CN107937438B - 携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建方法和应用，所述复制子是在坦布苏病毒删除编码结构基因后在编码C蛋白N端前38个氨基酸的序列之后连入海肾荧光素酶报告基因，并在Rluc后插入编码口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV2A，在坦布苏病毒的复制子5’UTR序列上游添加真核启动子CMV及原核启动子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40poly(A)序列，获得的复制子能够精确定量反映复制子在细胞内的复制情况，可方便的应用于研究坦布苏病毒乃至其他黄病毒的复制机理、抗病毒药物筛选、病毒与蛋白互作等。

Description

携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建 方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，还涉及瞬时转染复制子的构建方法和应用。

背景技术

我国是世界养禽大国，更是世界最大的养鸭国。鸭坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)是一种能引起产蛋鸭采食量和产蛋率急剧下降，甚至停产直至死亡的一种新型黄病毒。鸭坦布苏病毒病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。

鸭坦布苏病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组约11kb，有I型帽子结构，无poly(A)尾巴，编码一条3425个氨基酸的多聚肽链。病毒基因组5’端和3’端分别有90～100bp、550～600bp非编码区，对病毒的复制起到重要作用。病毒基因组编码的多聚肽链在宿主细胞内酶和自身编码的非结构蛋白的作用下，裂解为10个单体蛋白，分别是衣壳蛋白C，膜蛋白前体蛋白prM，囊膜蛋白E，以及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。

黄病毒复制子包含所有与病毒自我复制相关的元件，能够在宿主细胞体内自我复制，但不能编码结构蛋白，因此不会产生具有感染性的病毒粒子。基于DNA的复制子能够对黄病毒除删除掉的编码结构基因以外的任意位点进行突变，对于研究病毒的复制，非结构蛋白细胞内定位以及病毒包装有重要意义。复制子已经在其他黄病毒上得到了极大的应用，如黄热病毒(YFV)、登革病毒(DEGV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、昆病毒(KUN)、西尼罗病毒(WNV)，目前国内外尚无构建成功坦布苏病毒复制子的相关报道。因此，构建坦布苏病毒复制子对于研究坦布苏病毒甚至黄病毒其他病毒的复制、病毒的包装、抗病毒药物的筛选均有重大的意义及帮助，有助于理解坦布苏病毒的复制机理，更深入研究坦布苏病毒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，通过在黄病毒的复制子的基础上，人为插入一个能够编码荧光素酶的基因，使病毒非结构蛋白的表达情况能够通过检测荧光素酶活性或者检测荧光蛋白表达量来判断；通过构建的复制子质粒，可以实现在分子水平对黄病毒的改造，对于研究坦布苏病毒甚至黄病毒其他病毒的复制、病毒的包装、抗病毒药物的筛选均有重大的意义及帮助，有助于理解坦布苏病毒的复制机理，更深入研究坦布苏病毒。通过检测报告基因的活性能够方便且准确的定量检测TMUV复制子的复制情况。本发明的目的之二在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法；本发明的目的之三在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在定量检测鸭坦布苏病毒复制子的复制情况中的应用；本发明的目的之四在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在研究黄病毒的复制机理或抗病毒药物筛选中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，所述复制子是在坦布苏病毒删除编码结构基因后在编码C蛋白N端前38个氨基酸的序列之后连入海肾荧光素酶报告基因，并在海肾荧光素酶报告基因后插入编码口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV 2A，坦布苏病毒的复制子5’UTR序列上游添加真核启动子CMV及原核启动子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40poly(A)序列。

优选的，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。

2、所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-C2质粒为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作引物，PCR扩增得到CMV；再以pEGFP-C2质粒为模板SEQ ID No.5和SEQ ID No.6作引物，PCR扩增得到SV40，将扩增产物回收并纯化；然后将CMV通过Nhe I和Spe I酶切位点与pACYC 177A质粒连接，获得pACYC177A-CMV质粒，接着将SV40通过NotI和ClaI酶切位点与pACYC 177A-CMV质粒连接，获得pACYC177B质粒；

2)以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9作引物，扩增得到C38；不添加模板，将SEQ ID No.10和SEQ ID No.11直接PCR得到FMDV 2A；以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14作引物，扩增得到E30-XhoI；以pRL-TK质粒作模板，SEQ ID No.20和SEQ ID No.21作引物，扩增得到Rluc；再以扩增获得的C38和Rluc为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.21作引物，熔合PCR得到SpeI-Rluc，以FMDV 2A、E30-XhoI为模板，SEQ No.12和SEQ No.14作引物，熔合PCR得到FMDV 2A-XhoI；接着以SpeI-Rluc，FMDV2A-XhoI为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.14作引物，熔合PCR扩增得到SpeI-XhoI；最后以SpeI-XhoI为模板，SEQ ID No.15和SEQ ID No.22作引物，扩增得到P1-Rluc；将扩增产物回收并纯化；

3)以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.16和SEQ ID No.17作引物，PCR扩增得到P2；以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.18和SEQ ID No.19作引物，PCR扩增得到P3，将扩增产物回收并纯化；

4)将步骤3)扩增获得的P3与步骤1)构建的pACYC177B质粒通过EcoRV和NotI连接，得到pACYC-Rep-TMUV-P3质粒；再将P2通过XhoI和EcoRV连接到pACYC-Rep-TMUV-P3载体上，得到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3质粒，最后将步骤2)获得的P1-Rluc通过Spe Ⅰ和Xho Ⅰ连接到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3上，得到pACYC-Rep-TMUV-Rluc质粒，即获得携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子。。

优选的，步骤1)至步骤3)中，PCR扩增程序为98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火15s，72℃延伸10s；共30个循环；最后72℃延伸5min。

优选的，步骤1)至步骤3)中，熔合PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火15s，72℃延伸10s；共30个循环；最后72℃延伸5min。

3、所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在定量检测鸭坦布苏病毒复制子的复制情况中的应用。

4、所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在研究黄病毒的复制机理或抗病毒药物筛选中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，通过利用在黄病毒的感染性克隆中被广泛应用的pACYC 177载体构建鸭坦布苏病毒CQW1毒株(GenBank：KM233707.1)的感染性克隆的全长质粒，经过后期改造，将海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)的基因插入到TMUV病毒的C38环化序列之后，并缺失掉编码结构蛋白的基因，构建出插入了RLuc基因的TMUV复制子的质粒，由于海肾荧光素酶具有出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测，因而是理想的报告基因。本发明构建的报告复制子载体既能直接转染质粒，利用CMV启动子及HDVr，在真核细胞内转录得到病毒的mRNA，让其在细胞内复制。也可以利用高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得复制子转录本后，转染细胞，能随着复制的过程表达出海肾荧光素酶，可利用商品化的RLuc单荧光素酶检测试剂盒，通过检测RLuc的活性来反映病毒的复制情况，同时不会引起细胞病变。因此可用于研究TMUV复制机制，抗TMUV试验，病毒蛋白与宿主的相互作用等多方面的机制等多方面的研究，对鸭坦布苏病毒的研究具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pACYC177A载体图谱。

图2为各扩增片段电泳图(M5000：DL 5000DNA Marker；1：CMV；2：C38；3：Rluc；4：FMDV 2A；5：E30-XhoI；6：SV40；7：SpeI-Rluc；8：FMDV 2A-XhoI；9：P1-Rluc；10：P2 11:P3)。

图3为pACYC-Rep-TMUV-Rluc载体图谱。

图4为TMUV复制子结构图。

图5为转染pACYC-Replicon-TMUV-Rluc质粒后Rluc活性随时间变化结果。

图6为转染TMUV体外转录本RNA之后，Rluc活性随时间变化结果。

图7为荧光显微镜下观察EGFP荧光情况。

图8为荧光定量检测NS2A和EGFP相对表达量。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明中pACYC 177A载体构建方法如下：以MCS-F和MCS-R为引物，不添加模板，直接PCR扩增得到MCS，将MCS利用BmtI和ClaI连入pACYC177载体，得到改造的pACYC177A载体。

具体引物如下：MCS-F：5’-gccagtatacactccgctagcatactagtccgctcgagccggaattcctctgatatcaaggcaaaaagcggccgccc-3’(SEQ ID NO.1)；MCS-R：5’-atactagtccgctcgagccggaattcctctgatatcaaggcaaaaagcggccgcccatcgattgtatgggaagcccg-3’(SEQ ID NO.2)；

pACYC FL-TMUV载体构建：将鸭坦布苏病毒CQW1株(GenBank:KM233707.1)病毒基因组5'UTR前通过引物引入T7启动子，在3'UTR后添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr，利用SpeI和NotI连入pACYC 177A载体，再得到pACYC-TMUV。

实施例1、携带海肾荧光素酶的坦布苏病毒复制子载体的构建

1、pACYC177B质粒构建

以pEGFP-C2质粒为模板，SEQ ID No.3(CMV-F：5’-gccagtatacactccgctagcgtgatgcggttttggcagtac-3’)和SEQ ID No.4(CMV-R：5’-ttccggctcgagcggactagtagctctgcttatatagacctccc-3’)作引物，PCR扩增得到CMV，SEQ ID No.5(SV40-F：5’-atatcaaggcaaaaagcggccgcaacttgtttattgcagcttataat-3’)和SEQ ID No.6(SV40-R：5’-cgggcttcccatacaatcgattaagatacattgatgagtttggac-3’)作引物，PCR扩增得到SV40，扩增产物回收纯化。

利用NheI和SpeI两种限制性内切酶，将pACYC 177A质粒(图1)双酶切线性化，pACYC 177A质粒序列如SEQ ID No.7所示。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit，将线性化的pACYC 177A与扩增得到的CMV连接并转化到SURE大肠杆菌，待菌落长出，挑菌进行菌落鉴定。然后挑选PCR鉴定阳性的菌落送测序鉴定。待测序鉴定后，挑选测序正确的单菌落扩大培养后保存并抽提质粒备用，质粒命名为pACYC 177A-CMV。

用NotI和ClaI两种限制性内切酶，将pACYC177A-CMV质粒双酶切线性化，同pACYC-177A构建方法，将扩增得到的SV40与线性化的pACYC177A-CMV连接并转化到SURE大肠杆菌，待菌落长出，挑菌进行菌落鉴定。然后挑选PCR鉴定阳性的菌落送测序鉴定。待测序鉴定后，挑选测序正确的单菌落扩大培养后保存并抽提质粒备用，质粒命名为pACYC177B。

2、P1-Rluc片段的获得

以本实验构建的TMUV感染性克隆质粒pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.8(Replicon-SpeI-OE-F：5’-gttaatacgactcactatagggagaag-3’)和SEQ ID No.9(Replicon-C38-R：5’-gaccccatcaatcgtcctct-3’)作引物，扩增得到C38；将SEQ ID No.10(FMDV-2A-F：5’-gcatggacgagctgtacaagcagctgttgaattttgaccttctcaagctggcgggagac-3’)和SEQ IDNo.11(FMDV-2A-R：5’-tggcccagggttggactcgacgtctcccgccagcttgag-3’)直接PCR得到FMDV2A。SEQ ID No.13(E30-F：5’-agtccaaccctgggccaatgggcctgaatgcaagg-3’)和SEQ IDNo.14(Replicon-OE-XhoI-R：5’-ctcgagcctgctgactgatc-3’)作引物，扩增得到E30-XhoI。以pRL-TK质粒作模板，SEQ ID No.20(Rep-TMUV-Rluc-F：5’-agaggacgattgatggggtcatgacttcgaaagtttatgatccagaac-3’)和SEQ ID No.21(Rluc-R：5’-ttgttcatttttgagaactcgctcaac-3’)作引物，扩增得到Rluc。

以C38、Rluc为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.21作引物，熔合PCR得到SpeI-Rluc，以FMDV 2A、E30-XhoI为模板，SEQ ID No.12(Replicon-2A-OE-F:5’-gcatggacgagctgtacaag-3’)和SEQ ID No.14作引物，熔合PCR得到FMDV 2A-XhoI。最后以SpeI-Rluc，FMDV 2A-XhoI为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.14作引物，熔合PCR扩增得到SpeI-XhoI。最后以SpeI-XhoI为模板，SEQ ID No.15(Replicon-SpeI-F：5’-tatataagcagagctactagttaatacgactcactatagggagaag-3’)和SEQ ID No.22(OL-Rluc-2A-F:5’-tgagcgagttctcaaaaatgaacaacagctgttgaattttgaccttc-3’)作引物，扩增得到P1-Rluc。

每轮PCR结束作液回收。

PCR反应体系及反应程序如下：

片段扩增用PCR反应体系：模板DNA：1μg；引物F：1.5μl；引物R：1.5μl；PrimeSTARMAX Premix(2X)：25μl；ddH₂O：up to 50μl。

PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火(Tm+3℃)15s，72℃延伸10s(10s/kb)；共30个循环；最后72℃延伸5min。

熔合PCR反应体系：模板DNA 1：模板DNA 2＝1:1＝0.03pmol，引物F：1.5μl；引物R：1.5μl；PrimeSTAR MAX Premix(2X)：25μl；ddH₂O：up to 50μl。

熔合PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火(Tm+3℃)15s，72℃延伸10s(10s/kb)；共30个循环；最后72℃延伸5min。

3、P2、P3片段扩增

以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.16(P2-3-F：5’-cgatcagtcagcaggctcgag-3’)和SEQ ID No.17(CQW1-P2-3-R：5’-gccgctttttgccttgatatcc-3’)作引物，PCR扩增得到P2；以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQID No.18(P4-6-F：5’-agacctccctgtctggatatcgtacaaggtcgctgaagctgg-3’)和SEQ IDNo.19(CQW1-P4-6-R：5’-tgcaataaacaagttgcggccgccttctccctta-3’)作引物，PCR扩增得到P3，PCR产物液回收纯化，PCR反应体系及程序同上。

扩增片段电泳结果如图2所示。

4.TMUV复制子质粒pACYC-Rep-TMUV-Rluc的构建

将PCR扩增并纯化回收后的P3片段及天根质粒小提试剂盒抽提的pACYC177B质粒分别用NEB公司的EcoRV和NotI限制性核酸内切酶进行双酶切反应，酶切产物再用TakaraMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒纯化回收。然后将线性化的pACYC177B和双酶切后的P3按照摩尔比1:2的比例，加入5μl Solution I，ddH₂O补足至10μl体系，16℃孵育过夜，转化至SURE感受态细胞，菌落鉴定后挑取阳性菌测序，测序结果正确的菌摇菌用天根质粒小提试剂盒抽取质粒，得到pACYC-Rep-TMUV-P3质粒。同样的方法，将P2利用XhoI和EcoRV连接到pACYC-Rep-TMUV-P3载体上，得到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3质粒。将P1-Rluc通过Spe Ⅰ和Xho Ⅰ连接到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3上，得到pACYC-Rep-TMUV-Rluc质粒结构如图3所示，其中TMUV复制子结构如图4所示，pACYC-Rep-TMUV-Rluc载体序列如SEQ IDNo.23所示。

挑取测序正确的质粒的单菌落，180rpm/min，37℃振荡至浑浊度适宜。使用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒备用。

实施例2、RLuc报告基因活性检测

检测RLuc报告基因活性的方法，包括如下步骤：

1)将生长状态良好的BHK21细胞接种至48孔细胞培养板；

2)生长12～24h，待细胞长至汇合度70～90％时，按照TransIntro ELTransfection Reagent说明书，转染pACYC-Rep-TMUV-Rluc质粒。

3)转染后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h按照TransDetect Single-Lucifersase(Renilla)Reporter Assay Kit说明书测定报告基因Rluc的活性，具体操作如下：

a)吸弃细胞培养基，用PBS小心润洗细胞两次后加入60μl Cell Lysis溶液，室温裂解10min后，刮取细胞到EP管中，4℃12000g离心10min，取上清备用；

b)将平衡的室温的Luciferase Reaction Reagent II加入不透光的96孔板中，每孔100μl，再小心吸取20μl细胞裂解物至96孔板中，轻弹混匀，于化学发光仪(luminometer)中检测RLuc报告基因的活性；结果如图6所示。结果显示，RLuc在质粒转染后的24小时有一个初始表达峰，这是转染的DNA直接转录翻译表达造成的。随后24-36小时，RLuc的活性不断降低，36-96小时RLuc的活性又不断提升，表明TMUV RNA在细胞内进行复制，因而RLuc才会不断升高，表明表达RLuc的复制子被成功构建，能够在BHK21细胞内自我复制。

实施例3、RLuc活性检测

使用mMESSAGE mMACHINE^TM T7Transcription Kit进行体外转录，严格按照供应商推荐程序操作，使用RNase-free的枪头及EP管：

(1)为了防止转录出过长链，NotI单酶切充分线性化10μg pACYC-Rep-TMUV-Rluc质粒，以终止转录；

(2)体外转录体系的配制：

然后37℃孵育3h；

(3)转录完成后，加入1μl TuRBO DNase，混匀后，37℃孵育15min；

(4)氯化锂沉淀重获RNA：

a)加入30μl Nuclease-free ddH₂O和30μl LiCl沉淀溶液，轻轻混匀后，放置-20℃条件下至少30min；

b)4℃离心15min，≥12000rpm/min；

c)吸取并去掉上清，加入1ml 70％的乙醇，4℃离心15min，≥12000rpm/min；

d)小心去掉上清，晾干EP管

e)用适量的Nuclease-free ddH₂O重悬RNA，分装后于-80℃保存备用或立即转染。

(5)将生长状态良好的鸭胚成纤维细胞(DEF)接种到48孔板，培养12～24h，待细胞汇合度达到70～90％，按转染试剂TransIntro EL Transfection Reagent说明操作，每孔转染0.4μg TMUV复制子的转录本RNA；

(6)分别在转染后第3h、6h、9h、15h、21h、27h、33h、39h、48h、60h收集细胞样品，按照TransDetect Single-Luciferase(Renilla)Reporter Assay Kit说明书测定RLuc的活性。

结果如图5所示。结果显示，RLuc在RNA转染后的12小时有一个初始表达峰，这是转染的RNA直接翻译表达造成的。随后12-48小时，RLuc的活性不断降低，48-96小时RLuc的活性又不断提升，表明表达RLuc的TMUV复制子在DEF细胞内能够自我复制。

对比实施例

本发明中Rep-TMUV-EGFP载体构建方法：以pEGFP-C2质粒为模板，EGFP-F、EGFP-R为引物，同Rluc程序相同，扩增出EGFP片段。以C38、Rluc为模板，SEQ ID No.8和EGFP-R作引物，熔合PCR得到SpeI-EGFP。同SpeI-Rluc后续步骤相同，构建出Rep-TMUV-EGFP载体。抽提Rep-TMUV-EGFP质粒后，转染进BHK21细胞后，在荧光显微镜下观察EGFP荧光情况。如图7，在所有的时间点只能看到极少数荧光，不能达到复制子应用的要求。将Rep-TMUV-EGFP质粒转染进细胞后，转染后12h、24h、36h、48h收取细胞，用Takara公司的RNAiso Plus,按照说明书抽提总RNA。抽提的RNA用Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒按照说明书操作反转录。利用qPCR-NS2A-F和qPCR-NS2A-R作引物，反转录产物作模板，荧光定量PCR(qPCR)检测NS2A基因的mRNA在转染后12h,24h,36h,48h表达量，以qPCR-EGFP-F和qPCR-EGFP-R作引物，反转录产物作模板，β-actin作为内参基因相对定量检测EGFP的mRNA在转染后12h,24h,36h,48h的表达量(图8)。结果显示NS2A在细胞中表达量随时间增加而增加，表明复制子在细胞中能够正常复制；但是EGFP在细胞中表达量逐渐下降，说明EGFP在复制子结构中并不稳定，随着病毒基因组的复制逐渐丢失，因此选择EGFP作为报告基因构建坦布苏病毒的复制子是不可取的。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建方法和应用

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccagtatac actccgctag catactagtc cgctcgagcc ggaattcctc tgatatcaag 60

gcaaaaagcg gccgccc 77

<210> 2

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atactagtcc gctcgagccg gaattcctct gatatcaagg caaaaagcgg ccgcccatcg 60

attgtatggg aagcccg 77

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccagtatac actccgctag cgtgatgcgg ttttggcagt ac 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccggctcg agcggactag tagctctgct tatatagacc tccc 44

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatcaaggc aaaaagcggc cgcaacttgt ttattgcagc ttataat 47

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggcttccc atacaatcga ttaagataca ttgatgagtt tggac 45

<210> 7

<211> 3547

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300

gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 420

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 480

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 720

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat aagatgatct 780

tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg 840

cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900

ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960

aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020

ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080

gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140

tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200

caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260

ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320

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gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500

caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560

ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcatactag tccgctcgag ccggaattcc 1620

tctgatatca aggcaaaaag cggccgccca tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga 1680

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cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata 2280

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tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt 2580

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tggacaggaa cgtcgtgctg acgcttcatc agaagggcac tggtgcaacg gaaattgctc 3060

atcagctcag tattgcccgc tccacggttt ataaaattct tgaagacgaa agggcctcgt 3120

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 3180

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gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 3360

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<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttaatacga ctcactatag ggagaag 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaccccatca atcgtcctct 20

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcatggacga gctgtacaag cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggagac 59

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggcccaggg ttggactcga cgtctcccgc cagcttgag 39

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcatggacga gctgtacaag 20

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtccaaccc tgggccaatg ggcctgaatg caagg 35

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcgagcctg ctgactgatc 20

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tatataagca gagctactag ttaatacgac tcactatagg gagaag 46

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgatcagtca gcaggctcga g 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gccgcttttt gccttgatat cc 22

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agacctccct gtctggatat cgtacaaggt cgctgaagct gg 42

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgcaataaac aagttgcggc cgccttctcc ctta 34

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agaggacgat tgatggggtc atgacttcga aagtttatga tccagaac 48

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgttcattt ttgagaactc gctcaac 27

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgagcgagtt ctcaaaaatg aacaacagct gttgaatttt gaccttc 47

<210> 23

<211> 13743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 60

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 120

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 180

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 240

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 300

gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 360

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ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 540

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 600

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 660

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cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt 900

ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc 960

aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct 1020

ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg 1080

gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg 1140

tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa 1200

caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260

ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320

tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380

ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440

gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500

caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560

ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgtgatgc ggttttggca gtacatcaat 1620

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 1680

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ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctact 1800

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ggggtgctca atcgacttgg ctaggaaaga attaaaatgt ggacaaggca tgtttgtctt 3180

caacgatgtt gaggcctgga aggataatta caagtactat ccatccacac caaggagact 3240

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gctcgagcac aatatgtggg taagcatcaa acatgagttg aatgcgatct tggaagacaa 3360

tgccattgat ttgactgtgg tggttgaaga aaatcctgga agatacagga aaaccaatca 3420

gaggctgccg aacgttgatg gagagctcac gtacggatgg aagaaatggg ggaaaagtat 3480

ttttagcagc ccgaagatgt caaataatac atttgtcatt gatggaccaa aaactagaga 3540

gtgcccagat gagagaagag catggaatag catgaaaatt gaagactttg ggtttggagt 3600

gttgtccaca aaggtatgga tggaaatgcg aacagaaaat acaactgatt gtgacaccgc 3660

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agagagcaag aataatggaa gctggaaact ggagagggct gtgttgggcg aggtgaagtc 3780

atgcacatgg ccagaaaccc acaccctgtg gagtgacagc gttgtggaga gtgaactcat 3840

catacctaag acattgggag gaccgaagag tcatcacaac acgaggacag gatacagggt 3900

tcagagttcc ggaccgtggg atgagaaaga gattgcaata gacttcgact actgtcctgg 3960

aacaactgtc acagtaacga gctcgtgccg cgacagaggg ccttcagcta ggacaacaac 4020

agcgagtggg aaattgataa cagattggtg ttgtaggtct tgcaccatcc caccactgag 4080

atttgttaca aaaagtggat gctggtatgg gatggaaatt cggccaattg ttcacggaga 4140

cgacatgttg atcaaatcaa aggtcatggc ttttcaaggg ggtggcatgg aacctatgca 4200

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gttagcactc ataacagtgg cgatgagaga cttgaacatg agtataccaa cattactaaa 4560

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gggaacctct ggatcaccta ttattgacaa ggaaggacag gtggttggcc tctatggtaa 5700

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ggaagaagtt cctcaggtgt ttgacgaaaa catgctgcgg aaaaggcaac tgacagttct 5820

ggacctacat ccaggttcag gaaagaccag aaaggtcctc cccatgattc tgaagagcgc 5880

cattgacaaa cgattaagaa cagctgtctt ggctccgacg cgggtggtgg ccgctgaaat 5940

agcggaagca ctgaaaggac tcccaatacg gtatctgact ccggcagtaa agagggagca 6000

tactggaaca gagataatag atgtgatgtg tcacgcgact ttgacagcgc ggctgctcac 6060

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aacagacttt caaggaaaga ctgtatggtt tgtccccagc gtgaagtctg gtaatgagat 6360

cgccgtgtgc ttgacaaagg ccggtaagaa ggtaattcag ttaaatagga agagttttga 6420

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agccagtgca gcccagcgtc gtggacgggt tggaagggat gtgacacaaa ttggagatga 6660

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catgcctttt gtcaaagcag acttgtcagt acccctgcta ctcttagggt gttggggaca 7860

gttcacaatg acaacaacgg tctcggcagt catgatggtc atactgcatt atgcattttt 7920

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aggaacagct agggttatga acatcgtggc aagatggatg tggaactttg ttggcaggaa 9480

caaacaacca aggatgtgca caaaagaaga gttcatagag aaggtgaata gtaacgcagc 9540

cctgggggcc atgtttgagg agcaacacaa atgggccagc gccagggaag cggttgagga 9600

tcctgaattt tggagtcttg ttgacagaga gagagaactg cacttgcaag ggaagtgcga 9660

gacctgcatt tacaacatga tgggaaagcg agaaaagaag atgggagagt tcgggaaagc 9720

aaaaggtagc agagctattt ggtacatgtg gctcggggcc agattcctag agttcgaagc 9780

cttgggcttc ttgaacgagg atcactggat gagcagggaa aacactaaag gaggcgttga 9840

aggacttgga ctccaaaagt tggggtatgt gctgcgtgac atttcggcca aagaaggagg 9900

acttatgtac gcagacgaca cggccggatg ggacactaga ataaccaagg ctgatttgga 9960

aaacgaagcc atcatcttgg aaaagatgga accaatgcac agagctgttg cagaaccact 10020

cattaaattt gcctacatga ataaggtggt gaaggtgatg cgaccgggac gtgatgggaa 10080

gacagttatg gatgtcatct cgcgggaaga ccagagggga agtggacagg ttgtgaccta 10140

tgctctcaac actttcacga acctgtgtgt ccagctcatt agatgtatgg aaggggagga 10200

gctgctgctc cccgaggaaa cagagcgtct aaaaaaagga aaggagaagc gcatccaaga 10260

atggctccaa aagaatggag agaacaggtt gtcagccatg gcagtcagtg gggatgactg 10320

tgtggtgaaa ccagcggatg acagattcgc cacagcactg cacttcctca atagtatgtc 10380

taaggtgagg aaagatactc aggaatggaa gccctcaacc ggttggagaa actggcaaga 10440

agtccccttt tgctcacacc atttccacga gctgcaaatg aaagatggca gaaagattgt 10500

ggttccatgt cgagaccagg atgagctaat tggaagagcc aggctctctc cagggtctgg 10560

ctggtcacta acagaaacag catgcctgag caaagcatat gctcagatgt ggttattgat 10620

gtacttccac aggagggacc tcagactaat ggcaaacgcc atctgctcat ctgtccctgt 10680

ctcatgggtc cccacaggaa ggacaacgtg gtcaatccat ggaaaaggcg agtggatgac 10740

ttctgaagac atgctggcag tgtggaacag ggtgtggatt gaagaaaatg aacacatgga 10800

agacaaaacc ccagtgactt catggaacga agtgccatac cttggaaaga gggaagatgg 10860

ctggtgtggt agtctgattg gacaccgagc cagatctacc tgggccgaga acatatacac 10920

tccaattatg cagatcagag ctctcattgg ccctgagcac tatgtagatt atatgccaac 10980

tctaaatagg ttcaaaccca ttgaaagctg gagtgaaggt gttttgtaaa tatatgaggt 11040

aggtgtaaaa atgtatgtaa agtagtgtta gtctagagta gataaatata taaattagca 11100

tttgtttgaa tagataggaa gaggaagtca ggccagggaa tccctgccac cggatgttgg 11160

atgacggtgc tgtctgcgtt ccaaccccag gaggactggg ttaacaaatc tgggtgcatg 11220

gaggagctaa gcgttcaata ccgcctcgga gaactccctg gctcacgaag tgccctggac 11280

cagtgtcggg ccacaggttt tgtgccacta gcgtgcagtg cagcccggac aaaagacacg 11340

ccccaggagg actgggaaaa caaagccgaa atggccccca cggcctgaaa tgatggagct 11400

ggtgtgacca tcatggaggg actagaggtt agaggagacc ccgtggaaag aaagcaaggc 11460

ccaacctaga gtcaagctgt aactctaggg gaaggactag aggttagagg agaccccttg 11520

cgagtgagca ccacaagaaa cagcatattg acacctggga tagactagga gaccctctgt 11580

cctaacaaca ccagccactt ggcacagatc gccgaaagtg tggctggtgg tggtagaaca 11640

caggatctgg gtcggcatgg catctccacc tcctcgcggt ccgacctggg ctacttcggt 11700

aggctaaggg agaaggcggc cgcaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 11760

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 11820

tgtccaaact catcaatgta tcttaatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg 11880

tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta 11940

aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat 12000

gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt attagaagaa 12060

tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat 12120

tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg 12180

caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc 12240

tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca 12300

gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata 12360

ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta 12420

tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt 12480

attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 12540

tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta cgctgacttg acgggacggc 12600

ggctttgttg aataaatcga acttttgctg agttgaagga tcagatcacg catcttcccg 12660

acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa agttcaaaat caccaactgg tccacctaca 12720

acaaagctct catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg 12780

cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac gaggcagacc tcagcgctca aagatgcagg 12840

ggtaaaagct aaccgcatct ttaccgacaa ggcatccggc agttcaacag atcgggaagg 12900

gctggatttg ctgaggatga aggtggagga aggtgatgtc attctggtga agaagctcga 12960

ccgtcttggc cgcgacaccg ccgacatgat ccaactgata aaagagtttg atgctcaggg 13020

tgtagcggtt cggtttattg acgacgggat cagtaccgac ggtgatatgg ggcaaatggt 13080

ggtcaccatc ctgtcggctg tggcacaggc tgaacgccgg aggatcctag agcgcacgaa 13140

tgagggccga caggaagcaa agctgaaagg aatcaaattt ggccgcaggc gtaccgtgga 13200

caggaacgtc gtgctgacgc ttcatcagaa gggcactggt gcaacggaaa ttgctcatca 13260

gctcagtatt gcccgctcca cggtttataa aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata 13320

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 13380

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 13440

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 13500

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 13560

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 13620

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 13680

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 13740

cgt 13743

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agaggacgat tgatggggtc atggtgagca agggcgagga 40

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cttgtacagc tcgtccatgc 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagaagaacg gcatcaaggt g 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggactgggtg ctcaggtagt gg 22

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tttggaatca cgtacagt 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtgcacaatg tcaccacctg t 21

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gatcacagcc ctggcacc 18

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cggattcatc atactcctgc tt 22

Claims (6)

1.携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，其特征在于：所述复制子是在坦布苏病毒删除编码结构基因后编码C蛋白N端前38个氨基酸的序列之后连入海肾荧光素酶报告基因，并在海肾荧光素酶报告基因后插入编码口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV 2A，坦布苏病毒的复制子5’UTR序列上游添加真核启动子CMV及原核启动子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40 poly(A)序列，所述复制子的核苷酸序列如SEQ IDNo.23所示。

2.权利要求1所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）以pEGFP-C2质粒为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作引物，PCR扩增得到CMV；再以pEGFP-C2质粒为模板SEQ ID No.5和SEQ ID No.6作引物，PCR扩增得到SV40，将扩增产物回收并纯化；然后将CMV通过Nhe I和Spe I酶切位点与pACYC 177A质粒连接，获得pACYC177A-CMV质粒，接着将SV40通过NotI和ClaI酶切位点与pACYC 177A-CMV质粒连接，获得pACYC177B质粒；

2）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9作引物，扩增得到C38；不添加模板，将SEQ ID No.10和SEQ ID No.11直接PCR得到FMDV 2A；以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14作引物，扩增得到E30-XhoI；以pRL-TK质粒作模板，SEQID No.20和SEQ ID No.21作引物，扩增得到Rluc；再以扩增获得的C38和Rluc为模板，SEQID No.8和SEQ ID No.21作引物，熔合PCR得到SpeI-Rluc，以FMDV 2A、E30-XhoI为模板，SEQNo.12和SEQ No.14作引物，熔合PCR得到FMDV 2A-XhoI；接着以SpeI-Rluc，FMDV 2A-XhoI为模板，SEQ ID No.8和SEQ ID No.14作引物，熔合PCR扩增得到SpeI-XhoI；最后以SpeI-XhoI为模板，SEQ ID No.15和SEQ ID No.22作引物，扩增得到P1-Rluc；将扩增产物回收并纯化；

3）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.16和SEQ ID No.17作引物，PCR扩增得到P2；以pACYC FL-TMUV质粒为模板，SEQ ID No.18和SEQ ID No.19作引物，PCR扩增得到P3，将扩增产物回收并纯化；

4）将步骤3）扩增获得的P3与步骤1）构建的pACYC177B质粒通过EcoRV和NotI连接，得到pACYC-Rep-TMUV-P3质粒；再将P2通过XhoI和EcoRV连接到pACYC-Rep-TMUV-P3载体上，得到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3质粒，最后将步骤2）获得的P1-Rluc通过SpeⅠ 和XhoⅠ 连接到pACYC-Rep-TMUV-P_2-3上，得到pACYC-Rep-TMUV-Rluc质粒，即获得携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子。

3.根据权利要求2所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法，其特征在于：步骤1）至步骤3）中，PCR扩增程序为98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火 15s，72℃延伸10s ；共30个循环；最后72℃延伸5min。

4.根据权利要求2所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法，其特征在于：步骤1）至步骤3）中，熔合PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火 15s，72℃延伸10s；共30个循环；最后72℃延伸5min。

5.权利要求1所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在定量检测鸭坦布苏病毒复制子的复制情况中的应用。

6.权利要求1所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在研究黄病毒的复制机理或抗病毒药物筛选中的应用。

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