CN109402172B - 一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明中公开了一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，通过CQW1毒株(GenBank：KM233707.1)的反向遗传操作系统，对鸭坦布苏病毒基因组的第1‑2646核酸片段进行改造，将NanoLuc报告基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建报告病毒的全长cDNA感染性克隆。本发明对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性，拯救出的报告病毒在5代以内不会丢失报告基因；同时减少构建重组质粒时所使用的引物及扩增基因片段的数量，减少反应步骤，简化工序，方便操作，有效的缩短了获得报告病毒的周期，降低了生产成本。

Description

一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。

目前的研究对DTMUV的研究并不深入，报道主要集中与病毒的分离鉴定和宿主的免疫反应等。其致病机制，免疫逃避等分子机制，各种蛋白的结构功能还有待于进一步的研究，才能确定与其他黄病毒属是否一致，是否存在差异性，而有关鸭坦布苏病毒的各个蛋白的作用也还有待深入的研究与证明。由于当前对该病的防控措施尚不完善，因此，该病每年仍对我国养鸭业造成几十亿元的经济损失，切实安全、高效的DTMUV疫苗亟待研制和应用。

DTMUV属黄病毒属，黄病毒的报告病毒自首次报道以来的十多年来，不同种属的黄病毒的多种类型的报告病毒已经被成功构建，并被广泛应用于研究病毒的生命周期，复制机制，抗病毒研究，药物筛选等领域，成为研究黄病毒的前有力的工具。构建黄病毒的报告病毒依赖于黄病毒的反向遗传操作系统，通过感染性克隆技术，将外源的报告基因插入到病毒基因组的合适位置，从而拯救出能表达报告基因的具有增殖能力的报告病毒。目前，包括EGFP，mCherry,Renilla luciferase,FireFly luciferase等报告基因都被尝试用于构建报告病毒，但通常报告基因的插入会致弱病毒的复制，且一般来说，报告基因越大，在传代过程中丢失就越快。值得注意的是，报告病毒的稳定性是相对而言，即便是最稳定的报告病毒在长期传代过程中，最终都会回复成野生型病毒，但是获得的报告病毒越稳定，传代数越多，越适合用于对病毒的生命周期、复制机制、抗病毒等方面的研究。

中国发明专利CN107475294A公布了携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，该发明方法中将海肾荧光素酶的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建出了重组质粒，再用高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录RNA后转染BHK21细胞拯救出报告病毒。但是实践发现，该专利方法所获得的DTMUV报告病毒极不稳定，在第2代或者第3代就已经检测到报告基因的明显丢失了；在5代以内，报告基因几乎完全丢失回复成野生型病毒，非常不利于后续研究的开展。而且该专利方法比较复杂，涉及多对引物的设计使用、多条基因片段的扩增及多个重组质粒的克隆，最后才能得到报告病毒的质粒载体，操作复杂，得到报告病毒的周期比较长。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的以上问题，提供一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性并且精简操作步骤，缩短获得报告病毒的周期。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、以pACYC FL-TMUV质粒为模板，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增得到片段A；以pJET-NanoLuc质粒为模板，以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段B；以pACYC TMUV-RLuc质粒为模板，以序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，PCR扩增得到片段C；

b、以步骤a中的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，以片段A和片段B为模板进行熔合PCR扩增，得到片段AB；再以步骤a中的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6为引物，以片段AB和片段C为模板，进行第二轮熔合PCR扩增，获得片段ABC；

c、将pACYC FL-TMUV质粒用限制性内切酶SpeI和XhoI进行双酶切，并回收纯化，获得纯化的线性pACYC FL-TMUV质粒载体；

d、将步骤b中所述的片段ABC与步骤c中线性化的pACYC FL-TMUV质粒载体进行重组连接，获得重组质粒，命名为pACYC TMUV-NLuc质粒；

e、将步骤d中的pACYC TMUV-NLuc质粒进行体外RNA转录，然后将体外转录获得的RNA转染BHK21细胞，从而拯救出报告病毒TMUV-NLuc。

优选地，所述片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述片段B的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述pACYC TMUV-NLuc重组质粒的序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述PCR扩增的条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸10s/kb，共30个循环；最后72℃后延伸7min。

由所述制备方法获得的鸭坦布苏报告病毒。

所述鸭坦布苏报告病毒在研究鸭坦布苏病毒的复制机制的应用。

所述鸭坦布苏报告病毒在研究抗鸭坦布苏病毒药物筛选中的应用。

所述鸭坦布苏报告病毒在研究宿主抗鸭坦布苏病毒基因的筛选中的应用。

本发明通过本实验室(四川农业大学动物医学院禽病防治中心)已经建立的CQW1毒株(GenBank登录号：KM233707.1)的反向遗传操作系统，对鸭坦布苏病毒基因组的第1-2646核酸片段进行改造，构建报告病毒的全长cDNA感染性克隆。将NanoLuc报告基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，在NanoLuc的5’端保留Capsid蛋白的前38个氨基酸所对应的核酸序列，以保留病毒复制所需的RNA二级结构；同时在NanoLuc的3’端添加口蹄疫病毒2A蛋白序列(20个氨基酸)；最后，将插入位置后完整的Capsid基因上的RNA的5’端环化序列进行同义突变，以防止长链反应。将上述经改造后的病毒基因组的第1-2646核酸片段与经SpeI和XhoI双酶切线性化后的pACYC FL-TMUV载体进行重组，从而构建出能用于拯救鸭坦布苏报告病毒TMUV-NLuc的全长cDNA感染性克隆的质粒。

与常用的荧光素酶基因，如萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相比，NanoLuc荧光素酶基因更小巧，只有19.1kDa，而且具有更加出色的灵敏度，方便定量检测，因而是构建黄病毒的报告病毒的理想报告基因。本发明构建的报告病毒载体可以通过高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录本后，转染BHK21细胞拯救出报告病毒，且拯救出的报告病毒与现有的鸭坦布苏报告病毒相比，在5代以内，报告基因不会发生丢失，传代更加稳定。由于报告病毒复制的过程表达出高水平的NanoLuc荧光素酶，可利用商品化的NanoLuc单荧光素酶检测试剂盒，通过检测NanoLuc的活性来反应病毒的复制情况。因此可用于研究TMUV的复制机制，与宿主的相互作用，抗TMUV药物的筛选，宿主抗病毒基因的筛选等多方面的研究，因此对鸭坦布苏病毒的研究具有重要意义。

本发明仅需要设计使用6条引物，进行三次普通PCR反应和两轮熔合PCR反应，即得到改造后的病毒基因组的第1-2646核酸片段ABC；再将片段ABC重组到线性化的pACYC FL-TMUV载体上，即得到报告病毒的质粒载体pACYC TMUV-NLuc。本发明中报告病毒质粒载体的构建步骤简单，使用的引物及需扩增的基因片段少，方便操作，缩短了获得重组质粒的周期，从而能更快的拯救出报告病毒。

本发明所具有的有益效果：

1)对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性；

2)同时减少构建重组质粒时所使用的引物及扩增基因片段的数量，减少反应步骤，简化工序，方便操作，有效的缩短了获得报告病毒的周期，而且降低了生产成本。

附图说明

图1为扩增片段A、B、C、AB及ABC的PCR扩增结果的电泳图，A：扩增片段A的电泳图；B：扩增片段B的电泳图；C：扩增片段C的电泳图；AB：扩增片段AB的电泳图；ABC：扩增片段ABC的电泳图。

图2为pACYC TMUV-NLuc质粒图谱。

图3为pACYC TMUV-NLuc质粒构建过程示意图。

图4为报告病毒产生的细胞病变图。

图5为F1代报告病毒感染BHK21细胞48小时产生的荧光值。

图6为F0代报告病毒连续传代5次，得到F1、F2、F3、F4、F5代报告病毒。对5代报告病毒的RNA进行RT-PCR结果的电泳图。

图7为NS5-GDD/AAA突变对病毒的复制的影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

质粒及细胞：pACYC FL-TMUV质粒、pACYC TMUV-RLuc质粒、pJET-NanoLuc质粒和BHK21细胞均由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供。

主要试剂盒：ClonExpress II One Step Cloning Kit购自诺唯赞生物公司；mMESSAGE mMACHINE^TM T7 Transcription Kit购自Ambion公司；LipofectamineMessengerMAX Regent购自Invitrogen公司；点突变试剂盒Fast Mutagenesis System购自全式金生物公司。

实施例1

1、对鸭坦布苏病毒基因组的第1-2646核酸片段进行改造

以pACYC FL-TMUV质粒为模板，以SpeI-F和C38-NLuc-R为引物，PCR扩增得到片段A；以pJET-NanoLuc质粒为模板，以NLuc-F和NLuc-R为引物，PCR扩增得到片段B；以pACYCTMUV-RLuc质粒为模板，以FMDV 2A-F和XhoI-R为引物，PCR扩增得到片段C。

以SpeI-F和NLuc-R为引物，以片段A和片段B为模板进行熔合PCR扩增，得到片段AB；再以SpeI-F和XhoI-R为引物，以片段AB和片段C为模板，进行第二轮熔合PCR扩增，获得片段ABC。

PCR的反应体系为：

PCR扩增的条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸10s/kb，共30个循环；最后72℃后延伸7min。每轮扩增结束后，进行凝胶电泳鉴定，并作液回收或者胶回收。扩增中所使用的引物详见表1，PCR扩增的电泳结果见图1.

表1、PCT扩增引物序列表

2、构建重组病毒质粒pACYC TMUV-NLuc

将pACYC FL-TMUV质粒用限制性内切酶SpeI和XhoI进行双酶切，并回收纯化，获得纯化的线性pACYC FL-TMUV质粒载体；使用ClonExpress II One Step Cloning Kit，将核酸片段ABC与线性化的pACYC FL-TMUV质粒载体与进行重组连接反应，获得重组质粒，然后转化到大肠杆菌感受态细胞，待菌落长出，挑菌进行菌落鉴定。然后，挑选PCR鉴定阳性的菌落送测序鉴定，将测序确认的质粒命名为pACYC TMUV-NLuc质粒；挑选测序正确的单菌落扩大培养后保存并抽提质粒备用。

实施例2

1、体外转录及拯救报告病毒

(1)挑取测序正确的报告病毒质粒的单菌落，120rpm/min，室温(25℃)振荡至浑浊度适宜。使用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒备用。使用mMESSAGE mMACHINE^TM T7Transcription Kit进行体外转录，严格按照供应商推荐程序操作，并使用RNase-free的枪头及EP管等。

(2)为了防止转录出过长链，使用SmaI单酶切充分线性化10μg pACYC TMUV-NLuc质粒，以终止转录；

(3)体外转录体系的配制：

RNase-free ddH2O	Up to 20μl
		2xNTP/CAP	10μl
10xReaction buffer	2μl
		GTP	1μl
Linearized pACYC TMUV-NLuc	5μl
		Enzyme Mix	2μl

(4)然后37℃孵育3h；转录完成后，加入1μl TuRBODNase，混匀后，37℃孵育15min，消化模板DNA。

(5)用氯化锂沉淀重获RNA：

a)加入30μl Nuclease-free ddH2O和30μl LiCl沉淀溶液，轻轻混匀后，放置-20℃条件下至少30min；

b)4℃离心15min，≥12000rpm/min；

c)吸取并去掉上清，加入1ml 70％的乙醇，4℃离心15min，≥12000rpm/min；小心去掉上清，晾干EP管；

d)用适量的Nuclease-free ddH2O重悬RNA，使用Nanodrop2000测定浓度后，分装后于-80℃保存备用或立即转染。

2、拯救报告病毒TMUV-NLuc

(1)将生长状态良好的BHK21细胞接种到T25，培养12～24h，待细胞汇合度达到70～90％，按转染试剂Lipofectamine MessengerMAX Regent说明操作，每瓶T25转染8μg报告病毒的转录本RNA；

(2)转染后每天观察细胞状态，转然后约200小时现细胞病变，则初步认为拯救出TMUV-NLuc。报告病毒产生的细胞病变详见图4。

(3)当细胞病变程度达到70％时，将细胞瓶放-80℃冻存；或反复冻融3次后，收获病毒液进行传代，本步骤的病毒为F0代病毒。

(4)为了进一步验证报告病毒TMUV-NLuc被成功拯救，将步骤(3)中收获的F0代病毒用TCID50法测定病毒的滴度，结果显示病毒滴度达到10^4.25/ml。以F0代病毒进行传代培养，得到F1代病毒，检测F1代病毒感染BHK21细胞48小时产生的荧光值，达到10^8.7，说明成功拯救出报告病毒。F1代报告病毒产生的荧光值结果详见图5。

实施例3

评估报告病毒TMUV-NLuc的传代稳定性

将实施例2中获得的F0代报告病毒在BHK21细胞连续传代5次，依次得到F1、F2、F3、F4和F5五代传代病毒，抽提每代病毒RNA进行RT-PCR，对PCR结果进行电泳，以检测报告基因是否仍然存在与病毒基因组，有无发生丢失。电泳结果详见图6。结果显示，至少在5代以内报告基没有发生丢失，说明TMUV-NLuc的稳定性明显比以往报道的鸭坦布苏报告病毒稳定性更好。

实施例4

报告病毒TMUV-NLuc在病毒复制研究中的应用

黄病毒的NS5蛋白是病毒是一个多功能酶蛋白，其C端的含有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)结构域，是病毒RNA复制所必须的酶，其酶活中心为GDD三个氨基酸。为了研究这这三个氨基酸是否在TMUV中的功能也是保守的，设计以下实验：

(1)首先构建了一个突变型报告病毒质粒。利用点突变试剂盒Fast MutagenesisSystem,构建带NS5-G667A，D668A，D669A连续三个突变的报告病毒感染性克隆质粒，命名为pACYC TMUV-NLuc-GDD/AAA。

(2)按上述方法线性化pACYC TMUV-NLuc和pACYC TMUV-NLuc-GDD/AAA载体后，体外转录获得RNA转录本。

(3)将生长状态良好的BHK21细胞接种到48孔板，培养24h，待细胞汇合度达到70～90％，按每孔转染0.25μg报告病毒的转录本RNA；分别在转染后第4h、12h、24h、36h、48h、72h、96h收集48孔细胞样品，按照Nano-Glo Luciferase Assay System说明书测定NanoLuc的活性。具体操作如下：

a)吸弃细胞培养基，用PBS小心润洗细胞两次后加入65μl Glo Lysis buffer，室温裂解5min后，刮取细胞到EP管中，4℃12000g离心10min，取上清冻存-80℃备用；

b)将平衡到室温的Nano-Glo Luciferase Assay Reagent加入不透光的96孔板中，每孔100μl，再小心吸取20μl细胞裂解物至96孔板中，混匀，于化学发光仪(luminometer)中检测NanoLuc报告基因的活性；结果如图7所示。

(4)结果显示，不论是野生型(WT-TMUV-NLuc)还是突变型(GDD-TMUV-NLuc)报告病毒RNA产生的NanoLuc荧光值在转染后的4小时即有很高的表达水平，这是转染的RNA直接翻译表达造成的。随后12-36小时，WT-TMUV-NLuc产生的NanoLuc的活性不断降低，但在从36-96小时，NanoLuc的活性随时间增长而不断升高，表明细胞内的WT-TMUV-NLuc已经开始复制，因而NanoLuc活性才会不断升高。但GDD-TMUV-NLuc产生的荧光值，却从12小时开始，一直随时间降低，并未出现代表病毒复制的上升曲线，说明鸭坦布苏病毒NS5蛋白的RdRp酶与其他黄病毒一样，RdRp酶活中心为第667到669位的GDD三个氨基酸。这三个氨基酸的突变将直接影响病毒的复制。

本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

<141> 2018-11-23

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 15275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780

tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840

cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900

ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960

aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020

ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080

gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140

tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200

caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260

ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320

tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380

ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440

gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500

caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560

ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcatactag ttaatacgac tcactatagg 1620

gagaagttca tctgtgtgaa cttattccaa acagtttttt gggatagtgc gtgtgaacgt 1680

aaacacagtt tgaacgtttt ttggatagag acaactatgt ctaacaaaaa accaggaaga 1740

cccggctcag gccgggttgt caatatgcta aagcgcggaa cgtcccgcgg aaatccgcta 1800

gcgcggataa agaggacgat tgatggggtc atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg 1860

gactggcgac agacagccgg ctacaacctg gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc 1920

agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt 1980

gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac 2040

caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag gtggtgtacc ctgtggacga tcatcacttt 2100

aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac 2160

tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca 2220

gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc 2280

ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg accggctggc ggctgtgcga acgcattctg 2340

gcgcagctgt tgaattttga ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg 2400

ccaatgtcta acaaaaaacc aggaagaccc ggctcaggcc gggttgtgaa catgttgaag 2460

cgcggaacgt cccgcggaaa tccgctagcg cggataaaga ggacgattga tggggtcctg 2520

agaggagcag gacccataag gtttgtgctg gctctactga ctttcttcaa gtttacagcc 2580

ctgaggccaa ccattggaat gctgaagaga tggaagctgg ttggagtcaa tgaggcgacc 2640

aaacatctga aaagtttcaa gcgtgacatt ggacagatgc tcgacgggct gaataagcgg 2700

aaggcgaaac gtcggggggg gagttgctct tgggtcatca tgttactccc gatagttgct 2760

gggctgaaac ttggaaatta taatggtaga gttttggcca ctttaaacaa gactgatgtg 2820

tcagacttgc tagtcattcc aacaacggct ggcagcaatg gatgcgtcgt gcgagctcta 2880

gatgtgggac tgatgtgtca ggatgacata acgtacctgt gcccaaagtt ggagtacggc 2940

tatgaacctg aagacataga ctgctggtgc aatgagactg agatatacat tcattatggg 3000

agatgtaccc cttcacggca tggacggagg tctaggaggt cggtgaacgt gcatcaccat 3060

ggagagagtc tacttgaggc caagaacacg ccgtggatgg attcgaccaa agccactaaa 3120

tatctcacaa aggttgagaa ctgggcgttg agaaatcctg ggtacgccct tgctgccatc 3180

ttcataggct ggaacttggg aacgacgaga agccagaaga taattttcac aattatgtta 3240

atgttaattg ccccagcgta cagcttcagc tgtctgggga tgcagaaccg agactttgtt 3300

gagggagtga atggtgttga gtggatcgat gtcgttctgg aaggaggctc atgcgtaact 3360

attacggcaa aagacaggcc gaccatagac gtcaagatga tgaacatgga ggctacggaa 3420

ttagcggttg tgagatctta ctgctatgag ccgaaagtgt cggacgtgac gacagaatcc 3480

agatgcccaa ccatgggaga ggctcataat cccaaggcaa cttatgctga atacatatgc 3540

aaaaaagatt ttgtggacag gggttggggc aatggctgtg gcttgtttgg aaaggggagc 3600

atccagacat gtgccaagtt tgactgcaca aagaaagcag aaggcaggat cgtgcagaag 3660

gaaaacgtcc agtttgaagt tgcagttttt atacatggtt ccacggaagc gagcacctac 3720

cacaattatt cagcccagca gtcgctgaaa catgccgcta gattcgtgat aacgcccaaa 3780

agtcccgtct acactgctga gatggaggat tatggtaccg tcacactcga atgcgaaccc 3840

cgatctgggg ttgacatggg gcaattctac gtcttcacca tgaatacaaa gagctggctt 3900

gttaacagag actggtttca tgacctcaac ttaccatgga cagggtcatc agcggggacg 3960

tggcaaaaca aagagtcatt gatagaattt gaggaggctc atgccaccaa acaatcagtg 4020

gtggctttgg catcacaaga aggagccctc catgcagcat tggcgggagc tattccagtg 4080

aagtactctg gaaacaaatt ggaaatgacc tcaggtcatc ttaaatgcag ggtcaaaatg 4140

cagggtttga agctgaaagg aatgacctac ccgatgtgta gcaatacatt ttccctagtg 4200

aagaatccta ccgacactgg gcatggcact gtcgtggtgg aattgtctta tgcaggtacc 4260

gatgggccct gtagagttcc catatccatg tcggcagatt tgaatgacat gacaccagtt 4320

ggacgcttga taacagtcaa cccatacgtg tcgacttcct ccacgggtgc caagataatg 4380

gtggaagtgg aacctccatt cggggattca tttattttag taggaagtgg aaaaggacag 4440

attaggtacc agtggcatag aagtgggagt acaattggaa aagctttcac gtcaacactc 4500

aaaggagcac aaaggatggt tgctttgggt gacactgcat gggattttgg ttcagttggg 4560

ggtgtactca cttccattgg gaaaggcatt catcaagtct tcggctcagc atttaaaagc 4620

ttatttggag gaatgtcatg gattactcaa ggcatgttag gggcactgct attgtggatg 4680

ggcctgaatg caagggacag atccatttct atgacctttc tagtcgtagg aggaatttta 4740

gtcttcttgg cagtaaatgt caatgccgac acggggtgct caatcgactt ggctaggaaa 4800

gaattaaaat gtggacaagg catgtttgtc ttcaacgatg ttgaggcctg gaaggataat 4860

tacaagtact atccatccac accaaggaga cttgccaaag tcgtggcaaa agctcatgag 4920

gctggaattt gtggcatacg atcagtcagc aggctcgagc acaatatgtg ggtaagcatc 4980

aaacatgagt tgaatgcgat cttggaagac aatgccattg atttgactgt ggtggttgaa 5040

gaaaatcctg gaagatacag gaaaaccaat cagaggctgc cgaacgttga tggagagctc 5100

acgtacggat ggaagaaatg ggggaaaagt atttttagca gcccgaagat gtcaaataat 5160

acatttgtca ttgatggacc aaaaactaga gagtgcccag atgagagaag agcatggaat 5220

agcatgaaaa ttgaagactt tgggtttgga gtgttgtcca caaaggtatg gatggaaatg 5280

cgaacagaaa atacaactga ttgtgacacc gcagtaatgg gcacagcaat taaaggaaat 5340

agagctgtgc acagtgacct gagctattgg atagagagca agaataatgg aagctggaaa 5400

ctggagaggg ctgtgttggg cgaggtgaag tcatgcacat ggccagaaac ccacaccctg 5460

tggagtgaca gcgttgtgga gagtgaactc atcataccta agacattggg aggaccgaag 5520

agtcatcaca acacgaggac aggatacagg gttcagagtt ccggaccgtg ggatgagaaa 5580

gagattgcaa tagacttcga ctactgtcct ggaacaactg tcacagtaac gagctcgtgc 5640

cgcgacagag ggccttcagc taggacaaca acagcgagtg ggaaattgat aacagattgg 5700

tgttgtaggt cttgcaccat cccaccactg agatttgtta caaaaagtgg atgctggtat 5760

gggatggaaa ttcggccaat tgttcacgga gacgacatgt tgatcaaatc aaaggtcatg 5820

gcttttcaag ggggtggcat ggaacctatg caattaggga tgctcgttat gattgtagca 5880

gcccaggaga ttttgagaag gcgcatgacg gctccaattg cttggtcagc gctgctgttg 5940

ctgatggctt tggtcctgtt tggaggaatc acgtacagtg atctggtcaa gtacgtcatc 6000

ctagtggcag ctgcatttgc tgagagcaat acaggtggtg acattgtgca cttggccatg 6060

gtggctgctt ttaacattca gccaggttta ctgattggat ttttactgag gaggaagtgg 6120

agcaatcagg aaagcagatt gcttggcgtt gcgttagcac tcataacagt ggcgatgaga 6180

gacttgaaca tgagtatacc aacattacta aactccggag ccatggcctg gctcttgctg 6240

agagccgtgt ttgaagggac ggttagctcc tttgccctgc cgcttgttag cttgctggct 6300

ccaggactca gaatagtggg gatagatgtg gtgaggatag gtgtgctaac cctggggatc 6360

ctctcactat tgaaagagag gagcaacgca atggcaaaaa agaagggagg catgctcctg 6420

ggagtggcat gcgctaccgc tggaatcgct agccctttgg tgtttgctgg tctgcacatg 6480

gtgctgaagc cagtgacacg gagagggtgg ccagtcagtg aggctttgac tgctgtggga 6540

ttgacattcg cgttggcagg aggaatagcc cagtttgatg acagcagcat ggcgattcca 6600

ttagccgttg gcgggatcat gctggtggtg gcagtggtga caggcttctc tacagactta 6660

tggctagaga aagcgagcga catctcgtgg agtgaggagg cgagggtgac tggagcatca 6720

cagagatttg atgtggaaat tgatcaggac ggcaatatga gattgctgaa cgatcctggt 6780

gtgtcgctcg gcgtttgggc ctttcgaact gggcttattc tgctatcttc atacaaccca 6840

tatttcctgc cattgactct ggcaggttac tggatgacaa ctaaggcaaa acaacgagga 6900

ggagtcatct gggatgtgcc agctccaaag gaaaggaaga gagccgaagt aggcaatgga 6960

gttttccgaa ttatggcaag aggactgtta ggaaaatacc aggctggggt gggagtcatg 7020

catgagggag tgtttcacac catgtggcac gtgacgaacg gggccgttat ccaagcagga 7080

gaaggaacac tggtcccata ttgggcgagt gtacgcaatg atctgatttc ctatggtgga 7140

ccatggaaat tggggaagca atggaatggt gtagatgaag tgcaagtcat cgtcgtgcaa 7200

ccaggcaaag aggtcataaa cgtgcagact cagccaggaa ttttcaagac tcaatatggt 7260

gaagttggag ctgtgtccct cgattaccca acgggaacct ctggatcacc tattattgac 7320

aaggaaggac aggtggttgg cctctatggt aatggaattc tggtgggttc aggcgatttt 7380

gtcagcatga ttactcaagg ggagaagaag gaggaagaag ttcctcaggt gtttgacgaa 7440

aacatgctgc ggaaaaggca actgacagtt ctggacctac atccaggttc aggaaagacc 7500

agaaaggtcc tccccatgat tctgaagagc gccattgaca aacgattaag aacagctgtc 7560

ttggctccga cgcgggtggt ggccgctgaa atagcggaag cactgaaagg actcccaata 7620

cggtatctga ctccggcagt aaagagggag catactggaa cagagataat agatgtgatg 7680

tgtcacgcga ctttgacagc gcggctgctc acacctcagc gagtgccgaa ttacaacctg 7740

ttcattatgg atgaggctca cttcacagac cctgccagca ttgctgccag aggatacata 7800

tcaacaaagg tggaactggg agaggcagct gcaatattca tgacagccac acctccaggt 7860

acaactgagg catttccgga ctccaactcg ccaataacag acattgaaga gcaaatccct 7920

gacagagctt ggaattctgg gtatgagtgg ataacagact ttcaaggaaa gactgtatgg 7980

tttgtcccca gcgtgaagtc tggtaatgag atcgccgtgt gcttgacaaa ggccggtaag 8040

aaggtaattc agttaaatag gaagagtttt gactcagagt atcctaagtg caagagtgga 8100

gaatgggatt tcgtgataac cactgacatc tcagaaatgg gagcgaactt tggagcgcaa 8160

cgggtcatag atagtcggaa gtgcattaaa ccagtgatta ttgaggatgg agaaggaagt 8220

gtgcaaatga atggaccagt tccaataaca tcagccagtg cagcccagcg tcgtggacgg 8280

gttggaaggg atgtgacaca aattggagat gagtaccact actcaggacc aaccagcgag 8340

gatgatcatg atttcgctca ttggaaagag gccaagatac tgctggacaa cattaacatg 8400

ccagatgggc tggttgccca gttgtacggc ccagagcggg acaaggttga cgcaattgat 8460

ggggaattca gactgaggac tgagcagagg aaacactttg tggagtatct gaggacagga 8520

gacctccctg tctggatatc gtacaaggtc gctgaagctg ggataagtta caatgaccgg 8580

cggtggtgct ttgatggacc ctcatgcaat actgttctgg aggacaataa cccagtggag 8640

ttatggacaa agtcaggtga gaagaaaatc ttgaagcccc ggtggagaga tggaagattg 8700

tgggcagatc accaggcctt aaaagccttc aaggattttg cgagtggaaa gagatcagcg 8760

atagggatcc ttgaggtctt caggatgctt cccgatcact tcgctcacag aatgacagaa 8820

tccatggaca acatatacat gctgactaca gctgagaaag ggagtagggc ccacagagaa 8880

gccctggagg aactgcctga gacacttgaa acatttttac tggtgttcat gatgacagtc 8940

gcctctatgg gggtgttctt gttctttgtt cagaggagag gtttagggaa gacaggtctt 9000

ggagccatgg tcatggccac agtcacggtt ttgttatgga tagcagaagt cccagcccag 9060

aagattgccg gtgtgctcct agtttctcta ttgctgatga ttgttctgat cccagaacca 9120

gagagacaga gatcacagac ggatagtcac ttggctgttt tcatgattgt tgtcttgtta 9180

gtggtgggtg ctgtggcgtc aaatgaaatg ggttggctag agcaaacaaa gaaggacttg 9240

tcagctctgt ttgggagaaa aagcgaaagc catcaagaaa cctggagtat gccttggccg 9300

gatttgagac cagcgacggc atgggcggcc tacgcaggag ctacaacatt tctgactccc 9360

ttgctaaaac acctcataat aacagagtat gtgaattttt cactcatggc aatgacggcg 9420

caggctggag cactatttgg actagggaaa ggcatgcctt ttgtcaaagc agacttgtca 9480

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gtcatgatgg tcatactgca ttatgcattt ttggtgccag gttggcaagc agaagccatg 9600

aggtcggccc agaggagaac tgctgcaggt gtgatgaaaa atcccgtggt tgatggcata 9660

gtggctacag atgttccaga ccttgaggcc agcactccta ttacagaaaa gaaattgggt 9720

caatgcgtgc tagtgggaat agccttggtg gcggtgtttc taacaccaaa cacgctaact 9780

ttgactgagt ttggaatgtt gacctctgcc gcttcggtga cattaattga gggagctgca 9840

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ttggctgggg cctctctagc atggactata actcggaatc tccaggcagg gaccttgcgt 9960

cgaggaggag gaactggcag aactttgggg gaagcatgga aggcccagct taaccaactg 10020

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gcaaagttga ggtggctcgt ggagcgtggg tttctcaaac caagaggcaa agttgtggat 10200

ttaggctgcg gcagaggagg ctggagttac tactgtgcta cattaaagca ggttcaggaa 10260

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tctgacacac tgctatgtga cataggtgaa gcttcacccg tcccagaaat tgaatctgcc 10440

agaacaatca gggtgctgca aatggccgag gaatggttag ctaggggcgt tgaagagttc 10500

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gctgataggg tgaagaattt ggccagagaa tatgctccgt cttggcatta tgaccaagac 10860

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tgggacacta gaataaccaa ggctgatttg gaaaacgaag ccatcatctt ggaaaagatg 11640

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gaccagaggg gaagtggaca ggttgtgacc tatgctctca acactttcac gaacctgtgt 11820

gtccagctca ttagatgtat ggaaggggag gagctgctgc tccccgagga aacagagcgt 11880

ctaaaaaaag gaaaggagaa gcgcatccaa gaatggctcc aaaagaatgg agagaacagg 11940

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agcaaagcat atgctcagat gtggttattg atgtacttcc acaggaggga cctcagacta 12300

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tggtcaatcc atggaaaagg cgagtggatg acttctgaag acatgctggc agtgtggaac 12420

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gggaaggact agaggttaga ggagacccct tgcgagtgag caccacaaga aacagcatat 13200

tgacacctgg gatagactag gagaccctct gtcctaacaa caccagccac ttggcacaga 13260

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gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 13440

ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 13500

cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 13560

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tgcataagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 13860

ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 13920

tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 13980

cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 14040

agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact 14100

ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc 14160

tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca 14220

aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct 14280

cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc 14340

acgaggcaga cctcagcgct caaagatgca ggggtaaaag ctaaccgcat ctttaccgac 14400

aaggcatccg gcagttcaac agatcgggaa gggctggatt tgctgaggat gaaggtggag 14460

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atccaactga taaaagagtt tgatgctcag ggtgtagcgg ttcggtttat tgacgacggg 14580

atcagtaccg acggtgatat ggggcaaatg gtggtcacca tcctgtcggc tgtggcacag 14640

gctgaacgcc ggaggatcct agagcgcacg aatgagggcc gacaggaagc aaagctgaaa 14700

ggaatcaaat ttggccgcag gcgtaccgtg gacaggaacg tcgtgctgac gcttcatcag 14760

aagggcactg gtgcaacgga aattgctcat cagctcagta ttgcccgctc cacggtttat 14820

aaaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 14880

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tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 15000

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 15060

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 15120

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 15180

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 15240

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgt 15275

Claims (6)

1.一种鸭坦布苏报告病毒质粒载体，其特征在于，所述质粒载体为pACYC TMUV-NLuc质粒，所述pACYC TMUV-NLuc质粒的序列如SEQ ID NO.10所示。

2.一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的pACYC TMUV-NLuc质粒进行体外RNA转录，然后将体外转录获得的RNA转染BHK21细胞，从而拯救出鸭坦布苏报告病毒TMUV-NLuc。

3.由权利要求2所述制备方法获得的鸭坦布苏报告病毒。

4.权利要求3所述鸭坦布苏报告病毒在研究鸭坦布苏病毒的复制机制的应用。

5.权利要求3所述鸭坦布苏报告病毒在研究抗鸭坦布苏病毒药物筛选中的应用。

6.权利要求3所述鸭坦布苏报告病毒在研究宿主抗鸭坦布苏病毒基因的筛选中的应用。

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