光值。 

图6显示了不同的rTV-Fluc病毒感染剂量下的发光值。 

图7显示了三种rTV-Fluc病毒感染剂量标定的阳性对照HCS中和滴度。 

图8显示了用一种本发明的抗体测定方法和噬斑抑制法对人和鼠血清痘苗病毒天坛株中和抗体滴度检测的结果。 

图9显示了本发明的检测方法和噬斑抑制法的相关性分析结果。 

图10显示了用一种本发明的方法检测的小样本人群不同年龄段的人痘苗病毒天坛株中和抗体水平。 

图11显示了使用rTV-Fluc针对VTT接种的兔(■)和无关对照兔(□)的血清在不同稀释度下测得的中和抗体水平，x轴表示血清的系列稀释度，范围为从1∶30至1∶21870。 

图12显示了使用rTV-Fluc针对rTV-HIVgp145疫苗接种的小鼠血清 (■，▲)和首次接受实验的小鼠血清(□，△)的中和抗体检测结果。x轴表示血清的系列稀释度，范围为从1∶30至1∶21870。 

图13显示了使用rTV-Fluc针对ECT接种的鼠(▲)和无关对照鼠(△)的血清在不同的稀释度下测得中和抗体水平，x轴表示血清的系列稀释度，范围为从1∶30至1∶21870。 

图14显示使用rTV-Fluc针对两个rMVA-HIVgpe接种的人(■，▲)和两个首次接受实验的人(□，△)的血清不同的稀释度下测得的中和抗体水平，x轴表示血清的系列稀释度，范围为从1∶30至1∶21870。 

图15显示了T载体连接产物的酶切鉴定图谱。 

具体实施方式

如上所述，本发明构建了一种包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株。用于构建本发明重组病毒的痘苗病毒天坛株为本领域技术人员所熟知，例如在如金奇等人，痘苗病毒天坛株基因组25kb核苷酸序列分析及与非疫苗株WR的比较.病毒学报1988，4：288-304中，以及金奇等人，痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析，中国科学(C辑)1997年12月，第27卷第6期：562-567中有详细描述。 

用于本发明的痘苗病毒天坛株以及由其构建的本发明的重组病毒可以是复制型的，也可以是非复制型的。 

在本发明的实施方案中，所述萤火虫荧光素酶基因可以是非分泌型也可以是分泌型。优选地，在本发明中使用非分泌型萤火虫荧光素酶基因。所述萤火虫荧光素酶基因为本领域已知。 

如上所述，本发明提供了一种通过使用本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，来检测样品中的痘苗病毒中和抗体水平的方法。本发明的方法包括将本发明的重组病毒与待测样品共同孵育，接种痘苗病毒嗜性细胞，以及进行发光测定。根据本领域已有的知识，本领域技术人员知晓如何进行针对萤火虫荧光素酶催化的发光反应的发光测定。例如，所述发光测定步骤通常包括向所述待测样品中加入一种萤火虫荧光素酶底物试剂，如荧光素(luciferin)。 

本发明的方法可用于检测针对多种痘苗病毒毒株的中和抗体，例如针对痘苗病毒天坛株(VTT)、鼠痘病毒(ECT)或痘苗病毒安卡拉株(MVA) 等的中和抗体。 

本发明的方法可用于检测多个物种来源的样品中的中和抗体水平，例如用于检测来自小鼠、兔或人的血清样品中的中和抗体水平。 

在本发明的一个实施方案中，对兔血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的另一个实施方案中，对鼠血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的再一个实施方案中，对鼠血清检测针对鼠痘病毒的中和抗体。在本发明的又一个实施方案中，对人血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的另一个实施方案中，对人血清检测针对痘苗病毒安卡拉株的中和抗体。 

在本发明方法的实施方案中，所述样品可为可能含有痘苗病毒中和抗体的任何样品。例如，待测样品可为取自受试者的血液、尿液、唾液等。待测样品通常为受试者的血清。 

本发明的方法中所述的痘苗病毒嗜性细胞是指能够被痘苗病毒感染的细胞。本发明的重组痘苗病毒具有广谱细胞嗜性，因此，多种细胞——例如，原代鸡胚细胞(CEF)、人胸腺激酶缺陷性细胞系(143TK)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)等——均可作为痘苗病毒嗜性细胞用于本发明方法中。优选地，本发明方法使用Vero细胞作为痘苗病毒嗜性细胞。 

本发明的方法的实施方案中，所述发光测定可以包括细胞裂解步骤或者不包括细胞裂解步骤。本领域技术人员可以理解，当本发明方法的实施方案中使用分泌型萤火虫荧光素酶基因时，所述发光测定步骤中不需要进行细胞裂解；当本发明方法的实施方案中使用非分泌型萤火虫荧光素酶基因时，所述发光测定步骤还包括将所述痘苗病毒嗜性细胞裂解。 

在本发明的方法中，所述发光测定优选在接种细胞后20-40小时期间进行，更优选地，在细胞接种后20-24小时期间进行，再更优选地，在细胞接种后24小时时进行。 

在本发明的方法中，所述嗜性细胞的接种量可以是使测定的发光值结果的变异系数尽量小的接种量，例如使得变异系数小于15％，优选小于10％，更优选小于5％。由此，所述嗜性细胞的接种量优选为10000-30000细胞/孔之间，更优选地，接种量为30000细胞/孔(以接种孔为96孔板孔计)。 

在本发明的方法中，本发明的病毒感染剂量可以是使测定的发光值结 果的变异系数尽量小的剂量，例如使得变异系数小于15％，优选小于10％，更优选小于5％。由此，在本发明方法的一个优选的实施方案中，本发明病毒的感染剂量为66-1800pfu/30000细胞，更优选的剂量为100-1000pfu/30000细胞，再更优选的剂量为400pfu/30000细胞。 

本发明还提供了一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株。本发明的试剂盒中可进一步包含用于萤光素酶发光反应测定的一种或多种其他试剂，优选地，所述试剂盒中可进一步包含萤火虫荧光素酶底物试剂，如萤光素。 

以下结合实施例对本发明进行具体说明。实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。 

实施例1：包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株的构建 

包含萤火虫荧光素酶基因痘苗病毒天坛株的构建过程如下：首先，以pSC59质粒为框架构建包含萤火虫荧光素酶基因的重组质粒pSCluc；利用lipofect2000脂质体技术转染痘苗病毒天坛株(疫苗株)感染后的鸡胚成纤维细胞(CEF)，经过X-Gal基因蓝白斑挑选过程获得重组的复制型痘苗病毒天坛株rTV-Fluc。 

1.包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒穿梭质粒(pSCluc)的构建 

1.1荧光素酶基因PCR扩增 

用PrimeSTAR高保真酶(TAKARA，Cat：DR010A)以包含萤光素酶基因的质粒pLUCF(John T.Schiller，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)，包含萤光素酶基因的质粒也可通过商购如从本元正阳基因技术有限公司获得)为模板对Luc基因(非分泌型萤火虫荧光素酶基因，GenBank登记号为EU921841)进行PCR扩增。 

正向引物LVF(SalI酶切位点)： 

GTCGACGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC 

反向引物LVR(SmaI酶切位点)： 

CCCGGGTTACACGGCGATCTTGCCGCCC 

1.2PCR产物凝胶回收 

使用试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen 28704)对PCR产物进行回收： 

1)用手术刀将琼脂糖DNA片段切下来加到离心管中，尽可能不要切下凝胶。 

2)加500μl Buffer QG，如果用大于2％的琼脂糖凝胶则加1ml Buffer QG。 

3)50℃孵育10分钟，每2-3分钟反转离心管促使凝胶溶解。 

4)加10μl 3M醋酸钠和100μl异丙醇。 

5)将溶液加柱，13000rpm离心1分钟。将甩掉溶液倒掉，收集管重复使用。 

6)加500μl Buffer QG到柱子中13000rpm离心1分钟，去除所有琼脂糖痕迹。 

7)加750μl Buffer PE到QIAquick柱中静置2-5分钟，13000rpm离心1分钟。 

8)将甩掉溶液倒掉，13000rpm空甩1分钟。 

9)将QIAquick柱放到1.5ml离心管中。 

10)加50μl去离子水到膜中心，静置1分钟后13000rpm离心1分钟。得到回收产物。 

1.3T载体连接 

按如下所示步骤，将凝胶回收产物加A-Tailing(TaKaRa，DNA A-Tailing试剂盒，D404)后连接18-T Simple Vector( 

18-T Simple Vector，TaKaRa，D 103A)； 

①在微量离心管中配制下列加“A”反应液，全量为50μl。 

②72℃反应2O分钟。 

③冰中静置1～2分钟。 

A-TailingDNA片段与T载体的连接转化 

①在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。 

②加入5μl(等量)的Solution1^*。 

③16℃反应1～3小时。 

④全量(10μl)加入至100μl DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。 

⑤42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 

⑥加入800ul LB培养基，37℃振荡培养60分钟。 

⑦在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。 

⑧PCR法确认挑选白色菌落。 

小提质粒后进行SalI/SmaI酶切鉴定，选取电泳图谱正确(例如如图15所示)的T载体连接产物(引物：M13-47，RV-M，luc1(CTTGTGTCCGATTCAGTC)( 

18-T Simple Vector，TaKaRa，D103A))。 

1.4重组质粒pSCluc构建 

1)将pSC59载体(B.Moss教授惠赠，参阅B.Moss et al.Compact，synthetic，vaccinia virus early/late promoter for protein expression.Biotechniques.1997Dec；23(6)：1094-7.)和T连接产物分别进行SalI/SmaI双酶切：(pSC59载体和T连接产物分别为4μg，37℃过夜)； 

2)凝胶回收目的片段，用T4quick ligase(美国NEB公司，M2200S)连接(pSC65∶Luc基因＝1∶3摩尔比)； 

3)用所得重组质粒转化DH5a感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)后涂氨苄抗性LB平板： 

4)37℃孵育12-14h后，PCR克隆鉴定带有正确序列的重组质粒； 

5)5ml 2^＊YT培养基37℃下220rpm摇菌14h； 

6)2ml菌液小提质粒100μl，SalI/SmaI双酶切鉴定； 

7)V9SCF和V9SCR引物测序分析； 

8)荧光素酶基因蛋白表达分析： 

每个重组质粒各挑3个测序正确的质粒转化293FT细胞(Invitrogen，目录号：R700-07)，48h后检测Luc荧光值。 

9)基因序列和蛋白表达均正确的质粒重新转化DH5a细胞，用试剂盒QIAGEN Plasmid Maxi Kit小提质粒。质粒终浓度1mg/ml。 

10)最终获得的质粒再进行一次荧光素酶蛋白表达荧光检测分析。 

由此得到正确重组克隆pSCluc。 

2.rTV-Fluc重组痘苗病毒的构建 

2.1rTV-Fluc重组痘苗病毒毒种制备 

1)制备CEF细胞(原代鸡胚成纤维细胞)，转染时细胞达到80-90％的覆盖率。 

2)病毒感染前用3％DMEM维持培养基将上述CEF细胞洗1次，并加入2ml 3％DMEM维持培养基。 

3)用0.1MOI复制型痘苗病毒天坛株(北京天坛生物制品股份有限公司，76-1株)感染所述CEF细胞，37℃吸附1-2小时。 

4)将25μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，目录号.11668-019)和10μg上述制得的穿梭质粒pSCluc分别与500μl无血清无抗生素opti-MEM(GIBCO/Invitrogen)混匀，在室温下孵育5分钟，然后将二者混合均匀制得转染液，在室温下孵育＞20分钟。 

5)用5ml无血清无抗生素的opti-MEM漂洗CEF细胞3次，加入1.5ml无血清无抗生素opti-MEM培养基。 

6)将上述转染液逐滴加入经病毒吸附的CEF细胞中，边加边混匀， 37℃吸附5小时。 

7)倒掉转染液，加入5ml 3％DMEM维持培养基，37℃继续培养48小时。 

8)在T25细胞瓶中将所得CEF细胞于-70℃反复冻融3次，释放出病毒rTV-Fluc的毒种，将其分装，在-70℃下冻存。 

2.2采用有限稀释法筛斑 

1)提前一天，用10％DMEM完全培养基铺板(Corning Incorporated，150mm平皿)，感染时CEF细胞覆盖率为90-100％。 

2)用3％DMEM维持培养基系列稀释重组痘病毒毒种rTV-Fluc，制备MOI 0.01和0.1稀释度毒种各10ml。 

3)吸弃细胞培养液，向其中加入每稀释度毒种10ml。 

4)37℃吸附2-3小时，每隔30min摇匀一次。 

5)吸出孔中液体，加入30ml 3％DMEM维持培养基继续培养48小时。 

6)吸出孔中液体，加入35ml含200μg/ml X-gal和50μg/ml中性红的1％琼脂糖固体培养基，37℃培养＞2小时(第一轮筛斑需过夜)。 

7)观察蓝白斑，挑取蓝斑入1ml 3％DMEM维持培养基，反复冻融3次后进入下一轮筛斑。连续单斑纯化5-8次，直至200个斑中不多于1个白斑。 

8)将纯化获得的单斑重组病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF(1瓶T 25)，待细胞全部病变后(约72h)，在-70℃冻融三次。按1∶5接种病毒进行扩增(1瓶T175)。待细胞全部病变后(约48h)，在-70℃冻融三次。按1∶10接种病毒进行扩增(6瓶T225)。 

9)48h后将扩增的病毒在-70℃冻融三次，3000rpm离心3min去除细胞残渣。将上清进行超离后浓缩病毒，最后密度梯度离心纯化病毒后分装，得到rTV-Fluc，-70℃保存(批号：20110315)。 

rTV-Fluc重组痘苗病毒天坛株已于2011年10月27日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC V201135。 

2.3rTV-Fluc重组痘苗病毒滴度标定 

2.3.1实验材料 

2个长满单层CEF细胞和Vero细胞(ATCC CCL81)的6孔板； 

细胞培养液：含10％FBS的DMEM培养基； 

细胞维持液：含3％FBS的DMEM培养基； 

半固体培养基：含1％甲基纤维素、3％FBS的DMEM培养基 

结晶紫工作浓度染色液： 

结晶紫母液(5％)：结晶紫25g，无水乙醇475ml，溶解混匀后定容至500ml，过滤。 

结晶紫工作液(1％)：5％母液100ml，0.85％NaCl 375ml，40％甲醛25ml，加蒸馏水定容至500ml，混匀。 

2.3.2操作步骤(SOP)： 

1.用细胞维持液10倍系列稀释rTV-Fluc重组痘苗病毒：10²-10⁷共6个稀释度。 

2.吸弃6孔板中的细胞培养液，加入1×10⁵，1×10⁶和1×10⁷稀释度的标准品，每孔500μl，1×10⁶和1×10⁷稀释度做2个平行样，每个6孔板设细胞维持液阴性对照1个，充分摇匀，使病毒液均匀分布于板孔，37℃孵育2h，每隔30min摇一次。 

3.吸出孔中液体，每孔加入DMEM培养基2ml漂洗一次，以去除未吸附的游离病毒。 

4.每孔加入半固体培养基3-4ml，37℃5％CO₂孵箱静置培养4-5天。 

5.取出6孔板，吸出半固体培养基，每孔加入1ml工作浓度的结晶紫染色液，室温静置＞30min至3h。 

6.轻柔地流水冲洗掉染色液，计数每孔蚀斑个数。 

7.结果计算： 

计算每稀释度的蚀斑平均数，稀释度间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律，否则应考虑重新试验。 

病毒滴度(PFU/ml)＝病毒蚀斑平均数×稀释倍数/病毒加入量(ml，500μl即为0.5ml) 

经过多次实验标定，本批次rTV-Fluc病毒(批号：20110315)在Vero细胞中的感染滴度为1^＊10⁷pfu/ml，在CEF细胞中的感染滴度为1^＊10⁷pfu/ml。 

实施例2：痘苗病毒中和抗体检测 

本发明的痘苗病毒中和抗体检测方法基于样品中痘苗病毒中和抗体针对重组病毒萤火虫荧光素酶报告基因表达抑制特点而建立。 

以本实施例示例说明本发明的检测方法原理如下：将实施例1构建的rTV-Fluc病毒感染Vero细胞后表达萤火虫荧光素酶，催化底物萤光素产生发光反应。由于发光值和感染Vero细胞的rTV-Fluc病毒量成正比例关系，因此可以通过微孔板光度计读取的发光值反映病毒感染剂量(参见图1A)。待测血清中含有的痘苗病毒特异性中和抗体，可以封闭rTV-Fluc病毒表面的细胞受体结合的位点，从而阻挡病毒进入Vero细胞内，导致无法检测到酶促发光反应(参见图1B)，将检测的血清样品发光值和病毒对照发光值之间对比分析，得到待测样品对rTV-Fluc病毒的中和抑制率(参见图1C)。通过对每份样品的倍比稀释，获得大于50％中和抑制率的最大稀释倍数，即为每份样品的50％痘苗病毒中和抗体滴度。 

1.检测时间使用Vero细胞作为病毒感染细胞系。将细胞接种于96孔板，每孔10000细胞。rTV-Fluc病毒以两种剂量(10pfu/10000个细胞和1000pfu/10000个细胞)分别感染细胞，并于2、4、6、12、24、36、48小时连续检测荧光素酶蛋白化学发光值。 

结果表明，rTV-Fluc病毒在Vero细胞有效复制，并且24-48小时后并未见明显细胞病变过程。同时，因Vero细胞可大规模培养等特点，使该细胞特别适合本方法的推广应用(参见图3)。 

rTV-Fluc病毒感染Vero细胞6小时后，荧光素酶化学发光值表现出连续上升的特点(参见图3)。在下文的检测步骤中在病毒感染细胞后24小时进行检测。 

2.报告基因检测如实施例1所述，以非分泌型萤火虫荧光素酶为rTV-Fluc病毒表达的报告基因。加入荧光素底物100μl Bright-GLo^TM (D-荧光素，Caliper Technologies Corp，美国)进行荧光素反应2min，不需进行细胞洗涤即可直接用微孔板分光光度计读数。研究表明，rTV-Fluc病毒感染Vero细胞24小时后，利用1^＊PBS洗细胞一次和直接加入荧光素底物 检测之间没有差异(参见图4)。这表明，非分泌型萤火虫荧光素酶产物全部保留在Vero细胞内。 

3.细胞接种量： 

本研究对96孔培养板中Vero细胞的接种量进行了标准化，以10000细胞/孔和30000细胞/孔两种接种量进行接种。分别设置20pfu/孔、10pfu/孔、5pfu/孔、2.5pfu/孔四种病毒量和细胞对照，每组16孔，24小时后检测每孔发光值。统计学分析表明，2.5pfu、5pfu、10pfu和20pfu四种病毒剂量下，10000细胞/30000细胞组变异系数分别为：10.9％/7.0％、7.8％/6.9％、4.3％/3.3％和4.2％/3.6％，可见30000细胞/孔接种量的各种病毒剂量组均表现出更小的变异系数(参见图5)。在下文的检测步骤中使用30000细胞/孔的Vero细胞接种量。 

4.rTV-Fluc感染剂量 

在研究中，对rTV-Fluc病毒感染剂量进行了标准化。从5400pfu/30000细胞剂量开始连续3倍稀释至0.8pfu/30000细胞感染剂量，每组平行8孔。统计分析表明，病毒感染剂量在66pfu/30000细胞水平以上时，化学发光值变异系数均小于10％。且在66-1800pfu/30000细胞感染剂量之间表现出线性相关关系(参见图6)。在下文的检测步骤中使用400pfu/30000细胞的rTV-Fluc病毒感染剂量。 

5.痘苗病毒中和抗体检测步骤(操作SOP) 

1)将待检测的血清于56℃水浴灭活60min，6000g离心3min，将上清转移至1.5ml离心管中待用。 

2)取96孔板(BD)，于第1列(细胞对照CC)加入DMEM完全培养基(1％双抗(Hyclone)，10％FBS(Hyclone)，20mM HEPES)150μl/孔，于第2-12列(第2列为病毒对照VC，第3-12列为样品孔)加入DMEM完全培养基100μl/孔，于A2-A12孔中再加入DMEM完全培养基42.5μl/孔。 

3)于A2孔加入阴性血清7.5μl，将血清样品1-样品5以每样品两个复孔每孔7.5μl依次加至A3至A12孔中。 

4)将多道移液器调至50μl，对A2-A12孔中液体轻柔的反复吹吸6～8次充分混匀，然后转移50μl液体至对应的B2～B12孔，轻柔的反复吹吸6～8次后转移至C2-C12孔，以此类推，最后从H2-H12中吸弃50μl液体，由此获得不同稀释度的血清样品。 

5)用DMEM完全培养基将重组痘苗病毒rTV-Fluc稀释至8^＊10³pfu/ml，于第2～12列每孔加50μl，使每孔含400pfu rTV-Fluc病毒。 

6)将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育1小时。 

7)当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的Vero细胞(汇合率达50％～70％)，以T75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基，加入5ml Versene清洗细胞，倾去Versene后，加入2ml 0.25％胰酶-EDTA，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入5ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml DMEM完全培养基重悬细胞，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至3×10⁵个/ml。 

8)当孵育时间至1小时，96孔板中每孔加100μl细胞，每孔细胞为3×10⁴个。 

9)将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养24小时。 

10)24小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃100μl上清，然后加入100μl Bright-Glo^TM荧光素酶试剂，室温避光反应2min。 

11)反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出100μl液体，加于对应96孔化学发光检测板(Promega)中，置于化学发光检测仪(GLOMAX^TM Promega型号：9100-101)中，用BrightGlo程序读取发光值。 

12)计算中和抑制率，抑制率＝[1-(样品组的发光强度均值-细胞对照CC均值)/(病毒对照组的发光强度VC均值-细胞对照值CC均值)]×100％。 

实施例3本发明方法与噬斑抑制法的比较 

噬斑抑制法是一种最为传统的中和抗体检测方法，被认为是“金标准”。 因此，将本发明方法和噬斑抑制法进行比较分析，以确定本方法的特异性和灵敏度。 

在本实施例中，使用的阳性对照样品为北京天坛生物制品股份有限公司提供的经痘苗病毒天坛株免疫的高效价兔血清，标记为HCS。 

1.噬斑抑制法标准化 

1)血清56℃灭活60分钟； 

2)用3％DMEM培养基按1∶20，1∶100，1∶500，1∶2500，1∶12500，5倍梯度稀释血清； 

3)分别将17、33和66pfu/ml三种稀释度的痘苗病毒(rTV-Fluc)400μl与各稀释度400μl血清混合，37℃孵育1h； 

4)600μl的上述混合液加入80-90％成片的Vero细胞中，设阳性病毒对照(相同量的痘苗病毒单独接种，不加血清)，37℃孵育2h； 

5)倒掉液体，3％DMEM培养基洗1-2次； 

6)加入含0.5％甲基纤维素的2ml DMEM半固体培养基，37℃，5％CO₂条件培养； 

7)4-5天后使用结晶紫染色，记录各孔噬斑数； 

8)计算能抑制50％痘苗病毒的滴度对应的血清稀释度，即为中和抗体效价。 

对比分析表明：每30000细胞50pfu、100pfu和200pfu三种rTV-Fluc病毒感染剂量标定的阳性对照HCS中和抗体滴度非常一致，平均为1/850(参见图7)。由此，在标准化的噬斑抑制法中可选用100pfu/30000细胞感染剂量。 

2两种方法相关性分析 

本发明选用10份正常人血清和14份痘苗病毒(重组痘苗病毒天坛株rTV-Fluc)免疫鼠血清进行相关性分析。正常人血清来源于北京地区健康体检人群。参见图8，其中，NC1-NC10为≤20岁年龄段，NA1-NA10为≥30岁年龄段人群。V1-1至V6-4为重组痘苗病毒rTV-Fluc免疫BABL/c小鼠后30天血清样品。 

按照标准化的化学发光法(实施例2，SOP)和噬斑抑制法(见上文)对24份血清样品进行痘苗病毒中和抗体滴度检测。其中，10份20岁以下 年龄段正常人血清中和抗体滴度均为阴性，这和我国1980年停止痘苗病毒天花疫苗接种情况相符。10份30岁以上年龄段正常人血清中只有1份样品中和抗体检测阳性，且两种方法检测的中和抗体滴度非常接近(1∶52vs1∶82)。另外，9份小鼠血清两种方法检测中和抗体均为阳性，2份小鼠血清化学发光法检测中和抗体阳性而噬斑抑制法检测阴性(参见图8)。 

两种方法表现出较高的相关性，相关系数R²＝0.95，P＜0.0001(参见图9)。说明，本发明建立的化学发光法痘苗病毒中和抗体检测方法灵敏度高、特异性好，可以用来评价我国人群对于天花病毒的免疫状态和分析针对以痘苗病毒为载体的各类疫苗的预存免疫特点。 

实施例4小样本人群痘苗病毒中和抗体水平调查： 

样本来源：本研究对中国人群的痘苗病毒中和抗体水平进行了小样本量调查，从多家医疗机构健康体检人群中采集500份血清样品。按照年龄分为四组：≤20岁(男性：42份；女性：46份)，21-30岁(男性：67份；女性：67份)，31-40岁(男性：103份；女性：59份)，41-60岁(男性：66份；女性：50份)。 

按照本发明的检测方法(实施例2，SOP)进行痘苗病毒天坛株中和抗体检测，结果表明：≤20岁(88份)和21-30岁(134份)两组样品中和抗体检测均为阴性，这与30岁以下年龄段人群未接种天花疫苗的情况相符合。31-40岁组162份样品中有9份样品阳性(男女阳性率分别为5.8％和5.1％)，41-60岁组116份样品中有12份样品阳性(男女阳性率分别为9.1％和12％)(参见图10)。 

小样本量数据分析表明：我国30岁以下人群和大部分30岁以上人群均缺少针对痘苗病毒的中和抗体。 

实施例5痘苗病毒天坛株免疫的兔的血清抗体中和检测 

使用如上述实施例2(SOP)所述的方法对接种了痘苗病毒天坛株(获自北京天坛生物制品股份有限公司)的兔血清(即抗VTT兔血清(ATRS)，由北京天坛生物制品股份有限公司安焕宇博士惠赠)和对照正常兔的血清进行针对痘苗病毒天坛株的中和抗体检测。 

本实验的结果可见于图11，结果显示在首次接受实验的兔的血清中 没有观察到显著的中和活性，而抗VTT兔血清能够中和rTV-Fluc，IC50为3468，表明本发明的方法可用于兔中痘苗病毒天坛株的中和抗体检测。 

实施例6重组痘苗病毒免疫小鼠的血清的抗体中和检测 

对BABL/c小鼠两次接种重组rTV-HIVgp145疫苗(中国食品药品检定研究院)，第二次接种3周后，收集血清并用rTV-Fluc中和试验分析(分析步骤如实施例2所示)。结果如图12所示。在两只被接种的小鼠的血清中检测到中和活性(IC50为126和583)，而两只对照鼠血清没有显示出显著的中和活性。 

实施例7针对鼠痘病毒(ECT)的中和抗体检测 

鼠痘病毒(mouse pox virus)又名小白鼠脱脚病病毒，是Marchal于1929年在英国实验室的小鼠中发现的。1945年Burnet证明它与牛痘苗病毒有密切的免疫学关系。鼠痘在世界各地实验室的小白鼠中流行很广。所述病毒对小白鼠有高度的致病性。因此，针对鼠痘病毒的中和抗体检测对于实验性小鼠动物种群中鼠痘病毒的流行特点分析意义重大。 

本研究使用如上述实施例2所述的方法对接种了ECT(中国食品药品检定研究院)的鼠和无关鼠对照进行针对鼠痘病毒的中和抗体检测。 

本实验的结果可见于图13，结果显示在首次接受实验的鼠的血清中没有观察到显著的中和活性，而抗ECT小鼠血清能够中和rTV-Fluc，IC50为200，表明本发明的方法可用于针对鼠痘病毒的中和抗体检测。 

实施例8针对重组痘苗病毒安卡拉株的中和抗体检测 

使用如上述实施例2所述的方法对rMVA-HIVgpe免疫的人的血清(吉林大学孔维教授提供)和两个首次接受实验的人的血清进行针对重组痘苗病毒安卡拉株的中和抗体检测。 

本实验的结果可见于图14，从两个rMVA-HIVgpe免疫个体中分离的血清可检测出对不同rTV-Fluc病毒的中和活性(IC50为98和226)，而在两个首次接受实验的人血清中没有可检测的中和活性，表明本发明的方法可用于针对重组痘苗病毒安卡拉株(MVA)的中和抗体检测。 

根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。本领域人员能够理解，本申请所描述的本发明技术方案的各个特征均可根据需要进行适当的组合。 

Claims (19)

1.一种重组痘苗病毒天坛株，其包含萤火虫荧光素酶基因。

2.权利要求1的重组痘苗病毒天坛株，其中所述萤火虫荧光素酶基因是非分泌型萤火虫荧光素基因。

3.权利要求1或2的重组痘苗病毒天坛株，其是CCTCC V201135。

4.一种痘苗病毒中和抗体的检测方法，包括：

将权利要求1至3任一项的重组痘苗病毒天坛株与待测样品共同孵育；

接种痘苗病毒嗜性细胞；以及

进行发光测定。

5.权利要求4的方法，其中所述待测样品为可能包含针对痘苗病毒的中和抗体的样品。

6.权利要求5的方法，其中所述痘苗病毒为痘苗病毒天坛株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒。

7.权利要求4至6任一项的方法，其中所述待测样品来自人、小鼠或兔的血清。

8.权利要求4至7任一项的方法，其中所述痘苗病毒嗜性细胞是Vero细胞。

9.权利要求4至8任一项的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性细胞后20小时至40小时进行发光测定。

10.权利要求4至8任一项的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性细胞细胞后20小时至24小时进行发光测定。

11.权利要求4至10任一项的方法，其中病毒感染剂量为使测定的发光值结果的变异系数小于10％的剂量。

12.权利要求11的方法，其中病毒感染剂量为66-1800pfu/30000细胞。

13.权利要求12的方法，其中病毒感染剂量为400pfu/30000细胞。

14.权利要求4至13任一项的方法，其中Vero细胞接种量为使测定的发光值结果的变异系数小于10％的接种量。

15.权利要求14的方法，其中Vero细胞接种量以96孔板板孔计为10000-30000细胞/孔。

16.权利要求1至3任一项的重组痘苗病毒天坛株用于体外检测样品中痘苗病毒中和抗体的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述痘苗病毒中和抗体为针对痘苗病毒天坛株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒产生的抗体。

18.一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括权利要求1-3任一项的重组痘苗病毒天坛株。

19.权利要求18的试剂盒，其进一步包括萤光素酶发光反应检测试剂。

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