CN107475294B - 携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的构建方法及其产品和应用，将带鸭坦布苏病毒全长cDNA的感染性克隆的质粒经过改造，将海肾荧光素酶的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建出插入了RLuc基因的全长TMUV报告病毒的感染性克隆的质粒，再用高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录本后，转染BHK21细胞拯救出报告病毒，由于海肾荧光素酶具有出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测，因而可以通过检测RLuc的活性来反映病毒的复制情况，可用于研究TMUV的生命周期、复制机制，抗TMUV试验，病毒蛋白与宿主的相互作用等多方面的机制等多方面的研究。

Description

携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品 和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的构建方法，还涉及由该方法制得产品及产品的应用。
背景技术
我国是世界养禽大国，更是世界最大的养鸭国。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusuvirus，DTMUV)病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。
DTMUV属黄病毒科，黄病毒属，基因组为不分节段的单股正链RNA，约由10990个核苷酸组成，包含一个开放阅读框，编码一个3425aa的多聚蛋白。在宿主信号肽酶和病毒自身蛋白酶NS2B/NS3的切割作用下，产生3个结构蛋白(capsid[C]蛋白，premembrane[prM]蛋白，envelope[E]蛋白)，和7个非结构蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5；两端被5’UTR和3’UTR结构包围，分别长约94nt和618nt，病毒基因组RNA的5’端有帽子结构，3’端无poly(A)结构。
目前的研究对DTMUV的研究并不深入，报道主要集中与病毒的分离及鉴定。其致病机制，免疫逃避等分子机制，各种蛋白的结构功能还有待于进一步的研究，才能确定与其他黄病毒属是否一致，是否存在差异性，而有关鸭坦布苏病毒的各个蛋白的作用也还有待深入的研究与证明。由于当前对该病的防控措施尚不完善，因此，该病每年仍对我国养鸭业造成几十亿元的经济损失，切实安全、高效的DTMUV疫苗亟待研制和应用。
经典遗传学遵循从生物的表型、性状再到遗传物质的研究路线，来研究生命发生、发展的规律。而反向遗传学(reverse genetics)技术开辟了另外一条研究思路，即从遗传物质向生物性状、表型进行研究的手段。狭义的反向遗传学特指针对微生物的反向遗传操作，尤其是病毒的反向遗传操作，在RNA病毒研究中亦称作RNA感染性克隆技术。该方法具有定点改变、操作可控等优点。由于多数基因工程技术主要以DNA为对象，较DNA病毒研究而言，RNA病毒的反向遗传操作更为复杂，难度更大。针对不同的RNA病毒其反向遗传操作技术手段也不一。目前，多种RNA病毒的感染性克隆已成功构建，该技术的应用对于病毒学研究具有重大的推动作用。
与其他正链RNA病毒相比，黄病毒的反向遗传操作系统的构建更为困难，主要原因在于黄病毒基因组较长，且有潜在的原核毒性，在原核细胞中不稳定，极易发生片段的缺失或插入，以及多位点突变，因此，在构建稳定的感染性克隆重组载体过程中很难获得忠实的基因组cDNA序列。成功构建稳定的带报告基因的黄病毒感染性克隆，为后续对其生物学功能进行研究提供了良好的技术平台。例如通过构建点突变、嵌合体等衍生突变病毒并进行生物学特性研究，从而研究基因组结构、核酸序列和编码蛋白各基因的功能等。由于长片段PCR扩增技术的发展，利用高保真酶进行片段融合，构建全长cDNA为模板体外转录获得感染性RNA，转染合适的细胞以进行病毒的拯救是目前黄病毒拯救常用策略之一。
目前常用来进行黄病毒拯救的方法包括体外转录转染RNA法和DNA直接转染法，两种方法均需通过经典的分子克隆技术，构建含病毒基因组全长的重组质粒。此外，有研究人员采用环形聚合酶延伸克隆反应技术构建了WNV的感染性克隆质粒，和亚基因组扩增子技术成功拯救了多种黄病毒，这两种方法都不经过原核宿主克隆的步骤。通过多种方法，当前已成功构建的黄病毒属感染性克隆的病毒包括登革热病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒以及坦布苏病毒，其中研究最多的为登革热病毒、西尼罗病毒和日本乙型脑炎病毒和寨卡病毒。在感染性克隆的基础上，研究人员尝试在病毒基因组上插入外源的报告基因，试图构建能稳定表达报告基因的，且具有完整复制能力的报告病毒。能表达增强型绿色荧光蛋白WNV在2005年首先被构建成功，随后，多种类型的报告基因(荧光蛋白，荧光素酶，等)被引入到黄病毒的基因组，成功构建了DENV，JEV，YFV等报告病毒。由于报告病毒能表达外源的报告基因，所以能够直接通过检测报告基因的表达来检测病毒的量，因此对研究病毒的生命周期、复制机制，抗病毒研究、药物筛选等来说，报告病毒将是有力的实用工具等。
目前，国内外尚无DTMUV的报告病毒的被成功构建的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体的构建方法；本发明的目的之二在于提供上述方法构建的携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体；本发明的目的之三在于提供所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在作为鸭坦布苏报告病毒研究工具中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)以pRL-TK质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，PCR扩增获得RLuc表达盒，记为片段A；
(2)以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.9与SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增，分别扩增得A片段和D片段，再以pACYCFL-TMUV质粒为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增，扩增得片段C，然后用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示序列为引物，A片段和B片段为模板进行PCR扩增，获得A片段和B片段的融合片段，命名为AB片段，再以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示序列为引物，AB片段和C片段为模板进行PCR扩增，获得AB和C片段的熔合片段，命名为ABC片段；最后在以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示序列为引物，ABC片段和D片段为模板进行PCR扩增，获得ABC片段和D片段的融合片段，命名为RLuc-P1片段；
(3)将步骤(2)获得的P1-RLuc片段与经SpeI和XhoI进行双酶切后的pACYC 177A质粒连接，获得重组质粒，命名为pACYC RLuc-P1z质粒；
(4)以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.12与SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14与SEQ ID NO.15所示序列为引物，然后进行PCR扩增，扩增得到P2-3片段和P4-6片段，将P2-3片段与pACYC RLuc-P1质粒通过XhoI和EcoRV酶切位点进行亚克隆，获得中间载体pACYC RLuc-P1-3，再将P4-6片段通过EcoRV和NotI酶切位点亚克隆到pACYC RLuc-P1-3，获得携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体，命名为pACYC RLuc-TMUV质粒；
(5)用NotI将pACYC RLuc-TMUV质粒单酶切线性化，体外转录RNA，然后将转录的RNA转染BHK21细胞拯救出报告病毒。
本发明中，所述pACYC FL-TMUV质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pACYC177A质粒的序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的，所述PCR扩增条件为95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃(Tm+3℃)退火15s，72延伸15s/kb，共30个循环；最后72℃后延伸7min。
2、由所述的方法拯救的携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体。
3、所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒在作为鸭坦布苏报告病毒研究工具中的应用。
优选的，所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒在研究鸭坦布苏报告病毒生命周期中的应用。
优选的，所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒在研究鸭坦布苏报告病毒复制机制中的应用。
优选的，所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒在研究鸭坦布苏报告抗病毒药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体的构建方法，通过利用在黄病毒的感染性克隆中被广泛应用的pACYC 177载体构建鸭坦布苏病毒CQW1毒株(GenBank：KM233707.1)的感染性克隆的全长质粒，经过后期改造，将海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建出插入了RLuc基因的全长TMUV报告病毒的感染性克隆的质粒，由于海肾荧光素酶具有出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测，因而是理想的报告基因。本发明构建的报告病毒载体可以在高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录本后，转染BHK21细胞拯救出报告病毒，且拯救出的报告病毒，能随着复制的过程表达出海肾荧光素酶，可利用商品化的RLuc单荧光素酶检测试剂盒，通过检测RLuc的活性来反映病毒的复制情况。因此可用于研究TMUV的生命周期、复制机制，抗TMUV试验，病毒蛋白与宿主的相互作用等多方面的机制等多方面的研究，对鸭坦布苏报告病毒的研究具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为RLuc-P1片段扩增过程电泳图(A：A片段电泳图；B：B片段电泳图；C：C片段电泳图；D：D片段电泳图；AB：A片段和B片段融合片段电泳图；ABC：A片段、B片段和C片段融合片段电泳图；ABCD：A片段、B片段、C片段和D片段融合片段；E：线性化pACYC 177A质粒电泳图)。
图2为pACYC 177A质粒图谱。
图3为pACYC RLuc-TMUV质粒构建过程示意图。
图4为pACYC RLuc-TMUV全长质粒结构图。
图5为pACYC RLuc-TMUV全长质粒构建过程电泳和酶切图(1：RLuc-P1电泳图；2：P2-3电泳图；3：RLuc-P1-3电泳图；4：P4-6电泳图)
图6为转染后不同时间点测定RLuc的活性结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)合成包含FMDV 2A和同义突变的5’CS的序列：
为了将包含FMDV 2A和同义突变的5’CS的序列插入到P1片段并将原本的5’CS序列进行同义突变，需要进行多轮熔合PCR扩增。为了减小熔合PCR难度，将包含FMDV 2A和同义突变的5’CS的序列直接送全基因合成，简称为C26-RLuc-FMDV 2A，具体序列如下：
cgttgagcgagttctcaaaaatgaacaacagctgttgaattttgaccttctcaagctggcgggagacgtcgagtccaaccctgggccaatgtctaacaaaaaaccaggaagacccggctcaggccgggttgtgaacatgttgaagcgcggaacgtcccgcggaaatccgctagcgcggataaagaggacgattgatggggtcctgagaggagcaggacccataaggtttgtgctggctctactgactttcttcaagtttacagccctgaggc(SEQ ID NO.1)。
(2)扩增海肾荧光素酶表达框
以pRL-TK质粒为模板，以RLuc-F和RLuc-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：
PCR反应体系：5×EVO Buffer 10μl；dNTP Mix(10mM each)1μl；模板DNA 1μl；引物F(10μM)2μl；引物R(10μM)2μl；DNA Polymerase(1U/μl)1μl，ddH2O补足50μl体系；
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃(Tm+3℃)退火15s，72延伸15s/kb，共30个循环；最后72℃后延伸7min。
扩增获得含海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)基因的表达框，记为片段B。
(3)鸭坦布苏病毒P1片段改造
以感染性克隆全长质粒pACYC FL-TMUV质粒(SEQ ID NO.2)为模板，用SpeI-F/C26-R引物和C(native)-F/XhoI-R引物分别进行PCR，扩增分别得到A、D四个片段；再以pACYCFL-TMUV为模板，FMDV 2A-F/FMDV 2A-R为引物进行PCR扩增，扩增得到C片段，然后用SpeI-F/RLuc-R引物，将A和B片段熔合为AB片段。用SpeI-F/FMDV 2A-R引物，将AB和C片段熔合为ABC片段。最后，用SpeI-F/XhoI-R引物将ABC和D片段进行熔合，得到大小约3750bp的RLuc-P1片段。RLuc-P1片段中，将C26-RLuc-FMDV 2A盒子插入到DTMUV基因组P1片段的5’UTR和结构C蛋白之间，同时将原本完整C蛋白第15～18氨基酸对应的cDNA序列的5’端环化序列(5’CS)作同义突变，见图3。
每轮扩增结束时，进行凝胶电泳鉴定，并作液回收或胶回收。扩增中使用的引物如表1所示，扩增结果如图1所示。
表1、PCR扩增引物序列
Figure BDA0001380742990000061
PCR反应体系及反应程序同上。
(4)构建pACYC RLuc-P1质粒
利用SpeI和XhoI两种限制性内切酶，将pACYC 177A质粒(图2)双酶切线性化，pACYC177A质粒序列如SEQ ID NO.11所示。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit，将线性化的pACYC 177A与RLuc-P1连结并转化到SURE大肠杆菌，待菌落长出，挑菌进行菌落鉴定。然后挑选PCR鉴定阳性的菌落送测序鉴定，命名为pACYC RLuc-P1质粒。待测序鉴定后，挑选测序正确的单菌落扩大培养后保存并抽提质粒备用。
(5)构建pACYC RLuc-TMUV质粒
构建过程如图3所示，具体为：以pACYC FL-TMUV为模板，以P2-3-F/P2-3-R和P4-6-F/P4-6-R为引物，具体序列见表2，然后进行PCR扩增，扩增得到P2-3(2627-6229nt)和P4-6(6230-10992nt)片段。利用酶切位点XhoI和EcoRV，先将P2-3与pACYC RLuc-P1进行亚克隆，得到pACYC RLuc-P1-3质粒。再利用EcoRV和NotI双酶切，将P4-6亚克隆到pACYC RLuc-P1-3，得到pACYC RLuc-TMUV全长质粒，结构如图4所示，酶切结果图如图5所示。每次亚克隆都经测序确认无突变之后再进行下一步。挑菌落PCR鉴定正确的全长报告病毒单克隆，120rpm/min，30℃振荡扩大培养，减小质粒随大肠杆菌复制过程中引入突变的几率。待菌液达到适宜浑浊度后，抽提质粒送测序鉴定，挑选测序正确的单菌落扩大培养后保存。
表2、P2-3和P4-6片段PCR扩增引物
Figure BDA0001380742990000071
实施例2
挑取测序正确的报告病毒质粒的单菌落，120rpm/min，30℃振荡至浑浊度适宜。使用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒备用。
使用mMESSAGE mMACHINETM T7Transcription Kit进行体外转录，严格按照供应商推荐程序操作，使用RNase-free的枪头及EP管等：
(1)为了防止转录出过长链，NotI单酶切充分线性化10μg pACYC RLuc-TMUV质粒，以终止转录；
(2)体外转录体系的配制：
Figure BDA0001380742990000072
然后37℃孵育3h；
(3)转录完成后，加入1μl TuRBO DNase，混匀后，37℃孵育15min；
(4)氯化锂沉淀重获RNA：
a)加入30μl Nuclease-free ddH2O和30μl LiCl沉淀溶液，轻轻混匀后，放置-20℃条件下至少30min；
b)4℃离心15min，≥12000rpm/min；
c)吸取并去掉上清，加入1ml 70％的乙醇，4℃离心15min，≥12000rpm/min；
d)小心去掉上清，晾干EP管；
e)用适量的Nuclease-free ddH2O重悬RNA，分装后于-80℃保存备用或立即转染。
(5)将生长状态良好的BHK21细胞接种到12孔板，培养12～24h，待细胞汇合度达到70～90％，按转染试剂TransIntro EL Transfection Reagent说明操作，每孔转染1μg报告病毒的转录本RNA；
(6)分别在转染后第4h、12h、24h、36h、48h、72h、96h收集细胞样品，按照TransDetectSingle-Luciferase(Renilla)Reporter Assay Kit说明书测定RLuc的活性。具体操作如下：
a)吸弃细胞培养基，用PBS小心润洗细胞两次后加入250μl Cell Lysis溶液，室温裂解10min后，刮取细胞到EP管中，4℃12000g离心10min，取上清备用；
b)将平衡的室温的Luciferase Reaction Reagent II加入不透光的96孔板中，每孔100μl，再小心吸取20μl细胞裂解物至96孔板中，轻弹混匀，于化学发光仪(luminometer)中检测RLuc报告基因的活性；结果如图6所示。结果显示，RLuc在RNA转染后的12小时有一个初始表达峰，这是转染的RNA直接翻译表达造成的。随后12-48小时，RLuc的活性不断降低，48-96小时RLuc的活性又不断提升，表明细胞内已经有报告病毒的产生，因而RLuc才会不断升高，表明表达RLuc的报告病毒被成功拯救。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
<110> 四川农业大学；
<120> 携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用
<160> 15
<210> 1
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C26-Rluc-FMDV 2A序列
<400> 1
cgttgagcga gttctcaaaa atgaacaaca gctgttgaat tttgaccttc tcaagctggc 60
gggagacgtc gagtccaacc ctgggccaat gtctaacaaa aaaccaggaa gacccggctc 120
aggccgggtt gtgaacatgt tgaagcgcgg aacgtcccgc ggaaatccgc tagcgcggat 180
aaagaggacg attgatgggg tcctgagagg agcaggaccc ataaggtttg tgctggctct 240
actgactttc ttcaagttta cagccctgag gc 272
<210> 2
<211> 14588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACYC FL-TMUV质粒序列
<400> 2
gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300
gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 420
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 480
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780
tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840
cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900
ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960
aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020
ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080
gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140
tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200
caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260
ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320
tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380
ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440
gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500
caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560
ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcatactag ttaatacgac tcactatagg 1620
gagaagttca tctgtgtgaa cttattccaa acagtttttt gggatagtgc gtgtgaacgt 1680
aaacacagtt tgaacgtttt ttggatagag acaactatgt ctaacaaaaa accaggaaga 1740
cccggctcag gccgggttgt caatatgcta aagcgcggaa cgtcccgcgg aaatccgcta 1800
gcgcggataa agaggacgat tgatggggtc ctgagaggag caggacccat aaggtttgtg 1860
ctggctctac tgactttctt caagtttaca gccctgaggc caaccattgg aatgctgaag 1920
agatggaagc tggttggagt caatgaggcg accaaacatc tgaaaagttt caagcgtgac 1980
attggacaga tgctcgacgg gctgaataag cggaaggcga aacgtcgggg ggggagttgc 2040
tcttgggtca tcatgttact cccgatagtt gctgggctga aacttggaaa ttataatggt 2100
agagttttgg ccactttaaa caagactgat gtgtcagact tgctagtcat tccaacaacg 2160
gctggcagca atggatgcgt cgtgcgagct ctagatgtgg gactgatgtg tcaggatgac 2220
ataacgtacc tgtgcccaaa gttggagtac ggctatgaac ctgaagacat agactgctgg 2280
tgcaatgaga ctgagatata cattcattat gggagatgta ccccttcacg gcatggacgg 2340
aggtctagga ggtcggtgaa cgtgcatcac catggagaga gtctacttga ggccaagaac 2400
acgccgtgga tggattcgac caaagccact aaatatctca caaaggttga gaactgggcg 2460
ttgagaaatc ctgggtacgc ccttgctgcc atcttcatag gctggaactt gggaacgacg 2520
agaagccaga agataatttt cacaattatg ttaatgttaa ttgccccagc gtacagcttc 2580
agctgtctgg ggatgcagaa ccgagacttt gttgagggag tgaatggtgt tgagtggatc 2640
gatgtcgttc tggaaggagg ctcatgcgta actattacgg caaaagacag gccgaccata 2700
gacgtcaaga tgatgaacat ggaggctacg gaattagcgg ttgtgagatc ttactgctat 2760
gagccgaaag tgtcggacgt gacgacagaa tccagatgcc caaccatggg agaggctcat 2820
aatcccaagg caacttatgc tgaatacata tgcaaaaaag attttgtgga caggggttgg 2880
ggcaatggct gtggcttgtt tggaaagggg agcatccaga catgtgccaa gtttgactgc 2940
acaaagaaag cagaaggcag gatcgtgcag aaggaaaacg tccagtttga agttgcagtt 3000
tttatacatg gttccacgga agcgagcacc taccacaatt attcagccca gcagtcgctg 3060
aaacatgccg ctagattcgt gataacgccc aaaagtcccg tctacactgc tgagatggag 3120
gattatggta ccgtcacact cgaatgcgaa ccccgatctg gggttgacat ggggcaattc 3180
tacgtcttca ccatgaatac aaagagctgg cttgttaaca gagactggtt tcatgacctc 3240
aacttaccat ggacagggtc atcagcgggg acgtggcaaa acaaagagtc attgatagaa 3300
tttgaggagg ctcatgccac caaacaatca gtggtggctt tggcatcaca agaaggagcc 3360
ctccatgcag cattggcggg agctattcca gtgaagtact ctggaaacaa attggaaatg 3420
acctcaggtc atcttaaatg cagggtcaaa atgcagggtt tgaagctgaa aggaatgacc 3480
tacccgatgt gtagcaatac attttcccta gtgaagaatc ctaccgacac tgggcatggc 3540
actgtcgtgg tggaattgtc ttatgcaggt accgatgggc cctgtagagt tcccatatcc 3600
atgtcggcag atttgaatga catgacacca gttggacgct tgataacagt caacccatac 3660
gtgtcgactt cctccacggg tgccaagata atggtggaag tggaacctcc attcggggat 3720
tcatttattt tagtaggaag tggaaaagga cagattaggt accagtggca tagaagtggg 3780
agtacaattg gaaaagcttt cacgtcaaca ctcaaaggag cacaaaggat ggttgctttg 3840
ggtgacactg catgggattt tggttcagtt gggggtgtac tcacttccat tgggaaaggc 3900
attcatcaag tcttcggctc agcatttaaa agcttatttg gaggaatgtc atggattact 3960
caaggcatgt taggggcact gctattgtgg atgggcctga atgcaaggga cagatccatt 4020
tctatgacct ttctagtcgt aggaggaatt ttagtcttct tggcagtaaa tgtcaatgcc 4080
gacacggggt gctcaatcga cttggctagg aaagaattaa aatgtggaca aggcatgttt 4140
gtcttcaacg atgttgaggc ctggaaggat aattacaagt actatccatc cacaccaagg 4200
agacttgcca aagtcgtggc aaaagctcat gaggctggaa tttgtggcat acgatcagtc 4260
agcaggctcg agcacaatat gtgggtaagc atcaaacatg agttgaatgc gatcttggaa 4320
gacaatgcca ttgatttgac tgtggtggtt gaagaaaatc ctggaagata caggaaaacc 4380
aatcagaggc tgccgaacgt tgatggagag ctcacgtacg gatggaagaa atgggggaaa 4440
agtattttta gcagcccgaa gatgtcaaat aatacatttg tcattgatgg accaaaaact 4500
agagagtgcc cagatgagag aagagcatgg aatagcatga aaattgaaga ctttgggttt 4560
ggagtgttgt ccacaaaggt atggatggaa atgcgaacag aaaatacaac tgattgtgac 4620
accgcagtaa tgggcacagc aattaaagga aatagagctg tgcacagtga cctgagctat 4680
tggatagaga gcaagaataa tggaagctgg aaactggaga gggctgtgtt gggcgaggtg 4740
aagtcatgca catggccaga aacccacacc ctgtggagtg acagcgttgt ggagagtgaa 4800
ctcatcatac ctaagacatt gggaggaccg aagagtcatc acaacacgag gacaggatac 4860
agggttcaga gttccggacc gtgggatgag aaagagattg caatagactt cgactactgt 4920
cctggaacaa ctgtcacagt aacgagctcg tgccgcgaca gagggccttc agctaggaca 4980
acaacagcga gtgggaaatt gataacagat tggtgttgta ggtcttgcac catcccacca 5040
ctgagatttg ttacaaaaag tggatgctgg tatgggatgg aaattcggcc aattgttcac 5100
ggagacgaca tgttgatcaa atcaaaggtc atggcttttc aagggggtgg catggaacct 5160
atgcaattag ggatgctcgt tatgattgta gcagcccagg agattttgag aaggcgcatg 5220
acggctccaa ttgcttggtc agcgctgctg ttgctgatgg ctttggtcct gtttggagga 5280
atcacgtaca gtgatctggt caagtacgtc atcctagtgg cagctgcatt tgctgagagc 5340
aatacaggtg gtgacattgt gcacttggcc atggtggctg cttttaacat tcagccaggt 5400
ttactgattg gatttttact gaggaggaag tggagcaatc aggaaagcag attgcttggc 5460
gttgcgttag cactcataac agtggcgatg agagacttga acatgagtat accaacatta 5520
ctaaactccg gagccatggc ctggctcttg ctgagagccg tgtttgaagg gacggttagc 5580
tcctttgccc tgccgcttgt tagcttgctg gctccaggac tcagaatagt ggggatagat 5640
gtggtgagga taggtgtgct aaccctgggg atcctctcac tattgaaaga gaggagcaac 5700
gcaatggcaa aaaagaaggg aggcatgctc ctgggagtgg catgcgctac cgctggaatc 5760
gctagccctt tggtgtttgc tggtctgcac atggtgctga agccagtgac acggagaggg 5820
tggccagtca gtgaggcttt gactgctgtg ggattgacat tcgcgttggc aggaggaata 5880
gcccagtttg atgacagcag catggcgatt ccattagccg ttggcgggat catgctggtg 5940
gtggcagtgg tgacaggctt ctctacagac ttatggctag agaaagcgag cgacatctcg 6000
tggagtgagg aggcgagggt gactggagca tcacagagat ttgatgtgga aattgatcag 6060
gacggcaata tgagattgct gaacgatcct ggtgtgtcgc tcggcgtttg ggcctttcga 6120
actgggctta ttctgctatc ttcatacaac ccatatttcc tgccattgac tctggcaggt 6180
tactggatga caactaaggc aaaacaacga ggaggagtca tctgggatgt gccagctcca 6240
aaggaaagga agagagccga agtaggcaat ggagttttcc gaattatggc aagaggactg 6300
ttaggaaaat accaggctgg ggtgggagtc atgcatgagg gagtgtttca caccatgtgg 6360
cacgtgacga acggggccgt tatccaagca ggagaaggaa cactggtccc atattgggcg 6420
agtgtacgca atgatctgat ttcctatggt ggaccatgga aattggggaa gcaatggaat 6480
ggtgtagatg aagtgcaagt catcgtcgtg caaccaggca aagaggtcat aaacgtgcag 6540
actcagccag gaattttcaa gactcaatat ggtgaagttg gagctgtgtc cctcgattac 6600
ccaacgggaa cctctggatc acctattatt gacaaggaag gacaggtggt tggcctctat 6660
ggtaatggaa ttctggtggg ttcaggcgat tttgtcagca tgattactca aggggagaag 6720
aaggaggaag aagttcctca ggtgtttgac gaaaacatgc tgcggaaaag gcaactgaca 6780
gttctggacc tacatccagg ttcaggaaag accagaaagg tcctccccat gattctgaag 6840
agcgccattg acaaacgatt aagaacagct gtcttggctc cgacgcgggt ggtggccgct 6900
gaaatagcgg aagcactgaa aggactccca atacggtatc tgactccggc agtaaagagg 6960
gagcatactg gaacagagat aatagatgtg atgtgtcacg cgactttgac agcgcggctg 7020
ctcacacctc agcgagtgcc gaattacaac ctgttcatta tggatgaggc tcacttcaca 7080
gaccctgcca gcattgctgc cagaggatac atatcaacaa aggtggaact gggagaggca 7140
gctgcaatat tcatgacagc cacacctcca ggtacaactg aggcatttcc ggactccaac 7200
tcgccaataa cagacattga agagcaaatc cctgacagag cttggaattc tgggtatgag 7260
tggataacag actttcaagg aaagactgta tggtttgtcc ccagcgtgaa gtctggtaat 7320
gagatcgccg tgtgcttgac aaaggccggt aagaaggtaa ttcagttaaa taggaagagt 7380
tttgactcag agtatcctaa gtgcaagagt ggagaatggg atttcgtgat aaccactgac 7440
atctcagaaa tgggagcgaa ctttggagcg caacgggtca tagatagtcg gaagtgcatt 7500
aaaccagtga ttattgagga tggagaagga agtgtgcaaa tgaatggacc agttccaata 7560
acatcagcca gtgcagccca gcgtcgtgga cgggttggaa gggatgtgac acaaattgga 7620
gatgagtacc actactcagg accaaccagc gaggatgatc atgatttcgc tcattggaaa 7680
gaggccaaga tactgctgga caacattaac atgccagatg ggctggttgc ccagttgtac 7740
ggcccagagc gggacaaggt tgacgcaatt gatggggaat tcagactgag gactgagcag 7800
aggaaacact ttgtggagta tctgaggaca ggagacctcc ctgtctggat atcgtacaag 7860
gtcgctgaag ctgggataag ttacaatgac cggcggtggt gctttgatgg accctcatgc 7920
aatactgttc tggaggacaa taacccagtg gagttatgga caaagtcagg tgagaagaaa 7980
atcttgaagc cccggtggag agatggaaga ttgtgggcag atcaccaggc cttaaaagcc 8040
ttcaaggatt ttgcgagtgg aaagagatca gcgataggga tccttgaggt cttcaggatg 8100
cttcccgatc acttcgctca cagaatgaca gaatccatgg acaacatata catgctgact 8160
acagctgaga aagggagtag ggcccacaga gaagccctgg aggaactgcc tgagacactt 8220
gaaacatttt tactggtgtt catgatgaca gtcgcctcta tgggggtgtt cttgttcttt 8280
gttcagagga gaggtttagg gaagacaggt cttggagcca tggtcatggc cacagtcacg 8340
gttttgttat ggatagcaga agtcccagcc cagaagattg ccggtgtgct cctagtttct 8400
ctattgctga tgattgttct gatcccagaa ccagagagac agagatcaca gacggatagt 8460
cacttggctg ttttcatgat tgttgtcttg ttagtggtgg gtgctgtggc gtcaaatgaa 8520
atgggttggc tagagcaaac aaagaaggac ttgtcagctc tgtttgggag aaaaagcgaa 8580
agccatcaag aaacctggag tatgccttgg ccggatttga gaccagcgac ggcatgggcg 8640
gcctacgcag gagctacaac atttctgact cccttgctaa aacacctcat aataacagag 8700
tatgtgaatt tttcactcat ggcaatgacg gcgcaggctg gagcactatt tggactaggg 8760
aaaggcatgc cttttgtcaa agcagacttg tcagtacccc tgctactctt agggtgttgg 8820
ggacagttca caatgacaac aacggtctcg gcagtcatga tggtcatact gcattatgca 8880
tttttggtgc caggttggca agcagaagcc atgaggtcgg cccagaggag aactgctgca 8940
ggtgtgatga aaaatcccgt ggttgatggc atagtggcta cagatgttcc agaccttgag 9000
gccagcactc ctattacaga aaagaaattg ggtcaatgcg tgctagtggg aatagccttg 9060
gtggcggtgt ttctaacacc aaacacgcta actttgactg agtttggaat gttgacctct 9120
gccgcttcgg tgacattaat tgagggagct gcaggtcgta tttggaacgc aaccacagcc 9180
gttgctatgt gccatctgtt gaggaaaaac tggttggctg gggcctctct agcatggact 9240
ataactcgga atctccaggc agggaccttg cgtcgaggag gaggaactgg cagaactttg 9300
ggggaagcat ggaaggccca gcttaaccaa ctgacccggc aagagtttat ggaataccgg 9360
aaagacggga ttattgaagt agatagagct gctgcaaaaa gagcccgccg tgaaggaaat 9420
gtgacaggag ggcacccagt ttcacgaggc acggcaaagt tgaggtggct cgtggagcgt 9480
gggtttctca aaccaagagg caaagttgtg gatttaggct gcggcagagg aggctggagt 9540
tactactgtg ctacattaaa gcaggttcag gaagtgagag gttacacaaa aggagggcca 9600
gggcatgagg aaccagtgat gacccagagc tatggctgga acattgtgac gttaaagagt 9660
ggggttaatg ttcatttcaa gccgactgaa ccatctgaca cactgctatg tgacataggt 9720
gaagcttcac ccgtcccaga aattgaatct gccagaacaa tcagggtgct gcaaatggcc 9780
gaggaatggt tagctagggg cgttgaagag ttctgcataa aagtgctttg tccctacatg 9840
ccagcggtca taaaagaact ggaaagactg cagctgaaat ggggaggtgg tttggtcaga 9900
gtgccactct cgcgtaattc aacgcatgag atgtactggg tgagcggctc aagtgggaat 9960
gtgacaaata gtattaatac agtgagccaa atgctgatca acaggatgca caaaaccaac 10020
cgtaatggac ccaggtatga agaagatgtg gacttgggtt cagggaccag agctgtgagc 10080
tgcacaagac agaggactga ctggggaatg gtcgctgata gggtgaagaa tttggccaga 10140
gaatatgctc cgtcttggca ttatgaccaa gacaatcctt acaagacttg gaactatcat 10200
ggaagttacg aagtgaaagc cacaggctca gccagctcaa tggttaatgg ggtagttagg 10260
atactgtcaa aaccttggga caccttgcaa aacgtggtga atatggccat gacggacact 10320
actccttttg ggcaacagcg cgtatttaaa gaaaaggttg ataccaaagc cccagaacca 10380
cctgcaggaa cagctagggt tatgaacatc gtggcaagat ggatgtggaa ctttgttggc 10440
aggaacaaac aaccaaggat gtgcacaaaa gaagagttca tagagaaggt gaatagtaac 10500
gcagccctgg gggccatgtt tgaggagcaa cacaaatggg ccagcgccag ggaagcggtt 10560
gaggatcctg aattttggag tcttgttgac agagagagag aactgcactt gcaagggaag 10620
tgcgagacct gcatttacaa catgatggga aagcgagaaa agaagatggg agagttcggg 10680
aaagcaaaag gtagcagagc tatttggtac atgtggctcg gggccagatt cctagagttc 10740
gaagccttgg gcttcttgaa cgaggatcac tggatgagca gggaaaacac taaaggaggc 10800
gttgaaggac ttggactcca aaagttgggg tatgtgctgc gtgacatttc ggccaaagaa 10860
ggaggactta tgtacgcaga cgacacggcc ggatgggaca ctagaataac caaggctgat 10920
ttggaaaacg aagccatcat cttggaaaag atggaaccaa tgcacagagc tgttgcagaa 10980
ccactcatta aatttgccta catgaataag gtggtgaagg tgatgcgacc gggacgtgat 11040
gggaagacag ttatggatgt catctcgcgg gaagaccaga ggggaagtgg acaggttgtg 11100
acctatgctc tcaacacttt cacgaacctg tgtgtccagc tcattagatg tatggaaggg 11160
gaggagctgc tgctccccga ggaaacagag cgtctaaaaa aaggaaagga gaagcgcatc 11220
caagaatggc tccaaaagaa tggagagaac aggttgtcag ccatggcagt cagtggggat 11280
gactgtgtgg tgaaaccagc ggatgacaga ttcgccacag cactgcactt cctcaatagt 11340
atgtctaagg tgaggaaaga tactcaggaa tggaagccct caaccggttg gagaaactgg 11400
caagaagtcc ccttttgctc acaccatttc cacgagctgc aaatgaaaga tggcagaaag 11460
attgtggttc catgtcgaga ccaggatgag ctaattggaa gagccaggct ctctccaggg 11520
tctggctggt cactaacaga aacagcatgc ctgagcaaag catatgctca gatgtggtta 11580
ttgatgtact tccacaggag ggacctcaga ctaatggcaa acgccatctg ctcatctgtc 11640
cctgtctcat gggtccccac aggaaggaca acgtggtcaa tccatggaaa aggcgagtgg 11700
atgacttctg aagacatgct ggcagtgtgg aacagggtgt ggattgaaga aaatgaacac 11760
atggaagaca aaaccccagt gacttcatgg aacgaagtgc cataccttgg aaagagggaa 11820
gatggctggt gtggtagtct gattggacac cgagccagat ctacctgggc cgagaacata 11880
tacactccaa ttatgcagat cagagctctc attggccctg agcactatgt agattatatg 11940
ccaactctaa ataggttcaa acccattgaa agctggagtg aaggtgtttt gtaaatatat 12000
gaggtaggtg taaaaatgta tgtaaagtag tgttagtcta gagtagataa atatataaat 12060
tagcatttgt ttgaatagat aggaagagga agtcaggcca gggaatccct gccaccggat 12120
gttggatgac ggtgctgtct gcgttccaac cccaggagga ctgggttaac aaatctgggt 12180
gcatggagga gctaagcgtt caataccgcc tcggagaact ccctggctca cgaagtgccc 12240
tggaccagtg tcgggccaca ggttttgtgc cactagcgtg cagtgcagcc cggacaaaag 12300
acacgcccca ggaggactgg gaaaacaaag ccgaaatggc ccccacggcc tgaaatgatg 12360
gagctggtgt gaccatcatg gagggactag aggttagagg agaccccgtg gaaagaaagc 12420
aaggcccaac ctagagtcaa gctgtaactc taggggaagg actagaggtt agaggagacc 12480
ccttgcgagt gagcaccaca agaaacagca tattgacacc tgggatagac taggagaccc 12540
tctgtcctaa caacaccagc cacttggcac agatcgccga aagtgtggct ggtggtggta 12600
gaacacagga tctgggtcgg catggcatct ccacctcctc gcggtccgac ctgggctact 12660
tcggtaggct aagggagaag gcggccgccc atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag 12720
agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca 12780
gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 12840
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag 12900
aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 12960
tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 13020
aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 13080
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 13140
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 13200
taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 13260
tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 13320
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 13380
tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg 13440
acggcggctt tgttgaataa atcgaacttt tgctgagttg aaggatcaga tcacgcatct 13500
tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa gcaaaagttc aaaatcacca actggtccac 13560
ctacaacaaa gctctcatca accgtggctc cctcactttc tggctggatg atggggcgat 13620
tcaggcctgg tatgagtcag caacaccttc ttcacgaggc agacctcagc gctcaaagat 13680
gcaggggtaa aagctaaccg catctttacc gacaaggcat ccggcagttc aacagatcgg 13740
gaagggctgg atttgctgag gatgaaggtg gaggaaggtg atgtcattct ggtgaagaag 13800
ctcgaccgtc ttggccgcga caccgccgac atgatccaac tgataaaaga gtttgatgct 13860
cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta ccgacggtga tatggggcaa 13920
atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca caggctgaac gccggaggat cctagagcgc 13980
acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg aaaggaatca aatttggccg caggcgtacc 14040
gtggacagga acgtcgtgct gacgcttcat cagaagggca ctggtgcaac ggaaattgct 14100
catcagctca gtattgcccg ctccacggtt tataaaattc ttgaagacga aagggcctcg 14160
tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 14220
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 14280
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 14340
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 14400
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 14460
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 14520
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 14580
tatcccgt 14588
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SpeI-F
<400 > 3
acactccgct agcatactag ttaatac 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SpeI-F
<400 > 4
aagtcatatt tccgcgggac gttcc 25
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物RLuc-F
<400 > 5
gtcccgcgga aatatgactt cgaaagttta tgatccag 38
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物RLuc-F
<400 > 6
atttttgaga actcgctcaa cg 28
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物FMDV 2A-F
<400 >7
cgttgagcga gttctcaaaa at 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物FMDV 2A-R
<400 > 8
gcctcagggc tgtaaacttg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C(native)-F
<400 > 9
tcaagtttac agccctgagg c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物XhoI-R
<400 > 10
tacccacata ttgtgctcga gc 22
<210> 11
<211> 3547
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACYC 177A质粒序列
<400 > 11
gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300
gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 420
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 480
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780
tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840
cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900
ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960
aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020
ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080
gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140
tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200
caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260
ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320
tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380
ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440
gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500
caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560
ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcatactag tccgctcgag ccggaattcc 1620
tctgatatca aggcaaaaag cggccgccca tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga 1680
gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag 1740
actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc 1800
tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga 1860
agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt 1920
gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca 1980
ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa 2040
tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat tctcaccgga 2100
ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt 2160
aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat 2220
cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata 2280
tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt 2340
ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga 2400
cggcggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt 2460
cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc 2520
tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt 2580
caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcagcg ctcaaagatg 2640
caggggtaaa agctaaccgc atctttaccg acaaggcatc cggcagttca acagatcggg 2700
aagggctgga tttgctgagg atgaaggtgg aggaaggtga tgtcattctg gtgaagaagc 2760
tcgaccgtct tggccgcgac accgccgaca tgatccaact gataaaagag tttgatgctc 2820
agggtgtagc ggttcggttt attgacgacg ggatcagtac cgacggtgat atggggcaaa 2880
tggtggtcac catcctgtcg gctgtggcac aggctgaacg ccggaggatc ctagagcgca 2940
cgaatgaggg ccgacaggaa gcaaagctga aaggaatcaa atttggccgc aggcgtaccg 3000
tggacaggaa cgtcgtgctg acgcttcatc agaagggcac tggtgcaacg gaaattgctc 3060
atcagctcag tattgcccgc tccacggttt ataaaattct tgaagacgaa agggcctcgt 3120
gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 3180
cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 3240
tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 3300
gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 3360
tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 3420
tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 3480
ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 3540
atcccgt 3547
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P2-3-F
<400 > 12
cgatcagtca gcaggctcga g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P2-3-R
<400 > 13
cgatcagtca gcaggctcga g 21
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P4-6-F
<400 > 14
agacctccct gtctggatat cgtacaaggt cgctgaagct gg 42
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P4-6-R
<400 > 15
ccatacaatc gatgggcggc cgccttctcc ctta 34

Claims (6)

1.携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以pRL-TK质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，PCR扩增获得RLuc表达盒，记为B片段；
（2）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增，分别扩增得A片段和D片段，再以pACYC FL-TMUV质粒为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增，扩增得片段C，然后用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示序列为引物，A片段和B片段为模板进行PCR扩增，获得A片段和B片段的融合片段，命名为AB片段，再以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示序列为引物，AB片段和C片段为模板进行PCR扩增，获得AB和C片段的融合片段，命名为ABC片段；最后在以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示序列为引物，ABC片段和D片段为模板进行PCR扩增，获得ABC片段和D片段的融合片段，命名为RLuc-P1片段；
（3）将步骤（2）获得的RLuc-P1片段与经SpeI和XhoI进行双酶切后的pACYC 177A质粒连接，获得重组质粒，命名为pACYC RLuc-P1质粒；
（4）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.12与 SEQ ID NO.13，和SEQ IDNO.14与 SEQ ID NO.15所示序列为引物进行PCR扩增，扩增得到P2-3片段和P4-6片段，将P2-3片段与pACYC RLuc-P1质粒通过XhoI和EcoRV酶切位点进行亚克隆，获得中间载体pACYC RLuc-P1-3，再将P4-6片段通过EcoRV和NotI酶切位点亚克隆到pACYC RLuc-P1-3，获得携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体，命名为pACYC RLuc-TMUV质粒；
（5）用NotI将pACYC RLuc-TMUV质粒单酶切线性化，体外转录RNA，然后将转录的RNA转染BHK21细胞拯救出报告病毒；
所述pACYC FL-TMUV质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pACYC 177A质粒的序列如SEQ ID NO.11所示。
2.由权利要求1任一项所述的方法拯救的携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体。
3.权利要求2所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在作为鸭坦布苏报告病毒研究工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告病毒生命周期中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告病毒复制机制中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告抗病毒药物中的应用。
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