CN112057611B - 非洲猪瘟病毒e120r蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建。本发明首先发现了非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN‑β的激活，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN‑β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；其次本发明发现了非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制位点，并通过基因工程手段构建获得了E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著增强，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

Description

非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制 位点敲除毒株的构建
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁。
非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。非洲猪瘟病毒具有20面体结构，直径为175-215nm，基因组全长170-190kb，含有151个开放阅读框，可编码150-200种蛋白，可以编码的结构蛋白有54种以上，包括p54、p72、p30等，具有复杂的免疫逃逸机制。其中p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25ku，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网处，P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网转化成病毒包膜前体时起十分重要的作用。p72是主要的结构蛋白之一，根据p72基因末端一段478bp的核酸序列，非洲猪瘟可分为23个基因型，如Benin97/1为基因I型，Ma lawi Li20/1为基因VIII型，东非埃塞尔比亚分离株属于基因XXIII型。非洲猪瘟病毒基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性。非洲猪瘟病毒不能够诱导产生中和抗体，因此还没有对血清型进行分类。
E120R蛋白也属于ASFV的结构蛋白，其具有与DNA结合的活性，且在病毒质膜运输中发挥着重要作用。本发明首先意外发现，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。
基于上述发现，本发明通过突变PCR、基因合成等方法构建了一系列E120R蛋白突变体质粒，筛选出了发挥免疫抑制功能的关键位点；并通过在非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中缺失了E120R蛋白的免疫抑制位点，构建获得了一种E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。
发明内容
首先本发明发现，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。因此，本发明的目的在于：
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用。
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为cGAS-STING通路抑制剂的应用。
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为poly(dA:dT)抑制剂的应用。
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为IRF3磷酸化抑制剂的应用。
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白在制备用于抑制cGAS-STING通路的药物或药物组合物中的应用。
提供一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白在制备抑制IRF3磷酸化药物或药物组合物中的应用。
优选地，所述非洲猪瘟病毒E120R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其次，本发明通过突变PCR、基因合成等方法构建了一系列E120R蛋白突变体质粒，筛选出了发挥免疫抑制功能的关键位点，并通过在非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中缺失了E120R蛋白的免疫抑制位点，构建获得了一种E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株应用。因此，本发明的另一目的在于：
提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制功能制备非洲猪瘟重组病毒的应用。
提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制功能制备非洲猪瘟重组疫苗株的应用。
优选地，所述非洲猪瘟病毒E120R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述缺失包括将编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
提供一种E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒包括将编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
优选地，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株，所述非洲猪瘟重组病毒相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列缺失了第167953-167958位核苷酸序列。
提供一种非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包含E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
提供一种E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段使编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
优选地，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株，所述非洲猪瘟重组病毒相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列缺失了第167953-167958位核苷酸序列。
优选地，所述方法为同源重组技术，所述方法包括以下步骤：
(1)选取编码E120R蛋白72-73位氨基酸基因片段上下游序列各约1.0kb左右作为同源重组左臂和右臂，并分别克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体；
(2)在步骤(1)所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；
(3)将步骤(2)所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的BMDM细胞，纯化筛选获得E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
提供一种根据上述方法制备获得的E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
本发明的有益效果是：
①本发明首先发现非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活；抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达；抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化；具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；
②本发明首先发现了非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制位点，并通过基因工程手段构建获得了E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。
附图说明
图1非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制cGAS/STING诱导的IFN-β激活的结果图；
图2非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β激活的结果图；
图3非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制cGAS/STING诱导的IFN-β及其下游因子mRNA表达的结果图；
图4非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子mRNA表达的结果图；
图5非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制cGAS/STING诱导的IRF3磷酸化的结果图；
图6非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制poly(dA:dT)诱导的IRF3磷酸化的结果图；
图7非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制宿主天然免疫的位点区域分析结果；
图8非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制宿主天然免疫的关键位点区域分析结果；
图9非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制宿主天然免疫的关键位点分析结果；
图10E120R蛋白免疫抑制位点敲除的ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株的构建策略示意图；
图11转染并接种CN/GS/2018分离株后培养48h后疑似重组毒感染细胞的荧光成像图；
图12ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株的纯净性及免疫抑制位点敲除检测结果图；
图13ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株与亲本非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中E120R的核苷酸对比结果图；
图14ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株对宿主天然免疫应答的结果图；
图15不同基因型非洲猪瘟病毒E120R蛋白氨基酸序列同源性对比结果。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康长白猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
ASFV CN/GS/2018分离株为中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室分离株，属于基因II型，病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。
peGFP-N1载体、pUC19载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。
HEK-293T细胞，购于ATCC公司；IFN-β启动子质粒、TK质粒、HA-cGAS/HA-STING质粒(HA-cGAS质粒、HA-STING质粒)、FLAG-E120R及其突变体质粒、poly(dA:dT)由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建；Lipofectamine TM 3000，购于Invitrogen公司。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域知晓的操作方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
实施例1 E120R蛋白抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活
1.E120R蛋白对cGAS/STING诱导的IFN-β表达的影响
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)、HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)，和FLAG-E120R质粒(0、50、100、200ng)，转染24h，利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性。
结果如图1所示，其中Vec为不转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒。结果表明，仅转染HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)后，IFN-β表达含量较高；而共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)和不同剂量的FLAG-E120R质粒(50、100、200ng)后，IFN-β表达显著降低，且转染FLAG-E120R质粒越多，IFN-β表达降低越显著。说明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING诱导的IFN-β的激活，抑制cGAS/STING通路，具有免疫抑制作用。
2.E120R蛋白对poly(dA:dT)诱导的IFN-β表达的影响
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)和FLAG-E120R质粒0、50、100、200ng，转染24h后，再次利用脂质体转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)，转染12h，然后利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性。
结果如图2所示，其中Mock为不转染poly(dA:dT)和FLAG-E120R质粒。结果表明，仅转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)后，IFN-β表达含量较高；而共同转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)和不同剂量的FLAG-E120R质粒(50、100、200ng)后，IFN-β表达显著降低，且转染FLAG-E120R质粒越多，IFN-β表达降低越显著。说明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活，抑制poly(dA:dT)，具有免疫抑制作用。
综上所述，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β等相关干扰素的激活，具有免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂抑制天然免疫，并用于制备抑制cGAS/STING通路、抑制poly(dA:dT)、抑制IFN-β等相关干扰素的药物或药物组合物。
实施例2 E120R蛋白抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子mRNA的表达
1.E120R蛋白与cGAS/STING和poly(dA:dT)共转染细胞样品的制备
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染、HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)、FLAG-E120R质粒(200ng/孔)，转染24h后收样。
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂转染FLAG-E120R质粒(200ng/孔)，转染24h后，再次利用脂质体转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)，转染12h后收样。
2.IFN-β及其下游因子的qPCR检测
FLAG-E120R质粒与、HA-cGAS/HA-STING质粒和poly(dA:dT)质粒共转染细胞样品收样，并利用PBS清洗一次。RNA提取过程如下：
加入1mL Trizol试剂，剧烈吹打使细胞完全裂解5-15min，液体移至无RNA酶的1.5mL离心管；加入250μL氯仿，剧烈震荡使液体成浅红色，4℃静置10min；4℃，12000r/min离心15min，吸取200μL上清至新的无RNA酶的1.5mL离心管，并加入200μL的异丙醇，上下轻轻颠倒8次，-20℃静置30min，然后4℃，12000r/min离心15min；弃去上清，加入1mL 75％乙醇，上下颠倒5次，4℃，10000r/min离心5min；弃去上清，吸净残留液体，晾干离心管。然后加入25μL DEPC水溶解RNA；制备好的总RNA(病毒RNA和细胞RNA)，进行反转录后，进行实时定量PCR检测。
反转录体系：5×First Buffer，4μL；0.1M dTT，2μL；10mM each dNTPs，1μL；6ntRandom Primers，1μL；oligo-dT Primers，0.5μL；M-MLV transcriptase，1μL；RRI，0.5μL；H2O，6μL；RNA，4μL；
反应程序：25℃，10min；37℃，60min；75℃，10min。
实时定量PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq，5μL；上游引物(10μM)，0.2μL；下游引物(10μM)，0.2μL；H2O，4.1μL；cDNA模板，0.5μL。
反应程序：95℃，2min；95℃，10s，60℃，34s，40个循环；Melt Curve；4℃保存。
3.结果
cGAS/STING诱导结果如图3所示，仅转染FLAG-E120R质粒后，检测不到IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA的表达；而仅转染、HA-cGAS/HA-STING质粒后，IFN-β、ISG56和ISG15mRNA的表达显著升高；同时转染FLAG-E120R质粒和、HA-cGAS/HA-STING质粒后，IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA的表达又显著降低。说明非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制了cGAS/STING诱导的IFN-β、ISG56和ISG15的mRNA表达。
poly(dA:dT)诱导结果如图4所示，仅转染FLAG-E120R质粒后，检测不到IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA的表达；而仅转染poly(dA:dT)质粒后，IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA的表达显著升高；同时转染FLAG-E120R质粒和poly(dA:dT)质粒后，IFN-β、ISG56和ISG15mRNA的表达又显著降低。说明非洲猪瘟病毒E120R蛋白抑制了poly(dA:dT)诱导的IFN-β、ISG56和ISG15的mRNA表达。
综上所述，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够显著抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β、ISG56和ISG15的激活，具有免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂、cGAS/STING通路抑制剂和poly(dA:dT)抑制剂等用于抑制病毒感染后的相关干扰素的激活，抑制天然免疫。并用于制备抑制IFN-β、ISG56、ISG15、cGAS/STING通路以及poly(dA:dT)等免疫抑制相关药物或药物组合物。
实施例3 E120R蛋白抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3磷酸化
1.E120R蛋白与cGAS/STING和poly(dA:dT)共转染细胞样品的制备
同实施例2中(1)所述。
2.蛋白表达水平的Western blot检测
蛋白样品的制备：将FLAG-E120R与、HA-cGAS/HA-STING质粒或poly(dA:dT)质粒共转染细胞样品上清液弃去，用PBS清洗一次细胞样品，利用细胞铲刮下细胞，移入1.5mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀，即为收获的细胞样品(均在冰上操作)；根据收集细胞沉淀的多少加入适量的细胞裂解液，并快速反复吹打重悬细胞样品，冰上裂解5min，超声波瞬时破碎(冰上操作，超声2-3次)；4℃，13000rpm离心10min，弃去底部沉淀，取上清于另一预冷离心管中保存；取样品蛋白上清加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸变性10min，4℃，12000rpm离心5min，取适量上清进行蛋白质电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳及其电泳图蛋白转印：SDS-PAGE凝胶及电泳缓冲液均按照分子克隆实验指南配制。每个蛋白样品上样量为40μg，同时单独选孔加入预染蛋白marker作为指示。蛋白样品在浓缩胶时，调用80V电压；待蛋白样品进入分离胶后，调取电压至120V，直至电泳结束。转印前，根据SDS-PAGE凝胶的大小剪取合适的硝酸纤维素膜(NC膜)，并在转印缓冲液中浸泡10min左右，同时剪取6层滤纸浸泡在转印液中数分钟。按照“膜正胶负”顺序放置蛋白胶：负极-海绵-3层滤纸-凝胶-NC膜-3层滤纸-海绵-正极，安装好“转印夹心三明治”后，将其放置到全湿转印槽内，加入足够转印缓冲液，接通电源(恒流240mA或恒压65V转印2-3h)，转印槽外部用冰袋辅助降温。待转印结束后，5％的TBST-脱脂乳封闭NC膜，室温作用2-3h，弃去封闭液，TBST(pH7.6)缓冲液漂洗3次，洗去残留脱脂乳封闭液，随后进行抗体孵育。抗体反应：加入TBST稀释一抗，4℃轻摇振荡过夜(或室温4-6h)，一抗回收利用。TBST轻轻漂洗3次后，再用TBST洗2-3次，每次漂洗10min。漂洗完毕后，加入HRP标记的二抗，室温作用2h，作用完毕用TBST轻轻漂洗3次，再用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，进行显色反应。暗室中利用ECL显色试剂盒进行显色。取试剂盒中A液与B液等量混合，然后轻轻均匀地淋湿NC膜，作用1-2min后，将作用的膜放置在X光曝光夹内，在上方放置X光胶片进行曝光。曝光完成的胶片首先放入显影液中进行显影，待所需蛋白条带显示后，用自来水轻轻漂洗胶片，然后将胶片放入定影液中进行定影2-3min。定影结束后，将胶片放入自来水漂洗、进一步晾干、待晾干后标记蛋白Marker，扫描胶片保存结果。
3.结果
cGAS/STING诱导结果如图5所示，仅转染FLAG-E120R质粒后，检测不到IRF3的磷酸化；而仅转染、HA-cGAS/HA-STING质粒后，IRF3的明显发生了磷酸化；同时转染FLAG-E120R质粒和、HA-cGAS/HA-STING质粒后，IRF3的磷酸化水平又显著降低；并且同时转染FLAG-E120R质粒和、HA-cGAS/HA-STING质粒后，TBK1的磷酸化水平不受影响。说明非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够特异性抑制cGAS/STING诱导的IRF3磷酸化。
poly(dA:dT)诱导结果如图6所示，仅转染FLAG-E120R质粒后，检测不到IRF3的磷酸化；而仅转染poly(dA:dT)质粒后，IRF3的明显发生了磷酸化；同时转染FLAG-E120R质粒和poly(dA:dT)质粒后，IRF3的磷酸化水平又显著降低；并且同时转染FLAG-E120R质粒和poly(dA:dT)质粒后，TBK1的磷酸化水平不受影响。说明非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够特异性抑制poly(dA:dT)诱导的IRF3磷酸化。
上述结果表明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够特异性抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)等诱导的IRF3磷酸化，对抗感染免疫发挥重要的调节作用，可作为IRF3磷酸化抑制剂。
实施例4 E120R蛋白抑制宿主天然免疫的位点分析
1.E120R蛋白抑制宿主天然免疫的的位点区域分析
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内，待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)、HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)，和FLAG-E120R质粒及E120R蛋白片段质粒(FLAG-E120R 1-61质粒和FLAG-E120R 62-123质粒)(100ng/孔)，转染24h，利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性，所述的FLAG-E120R 1-61质粒和FLAG-E120R 62-123质粒分别表示表达仅含有编码E120R蛋白1-61位氨基酸的核苷酸序列和仅含有编码E120R蛋白62-123位氨基酸的核苷酸序列的片段质粒。
结果如图7所示，其中Vec大组为不转染HA-cGAS/HA-STING质粒的对照组，说明在不转染HA-cGAS/HA-STING质粒的情况下，转染FLAG-E120R质粒、FLAG-E120R 1-61质粒和FLAG-E120R 62-123质粒后均不会影响IFN-β表达。cGAS/STING为转染HA-cGAS/HA-STING质粒的实验组；结果表明，仅转染HA-cGAS/HA-STING质粒后，IFN-β表达含量显著升高，即病毒感染后IFN-β表达含量升高；而相较于仅转染HA-cGAS/HA-STING质粒，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒或FLAG-E120R 62-123质粒后，IFN-β的表达显著降低；但是共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R 1-61质粒后，IFN-β表达无显著变化。上述结果说明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白的62-123位氨基酸序列能够抑制cGAS/STING诱导的IFN-β的激活，抑制病毒感染后IFN-β的相关干扰素的激活，抑制cGAS/STING通路，是E120R蛋白抑制宿主天然免疫的的关键区域。
2.E120R蛋白抑制宿主天然免疫的的关键位点区域分析
分别构建E120R蛋白缺失62-65位氨基酸、66-70位氨基酸、71-75位氨基酸、76-80位氨基酸、81-85位氨基酸、86-90位氨基酸、91-95位氨基酸、96-100位氨基酸、101-105位氨基酸、106-110位氨基酸、111-115位氨基酸和116-123位氨基酸的质粒FLAG-E120R Δ62-65aa、FLAG-E120R Δ66-70aa、FLAG-E120R Δ71-75aa、FLAG-E120R Δ76-80aa、FLAG-E120R Δ81-85aa、FLAG-E120R Δ86-90aa、FLAG-E120R Δ91-95aa、FLAG-E120R Δ96-100aa、FLAG-E120R Δ101-105aa、FLAG-E120R Δ106-110aa、FLAG-E120R Δ111-115aa、FLAG-E120R Δ116-123aa(由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建)。
将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)、HA-cGAS/HA-STING质粒(100ng/孔)，和FLAG-E120R及上述构建的FLAG-E120R缺失质粒(100ng/孔)，转染24h，利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性。
结果如图8所示，其中Vec为不转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒的空白对照。结果表明，相较于Vec组，仅转染FLAG-E120R质粒(E120R组)后，IFN-β表达含量无显著变化，而仅转染HA-cGAS/HA-STING质粒(C+S+Vec组)后，IFN-β表达含量显著升高；相较于C+S+Vec组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒(C+S+E120R组)后，IFN-β表达显著降低，即发生了免疫抑制；而相较于C+S+E120R组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120RΔ71-75aa质粒(C+S+E120RΔ71-75组)后，IFN-β表达显著升高，且高于C+S+Vec组，即免疫抑制解除；然而相较于C+S+E120R组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和其他E120R缺失质粒(其他组)后，IFN-β表达无显著变化。上述结果说明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白的71-75位氨基酸是抑制cGAS/STING通路的关键位点区域。
3.E120R蛋白抑制宿主天然免疫的的位点分析
分别构建E120R蛋白突变质粒FLAG-E120R E71A、FLAG-E120R E72A、FLAG-E120RE73A、FLAG-E120R D74A、FLAG-E120R S75A(由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建)。
结果如图9所示，其中Vec为不转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒的空白对照组。结果表明，相较于Vec组，仅转染FLAG-E120R质粒(E120R组)后，IFN-β表达含量无显著变化，而仅转染HA-cGAS/HA-STING质粒(C+S+Vec组)后，IFN-β表达含量显著升高；相较于C+S+Vec组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R质粒(C+S+E120R组)后，IFN-β表达显著降低，即发生了免疫抑制；而相较于C+S+E120R组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和FLAG-E120R E72A质粒(C+S+E120R E72A组)或FLAG-E120R E73A质粒(C+S+E120R E73A组)后，IFN-β表达显著升高，即免疫抑制解除；然而相较于C+S+E120R组，共同转染HA-cGAS/HA-STING质粒和其他E120R突变质粒(其他组)后，IFN-β表达无显著变化。上述结果说明，非洲猪瘟病毒E120R蛋白的71和73位氨基酸是天然免疫抑制的关键位点区域。
实施例5 ASFV E120R-Δ72/73重组毒株的构建及纯化鉴定
1.筛选表达盒构建
为了便于筛选，共构建一套筛选标记基因的表达盒，即增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：
参照文献(O'Donnell V,Holinka LG,Krug PW,Gladue DP,Carlson J,SanfordB,Alfano M,Kramer E,Lu Z,Arzt J,Reese B,Carrillo C,Risatti GR,BorcaMV.AfricanSwine Fever Virus Georgia 2007with a Deletion of Virulence-Associated Gene9GL(B119L),when Administered at Low Doses,Leads to Virus Attenuation in Swineand Induces an Effective Protection against Homologous Challenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引物5’-TTATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGAAAAGTC-3’(SEQID NO.3所示)和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAATT-3’(SEQID NO.4所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.5所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO.6所示)；
参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a tooltoefficiently increase the development of recombinant African swine feverviruses.Sci Rep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA(SEQID NO.7)，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。
2.同源重组转移载体的构建
利用pUC19载体作为骨架载体，构建E120R基因72-73位氨基酸敲除用同源重组转移载体，所述的E120R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述敲除的E120R基因序列为非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS/2018分离株全基因序列167953-167958的核苷酸序列，构建策略见图10。
具体步骤为：设计编码E120R蛋白第72-73位氨基酸的基因片段的上下游序列各约1.0kb作为同源重组左臂(Left arm，SEQ ID NO.8所示)和右臂(Right arm，SEQ ID NO.9所示)，并分别克隆入pUC19载体中，获得E120R基因72-73位氨基酸缺失的重组转移载体；在E120R基因的重组转移载体左、右臂基因序列中间插入合成的第74位到终止子的DNA序列(图中表示为snyE120R(74-123aa))、BGH polyA序列(SEQ ID NO.10，图中表示为左侧polyA)以及eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly(图中表示为p72+GFP+右侧polyA)；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pE120R-del-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。
3.细胞转染和重组病毒筛选
将同源重组转移载体pE120R-del-eGFP(2μg)和6μL的
Figure BDA0002670807310000111
-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至猪BMDM细胞(细胞数约为106个/孔)，转染6h后，直接感染非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株(按1MOI感染量)，不换液，至感染48h，在荧光显微镜下观察荧光细胞数。结果如图11所示，在荧光显微镜下可见有零星绿色荧光，即视为可疑重组毒感染的细胞。挑取荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1h，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，接种预先铺好的96孔板PAM细胞中，每12h观察一次，观察出现荧光的细胞孔并标记，继续观察至72h。荧光细胞数量比例达100％的为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。
对该全阳性孔进行6次有限稀释扩大培养，挑取第8代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取10个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板PAM细胞中，继续生长72h。挑取GFP荧光较多的细胞，提取基因组DNA，利用E120R-F/R引物对其纯净度进行PCR鉴定，利用E120R-check-F/R引物对其缺失情况进行PCR鉴定。E120R-F/R引物对为：E120R-F：ATGGCAGATTTTAATTCTCCAATCC(SEQ ID NO.11所示)和E120R-R：GTAGAAAATTACTATCCTCTTCCTC(SEQ ID NO.12所示)。E120R-check-F/R引物对为：E120R-check-F：ATGGCAGATTTTAATTCTCCAATCC(SEQ ID NO.13所示)和E120R-check-R：TTGCTCTTGTGGCTGCTCAG(SEQ ID NO.14所示)。
PCR扩增结果显示，当以编码野生型ASFV E120R蛋白的基因为模板时，E120R-F/R引物可以扩增出明显的条带(图12，条带1)，当以缺失编码ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸的基因为模板时，E120R-F/R引物扩增不出条带(图12，条带2)，结果表明ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸已缺失并纯化。当以缺失编码ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸的基因为模板时，E120R-check-F/R引物可以扩增出明显的条带(图12，条带4)，结果表明，ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸已缺失，并且产物测序结果显示编码ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列已经成功缺失(图13)，并命名为ASFV E120R-Δ72/73重组毒株。
实施例6 ASFV E120R-Δ72/73重组毒株对免疫应答影响的评价
将PAM细胞铺置于3.5cm皿内，待细胞细胞贴壁后，分别感染亲本非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株(1MOI)和ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株(1MOI)，在感染0、12、24h收取细胞样品，提取RNA，利用定量PCR检测IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA的表达情况。
结果如图14显示，感染亲本非洲猪瘟CN/GS/2018分离株(ASFV WT)后，IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA均无显著性变化；然而相较于ASFV WT，感染ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株(ASFV E120R-Δ72/73)后，IFN-β、ISG56和ISG15 mRNA均显著增加。结果表明缺失编码ASFV E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列后构建的ASFV E120R-Δ72/73重组病毒株的天然免疫抑制能力解除，天然免疫功能显著增加。
实施例7 不同基因型非洲猪瘟病毒株E120R蛋白同源性对比
上述实施例中以ASFV CN/GS/2018分离株为例，分析了ASFV CN/GS/2018分离株中E120R蛋白的免疫抑制位点，并确定了ASFV CN/GS/2018分离株中E120R蛋白的72-73位氨基酸是免疫抑制的关键位点，能够显著抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活，抑制天然免疫，具有免疫抑制功能。并通过基因工程手段，获得了缺失编码ASFV CN/GS/2018分离株E120R蛋白的72-73位氨基酸的核苷酸序列的重组病毒株ASFV E120R-Δ72/73，相较于亲本ASFV CN/GS/2018分离株，ASFV E120R-Δ72/73重组病毒的天然免疫功能显著增加。
基于上述结果，对其他基因型非洲猪瘟病毒E120R蛋白的氨基酸序列进行同源性对比，结果如图15所示，非洲猪瘟病毒ASFV Georgia-2007分离株、ASFV AnhuiXCGQ-2018分离株、ASFV CAS19-2019分离株、ASFV DB LN-2018分离株、ASFV HLJ-2018分离株等不同基因型非洲猪瘟病毒中E120R蛋白的氨基酸序列与ASFV CN/GS/2018分离株E120R蛋白的氨基酸序列高度同源(同源性为100％)，即在不同基因型非洲猪瘟病毒中，E120R蛋白的氨基酸序列完全相同，且对应的免疫抑制位点一致。因此，在缺失编码ASFV CN/GS/2018分离株E120R蛋白的72-73位氨基酸的核苷酸序列成功获得免疫抑制敲除的重组病毒株ASFVE120R-Δ72/73的基础上，本领域技术人员也可以在其他基因型非洲猪瘟病毒中缺失编码E120R蛋白的72-73位氨基酸的核苷酸序列也能成功构建免疫抑制位点敲除的重组病毒株。
以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 1
Met Ala Asp Phe Asn Ser Pro Ile Gln Tyr Leu Lys Glu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Asp Arg Thr Ser Ile Gly Ser Leu Glu Tyr Asp Glu Asn Ala Asp Thr
20 25 30
Met Ile Pro Ser Phe Ala Ala Gly Leu Glu Glu Phe Glu Pro Ile Pro
35 40 45
Asp Tyr Asp Pro Thr Thr Ser Thr Ser Leu Tyr Ser Gln Leu Thr His
50 55 60
Asn Met Glu Lys Ile Ala Glu Glu Glu Asp Ser Asn Phe Leu His Asp
65 70 75 80
Thr Arg Glu Phe Thr Ser Leu Val Pro Asp Glu Ala Asp Asn Lys Pro
85 90 95
Glu Asp Asp Glu Glu Ser Gly Ala Lys Pro Lys Lys Lys Lys His Leu
100 105 110
Phe Pro Lys Leu Ser Ser His Lys Ser Lys
115 120
<210> 2
<211> 369
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
atggcagatt ttaattctcc aatccagtat ttgaaagaag attcgaggga ccggacctct 60
ataggttctc tagaatacga tgaaaatgcc gacacgatga taccgagctt cgcagcaggc 120
ttggaagagt ttgaacccat tcccgactat gaccctacca catcaacttc cctgtattca 180
caattgaccc acaacatgga aaaaatcgca gaggaagagg atagtaattt tctacacgat 240
actagggagt ttacttcact ggtccccgat gaggcagaca ataaaccgga agatgacgaa 300
gaaagcggtg caaaacctaa aaagaaaaaa catttgtttc caaaattaag ctcgcataaa 360
tcgaagtaa 369
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttataaaaca tatgttcata aaaagggtcg ccggaggaaa agtc 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggtgagca agggcgagga g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcagatt ttaattctcc aatcc 25
<210> 7
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagctgcag aagacagcaa cttcctgcat gacacccgcg aattcaccag cctagtgcca 60
gatgaggccg ataacaagcc agaggacgac gaggagtccg gggccaagcc aaagaagaag 120
aagcacctct tccccaagct gagcagccac aagagcaagt aaaaattgaa gcgaaaaaaa 180
gtagaaaaaa aaccggtctc ttggcccgga tcc 213
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 8
tgggaggctc tacaagcaaa aattccttta aaaatacgac caacattatc agcaattcca 60
ttttcaatca gatgcaaagt tgtatttcca tgttggatgg caaaaattac ataggcgtat 120
tcggtgatgg aaatatttta aaccacgttt tccaggattt aaacttatca ttaaacacaa 180
gttgcgtgca aaagcacgta aacgaggaaa atttcattac aaatctttcg aaccaaatta 240
ctcaaaattt aaaagaccaa gaagttgcgt taacccaatg gatggacgca ggaactcacg 300
atcagaaaac ggatatagaa gaaaatataa aggtaaactt aacaaccaca cttattcaaa 360
actgcgtttc atccctgtcg ggtatgaacg tgctggtggt gaaggggaat ggcaacattg 420
ttgaaaacgc aactcagaag cagtcgcagc aaatcatctc taactgcttg caggggagca 480
agcaggccat agacaccaca accggcatca ctaacacggt aaatcagtac tcacactaca 540
cctcaaaaaa cttttttgac ttcattgcag acgcaatttc ggctgttttt aaaaacatca 600
tggtcgcggc tgtagttatc gttctaatca tcgtagggtt tatagccgtc ttttactttt 660
tgcattcacg gcaccgccat gaggaggaag aagaagctga accactcata agcaacaagg 720
tattaaaaaa tgctgccgtt tcgtaataat ttaattaaaa gtaaaaaaaa aaggtattgt 780
tatagtgatg gcagatttta attctccaat ccagtatttg aaagaagatt cgagggaccg 840
gacctctata ggttctctag aatacgatga aaatgccgac acgatgatac cgagcttcgc 900
agcaggcttg gaagagtttg aacccattcc cgactatgac cctaccacat caacttccct 960
gtattcacaa ttgacccaca acatggaaaa aatcgcagag 1000
<210> 9
<211> 994
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 9
aattttctac acgatactag ggagtttact tcactggtcc ccgatgaggc agacaataaa 60
ccggaagatg acgaagaaag cggtgcaaaa cctaaaaaga aaaaacattt gtttccaaaa 120
ttaagctcgc ataaatcgaa gtaaaaattg aagcgaaaaa aagtagaaaa aaaatgtttg 180
gagcttttgt aagccaccgt ttgtggtcag atagtggttg tacgaccacc tgcatcacaa 240
acagcattgc taattatgta gccttcggcg aacaaattgg atttcccttt aaatcagctc 300
aggtatttat tgccggccct agaaaggctg tgataaatat tcaggaagat gataaagttg 360
agcttttaaa gatgattgtt aagcacaatc tttgggttgt tgctcatgga acctacttag 420
atgtgccctg gtcccgtaag agtgcgtttg ttacacattt tatacaacaa gaactactta 480
tatgcaagga agtcggtatt aaagggttag ttttacacct aggcgctgtg gagcctgaac 540
ttattatgga aggactaaaa aaaattaagc cggttgaggg ggttgtcatt tacctggaaa 600
ccccgcataa caaacatcat acatataaat acagtacaat tgagcagatc aaagaattgt 660
ttttacggat acgaaatacc aggttgaaac agattggttt atgcattgat acggctcaca 720
tctggtcttc cggtgtcaac atctccagct ataatgacgc ggggcaatgg ctgcgctcgc 780
tggaaaacat tcattccgtg atcccaccaa gccacattat gttccaccta aatgatgccg 840
ccacagaatg cggaagcggt atagaccgac atgcaagtct ttttgaagga atgatttgga 900
aatcatatag ccataaaata aagcaaagcg gtttatattg ttttgttgaa tacgttacgc 960
gacaccagtg tccggctata ttggagagaa acct 994
<210> 10
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaaaacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggcagatt ttaattctcc aatcc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtagaaaatt actatcctct tcctc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggcagatt ttaattctcc aatcc 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgctcttgt ggctgctcag 20

Claims (8)

1.通过缺失非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制功能制备非洲猪瘟重组病毒的应用，其特征在于，所述缺失包括将编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
2.一种E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒，其特征在于，将非洲猪瘟病毒中编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
3.如权利要求2所述的非洲猪瘟重组病毒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株。
4.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求2或3所述的E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
5.一种E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒的制备方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段使编码非洲猪瘟病毒E120R蛋白72-73位氨基酸的核苷酸序列缺失。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术，所述方法包括以下步骤：
（1）选取编码E120R蛋白72-73位氨基酸基因片段上下游序列约1.0kb作左右为同源重组左臂和右臂，并分别克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体；
（2）在步骤（1）所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；
（3）将步骤（2）所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的 BMDM细胞，纯化筛选获得E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
8.如权利要求5-7任一所述方法制备获得的E120R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。
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African Swine Fever Virus Structural Protein pE120R Is Essential for Virus Transport from Assembly Sites to Plasma Membrane but Not for Infectivity;GERMA´N ANDRE´S 等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20010831;第75卷(第15期);全文 *
Characterization of the African Swine Fever Virus Structural Protein p14.5:A DNA Binding Protein;LUISA MARTINEZ-POMARES;《VIROLOGY》;19970303;第229卷(第1期);全文 *

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