CN110184284B - 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用 - Google Patents

携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用。本发明提供了一种DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可将其用于构建重组质粒、重组病毒和小鼠模型。本发明中构建一种重组禽流感病毒，其与野生型病毒的复制能力和致病力相近。在SPF鸡胚传代中，收集的4代病毒液都能检测到NanoLuc荧光素酶基因，具有良好的稳定性。本发明中还成功构建了活体成像小鼠模型，具有可视化功能，在不需要剖解小鼠情况下，能够检测流感病毒在小鼠的分布位置。能够实现纵向评估，在同一小鼠上连续时间观察流感病毒的感染动态过程，为流感病毒的研究补充了一种可视化工具。

Description

携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模 型中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，特别涉及一种携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用。
背景技术
H9N2亚型禽流感病毒是甲型流感病毒的一种，广泛流行于世界各个地区，不仅给家禽业带来巨大的危害，还可以跨过宿主屏障感染人，在公共卫生上具有重要意义[1]。
小鼠模型是一种研究流感病毒在体内感染、致病性以及传播能力等常用的动物模型[2,3]。但在小鼠模型中不能实时观察到病毒在机体病毒的分布情况和感染的动态过程，另外，病毒载量的评估还需要剖杀小鼠，从而排除了纵向评估。生物发光报告病毒的体内成像是一种强有力的替代方法，能够实时观察病毒在同一动物体中的传播以及对病毒载量的快速评估。
NanoLuc荧光素酶是由深海虾Oplophorus gracilirostris的荧光素酶亚基改造而成的，大小仅为19kDa，信号半衰期大于2小时，具有分子量小、检测灵敏度高等优点，它比萤火虫或海肾荧光素酶的活性高150倍(即光输出)[4]。
目前，还没有携带NanoLuc荧光素酶基因的重组H9N2亚型禽流感病毒及相关应用的研究。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种DNA片段。
本发明的另一目的在于提供所述DNA片段在构建重组质粒或重组病毒中的应用。
本发明的又一目的在于提供所述重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用。
本发明的再一目的在于提供所述重组禽流感病毒在构建小鼠模型中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
含有所述的DNA片段的重组质粒或重组病毒。
一种重组质粒，为将所述的DNA片段(即V-NS-NanoLuc基因片段)插入到pHW2000质粒的BsmB I的酶切位点上获得。
所述的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：将所述的DNA片段用限制性内切酶Aar I进行酶切，然后将其用连接酶连接到用限制性内切酶BsmB I酶切后的pHW2000质粒上，得到重组质粒pHW2000-V-NS-NanoLuc。
所述的重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用。
所述的重组禽流感病毒的骨架优选为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。
一种携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建7个基因的重组表达质粒：
将PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因分别用BsmB I限制性内切酶酶切，然后分别用连接酶连接到用BsmB I限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M；
(2)构建重组禽流感病毒
将所述的重组质粒(pHW2000-V-NS-NanoLuc)、pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M共同转染到293T细胞，转染4～6小时后，更换为含TPCK胰酶和BSA(牛血清白蛋白)的Opti-MEM培养基，继续培养48小时后，收集细胞培养液，然后将细胞培养液接种鸡胚，72小时后，收取鸡胚尿囊液，得到所述携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒。
步骤(1)中所述的连接酶优选为T4连接酶。
步骤(1)中所述的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因为H9N2流感病毒中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因。
所述的H9N2流感病毒优选为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。
步骤(2)中所述的含有含TPCK胰酶和BSA的Opti-MEM培养基优选为含0.2μg/mLTPCK胰酶和终浓度为0.2％BSA的Opti-MEM培养基。
步骤(2)中所述的鸡胚优选为9日龄SPF鸡胚。
所述的携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒的构建方法，还包括将步骤(2)中得到的重组流感病毒进行鉴定的步骤。
所述的鉴定可以采用PCR方法进行鉴定。
一种携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的DNA片段、重组质粒或重组禽流感病毒在构建小鼠模型中的应用。
一种基于重组禽流感病毒构建活体成像小鼠模型的方法，包括如下步骤：先将小鼠麻醉，然后将上述重组禽流感病毒通过鼻腔接种到小鼠体内，重组病毒感染小鼠3～7天后通过小鼠眼眶注射荧光素酶底物，再利用活体成像仪观察，得到活体成像小鼠模型。
所述的小鼠优选为4～6周龄SPF级BALB/c小鼠。
所述的麻醉方式为采用异氟烷呼吸麻醉。
所述的接种的重组禽流感病毒的浓度为每50μL PBS缓冲液中含有103EID50～106EID50的重组禽流感病毒。
所述的感染的时间优选为3～7天。
所述荧光素酶底物的注射量优选为100μL/只小鼠。
所述的荧光素酶底物通过Nano-Glo底物与PBS缓冲液按体积比1：25稀释得到。
所述的活体成像仪优选为IVIS Lumina LT(Series III)活体成像仪。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明构建的携带的NanoLuc荧光素酶基因的重组H9N2亚型禽流感病毒与野生型病毒的复制能力和致病力相近。在SPF鸡胚传代中，收集的4代病毒液都能检测到NanoLuc荧光素酶基因，具有良好的稳定性。
2、本发明构建的小鼠模型具有可视化功能，在不需要剖解小鼠情况下，能够检测流感病毒在小鼠的分布位置。能够实现纵向评估，在同一小鼠上连续时间观察流感病毒的感染动态过程。
3、本发明能实时监测流感病毒在机体的分布情况及感染动态过程和对病毒载量快速评估，这对流感病毒传播性、致病性及致病机制研究具有重要意义，为流感病毒的研究补充了一种新的可视化工具。
附图说明
图1为NS基因重组质粒pHW2000-V-NS-NanoLuc的构建示意图(V-NS-NanoLuc基因片段序列顺序为：首端限制性内切酶Aar I的保护碱基及其识别位点、V病毒NS节段3’端非编码区序列、V病毒NS1节段编码区序列(不含终止子)、GSGG序列、NanoLuc荧光素酶基因序列(不含终止子)、PTV-1病毒2A肽编码序列、V病毒NEP节段编码区序列、V病毒NS节段5’端非编码区序列、末端限制性内切酶Aar I的保护碱基及其识别位点)。
图2为P1～P4代次的V-NS1-NanoLuc重组病毒NS基因和NanoLuc荧光素酶基因鉴定电泳图；其中，A为NS基因鉴定电泳图；B为NanoLuc荧光素酶基因鉴定电泳图。
图3为V-NS1-NanoLuc重组病毒Western-Blot检测结果图；其中，泳道1：野生型病毒；泳道2：V-NS1-NanoLuc重组病毒。
图4为V-NS1-NanoLuc重组病毒在MDCK细胞的增殖曲线图。
图5为V-NS1-NanoLuc重组病毒与野生型病毒对小鼠致病力的比较结果图；其中，A为野生型病毒感染小鼠的体重变化曲线图；B为野生型病毒感染小鼠的存活率图；C为V-NS1-NanoLuc重组病毒感染小鼠的体重变化曲线图；D为V-NS1-NanoLuc重组病毒感染小鼠的存活率图。
图6为V-NS1-NanoLuc重组病毒不同EID50/50μL感染剂量感染小鼠的体内成像图；其中，A为V-NS1-NanoLuc重组病毒不同EID50/50μL感染剂量感染小鼠后，同一只小鼠在感染后第3天以及第5天采集的生物荧光信号转化为荧光强度值图；B为生物荧光信号在小鼠体内的分布情况。
图7为V-NS1-NanoLuc重组病毒104EID50/50μL感染剂量感染小鼠的体内成像图；其中，A为V-NS1-NanoLuc重组病毒104EID50/50μL感染剂量感染小鼠后，同一只小鼠在感染后第0、3、5、7、9、11天的体重变化曲线图和采集的生物荧光信号转化为荧光强度值图；B为生物荧光信号在小鼠体内的分布情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。其中，研究用的流感病毒为A/chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)(参考文献获得：Li X,Qi W,He J,et al.Molecular basis of efficient replication and pathogenicity of H9N2avianinfluenza viruses in mice[J].PLoS One.2012,7(6):e40118.)、双向表达载体pHW2000购买于淼灵生物(P1784)、293T细胞系(
Figure BDA0002068556110000051
CRL-11268TM)和MDCK细胞(
Figure BDA0002068556110000052
CCL-34TM)购买于ATCC细胞库。
本发明中涉及的质粒pHW2000-V-PB2,pHW2000-V-PB1,pHW2000-V-PA,pHW2000-V-HA,pHW2000-V-NP,pHW2000-V-NA,pHW2000-V-M是以质粒pHW2000为出发质粒构建得到；其中，
质粒pHW2000-V-PB2是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株(以下简称V)PB2基因(GenBank:JQ639783.1)的cDNA(即用限制性内切酶BsmB I酶切pHW2000质粒，然后将PB2基因的cDNA的连接到质粒pHW2000上；下同)；
质粒pHW2000-V-PB1是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒PB1基因(GenBank:JQ639784.1)的cDNA；
质粒pHW2000-V-PA是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒PA基因(GenBank:JQ639785.1)的cDNA；
质粒pHW2000-V-HA是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒HA基因(GenBank:JQ639786.1)的cDNA；
质粒pHW2000-V-NP是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒NP基因(GenBank:JQ639787.1)的cDNA；
质粒pHW2000-V-NA是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒NA基因(GenBank:JQ639788.1)的cDNA；
质粒pHW2000-V-M是在pHW2000质粒BsmB I位点插入了V病毒M基因(GenBank:JQ639789.1)的cDNA。
实施例1
NS基因重组质粒pHW2000-V-NS-NanoLuc的构建，其步骤为：重组质粒构建示意图如图1所示,V-NS-NanoLuc片段序列如SEQ ID NO.1所示:首端限制性内切酶Aar I的保护碱基及其识别位点(第1-18位)、V病毒NS节段3’端非编码区序列(第19-44位)、V病毒NS1节段编码区序列(不含终止子)(第45-695位)、Linker(GSGG)序列(第696-707位)、NanoLuc荧光素酶基因序列(不含终止子)(第708-1220位)、PTV-1病毒2A肽编码序列(第1221-1286位)、V病毒NEP节段编码区序列(第1287-1652位)、V病毒NS节段5’端非编码区序列(第1653-1678位)、末端限制性内切酶Aar I的保护碱基及其识别位点(第1679-1697位)。V-NS-NanoLuc片段序列由金唯智公司合成，测序正确后使用Aar I酶切(购于赛默飞公司)，然后连接在经BsmB I(购于NEB公司)酶切的pHW2000质粒上，获得pHW2000-V-NS-NanoLuc重组质粒。
V-NS-NanoLuc片段(SEQ ID NO.1)：
gcgacacctgctacagggagcaaaagcagggtgacaaagacataatggattccaacactgtgtcaagcttccaggtagactgctttctttggcatgtccgcaaacgatttgcagaccaagaactgggtgatgccccatttctagaccggctccgccgggatcagaagtccctgagaggaagaggcagcactcttggtctggacattagaaccgcaactcgtgaaggaaagcatatagtggagcagattctgaaggaagaatcagatgaggcatttaaaatgactattgcttcagtgccagttccacgctacttaactgacatgactcttgaagaaatgtcaagagattggttaatgctcattcccaaacagaaagtgacagggtccctttgcattagaatggaccaagcaacagtggataaaaccatcacattaaaagcaaacttcagtgtgattttcaatcgactggaagctctaatactacttagagcttttacagacgaaggagcaatagtgggcgaaatctcaccattaccttctctcccgggacatactgatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcggaggatttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaaatctacagagattcgcttggagaagcagcgatgaggatgggagacctccactctctccaaagggatccggtggaatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcgggatccggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccatggattccaacactgtgtcaagcttccaggacatactgatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcggaggatttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaaatctacagagattcgcttggagaagcagcgatgaggatgggagacctccactctctccaaagtagaaactggaaatggagggaacaattgagccagaaattcgaagaaataagatggttgattgaagaagtgcgacgtagattaaagattacagagaatagctttgagcaaataacatttatgcaagccttacaactactgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaaaaacacccttgtttctactaatatgtagcaggtgtcgc。
实施例2
利用反向遗传学技术拯救携带NanoLuc荧光素酶基因的重组H9N2亚型禽流感病毒V-NS1-NanoLuc，其步骤为：
取293T细胞接种于6孔细胞板中用含10％的胎牛血清的DMEM细胞培养基进行培养(293T细胞购于ATCC；胎牛血清(FBS)购于以色列Biological Industries公司；DMEM细胞培养液购于Gibco公司)，次日，将携带NanoLuc荧光素酶基因的流感反向遗传系统所需的八个质粒pHW2000-V-PB2，pHW2000-V-PB1，pHW2000-V-PA，pHW2000-V-HA，pHW2000-V-NP，pHW2000-V-NA，pHW2000-V–M和pHW2000-V-NS-NanoLuc(0.6μg/质粒)共同转染6孔细胞板中，转染4～6小时后，弃去培养液并更换为含0.2μg/mL TPCK胰酶、终浓度为0.2％BSA(牛血清白蛋白)的Opti-MEM培养基。培养48小时后，反复冻融两次收取细胞液，并取100μL细胞液接种9日龄SPF鸡胚(大华农公司)。72小时后，收取鸡胚尿囊液，即为所需的V-NS1-NanoLuc重组病毒。
实施例3
携带NanoLuc荧光素酶基因的重组H9N2亚型禽流感病毒在SPF鸡胚上传代，其步骤为：
将上一代获得HA阳性鸡胚尿囊液(即V-NS1-NanoLuc重组病毒)使用PBS稀释100倍，然后取100μL尿囊液接种于9日龄的SPF鸡胚，37℃孵育72h，收集HA阳性的鸡胚尿囊液，保存于-80℃冰箱。重复此操作4次，按顺序将获得的病毒代次命名为P1～P4。
实施例4
V-NS1-NanoLuc重组病毒的RT-PCR鉴定，其步骤为：
用飞捷生物公司的总RNA极速抽提试剂盒提取重组病毒总RNA，所得总RNA使用Uni12primer引物通过反转录反应获得cDNA，使用NS基因的特异性引物(V-NS-F和V-NS-R)和NanoLuc荧光素酶基因特异性引物(NanoLuc-F和NanoLuc-R)进行PCR扩增，同时，以野生型病毒(H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株；简称V)为对照。引物序列如下：
V-NS-F：5’-GGAGCAGATTCTGAAGGAA-3’(SEQ ID NO.2)；
V-NS-R：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTT-3’(SEQ ID NO.3)；
NanoLuc-F：5’-ATGGTCTTCACACTCGAA-3’(SEQ ID NO.4)；
NanoLuc-R：5’-CGCCAGAATGCGTTCGC-3’(SEQ ID NO.5)；
Uni12primer：5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO.6)。
扩增结果如图2所示，使用NS基因的特异性引物能够从P1～P4代次的重组病毒扩增出V-NS-NanoLuc片段(图2A)，使用NanoLuc荧光素酶基因特异性引物也能够从P1～P4代次的重组病毒扩增出NanoLuc荧光素酶基因(图2B)，表明V-NS1-NanoLuc重组病毒具有良好的稳定性。
实施例5
V-NS1-NanoLuc重组病毒的Western-Blot检测，其步骤为：
V-NS1-NanoLuc重组病毒以1.0MOI感染MDCK细胞(MDCK细胞购于ATCC)，37℃细胞培养箱孵育1h，然后弃掉病毒液，PBS洗两遍，加入含1μg/mLTPCK胰酶和终浓度为0.2％BSA的DMEM维持液。病毒感染24h后，弃掉孔内液体，用PBS洗三遍，然后每孔加入100μL预冷的含蛋白酶抑制剂1:100稀释的Western-Blot裂解液，在冰上裂解15min后，收集每孔的细胞悬液。把收获的细胞进行SDS-PAGE电泳，转NC膜。将膜放置孵育盒，加入5％脱脂奶粉，37℃摇晃封闭2h。TBST洗膜3次，每次摇晃15min。加入NS1(购自GeneTex公司)一抗4℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，每次摇晃15min。加入1:10000稀释的羊抗兔IgG波长为800nm的荧光二抗(Odessey)，避光孵育1h。TBST洗膜，每次摇晃15min。同时，以野生型病毒(H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株)为对照。在扫膜仪中扫描，拍照(图3)。
结果表明V-NS1-NanoLuc重组病毒和野生型病毒感染MDCK细胞后NP蛋白都能正常表达，V-NS1-NanoLuc重组病毒NS1蛋白与NanoLuc荧光素酶蛋白以融合蛋白的形式表达。
实施例6
V-NS1-NanoLuc重组病毒在MDCK细胞的增殖曲线，其步骤为：
MDCK细胞铺12孔细胞板，待细胞密度生长约为90％，弃去孔内培养基，用PBS洗两次后，重组病毒以0.001MOI感染细胞，37℃细胞培养箱孵育1h，每隔15min轻轻晃动一次，然后弃去病毒液，PBS洗细胞两次，加入含1μg/mLTPCK胰酶和终浓度为0.2％BSA的DMEM维持液。分别于0、12、24、36、48小时取上清，每个时间点做三个重复，-80℃冻存，上清病毒液在MDCK细胞上测定TCID50，同时，以野生型病毒(H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株)为对照，绘制增殖曲线。
结果表明V-NS1-NanoLuc重组病毒各个时间点的滴度稍低于亲本病毒滴度，复制能力差异不显著，与野生型病毒复制能力相近(图4)。
实施例7
V-NS1-NanoLuc重组病毒与野生型病毒对小鼠致病力的比较，其步骤为：
用PBS将V-NS1-NanoLuc重组病毒与野生型病毒分别稀释至每50μL PBS中含103EID50、104EID50、105EID50、106EID50的病毒液，将4～6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠(购于广东省医学实验动物中心)利用异氟烷呼吸麻醉，取50μL稀释病毒液滴鼻感染小鼠，每个稀释度5只小鼠，感染后每天记录观察小鼠的体重变化和死亡情况，直到14天，按照Reed-Muench氏法计算病毒的MLD50。
结果如图5所示，综合体重变化曲线、存活率和MLD50实验结果，表明V-NS1-NanoLuc重组病毒对小鼠上的致病力与野生型病毒相近，具有高致病力。
实施例8
V-NS1-NanoLuc重组病毒不同EID50感染剂量感染小鼠的体内成像，其步骤为：
将病毒液用PBS分别稀释至每50μL PBS中含103EID50、104EID50、105EID50、106EID50的V-NS1-NanoLuc重组病毒，将4～6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠利用异氟烷呼吸麻醉，取50μL稀释病毒液滴鼻感染小鼠，固定同一只小鼠，在感染后第3天以及第5天，利用异氟烷呼吸麻醉后经眼眶注射100μL Nano-Glo底物(购于Promega公司，用PBS按照体积比1：25比例稀释)，然后将小鼠置于IVIS Lumina LT(Series III)活体成像仪观察，使用Living Image软件采集图像与分析结果，并拍照保存结果，软件采集图像的参数与图像呈现的标尺均为一致。
从图6可知，注射底物后主要在小鼠胸部观察到生物荧光信号，并且有着很强的感染剂量依赖性。随着感染剂量的升高，在小鼠体内检测到的荧光强度越强；同一感染剂量感染小鼠，感染后第5天比第3天在小鼠体内检测到的荧光强度强。
实施例9
V-NS1-NanoLuc重组病毒104EID50/50μL感染剂量感染小鼠的体内成像，其步骤为：
将病毒液用PBS分别稀释至每50μL PBS中含104EID50的V-NS1-NanoLuc重组病毒，将4～6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠利用异氟烷呼吸麻醉，取50μL稀释病毒液滴鼻感染小鼠，固定同一只小鼠，在感染后第0、3、5、7、9、11天，利用异氟烷呼吸麻醉后经眼眶注射100μLNano-Glo底物(购于Promega公司，用PBS按照体积比1：25比例稀释)，然后将小鼠置于IVISLumina LT(Series III)活体成像仪观察，使用Living Image软件采集图像并拍照保存结果，同时结合体重变化结果分析，软件采集图像的参数与图像呈现的标尺均为一致。
图7所示为V-NS1-NanoLuc重组病毒在小鼠体内的感染动态过程。在感染重组病毒后第3天，小鼠体重下降，主要可以观察到小鼠胸部左肺的位置出现较强的生物荧光信号；在感染后第5天，小鼠体重下降明显，小鼠胸部左右肺的位置与鼻子位置同时出现生物荧光信号，且荧光强度显著增强；在感染后第7天，小鼠体重下降缓和，仍可在小鼠胸部左右肺的位置观察到生物荧光信号，相应的荧光强度有所减弱；在感染后第9天，小鼠体重迅速回升，在小鼠体内观察不到生物荧光信号；在感染后第11天，小鼠体重超出初始体重，在小鼠体内也观察不到生物荧光信号。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 华南农业大学
<120> 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1697
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> V-NS-NanoLuc片段
<400> 1
gcgacacctg ctacagggag caaaagcagg gtgacaaaga cataatggat tccaacactg 60
tgtcaagctt ccaggtagac tgctttcttt ggcatgtccg caaacgattt gcagaccaag 120
aactgggtga tgccccattt ctagaccggc tccgccggga tcagaagtcc ctgagaggaa 180
gaggcagcac tcttggtctg gacattagaa ccgcaactcg tgaaggaaag catatagtgg 240
agcagattct gaaggaagaa tcagatgagg catttaaaat gactattgct tcagtgccag 300
ttccacgcta cttaactgac atgactcttg aagaaatgtc aagagattgg ttaatgctca 360
ttcccaaaca gaaagtgaca gggtcccttt gcattagaat ggaccaagca acagtggata 420
aaaccatcac attaaaagca aacttcagtg tgattttcaa tcgactggaa gctctaatac 480
tacttagagc ttttacagac gaaggagcaa tagtgggcga aatctcacca ttaccttctc 540
tcccgggaca tactgatgag gatgtcaaaa atgcaattgg ggtcctcatc ggaggatttg 600
aatggaatga taacacagtt cgagtctctg aaaatctaca gagattcgct tggagaagca 660
gcgatgagga tgggagacct ccactctctc caaagggatc cggtggaatg gtcttcacac 720
tcgaagattt cgttggggac tggcgacaga cagccggcta caacctggac caagtccttg 780
aacagggagg tgtgtccagt ttgtttcaga atctcggggt gtccgtaact ccgatccaaa 840
ggattgtcct gagcggtgaa aatgggctga agatcgacat ccatgtcatc atcccgtatg 900
aaggtctgag cggcgaccaa atgggccaga tcgaaaaaat ttttaaggtg gtgtaccctg 960
tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc actatggcac actggtaatc gacggggtta 1020
cgccgaacat gatcgactat ttcggacggc cgtatgaagg catcgccgtg ttcgacggca 1080
aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga acggcaacaa aattatcgac gagcgcctga 1140
tcaaccccga cggctccctg ctgttccgag taaccatcaa cggagtgacc ggctggcggc 1200
tgtgcgaacg cattctggcg ggatccggcg ccaccaactt cagcctgctg aagcaggccg 1260
gcgacgtgga ggagaacccc ggccccatgg attccaacac tgtgtcaagc ttccaggaca 1320
tactgatgag gatgtcaaaa atgcaattgg ggtcctcatc ggaggatttg aatggaatga 1380
taacacagtt cgagtctctg aaaatctaca gagattcgct tggagaagca gcgatgagga 1440
tgggagacct ccactctctc caaagtagaa actggaaatg gagggaacaa ttgagccaga 1500
aattcgaaga aataagatgg ttgattgaag aagtgcgacg tagattaaag attacagaga 1560
atagctttga gcaaataaca tttatgcaag ccttacaact actgcttgaa gtggagcaag 1620
agataagaac tttctcgttt cagcttattt aatgataaaa aacacccttg tttctactaa 1680
tatgtagcag gtgtcgc 1697
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> V-NS-F
<400> 2
ggagcagatt ctgaaggaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> V-NS-R
<400> 3
agtagaaaca agggtgtttt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NanoLuc-F
<400> 4
atggtcttca cactcgaa 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NanoLuc-R
<400> 5
cgccagaatg cgttcgc 17
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Uni12 primer
<400> 6
agcaaaagca gg 12

Claims (9)

1.一种DNA片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述的DNA片段的重组质粒。
3.一种重组质粒，其特征在于：为将权利要求1所述的DNA片段插入到pHW2000质粒的BsmB I的酶切位点上获得。
4.权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的DNA片段用限制性内切酶Aar I进行酶切，然后将其用连接酶连接到用限制性内切酶BsmB I酶切后的pHW2000质粒上，得到重组质粒。
5.权利要求3所述的重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用，其特征在于：所述的重组禽流感病毒的骨架为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。
6.一种携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建7个基因的重组表达质粒：
将PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因分别用BsmB
Figure DEST_PATH_IMAGE001
限制性内切酶酶切，然后分别用连接酶连接到用BsmB
Figure 273109DEST_PATH_IMAGE001
限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M；
（2）重组禽流感病毒
将权利要求3所述的重组质粒、pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M共同转染293T细胞，转染4～6小时后，更换为含TPCK胰酶和BSA的Opti-MEM 培养基，继续培养48小时后，收集细胞培养液，然后将细胞培养液接种鸡胚，72小时后，收取鸡胚尿囊液，得到所述携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒；
步骤（1）中所述的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因为H9N2流感病毒中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因。
7.一种携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒，其特征在于：通过权利要求6所述的方法制备得到。
8.权利要求1所述的DNA片段，权利要求3所述的重组质粒，或权利要求7所述的携带NanoLuc荧光素酶基因的重组禽流感病毒在构建小鼠模型中的应用。
9.一种基于重组禽流感病毒构建活体成像小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
先将小鼠麻醉，然后将权利要求7所述的重组禽流感病毒通过鼻腔接种到小鼠体内，重组病毒感染小鼠3～7天后通过小鼠眼眶注射荧光素酶底物，得到活体成像小鼠模型。
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